(86) Internationale Anmeldenummer: PCT/DE97/02994

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Anmerkung: Innerhalb von neun Monaten nach der Bekanntmachung des Hinweises auf die Erteilung des europäischen Patents kann jedermann beim Europäischen Patentamt gegen das erteilte europäische Patent Einspruch einlegen.

European Patent Office Office européen des brevets (19)

0 946 855 B1

EP000946855B1

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EP 0 946 855 B1

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EUROPÄISCHE PATENTSCHRIFT

(45) Veröffentlichungstag und Bekanntmachung des Hinweises auf die Patenterteilung:

17.10.2001 Patentblatt 2001/42 (21) Anmeldenummer:97953660.4 (22) Anmeldetag:20.12.1997

(51) Int Cl.⁷:

G01B 9/04, G02B 21/16, G02B 21/34

(86) Internationale Anmeldenummer:

PCT/DE97/02994

(87) Internationale Veröffentlichungsnummer:

WO 98/28592 (02.07.1998 Gazette 1998/26) (54) VERFAHREN UND VORRICHTUNGEN ZUR DISTANZMESSUNG ZWISCHEN

OBJEKTSTRUKTUREN

METHOD AND DEVICES FOR MEASURING DISTANCES BETWEEN OBJECT STRUCTURES PROCEDE ET DISPOSITIFS DE TELEMETRIE ENTRE DES STRUCTURES D’OBJETS (84) Benannte Vertragsstaaten:

DE

(30) Priorität:23.12.1996 DE 19654824 03.02.1997 DE 29701663 U (43) Veröffentlichungstag der Anmeldung:

06.10.1999 Patentblatt 1999/40

(73) Patentinhaber:Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg

69117 Heidelberg (DE) (72) Erfinder:

• CREMER, Christoph D-69126 Heidelberg (DE)

• HAUSMANN, Michael D-67071 Ludwigshafen (DE)

• BRADL, Joachim

D-69198 Schriesheim (DE)

• RINKE, Bernd D-66459 Kirkel (DE)

(74) Vertreter:Rudolph, Ulrike, Dr.

Patentanwältin In der Schanz 10 69198 Schriesheim (DE) (56) Entgegenhaltungen:

DE-A- 3 226 407 DE-B- 2 613 582 US-A- 3 401 458 US-A- 4 650 335 US-A- 5 414 258

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Beschreibung

[0001] Die Erfindung betrifft ein Verfahren und Vor- richtungen für die Fernfeldmikroskopie und Flußfluoro- metrie zur geometrischen Distanzmessung zwischen fluorochrommarkierten Objektstrukturen, wobei die Di- stanzen geringer sein können als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion.

Stand der Technik :

[0002] Durch den Einsatz hochspezifischer Marker, wie z.B. DNA-Proben oder Protein-Sonden, ist es mög- lich, in biologischen (Mikro-)Objekten, insbesondere in Zellen, Zellkernen, Zellorganellen oder auf Chromoso- men (im Folgenden abkürzend auch Objekt genannt), nahezu beliebig kleine (Sub-)Strukturen zu markieren.

Solche Marker können Strukturen in Dimensionen von einigenµm (10^-6m) bis zu wenigen zehnµm (10^-9m) spezifisch darstellen. Üblicherweise werden in diese Marker Reportermoleküle eingebunden, die eine hohe Affinität zu entsprechenden Komplexverbindungen tragen, an die Fluorochrome, aber auch kolloidale Mikro- partikel (z.B. Gold) angebunden sind. Es können aber auch solche Fluorochrome/Komplexe direkt in die Mar- ker eingebaut werden. Das zur Verfügung stehende Farbemissionsspektrum der Fluorochrome reicht vom tief blauen über grün, rot bis in den infraroten Spektral- bereich. Ebenso können Fluorochrome verwendet werden, die sich nicht in ihrem Spektrum der Anregung und/

oder Fluoreszenzemission unterscheiden, sondern bei denen die Lebensdauer ihrer Fluoreszenzemission als Parameter zur Unterscheidung genutzt wird.

[0003] Letztere haben den Vorteil, daß wellenlängen- abhängige fokale Shifts nicht auftreten. Fluorochrome können auch ein unterschiedliches Emissionsspektrum haben und damit verschiedene spektrale Signatur besitzen, aber mit derselben Photonenenergie angeregt werden, z.B. durch Mehrphotonenprozesse. Auch in diesem Fall können wellenlängenabhängige fokale Shifts in der Anregung zwischen Fluorochromen verschiedener spektraler Signatur vermieden werden.

[0004] Die oben genannten, an spezifische (Sub-) Strukturen in biologischen Mikroobjekten gebundenen Fluorochrome werden im folgenden als Fluoreszenz- marker bezeichnet. Unter Fluoreszenz wird im folgenden jede Photonenwechselwirkung verstanden werden, bei der zwischen dem Anregungsspektrum und dem Emissionsspektrum eines Stoffes Unterschiede auftreten, die nicht auf monochromatische Absorption oder Streuung zuruckgeführt werden können. Dies schließt insbesondere auch Mehrphotonenwechselwirkungen ein, bei denen die Anregungswellenlängen größer sein können als die Emissionswellenlängen. Ferner wird hier der Begriff Fluoreszenz auch für die eng damit verwandten Phänomene der Lumineszenz, insbesondere die Phosphoreszenz verwendet. Dies schließt insbesondere längere mittlere Fluoreszenzlebensdauern ein, z.B.

Fluoreszenzlebensdauern im Bereich von bis zu mehreren oder vielen msec (Millisekunden). Im folgenden werden die eng verwandten Vorgänge der Luminizsenz, Phosphoreszenz und Fluoreszenz als gleichermaßen erfindungsrelevant angesehen. Stimmen Anregungs- spektrum und/oder Emissionspektrum und/oder die Fluoreszenzlebensdauern zweier Fluoreszenzmarkern überein, so haben sie hinsichtlich der jeweiligen Para- meter die gleiche spektrale Signatur. Unterscheiden sie sich in einem oder mehreren für die Messung relevanten Parametern, so habe sie unterschiedliche spektrale Si- gnatur.

[0005] Für die Detektion der Fluoreszenzmarker in ausgedehnten biologischen Objekten und für die quantitative Lokalisation bezüglich definierter Objektpunkte/

Objektstrukturen (Distanz- und Winkelmessungen) werden eine Reihe von lichtmikroskopischen Meßverfahren eingesetzt. Hierbei handelt es sich vor allem um (a) die Epifluoreszenzmikroskopie, (b) die Konfokale Laser- Scanning-Mikroskopie, (c) die Laser-Scanning Flußfluorometrie, (d) das Fernfeldmikroskopieverfahren des "Point-Spread-Function-Engineerings" und (e) die Wellenfeldmikroskopie.

a) Bei der Epifluoreszenzmikroskopie mit einem klassischen aufrechten oder inversen Epifluores- zenzmikroskop wird das biologische Objekt durch dasselbe Objektiv beleuchtet, durch das es auch detektiert wird. Anregungslicht und emittierte Fluo- reszenz werden durch entsprechende optische Fil- ter spektral diskrimiert und in verschiedenen Strah- lengängen geführt. Die erzielbare Auflösung, d.h.

die kleinste noch meßbare Distanz zwischen zwei punktförmigen Objektstrukturen, die mit Fluoro- chromen gleicher spektraler Signatur markiert sind, ist entweder durch das Abbe-Kriterium (= das Ma- ximum 0 Ordnung des Beugungsbildes eines Punk- tobjektes ist im 1. Minimum des Beugungsbildes eines zweiten Punktobjektes lokalisiert) oder durch die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion gegeben. Diese hängt von der jeweiligen Wellenlänge, der Numerischen Aper- tur des verwendeten Objektivs, sowie von den lokalen Brechzahlen der Objekte, des Einbettungs- mediums, der eventuell verwendeten Deckgläser und der eventuell eingesetzter Immersionsflüssig- keiten ab (Ihre Dimension kann bei hoher Numeri- scher Apertur geringer als die Wellenlänge des zur Anregung verwendeten Lichtes sein.)

b) Bei der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie wird im Gegensatz zur Epifluoreszenzmikroskopie ein Laser in das Objekt fokussiert und die Fluores- zenz konfokal detektiert. Zur Erzeugung eines dreidimensionalen Bildes wird das Objekt mit dem Fo- kuspunkt in allen drei Raumrichtungen (x, y, z) ab- gerastert. Die erzielbare Auflösung ist wie bei der Epifluoreszenzmikroskopie durch die Halbwerts-

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breite des Hauptmaximums der effektiven Punkt- bildfunktion gegeben und hangt von der jeweiligen Wellenlänge, der Numerischen Apertur des verwendeten Objektivs, sowie von den lokalen Brech- zahlen der Objekte, des Einbettungsmediums, der eventuell verwendeten Deckgläser und der eventuell eingesetzter Immersionsflüssigkeiten ab.

c) Bei der Laser-Scanning Flußfluorometrie werden die Objekte beispielsweise durch einen freien oder in einer Küvette befindlichen Trägerflüssigkeits- strahl einzeln durch eine entsprechende Lichtver- teilung eines Fokus geführt (während bei der Epi- fluoreszenzmikroskopie und der konfokale Laser- Scanning-Mikroskopie die Objekte auf Objekthal- tern, d h. Objektträgerplättchen, -trägerkapillaren, -trägerkammern, -trägerflüssigkeiten u.a., fixiert vorliegen). Die Lichtverteilung ist üblicherweise spaltförmig, d.h. das Objekt wird bezüglich einer Achse gerastert. Die erzielbare Auflösung ist durch die Fokusbreite des verwendeten Laserstrahls und/

oder geeignet gewählter Detektionsblenden bestimmt, wobei die Variabilität in der Objekttrajek- torie (= laminarer, üblicherweise zentraler "Flüssig- keitsfaden", der die Objekte trägt), abhängig vom Tragermedium und -verfahren, die Fokustiefe und damit auch die minimale Fokusbreite vorgibt Der Vorteil von Flußfluorometrieverfahren liegt üblicher- weise in der gegenüber der Epifluoreszenzmikro- skopie und der konfokalen Laser-Scanning-Mikro- skopie wesentlich höheren zeitlichen Detektionsra- te, die bis zu einigen tausend Objekten pro Sekun- de reichen kann. Die Fokusbreite entspricht der Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion der Slit-Scan Optik unter den verwendeten Bedingungen.

d) Bei den Fernfeldmikroskopieverfahren des

"Point-Spread-Function-Engineerings": wird die Punktbildfunktion optisch geschmälert. Dies kann durch kohärente Überlagerung von zwei und mehreren Punktbildfunktionen erfolgen (z.B. 4Pi-Mikro- skopie) oder durch Auslöschen der Fluoreszenz von Fluorochromen, die sich im Randbereich des jeweiligen zentralen Punktbildfunktionsmaximums befinden (z.B. STED-Mikroskopie, Ground-Depleti- on-Mikroskopie). Da die Auflösung eines Mikro- skops durch die Halbwertsbreite des Hauptmaxi- mums der effektiven Punktbildfunktion gegeben wird, wird somit die Halbwertsbreite verringert und die Auflösung verbessert.

e) Bei der Wellenfeldmikroskopie gemäß dem US- Patent Nr. 4,621,911 werden lumineszente Präpa- rate im optischen Mikroskop mit einem stehenden Wellenfeld beleuchtet (Standing Wave Field Fluo- rescence Microscopy, SWFM). Die Präparate werden in einer Zone äquidistanter ebener Wellenfron-

ten angeordnet und zur Fluoreszenz oder Phospho- reszenz angeregt. Der Abstand der Wellenfronten und ihre Phase können zur Bilderzeugung variiert werden. Aus einzelnen optischen Schnitten kann durch Computer-Bildverarbeitung die dreidimensionale Verteilung der fluoreszenten bzw. lumines- zenten Objektpunkte rekonstruiert werden. Die ebenen Wellenfronten werden durch kohärente Überlagerung zweier Laserstrahlen unter einem definierten Winkel zur optischen Achse des Mikro- skopsystems erzeugt, wobei der Winkel den Ab- stand der Wellenfronten untereinander bestimmt bei gegebener Wellenlänge und Brechungsindex.

An Stelle von zwei sich kreuzenden Laserstrahlen kann das Wellenfeld auch dadurch erzeugt werden, daß ein Laserstrahl nach geeigneter Reflexion unter einem bestimmten Winkel mit sich selbst zur In- terferenz gebracht wird. Im Mikroskopaufbau sind in diesem Falle die Wellenfronten senkrecht zur optischen Achse des detektierenden Objektives angeordnet. Die Fluoreszenz bzw Lumineszenz wird entweder wie beim Epifluoreszenzmikroskop durch entsprechende optische Filter spektral diskriminiert und in verschiedene Strahlengänge gerührt oder konfokal detektiert. Die erzielbare Auflösung ist wie bei der Epifluoreszenzmikroskopie und der Konfo- kalen-Laser-Scanning-Mikroskopie durch die Halb- wertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion gegeben und hängt von der jeweiligen Wellenlänge, der Numerischen Apertur des verwendeten Objektivs, sowie von den lokalen Brechzahlen der Objekte, des Einbettungsmedi- ums, der eventuell verwendeten Deckgläser und der eventuell eingesetzter Immersionsflüssigkeiten ab.

Lateral besitzt das System eine Auflösung wie ein übliches Epifluoreszenzmikroskop oder Konfokales Laser Scanning Mikroskop; in axialer Richtung dagegen wird eine Tiefendiskriminierung und damit wesentlich verbesserte Auflösung erzielt.

Nachteile des Standes der Technik:

[0006] 1.) Da die effektiven Punktbildfunktionen stark beeinflußt werden von der jeweiligen lokalen Brechzahl und Absorption im Objekt, im Einbettungsmedium des Objektes und in der Immersion (einschließlich eventuell vorhandener Deckgläser), sind Distanzmessungen zwischen Objektstrukturen von der effektiven  d.h. der lokal im markierten Objektpunkt gegebenen Punkt- bildfünktion abhängig. Diese unterscheidet sich im all- gemeinen deutlich von berechneten Punktbildfunktio- nen des verwendeten Mikroskops. Auch die unter technisch optimierten Randbedingungen gemessenen Punktbildfunktionen unterscheiden sich in der Regel von den unter praktischen Routinelaborbedingungen in biologischen Objekten erzielbaren effektiven Punktbild- funktionen. Da diese effektiven Punktbildfunktionen

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meist nicht zur Verfügung stehen, greift man zur Kali- brierung der Distanzmessungen auf ideale, berechnete Ergebnisse zurück bzw. auf Kalibrierungsmessungen, die unter Standardbedingungen durchgeführt wurden, wie z.B. Reflexionsverfahren. Beide Verfahren erfolgen zu Lasten der Präzision bei der dreidimensionalen Di- stanzmessung in biologischen Mikroobjekten. Als Folge ergibt sich eine erhebliche Unsicherheit der Bestim- mung der tatsächlichen räumlichen Distanz zwischen den Objektstrukturen; bei biologischen Objekten bein- halten quantitative Größenabschätzungen Unsicherhei- ten von bis zu mehreren Mikrometern Eine Korrektur dieses Fehlers ist bei den bisher verwendeten Metho- den nur begrenzt möglich, nämlich nur unter Standard- bedingungen, deren tatsächliche Realisierung/Einhal- tung im biologischen Objekt jedoch nicht genau kontrol- liert bzw. gewährleistet werden kann.

[0007] Zwei Objektstrukturen der gleichen spektralen Signatur können nur dann separiert werden, wenn sie mindestens eine Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion von einander entfernt sind.

[0008] 2.) Bei allen oben beschriebenen Fernfeld- Verfahren besteht das Problem, daß die Breite des Hauptmaximums der Punktbildfunktion und damit die Auflösungsgrenze von der relativen Lage im Raum ab- hängt. So ist z.B. bei der Epifluoreszenzmikroskopie oder der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie die Punktbildfunktion lateral (senkrecht zur optischen Ach- se) schmäler als axial (in Richtung der optischen Ach- se). Bei statischen Mikroskopieverfahren kann dieser Nachteil zwar mit Hilfe der sog. Mikroaxialtomographie überwunden werden. Bei diesem Verfahren werden die (biologischen) Objekte in Kapillaren oder auf Glasfasern angeordnet und definiert im Mikroskop um eine Achse gedreht, die normalerweise senkrecht zur optischen Achse des Mikroskops steht. Dabei werden Abstands- messungen in derjenigen Richtung durchgeführt, die die schmalste Halbwertsbreite der effektiven Punktbild- funktion besitzt. Bei der Flußfluorometrie ist dieses Ver- fahren jedoch kaum einsetzbar.

[0009] 3.) Bei der. "eindimensionalen" Wellenfeldmi- kroskopie (SWFM) führt das periodische Wellenfeld bei epifluoreszenter Detektion in Verbindung mit Verfahren des Optical Sectioning zu einer Mehrdeutigkeit in der Abbildung der Objektstrukturen größer alsλ/2n (λ=Wel- lenlänge der Anregung, n= effektiver Brechungsindex).

Diese Mehrdeutigkeit erschwert zunächst eine effektive Nutzung der durch das Interferenzmuster erzielten Auf- lösungsverbesserung.

[0010] 4.) Hochpräzisionsdistanzmessungen mit Lichtmikroskopie-Fernfeldverfahren gelten nach dem Stand der Technik nur bis in den Größenordnungsbe- reich hundert Nanometer durchfuhrbar. Für Messungen im Distanz- und Genauigkeitsbereich der Größenord- nung 10 nm werden die Verfahren der Elektronenmikro- skopie, Rastertunnelmikroskopie, atomare Rasterkraft- mikroskopie, biologische und optische Nahfeldmikro-

skopie eingesetzt. Bei diesen Verfahren handelt es sich jedochim Gegensatz zu den optischen Fernfeldver- fahren um flächenorientierte und nicht volumenori- entierte Meßverfahren; d.h. sie eignen sich im Prinzip nur für Strukturuntersuchungen und Distanzmessungen an Oberflächen und in dünnen Schichten. Informationen über die Lage von Objekten bzw. Objektstrukturen im dreidimensionalen Raum können allenfalls anhand von mechanisch präparierten Schnittserien und einer Aus- wertung von Messungen in Einzelbildern erhalten werden. Dreidimensionale Messungen in intakten oder gar vitalen biologischen Mikroobjekten, z.B. dreidimensionalen (konservierten) Zellen, Zellkernen oder Zellorga- nellen, sind nicht möglich.

Aufgabe der Erfindung:

[0011] Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren für die Fernfeldmikroskopie und eine Vorrich- tung zur Durchführung dieses Verfahrens bereitzustel- len, mit dem bzw. mit der es möglich ist, Distanzmes- sungen zwischen Objektstrukturen, deren Abstand voneinander geringer ist als das Auflösungsvermögen des betreffenden Fernfeldmikroskops, d.h. die weniger als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion voneinander entfernt liegen, unab- hängig von der Lage der betreffenden Objektstrukturen im dreidimensionalen Raum, mit hoher Genauigkeit durchzuführen

Erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe:

[0012] Eine Lösung dieser Aufgabe besteht in der Be- reitstellung eines Verfahrens nach Anspruch 1.

[0013] Eine erfindungsgemäße Halterung für einen Objekthalter zur Durchführung des verfahrens ist im An- spruch 18 beansprucht.

• Vor, während oder nach der Präparation des betreffenden Objekts auf bzw. in einem Objekthalter, insbesondere Objektträgerplättchen, Objektträgerfa- ser/-kapillare oder Objektträgerflüssigkeit, werden die zu untersuchenden bzw. zu ortenden Strukturen (Meßstrukturen) mit Fluoreszenzfarbstoffen verschiedener und/oder gleicher spektraler Signatur markiert, d.h. solche zu ortende Strukturen (Meßstrukturen), die sich in unmittelbarer Nähe zueinander, nämlich innerhalb der Halbwertsbreite des Hauptmaximums ihrer effektiven Punktbild- funktion, befinden, werden mit Fluoreszenzfarb- stoffen verschiedener spektraler Signatur markiert, während solche Meßstrukturen, deren Abstand voneinander größer ist als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion, mit Fluoreszenzfarbstoffen verschiedener oder gleicher spektraler Signatur markiert werden. Zwei zu ortende Meßstrukturen dürfen immer dann mit der gleichen spektralen Signatur markiert sein,

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wenn sie z.B. durch ihre relative Lage oder durch andere Kriterien eindeutig identifiziert werden kön- nen.

• Mit den gleichen Fluoreszenzfarbstoffen werden Kalibriertargets definierter Größe und räumlicher Anordnung markiert,

• die fluoreszierenden Kalibriertargets werden entweder zusammen mit den Objekten oder separat auf bzw. in dem bzw. einem Objekthalter (Objekt- trägerplättchen, Objektträgerfaser/-kapillare, Ob- jektträgerflüssigkeit o.a.) präpariert.

• (Untersuchungs-)Objekt und Kalibriertargets werden unter übereinstimmenden Bedingungen, gleichzeitig oder nacheinander mikroskopisch oder flußfluorometrisch untersucht.

• Jeweils zwei definierte Kalibriertargets verschiedener spektraler Signatur werden unter Berücksichti- gung des wellenlängenabhängigen Abbildungs- und Lokalisationsverhaltens des jeweiligen optischen Systems (Mikroskop oder Flußfluorometer) vermessen, die dabei ermittelten Messwerte gleich Ist-Werte werden mit den vorbekannten tatsächli- chen Distanzwerten gleich Soll-Werten (d.h. den aufgrund der Geometrie berechneten Solllokalisa- tionen) verglichen, und die Differenz zwischen Ist- Werten und Soll-Werten, nämlich der Kalibrierwert, wird zur Korrektur des durch das optische System bedingten Versatzes in der Detektion unterschiedlicher Emissionsloci insbesondere der Meßstruktu- ren verwendet

[0014] Mit anderen Worten. Die Distanzmessung zwischen den (je nach Abstand voneinander) mit verschiedenen oder gleichen spektralen Signaturen markierten Objekt-(Sub-) Strukturen - im folgenden auch Meßstruk- turen genannt - wird anhand der hochpräzisen Lokali- sation unabhängiger (Kalibrier-)Targets mit entspre- chend spektraler Signatur und mit bekannter Größe und räumlicher Anordnung, unter Berücksichtigung des wel- lenlängenabhängigen Abbildungs- und Lokalisations- verhaltens des jeweiligen optischen Systems durchge- führt, wobei die Kalibriermessung zwischen den (Kali- brier-) Targets und die Messung im biologischen Objek- ten unter gleichen System- und Randbedingungen statt- findet. Diese Kalibriertargets haben diesselbe oder eine höhere Multispektralität wie die zu messenden (Objekt-) Strukturen. Sie können direkt in den biologischen Ob- jekten angeordnet sein, oder als separate Präparate auf einem Objekthalter (Objektträgerplättchen oder Objekt- trägerfaser/-kapillare oder Objektträgerflüssigkeit o.ä.) vorliegen oder Teil eines Objekthalters sein.

[0015] Zwei oder mehrere fluoreszierende Meßstruk- turen in intakten, dreidimensionalen biologischen Ob- jekten, deren Abstand und Ausdehnung kleiner als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion ist, können aufgrund ihrer unterschiedlichen spektralen Signatur (Fluoreszenzabsorpti- onswellenlangen und/oder Fluoreszenzemissionswel-

lenlängen und/oder Fluoreszenzemissionslebensdau- ern) diskriminiert werden, d.h. ihr Abstand untereinander kann bestimmt werden. Die Abstandsmessung wird auf die Lokalisation der einzelnen Meßstrukturen redu- ziert und kann nun auch in der optischen Fernfeld- mikroskopie oder Flußfluorometriemit einer wesentlich höheren Genauigkeit als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der Punktbildfunktion durchgeführt werden. Die Lokalisation des Schwerpunkts der betreffenden Meßstrukturen wird auf die Maximalintensität ih- res Fluoreszenzsignals angepaßt. D. h. aus dem gemessenen (beugungsbegrenzten) Signals (=Intensi- tätskurve) eines Fluoreszenzpunktes (=fluoreszierende Meßstruktur) wird  unter Berücksichtigung der Ge- samtinformation aus Haupt- und Nebenmaxima der Schwerpunkt (das Baryzentrum) des Signals bestimmt und damit der Ort der Meßstruktur. Bei fehlerfreiem optischen System und infolgedessen idealer Symmetrie der gemessenen Intensitätsverteilung (=Verlauf der In- tensitätskurve) kolokalisiert der Schwerpunkt (das Ba- ryzentrum) der Intensitätskurve innerhalb der Lokalisa- tionsgenauigkeit mit dem Hauptmaximum (=Maximim 0.

Ordnung des Beugungsbildes) der gemessenen Inten- sitätsverteilung

Vorteile der Erfindung:

[0016] Das Verfahren erlaubt es mittels optischer Fernfeld-Mikroskopie bzw Scanning-Flußfluorometrie, geometrische Distanzen in biologischen Mikro-Objek- ten zu messen, wobei die zu bestimmenden Distanzen geringer sein können als die Halbwertsbreite des Haupt- maximums der effektiven Punktbildfunktion im Objekt.

Da der Informationsgehalt der erfindungsgemäß durch- geführten Distanzbestimmungen einer bei erhöhter Auf- lösung gewonnenen Distanzmessung entspricht, kann abkürzend auch von Auflösungsäquivalent gesprochen werden. Die Messungen von solch geringen Distanzen in biologischen Mikroobjekten ist von großer Bedeutung z.B. für wissenschaftliche Fragestellungen in Biologie und Medizin, aber auch für bestimmte Aspekte der kli- nischen Forschung und der Diagnostik an Präparaten.

[0017] Die multispektrale Kalibrierung erlaubt es, in situ Messungen über das Abbildungsverhalten des Sy- stems am konkreten biologischen Objekt durchzufüh- ren. Bei Verwendung der Fluoreszenzlebensdauer als alleinigem Parametertyp und/oder bei Anregung der Fluorochrome mit derselben bzw. denselben Photonen- energie(n) entfällt aufgrund der Kalibrierung die in situ Korrektur des chromatischen Versatzes in der Objekte- bene. Für höchstauflösende Fernfeld-Mikroskoptypen wie z.B. das Wellenfeldmikroskop und bei Verwendung erfindungsgemäßer Fluoreszenzmarker ermöglicht die Erfindung dreidimensionale geometrische Distanzmes- sungen in biologischen Objekten bis hinunter zu mole- kularer Präzision (d. h. Auflosungsäquivalent besser 10 nm).

[0018] Im Gegensatz zur Elektronenmikroskopie bzw.

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zur optischen und nicht-optischen Nahfeldmikroskopie bleibt die dreidimensionale Struktur des zu untersuchenden Objektes intakt, da auf mechanische Schnitte verzichtet wird. Damit können in dreidimensional konservierten Mikroobjekten 3D-Distanzmessungen mit einem Bereich kleiner als die Halbwertsbreite des Haupt- maximums der effektiven Punktbildfunktion vorgenommen werden Insbesondere eröffnet das Verfahren die Möglichkeit, dreidimensionale Distanzmessungen auch unter vitalen Bedingungen des biologischen Objektes durchzuführen. Im Vergleich zu den im Stand der Tech- nik bekannten Verfahren des Point Spread Function En- gineering besteht ein wesentlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung darin, daß auch bereits vorhandene Sy- steme der quantitativen Fluoreszenzmikroskopie als Basis für die erfindungsgemäße Steigerung des Auflö- sungsäquivalents verwendet werden können.

Für die Detektion der Fluoreszenzemission eignen sich sowohl ein- und zweidimensionale rasternde als auch nicht-rasternde elektronische bzw. optoelektronische Detektorsysteme.

Ein Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens bietet sich insbesondere an für multispektrale Präzisionsdi- stanzmessung in biologischen Mikroobjekten zur absoluten und relativen Lokalisation und Distanzmessung von fluoreszenten Meßstrukturen beliebiger spektraler Signatur.

Vorteilhafte Ausführungsformen und Weiterbildun- gen der Erfindung :

[0019] Um bei Verwendung von statischen Mikrosko- psystemen eine möglichst scharfe Punktbildfunktion zu erhalten, sollte das biologische Objekt für die mikrosko- pischen Untersuchung axialtomographisch gedreht werden können (Mikroaxialtomographie). Auf diese Weise können Anisotropien in der 3D-Punktbildfünktion so überwunden werden, daß zwei Objektpunkte jeweils in einer Ebene mit der relativ besten Punktbildfunktion liegen. Das biologische Objekt ist vorzugsweise in oder an einem drehbaren Träger mit kreisförmigem, rechtek- kigem oder vieleckigem Querschnitt fixiert oder in ande- rer Weise befestigt.

Der Träger besteht aus einem für die verwendeten Licht- wellenlängen transparenten Material, dessen Bre- chungsindex sich um höchstens 12 % von dem des um- gebenden Mediums unterscheidet. Er kann hohl oder massiv sein und und sein Querschnittsdurchmesser sollte kleiner oder gleich 300µm betragen.

[0020] In einer bevorzugten Ausführungsform des er- findungsgemäßen Verfahrens wird der (im Querschnitt dreieckige, viereckige oder vieleckige) Träger für axial- tomographische Untersuchungen um die Winkelφm= 360/3 [°],φ_m= 360/4 [°], oderφ_m= 360/n [°] gedreht, wobei n die Zahl der planaren Seiten des Trägers ist.

Eine Abstandsmessung zwischen den Kalibriertargets und/oder Meßstrukturen wird bei einem, mehreren, oder jedem dieser Winkel, jeweils für eine zwei oder mehrere

spektrale Signaturen vorgenommen.

[0021] Zur Ermittlung von Ist- und Sollwerten, zu deren Vergleich und zur Bestimmung des Korrekturwerts/

Kalibrierwerts werden vorzugsweise die folgenden Ver- fahrensschritte durchgeführt:

- ein oder mehrere Kalibriertargets B mit einem Ab- stand größer als die Halbwertsbreite des Hauptma- ximum der effektiven Punktbildfunktion vom Schwerpunkt der N Meßstrukturen wird/werden mit einer beliebigen spektralen Signatur markiert, - die Abstände d_ik(i, k = 1 ... N, i≠k ) der Schwer-

punkte der spektral getrennten Beugungsfiguren der N Meßstrukturen und die Abstände d_iBder N Meßstrukturen zum Kalibriertarget B werden gemessen, wobei automatisierte Verfahren der Bild- analyse angewendet werden,

- für eine Meßstruktur werden die Strecken d_ikund d_iBjeweils in der Ebene der schmalsten Punktbild- funktion sowie alle übrigen Distanzen gemessen werden, wozu das Objekt axialtomographisch jeweils um einen definierten Winkelφ_mgedreht wird, - optische Aberrationen aus den Kalibrierungsmes- sungen werden korrigiert, und an die korrigierten gemessenen Abstände d_ik(φ_m) und d_iB(φ_m) wird jeweils eine Cosinusfunktion A_ikcos (φm+θik) bzw.

A_iBcos (φ_m+θ_iB) mit geeigneter Phasenverschie bung angepaßt,

- die Maxima A_ik und A_iB der Anpassungsfunktion von d_ikbzw. d_iBwerden durch den Vergrößerungs- faktor dividiert und als euklidischer Abstand D_ik bzw. D_iBder N Meßstrukturen untereinander bzw.

der Abstände der Meßstrukturen zum kalibviertar- get B bestimmt.

Für die Bestimmung der Maxima werden vorzugsweise zusätzlich die diesen entsprechenden Mini- ma des Abstandes z_ik, z_iBin der zu der Ebene der d_ik, d_iB orthogonalen Ebene herangezogen und analog ausgewertet.

[0022] Die Ermittlung aller Koordinaten der N Meßstrukturen und ihrer Relativkoordinaten zum Be- zugspunkt B, d.h. die Ermittlung der Positionen x_i, y_i, z_i und x_k, y_k, z_kbzw. der Abstände x_k- x_i, y_k- y_i, z_k- z_i und x_B- x_i, y_B- y_i, z_B- z_i, erfolgt erfindungsgemäß auf der Grundlage der mikroskopisch gemessenen 3D-Ab- stände D_ikbzw. D_iB, vorzugsweise unter Verwednung des folgenden Gleichungssystems

D²_ik= (x_k- x_i)²+ (y_k- y_i)²+ (z_k- z_i)²

D²_iB= (x_B- x_i)²+ (y_B- y_i)²+ (z_B- z_i)²

D²_kB= (x_B- x_k)²+ (y_B- y_k)²+ (z_B- z_k)²

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[0023] Zur Absicherung der ermittelten Meßergebn- sisse sollte die vorstehend beschriebene Vorgehens- weise für mehrene Kalibriertargets B und die gleichen N Meßstrukturen durchgeführt werden.

Die Koordinaten und Abstände der N Meßstrukturen können anhand der Schwerpunkte ermittelt werden, die sich aus Schwerpunktmittelungen der Messungen zu allen Bezugspunkten ergeben.

[0024] Insbesondere für graphische Darstellungen werden die ermittelten Positionen x_i, y_i, z_iund x_B, y_B, z_B vorzugsweise mit einer Punktbildfunktion gefaltet, die eine Halbwertsbreite mit dem jeweils erreichten Auflö- sungsäquivalent besitzt.

[0025] Zur Fluorochrommarkierung von Meßstruktu- ren und Kalibriertargets werden vorzugsweise solche Fluorochrome verwendet, die im ultravioletten, sichtbaren und/oder infraroten Lichtwellenlängenbereich angeregt werden können und die im ultravioletten, sichtbaren und/oder infraroten Lichtwellenlängenbereich emittie- ren.

[0026] Bei einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden markierte Regionen des biologischen Objekts mit bekannter Distanz voneinander als Kali- briertargets verwendet. Diese Markierung kann beispielsweise mit geeigneten biochemischen Sonden durchgeführt werden.

Die Verwendung biologischer Kalibriertargets hat ge- genüber der Verwendung synthetischer Kalibriertar- gets, beispielsweise Kalibrierkügelchen, den praktischen Vorteil, daß bei der Kalibrierung neben den optischen Randbedingungen des Objektes zusätzlich prä- parativ bedingte Randeffekte in die Kalibrierung einflie- ßen, wie z.B. das Verhältnis aus tatsächlichen Fluores- zenzsignal zu unspezifischem Hintergrund (das durch automatische Bildanalysealgorithmen bestimmt wird).

[0027] Als nicht-biologische bzw. synthetische Kali- briertargets eignen sich ganz besonders Mikrokügel- chen, die die gleiche oder eine höhere multispektrale Signatur als die zu ortenden Meßstrukturen aufweisen.

Sie werden wie die biologischen Objekte behandelt.

Solche Kalibriertargets sind vorzugsweise auf Objekt- haltern in definierter Raumanordnung fixiert. Die Fixie- rung kann bereits bei der Fabrikation der betreffenden Objekträger geschehen , was insbesondere für die Rou- tinebenutzung von Vorteil ist.

[0028] Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Di- stanzmessung unter Verwendung eines Mikroskops mit Axialtomograph werden die biologischen Objekte mit den Meßstrukturen und den/die Kalibriertargets in oder auf einer Mikrokapillare oder Glasfaser als Objekthalter bzw Objektträger präpariert. Die Kapillare/Faser hat einen exakt definierten Durchmesser, wobei verschiedene Durchmesser möglich sind. Zur Festlegung dieser Kapillare/Faser auf dem Mikroskoptisch wird erfin- dungsgemäß eine spezielle Halterung vorgeschlagen, die aus einem starren, vorzugsweise dorsiventral abgeplatteten Rahmen besteht, an bzw. auf dem wenigstens eine Lagerbuchse montiert ist, in der eine Mikrokapillare

oder Glasfaser um ihre Längsachse rotierfähig und mit der Rotationsachse senkrecht zur optischen Achse des Mikroskops gelagert werden kann. Die Lagerbuchse(n) sollten (sind) so angeordnet sein, daß die Rotationsach- se der Kapillare/Faser senkrecht zur optischen Achse des Mikroskops verläuft Die Drehung der Untersu- chungsobjekte in oder an der Kapillare/Faser erfolgt durch Drehung der Kapillare/Faser direkt, vorzugsweise vermittels eines Drehmotors. Das hat den Vorteil, daß die einmal eingestellte und justierte Optik des Mikro- skops unverändert beibehalten werden kann. Zur Un- terstützung bzw. Stabilisierung der zu drehenden Kapil- lare/Faser gegen Durchhängen oder Verschieben im Bereich der Ausnehmung des Rahmens ist ein aus- tauschbarer Einsatz für den Rahmen vorgesehen. Die- ser Einsatz kann insbesondere aus Plastik oder Glas gefertigt sein und eine grabenförmige Vertiefung in Langsrichtung der Kapillare/Faser aufweisen. Zur leich- teren Handhabung, vor allem beim Einsetzen in den Rahmen, kann dieser Einsatz einen oder mehrere Klemmschlitz(e) aufweisen.

Der erfindungsgemäße Rahmen hat vorzugsweise ähn- liche Außenmaße wie ein herkommliches Objektträger- plättchen, d.h. seine Länge beträgt weniger als 77 mm und seine Breite weniger als 27 mm, und er ist sehr leicht, d.h. er wiegt beispielsweise nur ca. 15 Gramm Mit einem Computergesteuerten Schrittmotor kann die Kapillare/Faser um einen exakt definierten Winkel um ihre Achse gedreht werden. Da diese Drehkraft direkt an der Kapillare/Faser ansetzt und nicht an ihrer Halte- rung, ist die Gefahr, daß die Kapillare/Faser verschoben wird und aus dem Blickfeld des Mikroskops gerät oder daß gar der ganze Mikroskoptisch verrückt bzw. verschoben wird, wesentlich verringert.

[0029] Fur die Durchführung des erfindungsgemäßen Distanzmessungsverfahrens unter Verwendung eines Laser-Scan- Flußfluorometers, das einen frei oder in einer Küvette stromenden Flüssigkeitsstrahl umfaßt, und mit einer oder mehren Laserstrahlquelle(n), deren La- serstrahl(en) auf die zentrale Trajektorie des Flüssig- keitsstrahls fokussiert sind, sollte die Laseroptik derart ausgewählt und angeordnet sein, daß der bzw. die La- serstrahlen bandförmig auf die Objekttrajektorie (die die Objekte führende zentrale Trajektorie des Flüssigkeits- strahls) fokussiert ist bzw. sind. Die Bandform des bzw.

der Laserstrahlen kann hierfür vorteilhaft einfach durch Interferenzstreifen zweier oder mehrerer sich kreuzen- der Teilstrahlen erzeugt werden Die Linsen und Blenden im Detektionsstrahlengang sind vorzugsweise derart ausgewählt und angeordnet, daß allein die Fluoreszen- zemission aus dem zentralen Interferenzstreifen auf den Detektor abgebildet wird. Außerdem sollte der De- tektor in einzelne Detektionspixel aufgeteilt, um eine räumliche Auflösung der Fluoreszenzemission sowohl in Flußrichtung als auch senkrecht zur Flußrichtung zu ermöglichen. Das hat den Vorteil, daß eine Lokalisation der fluoreszierenden Meßstrukturen und/oder Kalibrier- targets nicht nur in Flußrichtung aufgrund der Bewe-

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gung des Objektes mit konstanter Geschwindigkeit sondern auch senkrecht dazu erfolgen kann.

[0030] Bei einem Flüssigkeitsstrahl in z-Richtung und einer Laseroptik aus Laserstrahl(en) in x-Richtung und Blende(n) und Detektor(en) in y-Richtung ermöglicht das Verfahren eine Verbesserung der Auflösung in zwei Dimensionen. Wird zusätzlich eine entsprechende La- seroptik mit Laserstrahl(en) in y-Richtung und Blende (n) und Detektor(en) in x-Richtung angeordnet, erhält man eine Auflösungsverbesserung in drei Dimensio- nen. In beiden Fällen ist die Erstellung von Punktbild- funktionen möglich, die von der Orientierung des Ob- jekts nahezu unabhängig sind.

Ausführungsbeispiele zur näheren Erläuterung der Erfindung :

BEISPIEL 1: Distanzmessung zwischen Genab- schnitten von Chromosomen in einem Zellkern (un- abhängig vom Mikroskoptyp)

[0031] In einem Zellkern nimmt das Chromatin der einzelnen Chromsomen definierte Teilregionen ein. In- nerhalb einer oder mehrerer solcher chromosomalen Teilregionen werden die zu ortenden Strukturen , d.h.

die Meßstrukturen, z.B. kleine Chromosomenabschnit- te wie Gene oder Teilstücke von Genen, mit einer im Stand der Technik bekannten Methode der Fluoreszenz in situ Hybridisierung spezifisch markiert, und zwar mit Fluorochromen verschiedener bestimmter spektraler Signaturen M₁, M₂, M₃, .... Die Abstände zwischen den Markierungsorten (den markierten Meßstrukturen) liegen unter der klassischen Auflösung, d.h. sie sind kleiner als die Halbwertsbreite des Hauptmaximum der effektiven Punktbildfinktion. Die Markierung der (Objekt-) Strukturen (Meßstrukturen) erfolgt derart, daß die spektralen Signaturen an den zu ortenden Strukturen (Meßstrukturen) mit nahezu der gleichen Dynamik ver- treten sind. Das biologische Objekt wird auf einer Glas- faser exakt definierten Durchmessers oder in einer run- den oder rechteckigen Kapillare definierter Dimensio- nen präpariert

[0032] Um die Distanzen zu bestimmen, werden mi- kroskopierbare Präparate mit Kalibriertargets herge- stellt, und zwar unter den gleichen physikalischen und chemischen Versuchsbedingungen wie das Objekt bzw.

die zu ortenden Objektstrukturen (= Meßstrukturen).

[0033] AJs Kalibriertargets bzw als Präparate mit Ka- libriertargets dienen beispielsweise:

a) mikroinjizierbare Kügelchen einer spektralen Signa- tur (monochromatisch):

[0034] Die Kügelchen sind nach bekannten Verfahren mit jeweils einem Fluorochrom, d.h. monochromatisch markiert und aufgrund ihrer Größe von den auszumes- senden (zu ortenden) Strukturen im Objekt (den Meßstrukturen) unterscheidbar. Man injiziert solche Ka-

librierkügelchen, die die im Objekt vorhandenen spektralen Signaturen der Meßstrukturen repräsentieren, ansonsten aber vorzugsweise identisch sind (hinsichtlich Größe, Geometrie, Materialbeschaffenheit etc.). Mit anderen Worten: Die spektralen Signaturen der Meß- strukturen sowie der Kalibriertargets werden so ge- wählt, daß unter den gegebenen Untersuchungsbedin- gungen die von ihnen emittierten Fluoreszenzemissio- nen getrennt voneinander analysiert werden können.

Die Injizierung und Fixierung der monochromatischen Kalibrierkügelchen erfolgt derart, daß sich die einzelnen Kügelchen verschiedener spektraler Signatur in Clu- stern direkt an der Glasfaser-Oberfläche oder Kapillar- wand anordnen, vorzugsweise in einer Quer- schnittsebene der Faser bzw. Kapillare. Bei Verwen- dung von Präzisionsfasern und/oder -kapillaren liegen die Kügelchen folglich in definierten Abstände voneinander bzw. von einer Bezugsebene, Bezugsachse oder Bezugslinie.

b) mikroinjizierbare Testkügelchen multispektraler Si- gnatur (polychromatisch) und gleicher spektraler Dyna- mik:

[0035] Die Kügelchen sind nach bekannten Verfahren mit jeweils allen bei den markierten (Objekt-)Strukturen (Meßstrukturen) vorkommenden spektralen Signaturen markiert Infolgedessen können sie an beliebige Stellen im zu vermessenden biologischen Objekt (hier Kern) injiziert werden. Eine Sollgeometrie wie bei a) ist nicht er- forderlich, da für jede Signatur die chromatischen Schwerpunkte an derselben Stelle lokalisiert sein sollen Zur Unterscheidung von den markierten (Objekt-)Struk- turen (Meßstrukturen) können die Kügelchen entweder einer anderen Größenklasse angehören oder aber eine zusätzliche spektrale Signatur tragen, die bei den zu messenden Strukturen d h. den Meßstrukturen (gemäß Präparationsprotokoll) nicht vorkommt.

c) simultan markierte Chromosomenregionen bekannter Distanz an einem anderen Chromosom als demjeni- gen, das die zu ortenden Strukturen (Meßstrukturen) trägt:

[0036] Die Kalibriertargets, d.h. hier die Chromoso- menregionen mit bekanntem Abstand voneinander, sind mit Hilfe einer Probenkombination von DNA-Se- quenzen, die die verschiedenen spektralen Signaturen trägt, unterschiedlich markiert. Eine Unterscheidung der chromosomalen Kalibriertargets von den zu ortenden (Chromosomen-) Strukturen (Meßstrukturen) kann beispielsweise durch unterschiedliche Fluoreszenzintensi- tät erfolgen oder durch ein unterschiedliches Intensi- tätsverhältnis zwischen Fluorochromen verschiedener spektraler Signatur oder durch Verwendung eines zu- sätzlichen Fluorochroms mit abweichender spektraler Signatur, das bei der Fluoreszenzmarkierung der Meßtargets nicht verwendet wurde.

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Es ist auch möglich, daß die Kalibriertargets einer anderen Größenklasse angehören als die zur ortenden Meßstrukturen.

[0037] Die erfindungsgemäßen Distanzmessungen werden mittels bekannter Fernfeld-Mikroskopieanla- gen, bestehend aus Mikroskop, Photomultiplier und/

oder Kamera und Datenverarbeitungsanlage durchge- führt. Dabei werden zum einen die Abstände zwischen den Kalibriertargets mit Fluorochrommarkierungen verschiedener spektraler Signatur gemessen. Die gemessenen Lokalisationen ( d.h. die gemessenen Targetab- stände) werden mit den aufgrund der Geometrie berechneten Soll-Lokalisationen ( d.h. den tatsächlichen Targetabständen) verglichen und daraus der spektral bedingte Versatz (Shift) bestimmt. Dieser Versatz (Shift) ist der Kalibrierwert für die gemessenen Distanzwerte zwischen den zu ortenden (Objekt-)Strukturen (Meßstrukturen).

[0038] Da dieser Versatz von den optischen Eigen- schaften des Präparates abhängt (z.B. Brechzahlen in den Kernen und dem Präparationsmedium), sollte die Kalibrierung in situ erfolgen. Das heißt im vorliegenden Beispiel, daß sich die Kalibriertargets neben den zu untersuchenden und markierten (chromosomalen) Struk- turen (Meßstrukturen) im Kern befinden sollten Es werden die Abstände zwischen den zu ortenden (Objekt-) Strukturen (Meßstrukturen) bzw. die Abstände zwischen den verschiedenen Farbsignalen bzw. Farbpunk- ten der betreffenden Meßstrukturen, z.B. zwischen dem rotfluoreszierenden und dem grünfluoreszierenden Farbpunkt (von Intensitätsmaximum zu Intensitatsmaxi- mum oder von Schwerpunkt/Baryzentrum zu Schwer- punkt/Baryzentrum) gemessen, und dieser Meßwert wird um den mit den Kalibriertargets ermittelten (durch die verschiedene spektrale Signatur bedingten) Versatz in hochpräziser Weise korrigiert.

[0039] Bei Kalibriertargets in Gestalt von mikroinji- zierbaren Testkügelchen mit multispektraler Signatur (polychromatisch) wird der chromatische Versatz aus dem Lokalisationsunterschied der Schwerpunkte für jede Signatur bestimmt. Die dafür erforderliche Identifizie- rung der zu einem Kalibriertarget gehörenden Fluores- zenzemission kann beispielsweise durch volumener- haltende Schwellwertverfahren oder durch Mittelung der Segmentierungsergebnisse bei Schwellwertvariati- on erfolgen.

[0040] Bei Kalibriertargets in Gestalt von fluorochrommarkierten Objektregionen mit multispektraler Si- gnatur (polychromatisch) wird der chromatische Versatz genauso bestimmt

[0041] Als fluorochrommarkierte Kalibrierregionen eignen sich insbesondere auch Zentromerregionen, die mit einer Probenkombination von solchen DNA-Se- quenzen hybridisiert werden, die alle an dieselben chromosomalen DNA-Abschnitte binden, jedoch mit Fluoro- chromen unterschiedlichen spektraler Signatur markiert wird. Erfolgt die Hybridisierung unter noch stringenten Bedingungen, liegen pro Zellkern zwei Markierungsre-

gionen vor; bei nieder-stringenten Bedingungen werden aufgrund zusätzlicher Nebenbindungsregionen zusätz- liche Zentromerregionen markiert, so daß die Zahl der Kalibrierungsregionen ansteigt. Das ist u.U. sehr von Vorteil.

BEISPIEL 2: Distanzmessung zwischen Genab- schnitten von Chromosomen in einem Zellkern un- ter Verwendung eines Epifluoreszenzmikroskops mit Axialtomograph

[0042] Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein im Prinzipaufbau bekanntes Epi- fluoreszenzmikroskop mit Axialtomograph wie folgt modifiziert: Auf den Mikroskoptisch wird anstelle eines Ob- jektträgerplättchens eine erfindungsgemäße Halterung gemäß Fig. 1 für Mikrokapillaren oder Glasfasern, gesetzt. Diese Halterung besteht aus einem starren vorzugsweise dorsiventral abgeplatteten Rahmen 1, auf dem eine Lagerbuchse 2 montiert ist, in der eine Mikro- kapillare oder Glasfaser um ihre Längsachse rotierfähig und mit der Rotationsachse senkrecht zur optischen Achse des Mikroskops gelagert ist. Die Drehung des Untersuchungsobjektes in oder an der Kapillare/Faser erfolgt durch Drehung der Kapillare/Faser direkt, und zwar entweder manuell oder mittels eines Drehmotors.

Das hat den Vorteil, daß die einmal eingestellte und justierte Optik des Mikroskops unverändert beibehalten werden kann.

Zur Unterstützung bzw. Stabilisierung der zu drehenden Kapillare/Faser gegen Durchhängen und Verschieben im Bereich der Ausnehmung 3 des Rahmens 1 ist ein flächiger, scheibenförmiger Einsatz 5 austauschbar in dem Rahmen 1 angeordnet. Dieser Einsatz 5 besteht aus Plastik und weist eine grabenförmige Vertiefung 8 auf, die sich unterhalb und in Längsrichtung der Kapil- lare/Faser erstreckt. In seinem Randbereich ist der Ein- satz 5 mit zwei schlitzförmigen Ausnehmungen 6, 7 versehen, die sich jeweils senkrecht zur Randkante er- strecken und das Einsetzen des Einsatzes 5 in den Rah- men 1 erleichtern. Mit einem Computergesteuerten Schrittmotor wird die Kapillare/Faser in der Lagerbuch- se um einen definierten Winkel um ihre Achse gedreht.

Die Drehkraft setzt direkt an der Kapillare/Faser an (und nicht an ihrer Halterung), wodurch die Gefahr, daß die Kapillare/Faser beim Drehen verschoben wird und aus dem Blickfeld des Mikroskops gerät oder daß gar der ganze Mikroskoptisch verrückt bzw. verschoben wird, nahezu vollständig vermieden ist.

[0043] Das biologische Mikroobjekt, z.B. ein Zellkern, in dem die zu ortenden Meßstrukturen bereits mit Fluo- rochromen markiert sind und das auch bereits Kalibrier- targets enthält (zur Präparation siehe Beispiel 1), befin- det sich auf der Glasfaser oder in der Mikrokapillare Der Abstand von zwei oder mehr Meßstrukturen bzw. Kali- briertargets voneinander ist kleiner als die Halbwerts- breite des Hauptmaximums der axialen effektiven Punktbildfunktion. Mit dem Axialtomograph wird das

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Objekt gedreht unter ggf automatischer Refokussie- rung. Die Drehung erfolgt in der Art, daß jeweils ein Ab- stand zwischen zwei Meßstrukturen bzw. Kalibriertar- gets (d.h. zwischen deren Fluoreszenzintensitäts- schwerpunkten) maximal wird. Der maximale gemesse- ne Abstand entspricht dem tatsächlichen Abstand.

Ist man nur an den Abständen zwischen den Meßstruk- turen bzw. Kalibriertargets, d.h nicht an ihrer absoluten räumlichen Anordnung interessiert, kann man nun von einer der bekannten Meßstrukturen bzw. Kalibriertar- gets aus fortfahren, den Abstand zu einer dritten Meßstruktur bzw. einem dritten Kalibriertarget zu maxi- mieren und zu bestimmen. Sind die Abstände zwischen den Meßstrukturen bzw. Kalibriertargets größer als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der lateralen (senkrecht zur optischen Achse) Punktbildfunktion, so genügt eine einzige spektrale Signatur; sind die Abstän- de dagegen kleiner, müssen die Meßstrukturen bzw.

Kalibriertargets durch multispektrale Signatur unter- schieden werden. Die Schwerpunkte (Maxima) der Si- gnale dienen der Lokalisierung. Sofern die untersuchten Meßstrukturen einen Durchmesser haben, der kleiner als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven lateralen Punktbildfünktion ist, werden alle Beu- gungsbilder der Meßstrukturen bzw Kalibriertargets durch eine scharfe Punktbildfunktion bestimmt, so daß die Maxima optimal bestimmt werden können. Sind zwischen den Meßstrukturen bzw. Kalibriertargets auch Di- stanzen größer als die Halbwertsbreite des Hauptmaxi- mums der lateralen Punktbildfunktion zugelassen, so ist die Bestimmung aller Abstände zwischen den Meß- strukturen bzw. Kalibriertargets für N≥2 innerhalb eines Kerns bei einmaligem Drehen nur dann möglich, wenn bei jedem Drehwinkel optische Schnittserien registriert werden (siehe Beispiel 3 zur konfokalen Laser-Scan- ning Mikroskopie). Ist man an der absoluten Anordnung der Meßstrukturen bzw. Kalibriertargets im Raum interessiert, so müssen die jeweiligen Schwerpunkte (bary- zentren) präzise bestimmt werden. Durch mehrmaliges Wiederholen der gesamten Meßprozedur und statisti- sche Auswertung kann die absolute Lokalisierung der Meßstrukturen bzw. Kalibriertargets, d h. die Winkel- messung, verbessert werden

BEISPIEL 3: Distanzmessung zwischen Genab- schnitten von Chromosomen in einem Zellkern un- ter Verwendung eines Konfokalen Laser-Scanning Mikroskops

[0044] Von dem biologische Mikroobjekt, z.B. einem Zellkern, in dem die zu ortenden Meßstrukturen bereits mit Fluorochromen markiert ist, und das auch bereits Kalibriertargets enthält (zur Präparation siehe Beispiel 1), wird eine Serie optischer Schnitte aufgenommen Die Meßstrukturen besitzen l= 1,2,..,Lspektrale Signatu- ren. Die spektrale Signatur der Kalibriertargets unterscheiden sich von derjenigen der Meßstrukturen z.B. in Volumen, Durchmesser, Intensität oder in der Zahl der

spektralen Signaturen (l= 1,2,..,L+1). Die Bilder der optischen Schnitte werden für jede spektrale Signatur getrennt aufgenommen und gegebenenfalls noch der Un- tergrund korrigiert.

[0045] Zur Auswertung werden zum einen die Kali- briertargets identifiziert und der chromatische Versatz bestimmt. Dazu werden die Kalibriertargets unter jeder spektralen Signatur lokalisiert. Bei polychromatischen Kalibriertargets ergibt sich der spektrale Versatz aus der Differenz der Lokalisationen.

[0046] Zum anderen werden parallel zur oder im An- schluß an diese Kalibrierung die Meßstrukturen lokalisiert. Man bestimmt dabei in jeder spektralen Signatur zunächst unabhängig voneinander die Position der Schwerpunkte der gemessenen Intensitätssignale An- schließend werden die Lokalisationen um den aus den Kalibrierungsmessungen bekannten spektralen Versatz korrigiert.

[0047] Die korrigierten Positionen der Meßstrukturen werden in Bezug auf einen Vergleichspunkt angegeben.

Dieser Vergleichspunkt kann z.B. ein beliebig ausge- zeichneter fester Punkt im Objekt oder der Schwerpunkt eines Kalibriertargets (z.B. eine markierte Chromoso- menregionen) oder eines sonstwie ausgezeichneten Chromosomenterritoriums sein. Es kann aber auch die Schwerpunktskoordinate aller Meßstrukturen innerhalb eines Chromosomenterritoriums sein.

[0048] Die beschriebenen Meßverfahren für die konfokale Laser Scanning Mikroskopie können auch im Zu- sammenhang mit Axialtomographie durchgeführt werden. Dabei wird, wie in Beispiel 2 beschrieben, das biologische Mikroobjekt um einen definierten Winkel gedreht und pro Winkel ein kompletter 3D-Bildstapel aufgenommen Die Drehwinkelgröße wird so bestimmt, daß jeweils ein Abstand zwischen zwei Meßstrukturen maximal wird. Für jeden 3D Bildstapel wird dann, wie in Bei- spiel 2 beschrieben, verfahren. Der Vorteil der Drehung liegt darin, daß man einen Abstand auf die Lokalisierung zweier Punkte bezieht, die in der Lateralebene bestimmt wird und damit auf der Basis der schärfsten(steilsten) Punktbildfunktion

[0049] Anstatt wie vorstehend beschrieben die Kali- brierung und die Distanzmessung zwischen den zu ortenden Strukturen, d.h. Meßstrukturen, in demselben biologischen Objekt durchzuführen, kann man auch die Kalibrierung unabhängig von den Meßstrukturen an gleichartigen biologischen Objekten durchführen. Bei dieser Verfahrensvariante ist die Unterscheidung zwischen den Fluoreszenzsignalen der Kalibriertargets und denjenigen der Meßstrukturen erleichtert. Anhand der mit den Kalibriertargets ermittelten Werte des optischen Versatzes kann man Eichkurven für die Distanz- messungen zwischen den Meßstrukturen erstellen.

Derartige Eichkurven machen z.B. Angaben über den spektralen Versatz als Funktion von Brechungsindex und Absorption des verwendeten Immersionsmediums, der verwendeten Optik, Filter und Detektionseinheiten, der verwendeten Auswertealgorithmen, der verwende-

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ten biologischen Objekte, der axialen und lateralen Lo- kalisation der Meßstrukturen bzw. Kalibriertargets in ihnen etc. Die Verwendung der Information aus diesen speziellen Eichkurven zur erfindungsgemäßen Distanz- messung bietet sich insbesondere in solchgen Fällen an , bei denen einer größere Prazisionstoleranz verwendet erlaubt ist.

BEISPIEL 4: Distanzmessung zwischen Genab- schnitten von Chromosomen in einem Zellkern un- ter Verwendung eines Wellenfeldmikroskops [0050] Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Distanzmessung unter Einsatz der Wel- lenfeldmikroskopie ist praktisch identisch mit dem in Beispiel 3 beschriebenen Vorgehen Im Unterschied zum konfokalen Laser-Scanning Mikroskop ist hier die Lokalisierung in axialer Richtung wesentlich genauer als in lateraler, da hier die scharfste (steilste) Punktbild- funktion vorliegt. Durch Kombination mit Axialtomogra- phie kann die Genauigkeit der Positionsbestimmung und Distanzmessung noch gesteigert werden

BEISPIEL 5: Distanzmessung zwischen Genab- schnitten von Metaphasechromosomen in einem Zellkern unter Verwendung eines Laser-Scanning Flußfluorometers

[0051] Ein Laser-Scanning Flußfluorometer nutzt als Basisgerät ein Durchflußzytometer, wie es heute routi- nemäßig beispielsweise für Zellanalysen und -sortie- rung in der Immunologie oder Hämatologie eingesetzt wird. Dabei werden die biologischen Objekte in einem Flüssigkeitssystem so angeordnet, daß sie im Bereich der zentralen Trajektorie eines Flüssigkeitsstrahls, der frei oder in einer Küvette strömt, einzeln nacheinander durch einen oder mehrere Laserfoci geführt werden Die biologischen Objekte, im vorliegenden Beispiel die Me- taphasechrömosomen, sind spezifisch mit einem oder mehreren Fluoreszenzmarkern markiert und werden durch die Laserstrahlen selektiv zur Fluoreszenz angeregt. Diese wird üblicherweise in mehreren optischen Detektionskanälen, die durch spektrale Filter separiert sind, registriert und integral von Photomultipliern in ein entsprechendes verstärktes elektrisches Signal umge- setzt.

[0052] Um ortsaufgelöst in einer Richtung die Fluo- reszenzverteilung messen zu können, wurden sog. Slit- Scan Verfahren etabliert. Das biologische Mikroobjekt, hier Metaphasechromosomen, d.h. längliche Objekte von typischerweise 5 bis 15µm, wird von Flüssigkeits- strahl mit konstanter Geschwindigkeit durch einen oder mehrere Laserstrahlen geführt, die in Strömungsrich- tung so stark fokussiert sind, daß die Fluoreszenzver- teilung zeitabhängig entlang des Objektes gemessen wird. Aufgrund der bekannten Flußgeschwindigkeit kann das pro Dektektionskanal aufgenommene, eindimensionale, zeitabhängige Fluoreszenzprofil in eine

Ortsinformation transformiert werden Die Flußge- schwindigkeiten betragen typischerweise bis zu 10 m/

s, und es können bis zu einigen tausend Objekten pro Sekunde analysiert werden

[0053] Alle bisher in der Literatur beschriebenen Slit- Scan Systeme haben in Flußrichtung eine typische Fo- kusbreite (gemessen aus der effektiven Punktbildfunk- tion) von minimal etwa 2µm (= Auflosungsaquivalent), da aus prinzipiellen Gründen bei stärkerer Laserfokus- sierung die Fokustiefe stark abnimmt und somit eine gleichmäßige Auflösung im Bereich möglicher Partikel- trajektorien (typischerweise 10µm um die zentrale Ach- se des Flüssigkeitsstrahls) nicht mehr gewährleistet ist.

Hinzu kommt, daß bei den im Stand der Technik beschriebenen Verfahren nur ein eindimensionaler Scan möglich ist

[0054] Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Distanzmessung im Nanometerbereich wird ein im Prinzipaufbau bekanntes Laser-Scanning Flußfluorometer durch die folgend Anordnung (hier ex- emplarisch für einen Laser und einen Detektionskanal dargestellt) modifiziert:

[0055] Zwei kohärente Teilstrahlen des Lasers mit gleicher Intensitat und ebenen Wellenfronten werden unter einem kleinen Winkel zueinander in den Flüssig- keitsstrahl fokussiert und im Fokalbereich zur Interfe- renz gebracht. Es entsteht ein Muster aus konstruktiver und destruktiver Interferenz, wobei die Interferenzstrei- fen senkrecht zur Strömungsrichtung verlaufen Die Halbwertsbreite der Interferenzstreifen hängt nicht mehr von der Breite des Laserfokus, sondern nur noch von der Wellenlänge und dem Winkel der Laserteilstrah- len zueinander ab. Bei einem Winkel von 28°zwischen den beiden Teilstrahlen kann man für 500 nm Laserwel- lenlänge die Halbwertsbreite des Hauptinterferenzstrei- fens zu etwa 500 nm abschatzen.

[0056] Die Interferenzstreifen können mit der notwendigen Tiefe erzeugt werden, so daß alle möglichen Ob- jekttrajektorien des Flüssigkeitsstrahl mit gleicher Strei- fenbreite ausgeleuchtet werden.

[0057] Da mehrere Interferenzstreifen gleichzeitig erzeugt werden, ist die Objektinformation vieldeutig. Die bekannte Maßnahme der Rückfaltung der gemessenen Intensitätsverteilung mit dem Streifenmuster d.h. mit der Punktbildfunktion bringt hier keinen oder nur geringen Auflösungsgewinn gegenüber herkömmlichen Slit- Scan Verfahren, da aufgrund eines geeignet zu wählen- den Rauschfilters höhere Ortsfrequenzen und damit Auflösung verloren geht. Erfindungsgemäß wird statt- dessen wie folgt verfahren:

In die Detektionsoptik sind Schlitzblenden mit einem Schlitzverlauf parallel zur Orientierung der Interferenz- streifen einbaut. Mit geeigneten Linsen bilden diese Schlitzblenden nur diejenige Fluoreszenz auf den Pho- tomultiplier ab, die zwischen den beiden ersten Minima des Interferenzhauptstreifens angeregt wird. Im vorliegenden Beispiel können mit einem Aperturwinkel der Detektionsoptik von 19°(in Luft) und einem Minimalab-

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stand von ca. 1µm Objekttrajektorien von 6µm um die zentrale Flüssigkeitsachse mit nahezu gleicher optischer Auflösung beobachtet bzw. untersucht werden.

Um nicht nur eindimensionale Scans zu realisieren, wird der Detektionsschlitz in kleine Rechteckelemente aufgeteilt z.B. durch eine CCD-Zeile. Diesen CCD-Ele- menten können signalverstärkende optische Elemente vorgeschaltet sein. Günstigerweise ordnet man die CCD-Elemente in einem möglichst großen Kreisseg- ment um den Flüssigkeitsstrahl an. Die Detektionsoptik kann dann teilweise durch Mikrolinsen vor jedem Ele- ment ersetzt werden.

[0058] Eine Alternative besteht darin, bei einem Flüs- sigkeitsstrahl in z-Richtung eine Laseroptik aus Laser- strahl(en) in x-Richtung und Blende(n) und Detektor(en) in y-Richtung anzuordnen, wodurch man eine Verbes- serung der Auflösung in zwei Dimesionen erreicht. Bei Anordnung einer weiteren Laseroptik mit Laserstrahl (en) in y-Richtung und Blende(n) und Detektor(en) in x- Richtung erhält man eine Auflösungsverbesserung in drei Dimensionen.

[0059] Pro Detektionselement wird von dem Objekt, das sich beliebig orientiert und mit konstanter Ge- schwindigkeit im Flüssigkeitsstrahl durch den zentralen Laserinterferenzstreifen bewegt, ein Fluoreszenzprofil durch dieses Objekt aufgenommen. Kleine fluoreszierende Meßstrukturen bzw. Kalibriertargets in den biologischen Objekten erscheinen in den Scanprofilen als In- tensitätspeaks. Aus den Intensitätsmaxima und der Zu- ordnung der jeweiligen Scanprofilen zu den CCD-Ele- menten lassen sich die fluoreszenten Meßstrukturen bzw. Kalibriertargets im Objekt lokalisieren. Dies kann bei gleicher spektraler Signatur z.B. auf einen definierten Objektsbezugspunkt hin geschehen

[0060] Bei verschiedener spektraler Signatur kann man z.B. Laserstrahlen verschiedener Wellenlangen und/oder mehrere Detektionseinheiten verwenden Die- se werden dann versetzt entlang des Flüssigkeitsstrahls angeordnet. Durch Kalibrierung kann dann die Lokali- sation der einzelnen Meßstrukturen bzw. Kalibriertar- gets unterschiedlicher spektraler Signatur zueinander in Bezug gesetzt werden. Die Kalibrierung und Berech- nung erfolgt analog den vorstehend geschilderten Bei- spielen für die Epifluoreszenz- bzw konfokale Laser- Scanning-Mikroskopie.

BEISPIEL 6: Einsatz des erfindungsgemäßen Di- stanzmessungsverfahrens zur optischen Kontrolle von Anordnungen elektronischer Bauelemente (elektronischer Chips)

[0061] Bei der Anordnung von elektronischen Bauele- menten (elektronischen Chips) muß die planmäßige An- wesenheit bestimmter Bauelemente und deren geometrische Anordnung überprüft werden Da die handelsüb- lichen Chipabmessungen sehr gering sind und die einzelnen Bauelemente in enger Nachbarschaft zueinander liegen, sind die erforderlichen Kontrollverfahren

nach dem Stand der Technik extrem aufwendig und nicht immer zufriedenstellend genau.

[0062] Das erfindungsgemäße Distanzmessungsver- fahren ermöglicht nun eine Überprufung der vorgege- benen Anzahl und Anordnung der Bauelemente auf dem Chip auch in solchen Fällen, in denen der Minimal- abstand zwischen einzelnen Chips kleiner oder sogar sehr viel kleiner ist als die Halbwertsbreite des Haupt- maximums der effektiven Punktbildfünktion.

[0063] Hierzu werden die Bauelemente z.B. auf ihrer Oberfläche mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert, wobei zumindest diejenigen Bauelemente, deren Abstand untereinander kleiner als die Halbwertsbreite des Haupt- maximums der effektiven Punktbildfunktion ist, mit Fluo- reszenzfarbstoffen unterschiedlicher spektraler Signa- tur versehen werden.

[0064] Die Kontrolle der korrekten Anordnung der Bauelemente kann nun durch optische Analyse unter Einsatz des erfindungsgemäßen Distanzmessungsver- fahrens und unter Verwendung beliebiger Fernfeldmi- krosokopieverfahren durchgeführt werden, wobei anstelle der herkömmlicherweise notwendigen Objektive mit relativ sehr hoher numerischer Apertur von beispielsweise 1,3 nun ohne weiteres Objektive mit wesentlich geringerer numerischer Apertur eingesetzt werden können, ohne daß dadurch hier relevante Informa- tion verloren geht. Mit den Objektiven geringerer Aper- tur geht ein höherer Arbeitsabstand zwischen Objektiv und Untersuchungsobjekt einher, was die Handhabung wesentlich erleichtert und die Untersuchungen schnel- ler und sicherer macht. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann auch die vorschriftsmäßige Anordnung von solchen Bauelementen überprüft werden, deren Abstand untereinander kleiner als 200 nm ist. Das hat den Vorteil, daß auf den Einsatz von technisch sehr auf- wendigen optischen Nahfeldverfahren und/oder Verfah- ren der atomaren Kraftmikroskopie oder der Tunnel- elektronenmikroskopie verzichtet werden kann.

[0065] Anstelle von elektronischen Chips ist es eben- sogut möglich, DNA-Chips oder Protein-Chips in analo- ger Weise zu überprüfen.

Patentansprüche

1. Verfahren für die Fernfeldmikroskopie und Flußfluorometrie zur geometrischen Distanzmes- sung zwischen Objektstrukturen, wobei die Distan- zen geringer sein können als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfinkti- on,dadurch gekennzeichnet,

daß vor, während oder nach der Präparation des betreffenden Objekts auf einem bzw in einem Objekthalter die zu untersuchenden bzw.

zu ortenden Meßstrukturen mit Fluoreszenz- farbstoffen verschiedener oder gleicher spektraler Signatur markiert werden, wobei zumin-