Assoziationsanalysen zwischen genetischen Varianten im Bereich der Trace-Amin-Rezeptor-Gene TRAR1, TRAR4 und
TRAR5 und bipolar affektiven Störungen
Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Hohen Medizinischen Fakultät der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität
Bonn
Ishani Sircar aus Euskirchen
2008
Angefertigt mit Genehmigung der
Medizinischen Fakultät der Universität Bonn
1. Gutachter: Prof. Dr. med. Peter Propping 2. Gutachter: PD Dr. med. Kai Ernst Wilhelm
Tag der Mündlichen Prüfung: 23.4.2008
Aus dem Institut für Humangenetik der
Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Direktor: Prof. Dr. med. P. Propping
Diese Dissertation ist auf dem Hochschulschriftenserver der ULB Bonn http://hss.ulb.uni-bonn.de/diss_online elektronisch publiziert.
Meinen Eltern gewidmet
Inhaltsverzeichnis
Seite
Abkürzungsverzeichnis 7
1 Einleitung 9
2 Theoretische Grundlagen 10
2.1 Bipolar affektive Störungen – Krankheitsbegriff 10
2.2 Genetik affektiver Störungen 11
2.2.1 Familienstudien 11
2.2.2 Zwillingsuntersuchungen 13
2.2.3 Adoptionsstudien 14
2.3 Bipolar affektive Störungen – Modellvorstellungen zur Vererbung 14
2.3.1 Formalgenetischer Übertragungsmechanismus 14
2.3.2 Unipolare und bipolare Verlaufsformen 15
2.4 Methoden zur Genidentifikation bei genetisch komplexen Erkrankungen 16
2.4.1 Kopplungsuntersuchungen 16
2.4.2 Assoziationsuntersuchungen 16
2.4.3 Genetische Varianten zur Genidentifikation bei genetisch komplexen Erkrankungen 19
2.5 Die Gene TRAR1, TRAR4 und TRAR5 – Kandidatengene für affektive Störungen 19
2.5.1 Trace Amine und affektive Störungen 19
2.5.2 Chromosomale Region 6q23 – Bedeutung für bipolar affektive Störungen 21
3 Zielsetzung und Fragestellung 23
4 Material und Methoden 23
4.1 Patientenkollektiv 23
4.2 Geräte 24
4.3 Chemikalien 25
4.4 Enzyme und Längenstandards 25
4.5 Sonstige Ingredienzien und Materialien 26
4.6 Synthetische Oligonukleotide (Primer) 26
4.7 Isolierung und Aufbereitung humaner genomischer DNA 28
4.7.1 Isolierung und Reinigung der DNA 28
4.7.2 Photometrische Konzentrationsbestimmung und Überprüfung der Reinheit isolierter 29
genomischer DNA 4.8 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 29
4.9 Agarose-Gelelektrophorese 32
4.10 Genotypisierung durch Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus(RFLP)-Analyse 33 4.10.1 Auswahl geeigneter Restriktionsendonukleasen 34
4.10.2 Verdau von PCR-Produkten 34
4.10.3 Vorbereitung nativer 10%iger Polyacrylamidgele für RFLP-Assays 35
4.10.4 Gelelektrophorese 35
4.10.5 Silberfärbung der Polyacrylamidgele 36
4.11 Direktsequenzierung 36
4.11.1 Reinigung von PCR-Produkten mittels Glasfasersäulchen 37
4.11.2 Konzentrationsbestimmung von PCR-Produkten 37
4.11.3 Sequenzierung 37
5 Statistik 38
6 Ergebnisse 39
6.1 Validierung des RFLP-Assays durch Sequenzierung 39
6.2 Darstellung der genetischen Varianten in den Genen TRAR1, TRAR4 und TRAR5 40
6.3 Assoziationsanalysen mit genetischen Varianten in den Genen TRAR1, TRAR4 44
und TRAR5 6.3.1 Ergebnisse im Initialkollektiv mit bipolar affektiver Störung 44
6.3.2 Ergebnisse im Replikationskollektiv mit bipolar affektiver Störung 47
6.3.3 Ergebnisse im Gesamtkollektiv mit bipolar affektiver Störung 49
7 Diskussion 49
7.1 Aufklärung genetischer Ursachen komplex vererbter Krankheiten 49
7.2 Interpretation der Ergebnisse vorliegender Arbeit 50
7.3 Unabhängig publizierte Assoziationsergebnisse zwischen TRAR4 und 51
psychiatrischen Erkrankungen 7.4 Zusammenfassende Betrachtung und Ausblick 53
8 Zusammenfassung 55
9 Literaturverzeichnis 57 Curriculum vitae
Abkürzungsverzeichnis
A Adenin ß-PEA ß-Phenylethylamin bp Basenpaar(e) BPAD bipolar affective disorder
C Cytosin CARD15 caspase recruitment domain 15 DISC1 disrupted in schizophrenia 1 DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure (engl.: desoxyribonucleic acid) dNTP Desoxyribonukleosid-5´-Triphosphat ddNTP Didesoxyribonukleosid-5´-Triphosphat DSM Diagnostisches und statistisches Manual psychischer Störungen EDTA Ethylendiamintetraacetat
EZ Eineiige Zwillinge
G Guanin GPCR G-Protein gekoppelter Rezeptor
5-HAT 5-Hydroxytryptamin (Serotonin) KI Koinzidenzintervall kb Kilobasenpaar(e)
LD linkage disequilibrium
LOD-Score logarithm of odds
MAO-B Monoaminoxidase B
Mb Megabasenpaar(e)
mRNA Boten-Ribonukleinsäure (engl.: messenger ribonucleic acid) NIMH National Institute of Mental Health
NPL nonparametric linkage
OR odds ratio
p Wahrscheinlichkeit PAA Polyacrylamid
PCR Polymerasekettenreaktion (engl.: polymerase chain reaction) RFLP Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus RNA Ribonukleinsäure (engl.: ribonucleic acid)
rpm revolutions per minute
RT Raumtemperatur SA Standardabweichung
SCID-I Structured Clinical Interview for DSM-IV Axis I Disorders SDS Sodiumdodecylsulfat
SNP single nucleotide polymorphism STR short tandem repeat
T Thymin
Taq-Polymerase Polymerase von Thermophilus aquaticus TBE-Puffer Tris-Borsäure-EDTA-Puffer
TDT Transmission-Disequilibrium-Test TEMED N´,N´,N´,N-Tetramethylendiamin TRAR trace amine receptor
Tris Tris-(hydroxymethyl-)aminomethan U Einheit einer Enzymaktivität (engl.: unit)
UCSC University of California, Santa Cruz (bzw. UCSC genome browser)
UTR Untranslatierter Bereich
ZZ Zweieiige Zwillinge
1 Einleitung
Bipolar affektive Störungen stellen mit einer Prävalenz von etwa 0,5-1,5% ausgesprochen häufige Erkrankungen dar (Craddock und Jones, 1999). Dies trifft auf alle Kulturkreise und Populationen gleichermaßen zu. Es gibt nämlich – soweit bekannt – keine unterschiedlichen Prävalenzraten zwischen einzelnen Bevölkerungsgruppen (Regier et al., 1988). Das mittlere Erstmanifestationsalter bipolar affektiver Störungen liegt zwischen dem zweiten und dritten Lebensjahrzehnt, wenngleich auch Krankheitsausbrüche von der Pubertät bis in das hohe Lebensalter beobachtet werden (Angst, 1980; Smith und Weissman, 1992). Der typischerweise phasische Krankheitsverlauf bringt für die Patienten eine erhebliche Beeinträchtigung ihres Lebens über lange Zeiträume mit sich. Zudem sterben etwa 7-15% der Erkrankten durch Suizid (Guze und Robins, 1970; Huber, 1994).
Bereits der älteren psychiatrischen Forschung war die erhöhte familiäre Belastung von affektiven Störungen bekannt. Auch moderne, nach operationalisierten Kriterien ausgerichtete Studien konnten übereinstimmend die ätiologische Bedeutung genetischer Faktoren zeigen. Da es sich hierbei um den stärksten bislang erkannten prädisponierenden Faktor handelt, verspricht der molekulargenetische Ansatz, die derzeit erfolgreichste Strategie zur Erforschung der Ursachen affektiver Störungen zu sein. Durch die Fortschritte der modernen Molekulargenetik scheinen auch zunehmend die methodischen Möglichkeiten geschaffen, die verantwortlichen Krankheitsgene detektieren zu können. Dies, obwohl es sich um eine genetisch komplexe Krankheit handelt, die die Genetik und mit ihr die Biometrie und Bioinformatik vor weitaus größere Herausforderungen stellt, als es für die Identifizierung von Krankheitsgenen bei monogen erblichen Erkrankungen der Fall ist.
Zurzeit stehen prinzipiell zwei Methoden zur Identifikation von Krankheitsgenen bei genetisch komplexen Krankheiten zur Verfügung: der Kopplungs- und der Assoziationsansatz. Bei Kopplungsanalysen geht man davon aus, dass eine variable DNA-Sequenz (genetischer Marker) gemeinsam mit der krankheitsverursachenden Genveränderung innerhalb einer Familie vererbt wird, vorausgesetzt beide befinden sich auf einem Chromosom in nur geringem Abstand zueinander. Man versucht, innerhalb von Familien mit hoher Krankheitsdichte chromosomale Regionen zu identifizieren, in denen Krankheitsgene vermutet werden müssen. Bei Assoziationsanalysen wird überprüft, ob in einem Patientenkollektiv eine bestimmte DNA- Sequenzvariante – z.B. in einem Kandidatengen – überzufällig häufiger vorkommt als in einer
Kontrollgruppe. Auf diese Weise versucht man, die genetische Veränderung direkt zu identifizieren.
Die Zielsetzung vorliegender Arbeit lag darin, insgesamt 5 genetische Varianten in den Genen für die Trace-Amin-Rezeptoren 1 (TRAR1), 4 (TRAR4) und 5 (TRAR5) auf Assoziation mit bipolar affektiven Störungen hin zu untersuchen. Das hierfür gewählte Patientenkollektiv wurde von der Psychiatrischen Klinik des Universitätsklinikums Bonn zur Verfügung gestellt. Bei TRAR1, TRAR4 und TRAR5 handelt es sich um Kandidatengene, für die ein pathophysiologischer Zusammenhang mit der Entstehung affektiver Störungen vermutet werden kann. Die korrespondierenden Proteine sind Rezeptoren für Trace Amine, die bei affektiven Psychosen in ihrer Funktion oder Regulation betroffen sein könnten.
2 Theoretische Grundlagen
2.1 Bipolar affektive Störungen – Krankheitsbegriff
Nosologisch zählt die bipolar affektive Störung zu den endogenen Formen affektiver Psychosen und ist somit abzugrenzen von den exogenen oder auch organischen Psychosen. Letztere sind körperlich begründet und lassen sich einem somatischen Korrelat auf zerebraler oder damit verknüpfter Ebene zuordnen.
Huber (1994) charakterisiert affektive Störungen (Zyklothymien) als „unmotivierte Verstimmungen depressiv-gehemmter oder manisch-erregter Art“, deren Verlauf sich in Phasen gestaltet, d.h. zeitlich abgrenzbar ist, mit gewöhnlich mehrfach im Leben auftretenden Episoden.
Im Intervall kommt es zu einer kompletten Remission der Gemütsverfassung. Phasenzahl als auch Phasen- bzw. Zyklusdauer variieren dabei erheblich. Der Symptomenkomplex der Depression ist dabei durch eine Denkhemmung, eine psychomotorische Hemmung (Antriebsstörung), Vitalstörungen, vegetative Symptome (vor allem Schlaf-, Appetit- und Verdauungsstörungen) und durch depressive Wahngedanken gekennzeichnet. Zu den Symptomen der Manie zählen indes eine Denkerregung (sog. Ideenflucht), eine psychomotorische Erregung, Gehobenheit der Vitalgefühle, körperlich-vegetative Auffälligkeiten und manische Wahneinfälle.
Affektive Psychosen können sich bezüglich des Krankheitsverlaufs in unterschiedlicher Weise manifestieren: man spricht von unipolaren Verlaufsformen mit ausschließlich depressiven Phasen (mit etwa 66% weitaus am häufigsten) oder mit ausschließlich manischen Ereignissen (mit etwa 3-6% eher selten) und von bipolaren Verläufen (ca. 28%) mit alternierend depressiver und manischer Symptomatik (wobei meist die depressiven Phasen überwiegen).
Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die bipolar affektive Störung, deren Lebenszeitprävalenz etwa 0,5 bis 1,5% beträgt (Craddock und Jones, 1999). Eine nennenswerte Geschlechtspräferenz ließ sich bislang nicht beobachten. Das Alter bei Ersterkrankung erstreckt sich über die gesamte Erwachsenenperiode, d.h. von der Pubertät bis zum 70.Lebensjahr, das Mittel liegt bei etwa 30- 35 Jahren (Angst, 1980). Smith und Weissman (1992) geben allerdings für bipolare Verläufe ein mittleres Erstmanifestationsalter von 21 Jahren an. Die Prognose quoad vitam ist bei affektiven Störungen erheblich durch das Suizidrisiko (v.a. in den depressiven Phasen) eingeschränkt. Die Suizidrate für die bipolaren Verlaufsformen beträgt laut neueren Daten ungefähr 7% (Huber, 1994).
Die Diagnose einer affektiven Störung und die Zuordnung zu dem jeweiligen Verlaufstyp richten sich nach den klinischen Ordnungsvorgaben der heute international verwendeten Klassifikationssysteme, den DSM-IV Kriterien (American Psychiatric Association, 1994) sowie den RDC-Kriterien (Research Diagnostic Criteria; Spitzer et al., 1975).
2.2 Genetik affektiver Störungen
Die Beobachtung, dass Gemütskrankheiten familiär gehäuft auftreten, ist alt. So beschreibt bereits Robert Burton in seinem erstmals 1621 erschienenen Werk „Anatomie der Melancholie“, dass „die Melancholie eine Erbkrankheit darstellt“ und beruft sich hierbei auf verschiedene Gelehrte wie z.B. Paracelsus, Fernelius (Jean Fernel), Crato, Rodericus a Fonsèca. Ab dem späten 18. Jahrhundert kam dann der Gedanke einer genetischen Komponente bei der Genese von Geisteskrankheiten auf. Philippe Pinel (1745-1826) beschreibt die Vererbung als Ursache von Geisteskrankheiten; er unterteilte sie in Manie, Melancholie, Demenz und Idiotie. Auch Jean- Etienne-Dominique Esquirol (1772-1840), ein Schüler Pinels, benannte unter anderem Erbanlagen als ätiologischen Faktor für Geisteskrankheiten; zudem waren sie für ihn Krankheiten des Gehirns.
Mit Beginn der zwanziger Jahre des 20. Jahrhunderts wurden dann eine Vielzahl von Familien, Zwillings- und Adoptionsstudien durchgeführt, deren Resultate den genetischen Stellenwert bei der Entstehung affektiver Störungen letztendlich bewiesen.
2.2.1 Familienstudien
Familienuntersuchungen gründen auf der Tatsache, dass verwandte Personen aufgrund ihrer Abstammung naturgemäß einen Teil ihrer Gene gemeinsam haben. Für viele Krankheiten,
einschließlich psychiatrischer, kann man dabei eine Korrelation des Erkrankungsrisikos einer Person mit der Nähe seiner Verwandtschaft zum Patienten finden. Dies trifft auch auf die affektiven Psychosen zu. So sinkt das empirische Wiederholungsrisiko mit abnehmender verwandtschaftlicher Nähe zu dem Betroffenen (Gershon et al., 1976) und steigt mit der Anzahl betroffener Familienangehöriger (Lieb et al., 2002; Gershon et al., 1982). Beispielsweise haben Kinder, deren Eltern beide von einer affektiven Störung betroffen sind, ein auf über 55% erhöhtes Morbiditätsrisiko (Bertelsen, 1985).
Eine von Craddock und Jones (1999) durchgeführte Meta-Analyse (Tab. 1) zeigt bezüglich bipolar affektiver Störungen, dass das Risiko für Verwandte 1. Grades eines Indexfalls, ebenfalls an einer bipolaren Störung zu erkranken, bei 5-10% liegt und somit gegenüber der Allgemeinbevölkerung um das 7fache erhöht ist. In den entsprechenden Familien wurden jedoch nicht nur die Erkrankungen der Patienten überzufällig häufig beobachtet, auch andere psychiatrische Störungsformen treten vermehrt auf. So beträgt das Risiko erstgradig Verwandter bipolarer Indexfälle für eine unipolare depressive Störung 10-20%. Dass das Risiko, an einer unipolaren Depression zu erkranken, hierbei sogar größer ist als das Risiko für eine bipolare Störung, erklärt sich durch die allgemein höhere Prävalenz unipolarer Störungen gegenüber bipolaren Formen (10% versus 1%) (McGuffin und Katz, 1989). Dementsprechend kommen auch unter den Verwandten unipolarer Indexpatienten relativ seltener bipolar affektive Erkrankungen vor (0,6-4%) (Gershon et al., 1982).
Tab. 1 Abstufung der Lebenszeitrisiken für affektive Störungen (Übersichtsarbeit von Craddock und Jones, 1999)
Verwandtschaftsgrad zum bipolaren Probanden
Risiko für bipolar affektive Störung
Zusätzliches Risiko für unipolare Störung
Eineiiger Ko-Zwilling 40-70% 15-25%
Verwandter 1. Grades 5-10% 10-20%
Allgemeinbevölkerung 0,5-1,5% 5-10%
Insgesamt ist aber das empirische Wiederholungsrisiko, an einer affektiven Psychose zu erkranken, für Verwandte 1. Grades bipolarer Indexfälle sehr viel höher (etwa 18,2%) als für Verwandten 1. Grades unipolar depressiver Probanden (etwa 7,1%) (Gershon et al., 1982).
Entsprechend scheint der Beitrag genetischer Faktoren bei bipolar affektiven größer als bei unipolar depressiven Störungen zu sein. Craddock und Forty (2005) beziffern den Erblichkeitsanteil bipolarer Störungen mit 89-93% und den unipolar depressiver Störungen mit 33-42%.
Darüber hinaus kann man einer Vielzahl von Familienstudien entnehmen, dass das Ersterkrankungsalter des Indexpatienten sowohl bei bipolaren als auch bei unipolaren Verläufen Einfluss auf das Wiederholungsrisiko für Familienangehörige hat. Entsprechend haben Verwandte früh erkrankter Patienten ein erhöhtes Morbiditätsrisiko im Vergleich zu Personen, deren Angehörige spät erkrankt sind (Gershon et al., 1976; Baron et al., 1981; Strober, 1992).
2.2.2 Zwillingsuntersuchungen
Erhöhte Morbiditätsraten bei Familienangehörigen erkrankter Patienten können auch auf ähnliche Lebensbedingungen zurückgeführt werden. Eine Differenzierung zwischen genetischen, familiären und sozialpsychiatrischen Faktoren ist durch Zwillingsuntersuchungen möglich. Dabei versucht man durch den Vergleich eineiiger Zwillinge (EZ) mit zweieiigen Zwillingen (ZZ), den genetischen Anteil an der Ausprägung eines Merkmals abzuschätzen.
Eineiige Zwillinge besitzen identische Erbanlagen. Unterschiede im phänotypischen Erscheinungsbild lassen sich folglich auf Umwelteinflüsse zurückführen. Zweieiige Zwillinge haben (wie normale Geschwister) nur die Hälfte ihrer Gene gemeinsam, phänotypische Unterschiede sind hier das Resultat sowohl von genetischen als auch von exogenen Faktoren.
Hohe Konkordanzraten bei EZ im Vergleich zu niedrigen Konkordanzraten bei ZZ weisen daher stark auf das Gewicht von genetischen Faktoren hin.
Zwischen 1928 und 1977 sind zehn Zwillingsstudien zu affektiven Psychosen durchgeführt worden, deren wesentliche Ergebnisse einer Übersichtsarbeit von Propping (1989) zu entnehmen sind. Die Untersuchungen lassen folgende Aussagen zu: (1) In allen Untersuchungen liegen die Konkordanzraten für affektive Störungen bei EZ weitaus höher als bei ZZ (EZ/ZZ-Verhältnis:
4,0). Der Einfluss psychosozialer Faktoren wird jedoch auch sichtbar, da die Konkordanzraten auch bei EZ unter 100% liegen. (2) Für bipolare Verlaufsformen liegt die EZ-Konkordanz deutlich höher (EZ/ZZ-Verhältnis: 5,2) als für unipolare Verläufe (EZ/ZZ-Verhältnis: 3,1). Der Einfluss genetischer Faktoren scheint somit bei bipolaren Psychosen stärker ausgeprägt zu sein als bei unipolaren Störungen. (3) Die meisten, aber nicht alle für affektive Störungen
konkordanten EZ-Paare stimmen auch im Verlaufstypus überein. Entsprechend zeigten Craddock und Jones (1999), dass eineiige Zwillingspartner bipolarer Patienten ein Lebenszeitrisiko für bipolar affektive Störungen von 40-70% haben und ein zusätzliches Risiko von 15-25%, an einer unipolar depressiven Störung zu erkranken (Tab. 1).
2.2.3 Adoptionsstudien
Eine weitere Methode, genetische und exogene Einflüsse als Ursachenfaktoren zu trennen, stellen Adoptionsstudien dar. Hierbei vergleicht man die Häufigkeit des Auftretens eines Phänotyps bei den biologischen und den Adoptivverwandten. Mendlewicz und Rainer (1977) konnten in ihrer Adoptionsstudie, in die 29 bipolare Adoptivfälle und 22 gesunde Adoptivfälle einbezogen wurden, zeigen, dass sich die höchste Rate psychiatrischer Erkrankungsformen aus dem affektiven Spektrum unter den biologischen Eltern der bipolaren Patienten fanden (31% vs. 2,3%
bei den biologischen Eltern gesunder Kontrollen).
2.3 Bipolar affektive Störungen – Modellvorstellungen zur Vererbung 2.3.1 Formalgenetischer Übertragungsmechanismus
Für die meisten Fälle von affektiven Störungen muss angenommen werden, dass sie genetisch komplex vererbt werden. Man vermutet, dass gleichzeitig mehrere Genveränderungen bzw.
Genvarianten bei einer Person für die Erkrankung disponieren, wobei die Effektstärke jeder einzelnen Genvariante unterschiedlich sein dürfte. In unterschiedlichem und individuellem Zusammenspiel sowie in Wechselwirkung miteinander (Epistase) tragen sie zur Krankheitsdisposition bei. Das klinische Erscheinungsbild dürfte hierbei als Endzustand aufzufassen sein, an dem überdies auch nicht-genetische Faktoren beteiligt sind (Propping, 1989).
Ungeklärt ist bislang, ob affektiven Störungen eine relativ geringe Anzahl von Genveränderungen mit jeweils starkem Effekt (oligogenes Modell) zugrunde liegt oder aber eine Vielzahl von Genveränderungen mit jeweils geringem Effekt verursachend ist (polygenes Modell). Einige Arbeitsgruppen favorisieren das polygene Übertragungsmodell, dann müssten die Genvarianten in der Bevölkerung allerdings sehr häufig sein, weil man sonst die empirischen Wiederholungsziffern unter den Verwandten 1. Grades (5-10%) nicht erklären könnte. Andere geben dem oligogenen Modell den Vorzug, da es eher mit dem hohen Erkrankungsrisiko bei erstgradig Verwandten im Vergleich zur Allgemeinbevölkerung in Einklang zu bringen ist.
2.3.2 Unipolare und bipolare Verlaufsformen
Das gehäuft zu beobachtende Nebeneinander von bipolaren und unipolaren Verlaufsformen innerhalb einzelner Familien legt die Vermutung einer gemeinsamen (genetischen) Entstehungsgrundlage nahe. Das Zwei-Schwellen Modell (Gershon et al., 1976) fasst diesen Aspekt auf und gilt derzeit als das am meisten favorisierte Konzept, das intrafamiliär gehäufte Auftreten beider Verlaufsformen auf genetischer Ebene zu erklären. Es geht von einer Normalverteilung der Häufigkeit genetischer Dispositionsfaktoren in der Bevölkerung aus (Abb. 1). Dabei wird vorausgesetzt, dass uni- und bipolaren Verlaufsformen die gleichen genetischen Dispositionsfaktoren zugrunde liegen. Wird nun eine „weite“ Schwelle an Dispositionsfaktoren überschritten, kommt es zur Ausbildung einer unipolar affektiven Störung, beim Überschreiten der „engen“ Schwelle resultieren hingegen bipolare Verlaufsformen. Für Familienangehörige affektiv erkrankter Personen ist die Verteilungskurve nach rechts verschoben, somit liegt ein höherer Dispositionswert vor. Da man annimmt, dass bei bipolaren Verläufen die genetische Disposition stärker ausgeprägt ist, leitet sich folgendes – tatsächlich zu beobachtendes – ab (Gershon et al., 1975): (1) Das Wiederholungsrisiko für affektive Erkrankungen ist unter den Verwandten bipolarer höher als unter den Verwandten unipolarer Patienten. (2) Verwandte bipolarer Patienten sind häufiger an bipolaren Verlaufsformen erkrankt als Verwandte unipolarer Patienten.
Abb. 1. Zwei-Schwellen Modell (nach Gershon et al., 1976)
Die Befunde der meisten Familienstudien lassen sich in das Zwei-Schwellen-Modell integrieren (Gershon et al., 1982). Demnach folgt die Erkrankungsdisposition bei Verwandten erkrankter Personen ebenfalls einer Normalverteilung, jedoch ist die Kurve nach rechts verschoben, also in Richtung stärkerer genetischer Disposition und dies für Verwandte bipolar Erkrankter stärker als für Verwandte unipolarer Probanden.
2.4 Methoden zur Genidentifizierung bei genetisch komplexen Erkrankungen 2.4.1 Kopplungsuntersuchungen
Unter Kopplung versteht man die gemeinsame Vererbung (Kosegregation) eines genetischen Markers, d.h. einer bekannten variablen DNA-Sequenz, mit einem Krankheitsphänotyp innerhalb einer Familie. Es wird davon ausgegangen, dass der genetische Marker (z.B. ein STR-Marker) zusammen mit der krankheitsverursachenden Mutation vererbt wird, sofern er sich in derselben genetischen Region befindet. Je größer die chromosomale Nähe zwischen Markerallel und Defektallel ist, desto geringer ist die Wahrscheinlichkeit, dass beide durch ein Rekombinationsereignis während der Meiose getrennt und unabhängig voneinander weitervererbt wurden. Durch Kopplungsanalysen kann man somit eine Aussage über die chromosomale Lokalisation eines potentiellen Krankheitsgens treffen.
Hinsichtlich der Bewertung der Ergebnisse von genomweiten Kopplungsanalysen bei genetisch komplexen Erkrankungen bezeichnet man einen Kopplungsbefund als suggestive, der sich der Wahrscheinlichkeit nach einmal in einer genomweiten Kopplungsanalyse durch Zufall ergeben würde. Dies entspricht bei parametrischen Analysen einem LOD-Score von 1,9 (p=0,0017), sowie bei nicht-parametrischen Analysen einem NPL-Score von 2,2 (p=0,00074). Kopplung im Bereich von significant liegt bei einem Ergebnis vor, dass man zufällig in 5 von 100 durchgeführten Genom-Scans zu erwarten hätte. Bei parametrischen Analysen kommt dies einem LOD-Score von 3,3 (p=0,000049), bei nicht-parametrischen Analysen einem NPL-Score von 3,6 (p=0,000022) gleich.
2.4.2 Assoziationsuntersuchungen
Assoziation beschreibt das überzufällig häufige Vorkommen eines Risikofaktors in einem Patientenkollektiv. Bei molekulargenetischen Assoziationsanalysen werden DNA-Varianten – z.B. in ausgewählten Genen (Kandidatengenen) – betrachtet. Von den Kandidatengenen wird vermutet, dass sie am Erkrankungsprozess beteiligt sind.
Eine Assoziation zwischen einem bestimmten Allel und einer Krankheit kann im Prinzip auf zwei Ursachen zurückgeführt werden: (1) Das Allel selbst ist für die Krankheit verantwortlich, indem die entsprechende Variante eine Veränderung der Aminosäuresequenz oder der Expression des resultierenden Genproduktes zur Folge hat. (2) Das assoziierte Allel ist selbst nicht an der Krankheit beteiligt, befindet sich aber auf genomischer Ebene in enger Nachbarschaft zu der disponierenden Variante, so dass ein Kopplungsungleichgewicht zwischen der untersuchten und der eigentlich krankheitsverursachenden Variante besteht. Kopplungsungleichgewicht entsteht in der Evolution dann, wenn bei einem Individuum eine krankheitsverursachende Mutation auftritt und sich ein Großteil der Erkrankten in folgenden Generationen auf diese Person zurückführen lässt (sog. Gründereffekt). Gemeinsam mit der Mutation wird dann auch der die Mutation flankierende genomische Bereich überzufällig häufig weitergegeben. Varianten in diesem Bereich liegen dann im Kopplungsungleichgewicht zur eigentlich krankheitsdisponierenden Veränderung. Das Kopplungsungleichgewicht und damit die Assoziation bleiben in der Evolution jedoch nur dann bestehen, wenn nicht wiederholt Mutationen bei unabhängigen Personen zu demselben Krankheitsallel geführt haben, wenn der Abstand zwischen den beiden Genloci so gering war, dass im Laufe der Zeit keine Rekombinationsereignisse stattgefunden haben und wenn sich für die Träger des krankheitsverursachenden Allels kein Selektionsnachteil ergab.
Kopplungsungleichgewichte zwischen Markern lassen sich als Haplotypen darstellen. Als Haplotyp bezeichnet man zwei oder mehrere nebeneinander liegende Marker bzw. Allele, die gemeinsam als Einheit vererbt werden.
Als Maß für die Assoziation zwischen einem Risikofaktor, hier also die untersuchte Genvariante, und der Krankheit findet das „Relative Risiko“ Anwendung, das auch als „Odds Ratio“
ausgedrückt wird. Das Relative Risiko entspricht dem Verhältnis der Krankheitshäufigkeit bei Exposition gegenüber einem Risikofaktor zu der relativen Krankheitshäufigkeit ohne Exposition.
Es wird also angegeben, wieviel mal wahrscheinlicher es ist, dass ein Träger eines bestimmten Allels im Vergleich zu Personen erkrankt, die das Allel nicht tragen. Die Berechnung der Odds Ratio erfolgt anhand einer Vierfeldertafel:
Allel 1 Allel 2 Patienten a b Kontrollen c d
Hierbei stehen a-d für die Häufigkeiten des Vorkommens von Allel 1 oder 2 bei Patienten bzw.
Kontrollpersonen. Es gilt:
Odds Ratio (OR) = c b
d a
⋅
⋅
Die Odds Ratio gibt in diesem Beispiel die Risikoerhöhung für den Träger von Allel 1 an. Die Schätzung wird mit einem 95%-Konfidenzintervall (95%-KI) versehen, d.h. mit dem Intervall, in dem die Odds Ratio mit einer Wahrscheinlichkeit von 95% liegt.
Grundsätzlich stellen Assoziationsuntersuchungen eine etablierte Methode bei der Erforschung von Krankheiten mit genetisch komplexer Vererbung dar, insbesondere wenn Genveränderungen mit geringem oder schwachem krankheitsverursachenden Effekt vermutet werden.
In Abhängigkeit der Struktur des untersuchten Kollektivs unterscheidet man bei Assoziationsuntersuchungen Fall-Kontroll- und familienbasierte Analysen.
Fall-Kontroll-Assoziationsuntersuchungen: Im einfachsten Fall stellt die Assoziationsstudie eine klassische Fall-Kontroll-Studie dar. In ethnisch übereinstimmenden Patienten- und Kontrollkollektiven untersucht man die Frequenzen des Allels oder des Genotyps einer Variante und versucht, statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Kollektiven darzustellen. Um nicht falsch-positive oder falsch-negative Befunde zu erhalten, ist es dabei entscheidend, dass Patienten und Kontrollpersonen den gleichen genetischen Hintergrund haben. Entstammen die Kollektive nämlich nicht derselben ethnischen Population, können unterschiedliche Allel- und Genotypfrequenzen auf ethnischen Abweichungen zwischen den Bevölkerungsgruppen beruhen (sog. Stratifikationseffekt). Familienbasierte Assoziationsstudien: Bei diesem Design werden erkrankte Individuen samt ihren gesunden Eltern analysiert. Eine solche Untersuchungseinheit bezeichnet man als Trio. Sie hat den Vorteil, dass keine Stratifikationseffekte auftreten können, da Parallelisierung besteht. Zur Durchführung findet neben der Haplotype-relative-risk (HRR)- Methode der Transmission-Disequilibrium-Test (TDT) Anwendung. Bei letztgenanntem beobachtet man, wie häufig ein bestimmtes Allel von einem heterozygoten Elternteil an den Indexpatienten weitergegeben wird (Spielman et al., 1993). Es wird die Transmissionsrate eines disponierenden Allels untersucht. Besitzt ein Elternteil beispielsweise die Allele A und B, beträgt die a priori-Wahrscheinlichkeit, dass entweder A oder B an das Kind vererbt wird, jeweils 50%.
Ist nun Allel A das krankheitsverursachende oder liegt im Kopplungsungleichgewicht zur
disponierenden Veränderung, erwartet man, dass das Allel A überzufällig häufig an das erkrankte Kind weitergegeben wird.
2.4.3 Genetische Varianten zur Genidentifikation bei genetisch komplexen Erkrankungen
Unter anderem werden Assoziationsstudien im Bereich von Genen durchgeführt, denen aufgrund pathophysiologischer Hypothesen eine Rolle bei der Entstehung einer Erkrankung zukommen könnte (Kandidatengene). Dabei wird zunächst sowohl in kodierenden als auch nicht- kodierenden DNA-Regionen der Kandidatengene (in Introns, Exons und das Gen flankierenden Sequenzen) nach Varianten gesucht. Hierbei können theoretisch alle Arten von Varianten bzw.
Polymorphismen Assoziationsuntersuchungen zugrunde gelegt werden. Am gängigsten ist jedoch die Analyse von Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs), da sie die häufigsten genetischen Varianten zwischen Individuen und Populationen darstellen. Es handelt sich um biallelische DNA-Varianten, die durch einfache Basensubstitutionen bzw. Punktmutationen gekennzeichnet sind.
2.5 Die Gene TRAR1, TRAR4 und TRAR5 – Kandidatengene für affektive Störungen 2.5.1 Trace Amine und affektive Störungen
Neben den klassischen biogenen Aminen Noradrenalin, Dopamin und Serotonin, die in ihrer Aufgabe als Neurotransmitter hinsichtlich Funktion und Wirkweise bereits in hohem Maße erforscht sind, gibt es auch eine als Trace Amine bezeichnete Gruppe biogener Amine. Hierzu zählen Tyramin, ß-Phenylethylamin (ß-PEA), Tryptamin und Octopamin, die in geringer Konzentration (etwa im nanomolaren Bereich) in Geweben von Säugern, darunter auch im ZNS, vorkommen und in ihrer Struktur und ihrem Metabolismus den bekannten Katecholaminen ähneln.
Die Synthese der Trace Amine erfolgt über die L-aromatische Aminosäure-Decarboxylase (Dopa-Decarboxylase) aus den jeweiligen Aminosäure-Vorläufern (L-Tyrosin, L-Phenylalanin und L-Tryptophan) bzw. für Octopamin durch einen zusätzlichen Umwandlungsschritt mittels der Dopamin-ß-Hydroxlase. Der Abbau erfolgt für ß-PEA vorzugsweise über die Monoaminoxidase B (MAO B), für Tyramin und Octopamin neben MAO B auch über MAO A und für Tyramin maßgeblich über MAO A (Boulton et Dyck, 1974; Tallman et al., 1976). Neben diesem Hauptweg der Metabolisierung können Trace Amine auch über die unspezifische N-
Methyltransferase und die Phenylethanolamin-N-Methyltransferase in die entprechenden sekundären Amine (z.B. N-Methylphenylethylamin, N-Methyltyramin, Synephrin, N- Methyltryptamin) umgewandelt werden, die ähnliche Wirkungen auf TRAR1 (s.u.) wie ihre Vorläufer haben (Lindemann und Hoener, 2005).
Bislang wurde Trace Aminen eine Rolle als sog. falsche Transmitter zugeschrieben (Mc Geer et al., 1979), die lediglich indirekt über die Entleerung von Speichervesikeln, Hemmung der Wiederaufnahme und erhöhten Ausstrom der klassischen endogenen Amine eine modulatorische Wirkung entfalten. Inzwischen weiß man aber aus pharmakologischen Tests, dass Trace Amine durchaus als echte Transmitter anzusehen sind (Borowsky et al., 2001).
Bei einigen neuropsychiatrischen Erkrankungen wie den affektiven Störungen, der Schizophrenie und dem Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitäts-Syndrom wurden veränderte Urinspiegel von Trace Aminen gefunden (Usdin et Sandler, 1976; Boulton et al., 1988; Saaverda, 1989;
Merikangas et al., 1995; Janssen et al., 1999). Darüber hinaus soll ein funktioneller Mangel an ß- PEA zur Ausbildung einer depressiven Symptomatik führen (Sabelli und Mosnaim, 1974). Auf der anderen Seite wurde ein Zusammenhang zwischen erhöhten ß-PEA-Werten im Urin und manischen Phasen bei bipolarer affektiver Störung beschrieben (Linnoila et al., 1983). Auch pharmakologische Studien deuten auf eine mögliche Beteiligung von Trace Aminen am Entstehungsprozess von affektiven Störungen hin. So haben Antidepressiva wie Selegilin, die als Inhibitoren der MAO-B agieren, einen beträchtlichen Anstieg des ß-PEA-Spiegels aufgrund verzögerten Abbaus zur Folge (Juorio et al., 1988; Berry et al., 1994). Entsprechend zeigen auch MAO-B knock-out-Mäuse einen 8fachen Anstieg der Konzentration von ß-PEA sowohl im Urin als auch im Hirn. Verhaltensbiologisch zeigen diese Mäuse eine im Vergleich zu Wildtypmäusen signifikant erhöhte stressinduzierte Hyperaktivität im erzwungenen Schwimmtest, die auch in einem nach Wochen wiederholten Test persistierte (Grimbsy et al., 1995). Auffälligkeiten des Trace Amin-Stoffwechsels wurden auch bei schizophrenen Störungen beobachtet. So wurde ein erhöhter ß-PEA-Spiegel im Urin von Patienten gefunden (Davis et al., 1991; O`Reilly et al., 1991). Des Weiteren haben erhöhte zentralnervöse Spiegel von ß-PEA bei Affen Effekte mit verstärktem stereotypen Verhalten sowie erhöhter lokomotorischer Aktivität gezeigt, ähnlich den Auswirkungen von psychomotorisch stimulierenden Drogen wie Kokain oder Amphetamin (Bergman et al., 2001).
Borowsky et al. (2001) gelang die Identifikation der humanen Trace-Amin-Rezeptoren TRAR1, TRAR4 und TRAR5, die im hohen Maß homologe Sequenzen aufweisen und einer Unterfamilie von Rhodopsin G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCR) angehören, die Verwandtschaft zu 5- HT-, Dopamin- und Noradrenalin-Rezeptoren aufweist. Es handelt sich dabei um integrale Membranproteine. Funktionell ergaben pharmakologische Tests mit verschiedenen Bioaminen für TRAR1 die stärkste Aktivierung durch die Agonisten ß-PEA und Tyramin, worin sich Vermutungen begründen, dass Trace Amine echte Neurotransmitter sind. Die gewebespezifische Expression der drei Trace-Amin-Rezeptoren wurde mittels quantitativer RT-PCR untersucht.
Neben peripheren Geweben ließ sich die mRNA der Trace-Amin-Rezeptoren insbesondere in bestimmten Arealen des ZNS nachweisen, darunter in der Amygdala und dem Hippocampus;
Bereiche, die mit kognitiven Funktionen, Emotion und Affekt in Verbindung gebracht werden.
Die für TRAR1, TRAR4 und TRAR5 kodierenden Gene, die jeweils aus einem Exon bestehen, befinden sich in einem umschriebenen genomischen Bereich auf Chromosom 6q23.2 (Abb. 2) Innerhalb dieses TRAR-Clusters sind zudem TRAR3, das nur in der Niere (Borowsky et al., 2001) sowie in der Glandula pituitaria und im Skelettmuskel (Vanti et al., 2003) exprimiert wird, und die zur GPCR-Subfamilie gehörenden Pseudogene GPR57, GPR58, 5-HT4Ψ und PNR lokalisiert.
2.5.2 Chromosomale Region 6q23 – Bedeutung für bipolar affektive Störungen
Bei der chromosomalen Region 6q23 handelt es sich um eine Kopplungsregion für bipolare affektive Störungen. Bei einem Genom-Scan (genomweite Kopplungsanalyse) an 75 Familien mit bipolar affektiver Störung zeigten sich starke Kopplungshinweise bei STR-Marker D6S262 mit einem NPL-Score von 3,75 (Cichon et al., 2001). D6S262 ist etwa 1 Mb proximal vom TRAR-Cluster auf Chromosom 6q23.2 lokalisiert. Darüber hinaus erhielten Ewald et al. (2002) bei ihrem Genom-Scan an zwei Multiplex-Familien mit bipolar affektiver Störung einen NPL- Score von 2,49 für D6S1009 und Rice et al. (1997) fanden bei demselben STR-Marker einen LOD-Score von 2,08 bei 97 Familien mit bipolar affektiven Störungen. DS61009 ist etwa 5 Mb distal vom TRAR-Cluster kartiert. Interessanterweise ergeben sich auch bei schizophrenen Störungen in unabhängigen Kollektiven Kopplungshinweise in dieser Region. So liegt das TRAR- Cluster innerhalb SCZD5 (MIM 603175), ein Suszeptibilitätslocus für schizophrene Störungen, der durch das Humane Gene Nomenclature Comittee gelistet wird.
Abb. 2 Genomische Struktur und Lokalisation genetischer Varianten in den humanen Trace-Amin-Rezeptor-Genen (TRARs) in der chromosomalen Region 6q23.2
8 kb
31 kb 27 kb
23 kb
rs4897595 rs8192617 rs8192618 rs8192619 rs8192620
TRAR3 14 kb
1 Mb 16.5 kb
GPR-58
GPR-57 TRAR1
TRAR4 TRAR5
rs8192621
1020 bp 5-HT4Ψ
rs7772821 rs8192625 rs8192624 rs8192622
1029 bp 1038 bp rs8192627
rs8192626
Größe in bp D6S262
3 Zielsetzung und Fragestellung
Bei den Genen TRAR1, TRAR4 und TRAR5 handelt es sich sowohl unter funktionellen wie auch unter positionellen Aspekten um geeignete Kandidatengene für bipolar affektive Störungen. Sie sind in einer Suszeptibilitätsregion für bipolar affektive Störungen lokalisiert und verschiedene funktionelle Untersuchungen deuten auf eine Beteiligung von Trace Aminen am Entstehungsprozess bipolar affektiver Erkrankung hin. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, den möglichen Beitrag dieser Gene an der Ätiologie von bipolar affektiven Störungen zu untersuchen. Hierfür wurden fünf von zwölf zuvor identifizierten Varianten (Freudenberg-Hua et al. 2003) unter funktionellen Gesichtspunkten ausgewählt und einer familienbasierten Assoziationsstudie zugeführt. Insgesamt wurden 118 Trios mit bipolar affektiven Störungen untersucht. Im Einzelnen wurden rs8192620 in TRAR1, rs8192624 (V265I), rs8192625 (C291Y) und rs7772821 in TRAR4 und rs8192627 (D328A) in TRAR5 analysiert. Um die positiven Ergebnisse, die sich bei den Untersuchungen im Bereich von TRAR4 im Trio-Kollektiv zeigten, zu replizieren, wurden die drei SNPs in TRAR4 anschließend in einer unabhängigen Stichprobe analysiert, die 263 Patienten mit bipolar affektiver Störung und 430 Kontrollprobanden umfasste.
4 Material und Methoden 4.1 Patientenkollektiv
Den molekulargenetischen Untersuchungen vorliegender Arbeit wurde insgesamt die DNA von 1047 Personen, allesamt deutscher Abstammung, zugrunde gelegt. Ein initiales Kollektiv für die Assoziationsuntersuchung im Bereich von TRAR1, TRAR4 und TRAR5 bestand aus 118 Eltern- Kind-Trios (Indexpatient mit bipolar affektiver Störung, durchschnittliches Ersterkrankungsalter 23 Jahre, SA 7 Jahre). Da sich dabei positive Ergebnisse für Varianten im Bereich von TRAR4 ergaben, wurde anschließend ein Replikationskollektiv untersucht, das 263 Personen mit bipolar affektiver Störung (durchschnittliches Ersterkrankungsalter 27 Jahre, SA 11 Jahre) und 430 Kontrollpersonen umfasste. Die Rekrutierung der unverwandten Patientenkollektive erfolgte durch die Psychiatrische Klinik des Universitätsklinikums Bonn und das Zentralinstitut für Seelische Gesundheit in Mannheim. Die Diagnosestellung nach den DSM-IV Kriterien (American Psychiatric Association, 1994) erfolgte auf der Basis des standardisierten Interviews SCID-I (First et al., 1996), der OPCRIT-Dokumentation (McGuffin et al., 1991) und einer Aufarbeitung der Krankenakten.
Alle untersuchten Patienten und Kontrollprobanden wurden vor der Blutentnahme über die geplanten molekulargenetischen Untersuchungen informiert. Ihre schriftliche Einverständniserklärung liegt vor. Da es sich um Untersuchungen am Menschen handelt, wurde vor Beginn der Studie ein entsprechendes Votum bei der Bonner Ethikkommission eingeholt (Lfd. Nr.: 216/00).
4.2 Geräte
Folgende Geräte fanden bei vorliegender Arbeit Verwendung.
Autoklav Varioklav Dampfsterilisator Typ 500 EP-Z, H+P Labortechnik, Oberschleißheim
Elektrophoresekammern JSB-96, Shelton Scientific, Shelton, Conneticut Multigel-Long Typ G 47 (inkl. Glasplatten mit 1mm Spacern, Silikonabdichtungen, Kämmen, Klammern), Biometra, Göttingen
Eissystem AF-0 ASB 0600, Scotsman Ice Systems, Mailand Gel-Dokumentations-System Digit-Store Duo, Intas, Göttingen
Geltrockner Slab Gel Dryer, Modell SE1160, Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, Kalifornien
Magnetrührer IKA MAG RET-G, Staufen i.Br.
IKA big squid (star), Staufen i.Br.
Mehrkanalpipetten Pre Cision, Biozym, Hess. Olendorf Einkanalpipetten Proline, BioHit, Rosbach
Pipetman, Gilson, Middelton, Wisconsin Eppendorf Reference, Eppendorf, Hamburg Eppendorf Research, Eppendorf, Hamburg Photometer Gene Quant II, Pharmacia Biotech, Cambridge Thermocycler PTC-200 Peltier Thermal Cycler, MJ Research,
Watertown, Massachusetts
PTC-225 Peltier Thermal Cycler, MJ Research, Watertown, Massachusetts
GeneAmp PCR-System 9600, PerkinElmer, Boston, Massachusetts
Schüttler 3005, Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel Spannungsgeräte Gene Power Supply 200/400, Pharmacia Biotech,
Freiburg
Electrophoresis Power Supply PS 9009, Life Technologies Gibco BRL, Eggenstein Electrophoresis Power Supply ST 606 T, Life Technologies Gibco BRL, Eggenstein Trockenschrank T 20, Heraeus, Hanau
Vortexer Vortex-Genie 2, Scientific Industries, New York Vakuumpumpe Membrane-Vakuumpumpe ME2, Vacuubrand,
Wertheim
Waage SBC 52, Scaltec, Heiligenstadt
Wasserbad 1004, Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel Zentrifugen Megafuge 1.0, Heraeus, Osterode
Megafuge 1.0 R, Heraeus, Osterode Centrifuge 5415 D, Eppendorf, Hamburg
4.3 Chemikalien
Folgende Chemikalien fanden bei vorliegender Arbeit Anwendung.
Tris ICN Biomedicals, Aurora, Ohio
Agarose Life Technologies Gibco BRL, Karlsruhe Ammoniumchlorid, Bromphenolblau, Essigsäure,
Ethanol, Extran, Formaldehyd, Formamid,
Kaliumhydrogencarbonat, Natriumchlorid, Natrium- EDTA, Natriumhydroxid, Salpetersäure, Salzsäure, Silbernitrat
Merck, Darmstadt
Ficoll 400 Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden Isopropanol Riedel de Haen, Seelze
Ethidiumbromid, SDS, Tris Serva, Heidelberg
Ammoniumpersulfat, Dimethylsulfoxid, TEMED Sigma-Aldrich Chemie, Deisenhofen 40% Acrylamid/Bis Solution, 29:1 (3,3% C) BioRad Laboratories, Hercules, California 10 x TBE-Puffer Invitrogen Life Technologies, Karlsruhe LiChrosolv (Wasser für Chromatographie) Merck, Darmstadt
4.4 Enzyme und Längenstandards
Folgende Enzyme und Längenstandards fanden bei vorliegender Arbeit Anwendung.
Biotherm DNA Polymerase
[sowie 10 x Puffer Biotherm ohne MgCl2 und mit 15mM MgCl2]
Genecraft, Lüdinghausen
AluI [sowie Puffer Tango]
Bst1107I (SnaI) [sowie Puffer 0+]
Csp6I (RsaI) [sowie Puffer B+] Konz. 10 U / µl KpnI [sowie Puffer KpnI+]
VspI [sowie Puffer 0]
MBI Fermentas, St.Leon-Rot
Pronase Boehringer Mannheim, Mannheim
100 bp DNA-Leiter Genecraft, Lüdinghausen 1 kb DNA-Leiter MBI Fermentas, St.Leon-Rot
4.5 Sonstige Ingredienzien und Materialien
An weiteren Ingredienzien und Materialien wurden zur Durchführung vorliegender Arbeit verwendet:
Magnesiumchlorid (25mM) Genecraft, Lüdinghausen DNA Polymerisationsmix (dNTPs) Genecraft, Lüdinghausen
GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit Amersham Biosciences, Buckinghamshire Reaktionsgefäße
Vol. 1,0; 2,0 ml
Eppendorf, Hamburg
Mikrotiterplatten 6509 Thermowell 96 Well Plate, Costar, Niederlande Folien für Mikrotiterplatten Adhesive Plate Seals, Peqlab, Erlangen
GB 002 Gel Blotting Papier Schleicher und Schuell, Dassel
4.6 Synthetische Oligonukleotide (Primer)
Einige der für den Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus verwendeten Primer (s. Tab. 2) wurden jeweils mit einer im Vergleich zur komplementären Zielsequenz modifizierten Base ausgewählt (mismatch), um so im Verlauf der Polymerasenkettenreaktion ein Produkt anzureichern, welches in seiner Basenabfolge Schnittstellen bestimmter Restriktionsenzyme beinhaltet. Alle Primer wurden auf ihre Sequenzspezifität innerhalb des humanen Genoms mit Hilfe des Programms Ensembl Blast Search (http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/blastview) überprüft. Mit der Synthese wurden die Firmen Sigma-ARK (Darmstadt) und Quiagen (Hilden) beauftragt.
Tab. 2 Bezeichnung und chromosomale Lokalisation der Primerpaare zur Fragmentamplifizierung zwecks RFLP-Analyse (X* = Basenaustausch).
Position (bp) auf Chr. 6 1)
Primerbezeichnung Primersequenz
132.916.466- 132.916.487
rs8192627-F 5` TCCTTGGTTTAGGAAAGCCATA 3`
132.916.673- 132.916.694
rs8192627-R 5` CCTGTGACCTTTTTCCTGGTTA 3`
132.933.851- 132.933.872
rs8192624-F 5` ATACTGGTAGCAAGACAGAATC-3`
132.933.947- 132.933.971
rs8192624-R 5` GGTAACCATGAAATCATAAATGG*TA 3`
132.933.851- 132.933.872
rs8192625-F 5` ATACTGGTAGCAAGACAGAATC 3`
132.934.026- 132.934.049
rs8192625-R 5` CACCAACAGCAAATCTCATAAG*TA 3`
132.934.149- 132.934.169
rs7772821-F 5` GAACAGTTCAGCAACCATGAA 3`
132.934.199- 132.934.222
rs7772821-R 5` AAGGTATCCTGAACTTCGTG*TAT 3`
133.007.947- 133.007.971
rs8192620-F 5` AGTTCAAGTAGCCAAACCAAATT*AA 3`
133.008.142- 133.008.163
rs8192620-R 5` AGTGATGCCAATCAGAAGCTCC 3`
1) Stand: UCSC Mai 2004 (Build 35)
Tab. 3 Bezeichnung und chromosomale Lokalisation der Primerpaare zur Fragmentamplifizierung zwecks Sequenzanalyse.
Position (bp) auf Chr. 6 1)
Primerbezeichnung Primersequenz
132.933.037- 132.933.058
TRAR4-F 5`-TGGCATCCTGGTGAATATGTGT-3`
132.933.648- 132.933.668
TRAR4-FF 5`-TGCTGTGTTCTACACAGGTGT-3`
132.933.709- 132.933.730
TRAR4-R 5`-CGGTCTGACAACCTCCTATACA-3`
132.934.320- 132.934.341
TRAR4-RR 5`-GTGCACATCTTAACAAGACTGA-3`
1) Stand: UCSC Mai 2004 (Build 35)
4.7 Isolierung und Aufbereitung humaner genomischer DNA 4.7.1 Isolierung und Reinigung der DNA
Hochmolekulare menschliche DNA wurde aus kernhaltigen Leukozyten von frischem Blut, dem EDTA als Antikoagulans zugesetzt wurde, isoliert. Es wurde die Aussalzmethode nach Miller et al. (1988) angewendet: 10 ml Frischblut wurden mit 30 ml Frischblutlysispuffer versetzt, mehrfach invertiert, 15 min auf Eis lysiert und 15 min bei 4°C und 1500 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert. Das Leukozytenpellet wurde zweimal vorsichtig mit je 5 ml Kernlysispuffer gewaschen, in 10 ml Kernlysispuffer resuspendiert, mit 660 µl 10% SDS und 500 µl Pronase (20 mg/ml) versetzt und über Nacht bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Es wurden 3,2 ml gesättigte NaCl-Lösung (6 M) zugegeben. Die Reaktionsgefäße wurden kräftig geschüttelt, 10 min bei 4000 rpm und RT zentrifugiert, mehrmals invertiert und erneut 10 min bei 4000 rpm und RT zentrifugiert. Das Proteinpellet wurde verworfen. Der Überstand wurde mit 1 Vol 2-Propanol versetzt und leicht geschwenkt, bis die DNA ausfiel. Die präzipitierte DNA wurde mit einem sauberen Glashaken aus der Lösung „gefischt“ und nach Waschen in 70%
Ethanol in 400 µl TE-4 (pH 8,0) gelöst.
Lösungen, die Verwendung fanden:
Frischblutlysispuffer 155 mM NH4Cl 10 mM KHCO3
0,1 mM EDTA (pH 7,0) Kernlysispuffer 10 mM Tris/HCl (pH 8,0)
400 mM NaCl 2 mM EDTA (pH 8,0) TE-4 10 mM Tris/HCl (pH 8,0)
0,1 mM EDTA (pH 8,0)
4.7.2 Photometrische Konzentrationsbestimmung und Überprüfung der Reinheit isolierter genomischer DNA
Die Bestimmung der Konzentration und Reinheit der isolierten DNA erfolgte durch spektrophotometrische Messung im Bereich von 260 nm und 280 nm. DNA weist bei 260 nm ihr Absorptionsmaximum auf. Proteine, Ethanol sowie in der Lösung verbliebenes NaCl hingegen absorbieren bei 280 nm.
Aus der optischen Dichte bei 260 nm lässt sich mit Hilfe des Lambert-Beerschen-Gesetzes die DNA-Konzentration ermitteln.
Der Quotient der Absorption bei 260 nm / 280 nm liefert Aussagen über die Reinheit der isolierten DNA. Werte zwischen 1,7 und 1,9 zeigen an, dass die DNA in sehr reiner Form vorliegt. Kleinere Quotienten sprechen für verunreinigte DNA, eine erneute Fällung sollte erfolgen. Ein Quotient über 1,9 weist auf RNA-Rückstände hin, so dass die DNA-Konzentration geringer als der ermittelte Wert ist.
4.8 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Bei der von Mullis und Faloona 1987 etablierten Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction [PCR]) handelt es sich um ein Verfahren, das die enzymatische Vervielfältigung von DNA ermöglicht. Unter Kenntnis der flankierenden DNA-Sequenzen kann ein spezifischer DNA- Abschnitt, der zunächst in Form nur einer oder weniger Kopien vorliegt, selektiv in vitro millionenfach amplifiziert werden.
Die zu amplifizierende Ausgangs-DNA, die zunächst als Doppelstrang vorliegt, wird durch Hitzeeinwirkung denaturiert und somit in einzelsträngige DNA überführt. Diese Einzelstränge dienen als Matrize für die Synthese neuer, komplementärer DNA-Stränge. Als Startmoleküle für die DNA-Synthese werden sog. Primer verwendet. Diese sind synthetische Oligomoleküle, die die zu vervielfältigende DNA-Sequenz flankieren und sich demnach komplementär an die entsprechenden Zielstellen der DNA anlagern. Die eigentliche Elongation der DNA erfolgt dann durch die thermophile DNA-Polymerase von Thermus aquaticus (Taq), indem den Oligonukleotiden zur Matrize komplementäre Nukleotidbausteine angehängt werden. Die Synthese läuft hierbei immer in 5`Æ3`-Richtung, ausgehend von den 3`-OH-Enden der Primer.
Ablauf der PCR im zyklischen Wechsel von drei Reaktionsschritten:
1. Denaturierung der DNA bei 90 - 95°C
2. Hybridisierung der Primer bei 45 - 68°C (Annealing) 3. Elongation des Komplementärstranges durch Taq bei 72°C
Da mit jedem Durchlauf sowohl die ursprüngliche DNA-Matrize als auch die bereits synthetisierten DNA-Kopien amplifiziert werden, resultiert eine exponentielle Vermehrung des PCR-Produktes. So erzielt man mit einem in der Regel 30-40 Zyklen umfassenden Programm eine Anreicherung um einen Faktor von 106 bis 107 innerhalb einer Zeitspanne von ca. 2 bis 3 Stunden.
Die Qualität des PCR-Produktes hängt insbesondere von der Spezifität der Primer ab, deren Basensequenz im menschlichen Genom einmalig sein sollte. Außerdem ist die Annealing- Temperatur entscheidend. Je höher diese Temperatur, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass der Primer an die exakt komplementäre Basensequenz der Matrize bindet. Unspezifische Bindungen hingegen hat die Amplifikation zusätzlicher unerwünschter DNA-Abschnitte zur Folge. Zu hohe Annealing-Temperaturen wiederum hemmen die Hybridisierung der Primermoleküle mit der DNA-Matrize, das Ausmaß an Amplifikation bleibt unzureichend.
Als Ausgangsmaterial (Template) für die PCR wurde genomische DNA der in die Assoziationsuntersuchungen einbezogenen Personen herangezogen. Die Reaktionsansätze wurden für ein Volumen von 20 µl berechnet. Als Basiskomponenten wurden folgende Reagenzien verwendet:
H2O deionisiert und autoklaviert 10 x Puffer 160 mM (NH4)2SO4
670 mM Tris-HCl (pH 8,8) 0,1% Tween20
inkl. und exkl. 15 mM MgCl2
Nukleotidgemisch 10 mM (= unverdünnt) und 1,25 mM (= verdünnt) je dNTP
Magnesiumchlorid 25 mM
Primer 10 pmol/µl
DMSO
Taq-DNA-Polymerase 5 U/µl
Genomische DNA 20 ng/µl
Die PCR-Ansätze waren wie folgt zusammengesetzt:
PCR-Ansatz für die Untersuchung der SNPs rs8192624 und rs8192625
Mengenangaben (für 1x) Endkonzentrationen PCR-Mix 2 µl 10 x PCR-Puffer inkl.MgCl2
3,2 µl dNTPs (verdünnt) 0,8 µl Vorwärtsprimer 0,8 µl Rückwärtsprimer 1 µl DMSO
0,032 µl Taq-DNA-Polymerase H2O ad 20 µl
1x
0,2 mM je dNTP 0,4 pmol/µl 0,4 pmol/µl 0,008 U/µl
Genomische DNA 2,0 µl 2 ng/µl
Endvolumen 20,0 µl
PCR-Ansatz für die Untersuchung der SNPs rs8192620, rs7772821 und rs8192627
Mengenangaben (für 1x) Endkonzentrationen PCR-Mix 2 µl 10 x PCR-Puffer
2 µl dNTPs (verdünnt) 1,2 µl MgCl2
1 µl Vorwärtsprimer 1 µl Rückwärtsprimer
0,13 µl Taq-DNA-Polymerase H2O ad 20 µl
1x
0,125 mM je dNTP 1,5 mM
0,5 pmol/µl 0,5 pmol/µl 0,0325 U/µl
Genomische DNA 2,7 µl 2,7 ng/µl
Endvolumen 20,0 µl
Alle Komponenten des PCR-Mixes wurden auf Eis zusammenpipettiert und gemischt. Je 2 µl der genomischen DNA wurden in die entsprechenden Reaktionsgefäße vorgelegt und mit jeweils 18 µl des Mixes versetzt sowie bei ca. 800 rpm zentrifugiert. Anschließend wurde die PCR im Thermocycler mit folgenden Programmen, die zuvor im Rahmen einer Optimierung empirisch ermittelt wurden, durchgeführt.
PCR-Programm für die Untersuchung der SNPs rs8192624 und rs8192625
5 min 94°C initialer Denaturierungsschritt 40 Zyklen
40 sec 40 sec 30 sec
94°C 58°C 72°C
Denaturierung Primer-Annealing Primer-Verlängerung 5 min 72°C finaler Verlängerungsschritt
PCR-Programm für die Untersuchung der SNPs rs8192620, rs7772821 und rs8192627 – Touchdown-Programm (in 1°C-Schritten)
3 min 94°C initialer Denaturierungsschritt
27 Zyklen
30 sec 30 sec 30 sec
94°C
63°C bis 55°C (je 3 Zyklen pro Stufe) 72°C
Denaturierung Primer-Annealing Primer-Verlängerung 10 min 72°C finaler Verlängerungsschritt
PCR-Ansatz für Templates zwecks Sequenzierung
Mengenangaben (für 1x) Endkonzentrationen PCR-Mix 4 µl 10 x PCR-Puffer
0,2 µl dNTPs (unverdünnt) 2,4 µl MgCl2
1 µl Vorwärtsprimer 1 µl Rückwärtsprimer 0,5 µl Taq-DNA-Polymerase H2O ad 40 µl
1x
0,05 mM je dNTP 1,5 mM
0,25 pmol/µl 0,25 pmol/µl 0,0625 U/µl
Genomische DNA 4 µl 2 ng/µl
Endvolumen 40,0 µl
PCR-Programm für Templates zwecks Sequenzierung
5 min 94°C initialer Denaturierungsschritt
35 Zyklen
30 sec 30 sec 90 sec
94°C 58°C 72°C
Denaturierung Primer-Annealing Primer-Verlängerung 5 min 72°C finaler Verlängerungsschritt
4.9 Agarose-Gelelektrophorese
Die Qualität und Quantität der PCR-Reaktion wurde auf einem 1,5%igen Agarosegel überprüft.
Hierbei fanden folgende Reagenzien Anwendung:
10 x TBE-Puffer 1M Tris 0,9M Borsäure 0,01M EDTA (pH 8,0) Ethidiumbromid 10 mg/ml in aqua dest.
Gel-Ladepuffer (BPB-Puffer) 10 x TBE
20% Ficoll
0,1% Bromphenolblau (BPB) Längenstandard 100 bp DNA-Leiter
1 kb DNA-Leiter
Für ein 1,5%iges Agarosegel wurden 3 g Agarose in 200 ml 1 x TBE-Puffer durch Aufkochen vollständig gelöst, unter Rühren auf 50°C abgekühlt und Ethidiumbromid (1 µg/ml Gel) zugesetzt. Die Gellösung wurde in einen Gelträger gegossen, in den Kämme eingesetzt waren, und bis zum Erstarren horizontal gelagert. Nach Entfernen der Kämme wurde das Gel in die mit 1 x TBE gefüllte Laufkammer (JSB-96, Shelton Scientific) gelegt. Je 5 µl der PCR-Produkte wurden mit der gleichen Menge Probenpuffer gemischt und in die Geltaschen pipettiert. In eine weitere Tasche wurden 600 ng der 100 bp DNA-Leiter als Längenstandard aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte bei 121 V.
Agarose bildet nach dem Erstarren ein Netzwerk, in dem die verschieden großen, aufgrund der Phosphatgruppen negativ geladenen, DNA-Fragmente unterschiedlich schnell durch die Gelporen zur Anode wandern (Molekularsiebeffekt). Die Wanderungsgeschwindigkeit linearer DNA im elektrischen Feld ist von der angelegten Spannung, der Größe der DNA-Fragmente und der Agarosekonzentration abhängig. In der Gelmatrix befindliches Ethidiumbromid, ein unter UV- Bestrahlung fluoreszierender Farbstoff, interkaliert zwischen die Basenpaare und ermöglicht so die Visualisierung des PCR-Produktes. Nach der Elektrophorese wurde das Gel daher mit UV- Licht der Wellenlänge 366 nm durchleuchtet, so dass die DNA-Fragmente als orangefarbig leuchtende spezifische Banden erkennbar wurden. Durch Vergleich der Banden mit dem Längenstandard konnte beurteilt werden, ob das DNA-Fragment der erwarteten Größe entsprach.
4.10 Genotypisierung durch Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus (RFLP)- Analyse
Die beschriebenen DNA-Sequenzvarianten in den TRAR-Genen sollten hinsichtlich ihrer Bedeutung für die Entstehung von bipolar affektiven Störungen charakterisiert werden. Zu diesem Zweck wurde ein aussagekräftiges Probandenkollektiv genotypisiert. Als effiziente und robuste Methode zur Genotypisierung bieten sich dabei PCR-basierte RFLP-Assays an. Hierbei wird das Fragment, welches die polymorphe Region enthält, mittels PCR amplifiziert und das Produkt im Anschluss mit einer Restriktionsendonuklease geschnitten, in deren
Erkennungssequenz die variable Stelle liegt. Je nach Vorhandensein der verschiedenen Allele variiert das Restriktionsmuster, d.h. es finden sich Restriktionsfragmente unterschiedlicher Länge, die nach Auftrennung auf einem Agarose- oder Polyacrylamidgel die exakte Bestimmung des Genotyps der betreffenden Person zulassen.
4.10.1 Auswahl geeigneter Restriktionsendonukleasen
Zur Auswahl geeigneter Restriktionsenzyme wurde das Programm Restriction Enzyme Analysis (http://darwin.bio.geneseo.edu/~yin/WebGene/) verwendet. Für alle fünf Varianten wurden jeweils beide möglichen Allele und ein etwa 20 bp langer flankierender Genabschnitt in den Sequenzeditor eingegeben. Anschließend konnte ein simulierter Restriktionsverdau mit einer großen Anzahl bekannter Restriktionsendonukleasen durchgeführt werden. Hierdurch konnten folgende RFLP-Assays etabliert werden:
rs8192627: Dieser SNP enthält die Erkennungssequenz für das Schnittenzym AluI,
5` GGTAC↓C 3`
3` C↓CATGG 5`
rs8192624: Durch Gebrauch eines modifizierten Rückwärtsprimers wird die Schnittstelle für das Restriktionsenzym KpnI geschaffen,
rs8192625: Ein modifizierter Rückwärtsprimer ermöglicht die Erkennungssequenz für das Enzym Csp6I,
5` GTA↓TAC 3`
3` CAT↓ATG 5`
rs7772821: Die Schnittstelle für die Endonuklease Bst1107I ergibt sich durch Einsatz eines modifizierten Rückwärtsprimers,
5`AT↓TAAT 3`
3` TAAT↓TA 5`
rs8192620: Durch Verwendung eines modifizierten Rückwärtsprimers entsteht die Angriffssequenz für das Enzym VspI,
5` AG↓CT 3`
3` TC↓GA 5`
5` G↓TAC 3`
3` CAT↓G 5`
4.10.2 Verdau von PCR-Produkten
Die Ansätze für den Restriktionsverdau der PCR-Produkte bestanden aus folgenden Komponenten (Eis):
Mix Tango / KpnI+ / B+ / 0+ / 0 –Puffer 1,5 µl
Restriktionsendonuklease AluI / KpnI / Csp6I / Bst1107I / VspI 1 / 4 / 1,5 / 5 / 2 U deionisiertes und autoklaviertes H2O ad 15 µl
DNA ungereinigtes PCR-Produkt 3 µl
Die Ansätze wurden 4 h bei 37°C inkubiert, der Temperatur, bei der die maximale Aktivität der gewählten Enzyme gewährleistet ist.
4.10.3 Vorbereitung nativer 10%iger Polyacrylamidgele für RFLP-Assays Verwendete Reagenzien:
Gel-Stammlösung (Acrylamid : Bisacrylamid = 29 : 1) in 1 x TBE:
125 ml Acrylamid/Bisacrylamid-Lösung 50 ml 10 x TBE-Puffer
500 µl TEMED ad 500 ml aqua dest.
10%ige APS-Lösung (Ammoniumpersulfat) 200 µl
Für die RFLP-Analyse wurden Polyacrylamidgele der Größe 110 x 120 x 1 mm angefertigt. Die Glasplatten wurden mit Wasser und Extran und anschließend mit 70%igem Ethanol gründlich gereinigt. Nun wurde eine U-förmige Silikonabdichtung um die Spacer einer Platte herum positioniert. Nach Auflegen eines Gegenstücks fixierte man die Platten samt Gummi mit vier Klammern. Etwa 20 ml Gel-Stammlösung wurden mit 200 µl 10%iger APS-Lösung gemischt.
APS und TEMED fungieren als Startreagenzien der radikalischen Polymerisation. Die Lösung wurde in den Spalt zwischen den beiden Glasplatten bis zur Oberkante der kleinen Platte gegossen. Danach wurde ein Kamm für 24 Taschen eingesetzt und mit einer Klammer fixiert. Die Polymerisation war innerhalb von 30 min abgeschlossen und das Gel gebrauchsfertig.
4.10.4 Gelelektrophorese
Die Klammern und Gummidichtungen an den Glasplatten wurden entfernt, das Gel in die Elektrophoresekammer (Multigel-Long, Biometra) eingespannt und die obere und untere Pufferkammer mit 1 x TBE gefüllt. Der Kamm wurde vorsichtig entfernt und die Geltaschen mit einer Pipette ausgespült, um evtl. vorhandene Polyacrylamidreste zu beseitigen.
Je 5 µl Restriktionsprodukt der Proben wurde mit 5 µl Probenpuffer gemischt und auf das Polyacrylamidgel aufgetragen, zudem eine 100 bp-DNA-Leiter, die zum einen als Längenstandard diente, zum anderen später eine fehlerfreie Zuordnung der Proben unter simultan gefärbten Gelen sicherstellte.
Die Elektrophorese erfolgte je nach erforderlicher Auftrennung ca. 1,0 bis 1,5 h bei 20 mA.
