der Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Parakrine Kommunikation von primären Fibroblasten und endothelialen Progenitorzellen im Kontext der Prävaskularisierung komplexer Gewebeäquivalente
Inauguraldissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Universitätsmedizin
der Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Vorgelegt von
Clara Yolanda Elisabetta Bader geb. Haslbauer aus Stuttgart
Mainz 2021
Wissenschaftlicher Vorstand:
1. Gutachter:
2. Gutachter:
Tag der Promotion: 07. Dezember 2021
I
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ...I Abkürzungsverzeichnis ... III Abbildungsverzeichnis ... IV Tabellenverzeichnis ... VI
1 Einleitung / Ziel der Dissertation ... 1
2 Literaturdiskussion ... 3
2.1 Tissue Engineering ... 3
2.2 Vaskularisierung ... 5
2.2.1 Aufbau eines Gefäßes ... 5
2.2.2 Vaskulogenese ... 6
2.2.3 Angiogenese ... 7
2.3 Prävaskularisierung von in vitro generiertem Gewebe ... 9
2.3.1 Endothelzellen für die Prävaskularisierung von Gewebeäquivalenten ... 9
2.4 Endotheliale Progenitorzellen ... 11
2.5 Einfluss der untersuchten Zytokine auf die Vaskularisierung ... 12
3 Material und Methoden ... 17
3.1 Material ... 17
3.1.1 Chemikalien ... 17
3.1.2 Kits ... 17
3.1.3 Verbrauchsmaterialien ... 17
3.1.4 Gebrauchsmaterialien... 17
3.1.5 Geräte ... 18
3.2 Methoden ... 18
3.2.1 Isolation der Fibroblasten ... 18
3.2.2 Isolation der endothelialen Vorläuferzellen ... 18
3.2.3 Kultur der Zellen ... 19
3.2.4 Im Rahmen dieser Arbeit durchgeführter ELISA ... 20
4 Ergebnisse ... 23
4.1 Einfluss der Kokultivierung auf die Zytokin-Sekretion durch ECFC und Fibroblasten ... 23
4.1.1 Ang-2 ... 23
4.1.2 VEGF, IL-8, eNOS und bFGF ... 25
Inhaltsverzeichnis
II 4.2 Einfluss der Kollagenmembran auf die Zytokin-Sekretion durch ECFC und Fibroblasten in
Kokultur ... 31
4.2.1 VEGF ... 31
4.2.2 IL-8 ... 33
4.2.3 eNOS ... 35
4.2.4 bFGF ... 37
4.2.5 Ang-2 ... 39
4.3 Vergleich des Sekretionsverhalten von HDMEC und ECFC ... 41
4.3.1 VEGF ... 41
4.3.2 IL-8 ... 44
4.3.3 eNOS ... 47
4.3.4 bFGF ... 50
4.3.5 Ang-2 ... 53
4.4 Zytokin-Sekretion im Rahmen der Prävaskularisierung eines Schleimhautäquivalentes unter Verwendung von HDMEC oder ECFC ... 56
5 Diskussion ... 58
5.1 Humorale Interaktion von Fibroblasten und ECFC ... 58
5.2 Einsatz von ECFC in der Prävaskularisierung von komplexen Gewebeäquivalenten ... 61
5.3 Abschließende Bewertung ... 69
6 Zusammenfassung ... 70
7 Literaturverzeichnis ... 72
8 Anhang – Werte der Abbildungen ... 80
9 Danksagung ... 89
10 Lebenslauf ... 90
III
Abkürzungsverzeichnis
Ang-1 Angiopoietin-1
Ang-2 Angiopoietin-2
bFGF basic fibroblast growth factor CFU-EC colony-forming-unit endothelial cell CAC circulating angiogenic cells
CXCR Interleukin-8 Rezeptor
DBPS dulbeccos phosphate buffered Saline ECFC endothelial colony forming cell EZM Extrazelluläre Matrix
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ELISA enzym linked immunosorbent assay eNOS Endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase EPC endothelial progenitor cell
HDMEC human dermal microvascular endothelal cell HIF Hypoxie induzierter Faktor
HRP horseradish peroxidase (Meerrettich Peroxidase) HUVEC human ubilical-vein endothelial cell
IL-8 Interleukin 8
MMP Matrix-Metalloproteinase
NO Stickstoffmonoxid
NOS Stickstoffmonoxid-Synthase
PBMC Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes VEGF vascular endothelial growth factor
VEGFR Rezeptor des VEGF
Abbildungsverzeichnis
IV
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Prinzip des Tissue Engineerings mittels cell seeding ... 4
Abbildung 2: Dreischichtiger Aufbau eines Gefäßes ... 6
Abbildung 3: Vaskulogenese ... 7
Abbildung 4: Sprossende Angiogenese ... 8
Abbildung 5 Intussuzeptives Wachstum ... 8
Abbildung 6: Einfluss der untersuchten Zytokine auf die postnatale Vaskulogenese ... 15
Abbildung 7: Einfluss der untersuchten Zytokine auf die Angiogenese ... 16
Abbildung 8: Insert-System ... 20
Abbildung 9: Durchführung ELISA ... 22
Abbildung 10: Ang-2-Sekretion durch Fibroblasten in Mono- und Kokultur ... 24
Abbildung 11: Ang-2-Sekretion durch ECFC in Mono- und Kokultur ... 24
Abbildung 12: Zytokin-Sekretion durch ECFC und Fibroblasten jeweils in Monokultur im Well ... 26
Abbildung 13: Zytokin Sekretion durch ECFC und Fibroblasten in Kokultur im Insert-System ohne Kontakt ... 28
Abbildung 14: Zytokin Sekretion durch ECFC und Fibroblasten in Kokultur im Insert-System mit Kontakt ... 30
Abbildung 15: VEGF-Sekretion durch ECFC und Fibroblasten in Kokultur auf der Kollagenmembran und in Kokultur im Insert-System mit Kontakt ... 31
Abbildung 16: VEGF-Sekretion durch ECFC und Fibroblasten in Kokultur auf der Kollagenmembran und in Kokultur im Insert-System ohne Kontakt ... 32
Abbildung 17: IL-8-Sekretion durch ECFC und Fibroblasten in Kokultur auf der Kollagenmembran und in Kokultur im Insert-System mit Kontakt ... 33
Abbildung 18: IL-8-Sekretion durch ECFC und Fibroblasten in Kokultur auf der Kollagenmembran und in Kokultur im Insert-System ohne Kontakt ... 34
Abbildung 19: eNOS-Sekretion durch ECFC und Fibroblasten in Kokultur auf der Kollagenmembran und in Kokultur im Insert-System mit Kontakt ... 35
Abbildung 20: eNOS-Sekretion durch ECFC und Fibroblasten in Kokultur auf der Kollagenmembran und in Kokultur im Insert-System ohne Kontakt ... 36
Abbildung 21: bFGF-Sekretion durch ECFC und Fibroblasten in Kokultur auf der Kollagenmembran und in Kokultur im Insert-System mit Kontakt ... 37
Abbildung 22: bFGF-Sekretion durch ECFC und Fibroblasten in Kokultur auf der Kollagenmembran und in Kokultur im Insert-System ohne Kontakt ... 38
Abbildung 23: Ang-2-Sekretion durch ECFC und Fibroblasten in Kokultur auf der Kollagenmembran und in Kokultur im Insert-System mit Kontakt ... 39
Abbildung 24: Ang-2-Sekretion durch ECFC und Fibroblasten in Kokultur auf der Kollagenmembran und in Kokultur im Insert-System ohne Kontakt ... 40
Abbildung 25: VEGF-Sekretion durch HDMEC und ECFC jeweils in Kokultur mit Fibroblasten auf der Kollagenmembran ... 41
V Abbildung 26: Vergleich der VEGF-Sekretion durch HDMEC und ECFC in verschiedenen Kulturen . 43 Abbildung 27: IL-8-Sekretion durch HDMEC und ECFC jeweils in Kokultur mit Fibroblasten auf der
Kollagenmembran ... 44 Abbildung 28 Vergleich der IL-8-Sekretion durch HDMEC und ECFC in verschiedenen Kulturen ... 46 Abbildung 29: eNOS-Sekretion durch HDMEC und ECFC jeweils in Kokultur mit Fibroblasten auf der
Kollagenmembran ... 47 Abbildung 30: Vergleich der eNOS-Sekretion von HDMEC und ECFC in verschiedenen Kulturen .... 49 Abbildung 31: bFGF-Sekretion durch HDMEC und ECFC jeweils in Kokultur mit Fibroblasten auf der
Kollagenmembran ... 50 Abbildung 32: Vergleich der bFGF-Sekretion durch HDMEC und ECFC in verschiedenen Kulturen . 52 Abbildung 33. Ang-2-Sekretion durch HDMEC und ECFC jeweils in Kokultur mit Fibroblasten auf der
Kollagenmembran ... 53 Abbildung 34: Vergleich der Ang-2-Sekretion von HDMEC und ECFC in verschiedenen Kulturen .... 55 Abbildung 35: Zytokin-Sekretion durch Endothelzellen und Fibroblasten in Kokultur auf der
Kollagenmembran ... 57
Tabellenverzeichnis
VI
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Zytokin-Sekretion der unterschiedlichen Endothelzellen unter verschiedenen Kulturbedingungen ... 62
1
1 Einleitung / Ziel der Dissertation
Das Gebiet des Tissue Engineering beschäftigt sich mit der in vitro-Generierung von Geweben.
Mittels einer Biopsie werden einem Patienten lebende Zellen entnommen. Diese werden kultiviert, um aus ihnen ein Gewebe herzustellen. Dieses aus seinen eigenen Zellen hergestellte Gewebe kann dem Patienten reimplantiert werden, um beispielsweise eine Verletzung abzudecken (Berthiaume et al., 2011). Da hierfür lediglich Zellen benötigt werden und keine größeren Gewebe, kann dem Patienten ein chirurgischer Eingriff zur Gewebegewinnung erspart werden. Ein chirurgischer Eingriff geht mit Risiken wie Schmerzen, Wundheilungsstörungen und Sensibilitätsverlust einher. Daher ist es für den Patienten von Vorteil, wenn er diesem entgehen kann. Durch diesen Vorteil gilt aus Tissue Engineering gewonnenes Gewebe als vielversprechende Alternative für autologe Transplantate.
Ein in vitro generiertes Gewebe, das einen klinischen Nutzen haben soll, muss eine gewisse Größe aufweisen. Wenn es gelingt, ein ausreichend großes Gewebe herzustellen, muss dieses mit Nährstoffen und Sauerstoff versorgt werden. Die Versorgung hiermit erfolgt über die Durchblutung (Ko et al., 2007). Unterbleibt diese, stirbt das Gewebe ab und es kommt zu Nekrosen. Die Lösung und gleichzeitig Herausforderung stellt die Prävaskularisierung des Gewebes in vitro dar: Wenn schon in der Herstellung des Gewebes Gefäße entstehen, kann dem Patienten ein Material implantiert werden, das bereits ein funktionierendes Gefäßnetz enthält. Dieses muss sich nur noch mit dem bestehenden Gefäßsystem des Patienten verbinden (Kim et al., 2016). Damit wird die Zeit, in der das Gewebe ohne Nährstoffversorgung ist, verkürzt und die Chance zu überleben erhöht.
In Vorarbeiten der Arbeitsgemeinschaft von Prof. Brenner ist es bereits gelungen, ein prävaskularisiertes komplexes Schleimhautäquivalent zu generieren. Auch die Anbindung an das Gefäßsystem in vivo war erfolgreich (Schulze, 2016, Bauer, 2017, Heller et al., 2016). Dies erfolgte in unterschiedlichen Kulturen von oralen Epithelzellen, Fibroblasten und Endothelzellen auf einer Kollagenmembran. Die Endothelzellen sind in den Kokulturen notwendig, damit Gefäße entstehen können. In diesen Versuchen wurden humane dermale mikrovaskuläre Endothelzellen (HDMEC) verwendet, die aus Vorhaut gewonnen wurden. Da diese Zellen für die Verwendung in der Gynäkologie nicht geeignet sind, erfolgten bereits Versuche mit endothelialen Progenitorzellen (EPC). Diese haben gegenüber den HDMEC den
Einleitung / Ziel der Dissertation
2 Vorteil, dass sie aus peripherem Blut gewonnen werden können. Dadurch ist für Patienten nur eine venöse Blutentnahme notwendig und sie können Anwendung in der Gynäkologie finden.
Während der Entstehung von Gefäßen kommunizieren die einzelnen Zellen über die Sekretion von sogenannten Zytokinen miteinander. Diese Zytokine beeinflussen sowohl das Wachstum der Zelle selbst als auch das der benachbarten Zellen (autokrin und parakrin) (Neufeld and Kessler, 2006). Ziel der vorliegenden Dissertation ist die Untersuchung der Zellkulturüberstände von verschiedenen Kulturen aus endothelialen Vorläuferzellen und Fibroblasten auf ihre sezernierten Zytokine. Hieraus erhofft man sich neue Erkenntnisse zur zellulären Kommunikation dieser Zellen im Rahmen der Vaskularisierung
Da die endothelialen Vorläuferzellen eine vielversprechende Alternative zu den HDMEC darstellen, wird das Sekretionsverhalten dieser beiden Zellarten miteinander verglichen.
Möchte man die HDMEC auf Dauer durch endotheliale Vorläuferzellen ersetzen, muss man das sekretorische Verhalten der Zellen verstehen. Ein besseres Verständnis der zellulären Kommunikation und der Eigenschaften von endothelialen Vorläuferzellen ermöglicht die Optimierung der Prävaskularisierung von in Tissue Engineering generierten Geweben.
3
2 Literaturdiskussion
2.1 Tissue Engineering
Tissue Engineering bezeichnet ein Verfahren, das zur in vitro-Herstellung eines physiologischen Gewebes aus lebenden Zellen dient. Damit möchte man Gewebedefekte, die durch Krankheiten, Verletzungen oder Operationen entstehen können, im Heilungsprozess unterstützen und rekonstruieren. Bisher musste man solche Gewebedefekte mit Transplantaten, die entweder von einem Spender oder vom Patienten selbst (autolog) stammten, versorgen. Die Transplantatgewinnung erfolgt mittels eines chirurgischen Eingriffs, der Risiken birgt und es besteht die Gefahr einer Narbenbildung. Bei der Verwendung von Fremdmaterial ist man zusätzlich auf einen Spender angewiesen und es besteht die Gefahr einer Abstoßungsreaktion durch den Empfänger (Langer and Vacanti, 1993).
Dieser Problematik möchte man durch das Tissue Engineering entgehen. Dafür werden dem Patienten mittels einer Biopsie Zellen entnommen. Diese Zellen werden nach der Entnahme vermehrt und durch verschiedene technische Verfahren entstehen daraus funktionsfähige Gewebe. Dieses Gewebe wird dem Patienten zur Defektdeckung transplantiert (Abb. 1). Damit kann man dem Patienten einen Eingriff zur Gewebegewinnung ersparen und einer Abstoßungsreaktion entgehen, da körpereigene Zellen eingesetzt werden (Berthiaume et al., 2011).
Um aus den kultivierten Zellen ein vollständiges Gewebe zu erhalten, gibt es verschiedene technische Ansätze: Eine Möglichkeit ist die Generierung von Spheroiden. Hierbei werden unterschiedliche Zellarten in einer bestimmten 3D-Kultur in Kontakt gebracht und bilden dadurch runde Zellansammlungen aus. Durch die Form haben die Zellen engen Kontakt miteinander und imitieren die in vivo-Bedingungen (Buno et al., 2016). Bei der cell sheet Technik werden einfache Lagen von Zellen kultiviert. Nach einer gewissen Zeit werden mehrere dieser Lagen übereinandergelegt, wodurch man ein mehrschichtiges Gebilde erhält (Cerqueira et al., 2014). Die für diese Arbeit relevante Technik ist die des cell seedings (Abb. 1).
Hierbei werden Zellen nach der Isolation und Proliferation auf ein Gerüst aus Kollagen, das sogenannte Scaffold, ausgesät. Das Scaffold imitiert die extrazelluläre Matrix (EZM). Durch chemische und mechanische Stimulation entsteht aus den Zellen auf dem Kollagengerüst ein funktionsfähiges Gewebe. Dieses kann den Patienten, von dem die Zellen isoliert wurden,
Literaturdiskussion
4 implantiert werden (Abb. 1). Der Vorteil an dieser Technik ist die bereits bestehende 3D- Struktur des Scaffolds (Laschke and Menger, 2016).
Abbildung 1: Prinzip des Tissue Engineerings mittels cell seeding
Einem Patienten, der einen Gewebedefekt aufweist, wird eine Biopsie entnommen, aus der Zellen isoliert werden. Diese Zellen werden kultiviert und vermehrt. Nach der Proliferation werden sie auf ein Gerüst aus Kollagenen gegeben. Durch mechanische und chemische Stimulation entsteht ein funktionsfähiges Gewebe, das dem Patienten zur Defektdeckung reimplantiert wird. Modifiziert nach Asadian et al. (Asadian, 2020).
Der Begriff Tissue Engineering ist seit 1987 etabliert, auch wenn bereits vorher Versuche auf diesem Gebiet erfolgten. So arbeitete man seit den 1970er Jahren daran, Hautersatz herzustellen, der bei Verletzungen oder Verbrennungen die Wunde abdecken sollte.
Mittlerweile gibt es eine große Anzahl verschiedener Hautersatze, die klinisch verwendet werden (Kaul and Ventikos, 2015). Auch Schleimhaut, insbesondere orale Schleimhaut, stellt einen Fokus der Forschungen im Tissue Engineering dar. Sie spielt unter anderem in der Gynäkologie und der Urologie eine wichtige Rolle für die Abdeckung von Gewebedefekten (Caldamone et al., 1998, Chan et al., 2017). Um den Patienten die Entnahme großer Teile Schleimhaut aus dem Mund zu ersparen und damit verbundene Risiken zu minimieren, gibt es bereits erfolgreiche Verfahren, mittels Tissue Engineering hergestellte Schleimhaut zu verwenden (Barbagli et al., 2018).
Auch die Versuche unserer Arbeitsgruppe beschäftigen sich mit der Generierung von Schleimhautäquivalenten, wobei der Schwerpunkt auf der Prävaskularisierung dieser Gewebe liegt (Heller et al., 2016). Gelingt es, im Rahmen des Tissue Engineering ein Gewebe zu generieren, werden während der in vitro-Kultur die Zellen permanent mit Sauerstoff und
5 Nährstoffen versorgt. Durch den Mediumwechsel werden Zellabfälle regelmäßig entfernt und neue Nährstoffe geliefert. Diese Funktionen müssen auch nach der Implantation des Gewebes in den Empfänger gewährleistet werden, um einen Untergang des Gewebes zu verhindern. Da die Versorgung über Diffusion nur über eine Strecke von 150-200 µm sichergestellt werden kann (Folkman and Hochberg, 1973), muss eine rasche Anbindung an das Gefäßsystem und damit an die Blutversorgung des Empfängers erfolgen (Laschke and Menger, 2016). Bei all den Erfolgen, die bisher im Tissue Engineering verzeichnet werden konnten, stellt diese Anbindung an das Gefäßsystem den limitierenden Faktor dar (Kim et al., 2016).
2.2 Vaskularisierung
2.2.1 Aufbau eines Gefäßes
Die Gefäße des menschlichen Körpers werden in Arterien, Venen und Kapillaren unterschieden (Welsch, 2014, Schünke et al., 2018). Sie alle transportieren das Blut im Körper, wobei die Arterien das Blut vom Herzen weg transportieren, die Venen das Blut zum Herzen zurückführen und die dazwischen geschalteten Kapillaren in den Organen den Stoffaustausch gewährleisten. Mit dem Blut werden Sauerstoff und Nährstoffe zu den Organen transportiert und Stoffe, die durch Stoffwechsel anfallen, aus den Organen abtransportiert (Welsch, 2014).
Arterien und Venen bestehen alle aus drei Schichten (Abb. 2):
• Tunica interna
• Tunica media
• Tunica externa
Die innerste Schicht – die Tunica interna – besteht aus einer Endothelzellschicht, einer bindegewebigen Subendothelialschicht und der Membrana elastica interna. Die Endothelzellschicht kleidet das Gefäß von innen aus.
Die Tunica media besteht aus einer ringförmigen Schicht aus glatten Muskelfasern und der Membrana elastica externa.
Die Tunica externa, die auch Adventitia genannt wird, besteht aus lockerem Bindegewebe.
Dieses bettet das Gefäß in das umgebende Gewebe ein. Sie enthält sowohl elastische Fasern als auch Vasa vasorum, die die großen Gefäße mit Sauerstoff versorgen.
Der Unterschied zwischen Arterien und Venen liegt in der Dicke der jeweiligen Schichten (Welsch, 2014, Schünke et al., 2018).
Literaturdiskussion
6 Die Kapillaren besitzen keine Muskelschicht, sondern sind nur aus einer Endothelschicht und einer Basalmembran aufgebaut. Dieser Wandaufbau ermöglicht die Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen, da diese die dünne Wand überwinden können (Schünke et al., 2018).
Abbildung 2: Dreischichtiger Aufbau eines Gefäßes
Das Lumen eines Gefäßes wird durch eine Endothelzellschicht ausgekleidet. Zusammen mit subendothelilalem Bindegewebe und der Membrana elastica interna bildet sie die Tunica interna. An sie schließt sich die Tunica media aus glatter Muskulatur und der Membrana elastica externa an. Die Tunica externa aus lockerem Bindegewebe bettet das Gefäß in das umliegende Gewebe ein (Schünke et al., 2018).
2.2.2 Vaskulogenese
Vaskulogenese beschreibt die Bildung neuer Blutgefäße aus Angioblasten in der Embryonalentwicklung. Als Angioblast wird die Vorläuferzelle von Endothelzellen bezeichnet (Welsch, 2014). Da die entstehenden Organe mit Sauerstoff und Nährstoffen versorgt werden müssen, ist die Ausbildung des Gefäßsystems ein Entwicklungsschritt, der sehr früh in der Embryonalentwicklung abläuft: Nach der Gastrulation (der Entstehung der dreiblättrigen Keimscheibe) differenzieren sich aus mesodermalen Zellen die Angioblasten aus, die sich als sogenannte Blutinseln ansammeln. Die inneren Zellen der Blutinseln entwickeln sich zu Blutzellen, während sich die äußeren zu Endothelzellen weiterentwickeln und das eigentliche Gefäß bilden (Ribatti et al., 2015) (Abb. 3). Aufgrund dieser engen Entwicklung geht man von einem gemeinsamen Vorläufer – dem Hämangioblasten - sowohl für die Entstehung der Blutzellen als auch der Endothelzellen aus (Risau and Flamme, 1995).
7
Abbildung 3: Vaskulogenese
Schematische Darstellung der Vaskulogenese (modifiziert nach Ribatti et al., 2015). Zuerst formen sich Blutinseln aus Hämangioblasten, dem gemeinsamen Vorläufer von Endothel- und Blutzellen. Unter dem Einfluss von VEGF bilden die Angioblasten eine äußere Schicht, die dem späteren Gefäß entsprechen. Von dem primitiven Gefäß aus Angioblasten umgeben, liegen die Blutzellen in der Mitte.
Die beschriebenen Mechanismen beziehen sich nur auf die Embryonalentwicklung. Es gibt jedoch auch eine postnatale Vaskulogenese. Dies spielt unter anderem eine Rolle bei der Vaskularisierung von Tumoren (Ribatti et al., 2001). Hierbei spielen statt der Hämangioblasten die endotheliale Vorläuferzellen (EPC) eine entscheidende Rolle (Asahara et al., 1997). Unter hypoxischen Bedingungen werden Zytokine freigesetzt, die eine Mobilisierung der EPC aus dem Knochenmark an den Ort der Hypoxie bewirken. Dort wandern sie in das Gewebe ein und bilden ebenfalls durch die Zytokinwirkung neue Gefäße aus (Balaji 2013).
2.2.3 Angiogenese
Unter Angiogenese versteht man die Weiterentwicklung eines primitiven Kapillarnetzes zu einem ausgereiften Gefäßsystem (Schmidt et al., 2010). Man unterscheidet hierbei den sprossenden und den nicht-sprossenden Mechanismus (Intussuszeption):
Bei der sprossenden Angiogenese werden Endothelzellen unter anderem von vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF) und fibroblastischem Wachstumsfaktor (bFGF) stimuliert, bestimmte Proteasen zu sezernieren (Cross and Claesson-Welsh, 2001). Proteasen sind Enzyme, die Proteine spalten (Barrett and McDonald, 1986). Die hier beschriebenen Proteasen spalten die Basalmembran und lockern sie dadurch auf. Durch die Auflockerung der Basalmembran können Endothelzellen in die EZM invadieren. Dort proliferieren sie und differenzieren durch Reorganisation zu neuen Gefäßen (Abb. 4). Im Anschluss wird eine neue Basalmembran gebildet und Zytokine wie Angiopoietin-1 (Ang-1) werden ausgeschüttet.
Dadurch angelockte Perizyten stabilisieren das ausgesprosste Gefäß (Risau, 1997, Cross and Claesson-Welsh, 2001).
Literaturdiskussion
8
Abbildung 4: Sprossende Angiogenese
Dargestellt ist die sprossende Angiogenese (modifiziert nach Ribatti et al., 2015). Unter dem Einfluss von VEGF sezernieren Endothelzellen bestimmte Proteasen. Diese lösen die Basalmembran auf. Dadurch ist eine Invasion der Endothelzellen in die Umgebung möglich. Durch Reorganisation bilden sie neue Gefäße, die durch eine Basalmembran und durch Zytokine angelockte Perizyten stabilisiert werden.
Die nicht sprossende Angiogenese wird als intussuzeptives Wachstum bezeichnet. Dabei trennen sich bestehende Gefäße durch Einwachsen von Gewebebrücken auf (Abb. 5). Diese Gewebebrücken aus Bindegewebszellen teilen das Gefäß in zwei Lumina und trennen es am Schluss in zwei Gefäße auf (Ribatti et al., 2015). Sprossende und nicht sprossende Angiogenese kann parallel vorliegen und hängt teilweise von dem Organ ab, in dem die Angiogenese stattfindet (Risau, 1997).
Abbildung 5 Intussuzeptives Wachstum
Dargestellt ist das nicht sprossende Wachstum von Kapillaren (modifiziert nach Ribatti et al., 2015). In bestehenden Kapillaren bilden sich Gewebsbrücken aus Bindegewebszellen, die das Lumen des Gefäßes teilen.
Dadurch entsteht ein neues Lumen. Das Gefäß trennt sich in zwei neue Gefäße auf.
Auch die Angiogenese spielt eine wesentliche Rolle bei der Embryonalentwicklung. Jedoch kann auch sie postnatal vorkommen, was physiologischerweise im weiblichen Menstruationszyklus und bei der Wundheilung der Fall ist (Ribatti et al., 2001, Schmidt et al.,
9 2010). Vaskulogenese und Angiogenese kann man in vivo nicht strikt voneinander trennen, da sie teilweise parallel ablaufen (Ribatti et al., 2015).
2.3 Prävaskularisierung von in vitro generiertem Gewebe
Eine Möglichkeit, die Anbindung des im Tissue Engineering gewonnenen Gewebes an das Gefäßnetz nach Implantation zu verbessern, besteht darin, Modifikationen am Scaffold vornehmen. Dies ist beispielsweise durch Veränderung der Porengröße (Choi et al., 2013) oder die Beimpfung mit proangiogenen Wachstumsfaktoren (Kirkpatrick et al., 2011) möglich.
Unser Ziel ist es jedoch, nicht nur die Gefäßanbindung nach Implantation zu verbessern, sondern bereits in vitro ein funktionierendes Gefäßnetz auszubilden. Dadurch muss das Gefäßnetz des Implantates nur noch an das Empfänger-Gefäßnetz anastomisieren. Hierfür ist bereits in vitro bei der Herstellung des Gewebes die Verwendung von Zellen notwendig, die in der Lage sind, Gefäße zu bilden.
2.3.1 Endothelzellen für die Prävaskularisierung von Gewebeäquivalenten
In der Prävaskularisierung von Geweben, die durch Tissue Engineering hergestellt wurden, spielen Endothelzellen eine essentielle Rolle (Baiguera and Ribatti, 2013, Baldwin et al., 2014, Rouwkema and Khademhosseini, 2016). Es wurden Versuche zur Prävaskularisierung im Rahmen des Tissue Engineering mit unterschiedlichen Endothelzellen durchgeführt, die sich hinsichtlich ihres Wachstums, ihrer Differenzierung und der Migrationsfähigkeit unterschieden (Baiguera and Ribatti, 2013).
Bereits 1998 gelang es, ein prävaskularisiertes Hautäquivalent herzustellen, indem Endothelzellen, Keratinozyten und Fibroblasten kokultiviert wurden (Black et al., 1998).
Verwendet wurden Endothelzellen aus der menschlichen Nabelschnurvene, die sogenannten human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). HUVEC können zwar einfach gewonnen werden, die durch sie gebildeten Gefäße sind allerdings instabil und nicht immunkompatibel (Baiguera and Ribatti, 2013). Unser Ziel ist es, ein Gewebe aus autologen Zellen zu generieren.
Dies ist mit HUVEC nicht möglich, da hierfür die Nabelschnur des Patienten vorliegen müsste.
HDMEC aus der Haut sind ein weiterer Ansatzpunkt. Für die Wundabdeckung von Hautdefekten wurden mittels Cell Sheet-Technologie Keratinozyten, Fibroblasten und HDMEC aus menschlicher Haut verwendet, um das Hautäquivalent zu prävaskularisieren (Cerqueira et al., 2014). Auch für die Prävaskularisierung von Knochengewebe wurden HDMEC aus der Haut
Literaturdiskussion
10 verwendet (Wenz et al., 2018). Die bisherigen Erfolge in der Arbeitsgruppe um Frau Professor Brenner, ein prävaskularisiertes Schleimhautäquivalent herzustellen, das sich in vivo an das bestehende Gefäßnetz anschloss, erfolgten ebenfalls unter Verwendung von HDMEC (Heller et al., 2016).
Die HDMEC hierfür stammen aus Vorhaut, weshalb sie in der Gynäkologie keine Anwendung finden können. Für die Gewinnung der HDMEC aus Vorhaut oder auch von anderen Hautstellen ist ein invasiver Eingriff notwendig, wodurch eine Wunde entsteht. Des Weiteren gehören die HDMEC zu den ausgereiften Endothelzellen. Dadurch entdifferenzieren sie nach wenigen Passagen. Aus diesen Gründen sind sie nicht optimal geeignet, um längerfristig für die Prävaskularisierung von Gewebeäquivalenten verwendet zu werden (Baiguera and Ribatti, 2013).
Aufgrund der beschriebenen Schwierigkeiten in der Verwendung von reifen Endothelzellen gewinnen die EPC an Bedeutung. Sie haben den Vorteil, dass sie minimalinvasiv aus peripherem Blut gewonnen werden, sich in alle möglichen Arten von Kapillaren entwickeln können und ein hohes proliferatives Potential aufweisen (Peters, 2018). Im Jahr 2004 gab es erste Versuche mit EPCs, die aus Nabelschnurblut (Wu et al., 2004) oder aus peripherem Blut gewonnen wurden, in vitro Gefäße herzustellen. Im Jahr 2008 gelang es, aus Kulturen von EPCs aus Nabelschnurblut und peripherem Blut in Kokultur mit mesenchymalen Stammzellen der Maus Gefäße auszubilden. Während aus den EPC der Nabelschnur schnell stabile Gefäße gebildet wurden, blieben die aus dem peripheren Blut instabil (Au et al., 2008). In weiteren Versuchen wurden anstelle der murinen Stammzellen, Stammzellen aus dem menschlichen Knochenmark verwendet. Bei diesen Versuchen zeigte sich, dass sowohl die EPC aus Nabelschnurblut als auch die aus peripherem Blut in der Lage sind, stabile Gefäße auszubilden (Melero-Martin et al., 2008).
Aufgrund des vielversprechenden Potentials von EPC wurde anknüpfend an die erfolgreiche Prävaskularisierung eines Schleimhautäquivalentes in unserer Arbeitsgruppe um Frau Professor Brenner in weiterführenden Versuchen die HDMEC durch EPC ersetzt (Schulze, 2016). Hierbei wurden durch Kokulturen von EPC und Fibroblasten auf einer kollagenhaltigen Matrix gefäßähnliche Strukturen nachgewiesen.
11
2.4 Endotheliale Progenitorzellen
EPC sind Vorläuferzellen, die an der Vaskulogenese (Kap. 2.2.2) beteiligt sind. Sie wurden erstmals im Jahr 1997 von Asahara et al beschrieben. Bis zu diesem Zeitpunkt bestand die Meinung, dass postnatale Ausbildung von Blutgefäßen nur über die Angiogenese, also aus bereits vorhandenen Gefäßen, möglich ist (Asahara et al., 1997). Jedoch ebnete diese Entdeckung den Weg zum heutigen Wissen, dass Vorläuferzellen in der Lage sind, Gefäße zu bilden (Basile and Yoder, 2014). Als EPC werden eine heterogene Gruppe von Zellen bezeichnet, die zur Fraktion der mononukleären Zellen des peripheren Blutes gehören. Jedoch sind nur ein Teil von ihnen tatsächliche Vorläuferzellen:
Die colony-forming unit-endothelial cells (CFU-ECs), die circulating angiogenic cells (CACs) und endothelial colony forming cells (ECFC) werden alle zu den EPC gezählt. Sie können aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) kultiviert werden. Sie unterscheiden sich in der Art der Kultivierung und werden aufgrund der Reifezeiten in early outgrowth und late outgrowth unterteilt. Die CFU-ECs und die CACs zählen zu den early outgrowth EPCs. Sie sezernieren Zytokine wie VEGF und IL-8. Durch diese Wachstumsfaktoren entfalten diese Zellen ihr proangiogenes Protential (Hur et al., 2004, Prater et al., 2007). Die ECFC, die den late outgrowth EPCs entsprechen, werden als die eigentlichen endothelialen Vorläuferzellen angesehen (Liu et al., 2012, Basile and Yoder, 2014). In vivo bilden sie de novo Gefäße mit einem Lumen aus. In vitro formen sie kapillarähnliche Strukturen aus und haben ein hohes proliferatives Potential.
ECFC können aus Nabelschnurblut oder peripherem Blut gewonnen werden. Da im peripheren Blut nur eine ECFC unter einer Million mononukleärer Zellen vorkommt, ist die Isolation sehr aufwändig (Yoder et al., 2007). Man kann ECFC über durchflusszytometrische Analyse von Oberflächenmarkern identifizieren oder schon bei der Kultur der Zellen wie oben genannt selektionieren (Tura et al., 2013). ECFC bilden Oberflächenmarker wie reife Endothelzellen, aber keine hämatopoietischen Marker aus (Yoder et al., 2007, Tura et al., 2013). Daher postulieren Tura et al, dass die ECFC entgegen der bisherigen Meinung keine Vorläuferzellen aus dem Knochenmark (Balaji et al., 2013), sondern Endothelzellen mit der Fähigkeit zur Proliferation sind. Green et al. haben aus der Endothelzellschicht der Vena saphena magna ECFC isoliert (Green et al., 2017). Damit stützen sie diese These und widerlegen die bisherige Meinung, dass die Endothelschicht nur aus ausdifferenzierten Zellen besteht.
Literaturdiskussion
12 Unabhängig davon, welche Endothelzellart verwendet wird, spielen bei der Gefäßneubildung verschiedene Zytokine eine wichtige Rolle. Diese entfalten auf unterschiedliche Art ihre proangiogene Wirkung bei der Angiogenese und der Vaskulogenese.
2.5 Einfluss der untersuchten Zytokine auf die Vaskularisierung
Ein Wachstumsfaktor, der sowohl für die Vaskulo- als auch die Angiogenese essentiell ist, ist das VEGF (Moens et al., 2014, Ribatti et al., 2015, Simons et al., 2016). Es gibt die fünf Untergruppen VEGF-A bis E (Schmidt et al., 2010). Der wichtigste Stimulus, der zur Expression von VEGF führt, ist Hypoxie. Unter Hypoxie kann ein bestimmtes Protein, der so genannte Hypoxie induzierbare Faktor (HIF), nicht abgebaut werden, da die hierfür benötigte Reaktion sauerstoffabhängig ist. Liegt HIF vor, wird die Expression von VEGF verstärkt. Dies erklärt, weshalb unter Hypoxie die Vaskularisierung gesteigert ist (Schmidt et al., 2010, Zimna and Kurpisz, 2015).
VEGF entfaltet seine Wirkung über verschiedene Rezeptoren. Dazu gehören die VEGFR1-3 sowie weitere Co-Rezeptoren. VEGFR1-3 haben die Funktion einer Rezeptortyrosinkinase, wobei VEGFR2 die stärkste Signaltransduktion bewirkt und damit den größten Einfluss auf die Vaskularisierung hat (Cross and Claesson-Welsh, 2001, Shibuya, 2013). Nach Bindung an den Rezeptor werden verschiedene Signalwege wie der PLCγ-ERK1/2-Signalweg aktiviert. Hierüber wird die Transkription beeinflusst (Simons et al., 2016) und VEGF kann seine Wirkungen auf die Gefäßentwicklung entfalten, die im Rahmen der Embryogenese unabdingbar ist. Mäuse, deren Gen für den VEGFR inaktiviert wurde, sterben in der Embryonalentwicklung, da sie keine Gefäße ausbilden können (Shalaby et al., 1995). VEGF wird hierbei sowohl für die Angiogenese als auch die Vaskulogenese benötigt (Asahara et al., 1999). Einfluss auf die frühe Angiogenese nimmt VEGF über die permeabilitätssteigernde Wirkung auf Kapillaren und Mikrogefäße (Dvorak, 2002, Moens et al., 2014, Ribatti et al., 2015) (Abb. 7). Des Weiteren werden die Migration und die Proliferation von Endothelzellen durch VEGF gesteigert sowie Zelladhäsion, Vasodilatation und Apoptoserate beeinflusst (Simons et al., 2016). Auf die Vaskulogenese nimmt VEGF Einfluss, indem es chemotaktisch auf EPC wirkt (Asahara et al., 1999) (Abb. 6).
Damit mobilisiert es in vivo die EPC in das ischämische Gebiet und bewirkt dort die Ausbildung neuer Gefäße, wodurch die Versorgung mit Sauerstoff erfolgen kann (Moens et al., 2014).
Nach abgeschlossener Gefäßbildung fällt die Menge an sezerniertem VEGF ab. Es wird dann
13 nur noch eine basale Menge VEGF ausgeschüttet, um die Homöostase zu gewährleisten (Moens et al., 2014).
Eine ähnliche Wirkung auf die Angiogenese entfaltet das Chemokin Interleukin-8 (IL-8), das von Makrophagen, Leukozyten und Endothelzellen sezerniert wird. Ursprünglich als Entzündungsmediator bekannt, wurde 1992 erstmals seine proangiogene Wirkung beschrieben (Koch et al., 1992, Xie, 2001). Diese Wirkung entfaltet IL-8 über zwei Rezeptoren, die CXCR1 und CXCR2. Sie sind G-Protein gekoppelte Rezeptoren und aktivieren über Konformationsänderung ihre Signaltransduktion. Diese steigert die Migrationsfähigkeit und die Proliferation von Endothelzellen, während die Apoptoserate reduziert wird (Li et al., 2003, Waugh and Wilson, 2008, Keeley et al., 2011).
Unter der Wirkung von IL-8 sezernieren Endothelzellen verstärkt Matrix-Metalloproteinasen (MMP). Diese degradieren die Basalmembran und nehmen damit einen wichtigen Einfluss auf die frühe Angiogenese (Abb. 7). Ebenfalls fördert es die Proliferation von Endothelzellen. Diese Wirkungen von IL-8 auf Endothelzellen entfalten sich nicht nur als parakrine Effekte, sondern auch als autokrine, indem die Endothelzellen selbst das IL-8 ausschütten, welches dann an den CXCR auf der Endothelzelloberfläche bindet (Li et al., 2005). Einfluss auf die frühe Angiogenese nimmt IL-8 nicht nur über die Sekretion von MMP, sondern auch über eine VEGF-unabhängige Phosphorylierung des VEGFR2. Dies erfolgt über eine Transaktivierung nach der Bindung von IL-8 an seine beiden Rezeptoren (Petreaca et al., 2007). Durch diese Wirkung auf den VEGFR2 wird zusätzlich zu den oben beschriebenen Wirkungen auf die Endothelzellen die Permeabilität der Gefäße gesteigert.
Hinsichtlich der Wirkung von IL-8 auf endotheliale Progenitorzellen - und damit auf die Vaskulogenese - herrscht Uneinigkeit. Während ECFC aus Nabelschnurblut beschrieben wurden, die CXCR1 und CXCR2 exprimieren (Kimura et al., 2011), konnte die Arbeitsgruppe um Smadja diese Ergebnisse weder für ECFC aus Nabelschnurblut noch aus peripherem Blut nachweisen (Blandinieres et al., 2019). Aus der Tumorforschung ist bekannt, dass IL-8 im Tumormilieu erhöht ist und durch Stressfaktoren wie Hypoxie, Azidose und Stickstoffmonoxid (NO) verstärkt sezerniert wird (Xie, 2001). Durch seine proangiogene Wirkung fördert es den Tumorprogress und die Metastasierung (Li et al., 2005).
NO ist ein gasförmiges Signalmolekül, das nicht nur über die gesteigerte IL-8-Sekretion Einfluss auf die Vaskularisierung nimmt. Es wird von Stickstoffmonoxid-Synthasen (NOS) aus L-Arginin synthetisiert. Es gibt in verschiedenen Zellen NOS. Für die Vaskularisierung relevant ist die
Literaturdiskussion
14 endotheliale NOS (eNOS), die in Endothelzellen exprimiert wird (Alderton et al., 2001). Für die Aktivierung von eNOS in der Zelle gibt es verschiedene Mechanismen. Einer ist ein Calcium- Einstrom in die Zelle, der über den second-messenger Calmodulin eNOS aktiviert. Calcium- unabhängig kann es über den PI3K-Akt-Signalweg mittels Phosphorylierung von eNOS zu dessen Aktivierung kommen. Dieser Signalweg wird unter anderem durch VEGF aktiviert.
(Fulton et al., 1999, Duda et al., 2004, Zhao et al., 2015, Dimmeler et al., 1999).
Durch eNOS werden die Permeabilität (Gratton et al., 2003), die Proliferation (Luo et al., 2014) und die Migration von Endothelzellen gesteigert (Yang et al., 2018). Über diese Effekte nimmt eNOS Einfluss auf die frühe Angiogenese (Abb. 7). Da es unter anderem durch VEGF aktiviert wird, entfalten diese beiden Faktoren eine synergistische Wirkung auf die Gefäßpermeabilität und damit auf die Aussprossung neuer Gefäße. Seine Wirkung auf die Vaskulogenese entfaltet eNOS über die Sekretion von MMP, wodurch EPC aus dem Knochenmarkt mobilisiert werden (Aicher et al., 2003). Ebenfalls steigert eNOS die Migration und die Proliferation von EPC (Lu et al., 2015) (Abb. 6).
Ein weiterer Wachstumsfaktor, der seine Wirkung unter anderem über VEGF entfaltet, ist bFGF. Der für die Vaskularisierung wichtige Rezeptor ist der FGFR-1 (Cross and Claesson- Welsh, 2001). Über die Sekretion von Plasminogenaktivator wird die Migrationsfähigkeit von Endothelzellen gesteigert. Die Basalmembran wird gelockert und die Endothelzellen können sich nach Invasion zu neuen gefäßähnlichen Strukturen formen (Montesano et al., 1986) (Abb. 7). Diese Wirkung entfalten die Endothelzellen teilweise in autokriner Weise (Sato and Rifkin, 1988). Des Weiteren bewirkt bFGF eine verstärkte VEGF-Expression und verstärkt damit seine Wirkung auf die frühe Angiogenese (Tzeng et al., 2015) (Abb. 7). Wie VEGF und eNOS mobilisiert bFGF EPC und steigert dadurch die Vaskulogenese (Fons et al., 2015), wobei es diesen Einfluss auch über die gesteigerte Expression von VEGF nimmt (Tzeng et al., 2015) (Abb. 6).
bFGF spielt auch in der späteren Angiogenese eine wichtige Rolle. Unter der VEGF-Wirkung der frühen Angiogenese bilden sich instabile und permeable Gefäße. Diese werden in Anwesenheit von bFGF in einem späteren Stadium der Angiogenese stabilisiert, was vermutlich durch den chemotaktischen Einfluss auf Perizyten geschieht (Abb. 7) (Spanholtz et al., 2011).
15 Ebenfalls über die Stabilisierung von neu entstandenen Gefäßen beeinflusst der Ang-Tie2- Signalweg die späte Angiogense (Abb. 7). Diese Stabilisierung erfolgt über die verstärkte Interaktion zwischen Endothelzellen und EZM sowie anderen Endothelzellen (Eklund and Saharinen, 2013). Tie-2 ist ein Rezeptor, der auf Endothelzellen und einigen hämatopoietischen Zellen exprimiert wird (Thurston and Daly, 2012). Für die Aktivierung dieses Signalweges dient Angiopoietin-1 (Ang-1) (Suri et al., 1996). In der frühen Angiogenese, die durch eine gesteigerte Permeabilität gekennzeichnet ist, wird der Tie2-Rezeptor durch das Angiopoietin-2 (Ang-2) blockiert und dadurch die Gefäßbildung durch VEGF ermöglicht (Maisonpierre et al., 1997). Allerdings ist diese Auffassung mittlerweile umstritten, da in Tumorgewebe Ang-2 agonistisch auf Tie-2 wirkt (Daly et al., 2012). Die genaue Wirkung von Ang-2 im Rahmen der Vaskularisierung ist noch nicht ganz aufgeklärt.
Abbildung 6: Einfluss der untersuchten Zytokine auf die postnatale Vaskulogenese
Dargestellt ist der Einfluss der verschiedenen Zytokine auf die einzelnen Schritte der postnatalen Vaskulogenese.
Für die Mobilisierung der EPC aus dem Knochenmark werden VEGF, bFGF und eNOS benötigt. Unter dem Einfluss von Chemokinen, VEGF und möglicherweise IL-8 wandern die EPC in das zu vaskularisierende Gebiet ein. Dort steigern IL-8, eNOS und bFGF die Permeabilität der Gefäße, wodurch die EPC in das umgebende Gewebe invadieren und migrieren können. Durch bFGF und VEGF formen sich die EPC letztendlich zu neuen Gefäßen.
Literaturdiskussion
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Abbildung 7: Einfluss der untersuchten Zytokine auf die Angiogenese
Zu Beginn der frühen Angiogenese steigert VEFG die Permeabilität. Die Zytokine bFGF, eNOS und IL-8 sorgen für die Ausschüttung von Plasminogenaktivator und Matrix-Metalloproteinasen, wodurch die Basalmembran gelockert und die Permeabilität ebenfalls gesteigert wird. Unter dem Einfluss von VEGF, IL-8 und eNOS wird die Migration, Proliferation und die Differenzierung der Endothelzellen gesteigert, die für die Ausbildung eines neuen Gefäßes notwendig sind. Im Anschluss werden in der späten Angiogenese durch bFGF Perizyten angelockt, die das bisherige instabile Gefäß stabilisieren. Unter der Wirkung von Ang-1 werden neue Zell-Zell- und Zell-EZM- Kontakte gebildet, die das neu entstandene Gefäß ebenfalls stabilisieren.
Die dargestellten Zusammenhänge verdeutlichen, dass im Rahmen der Vaskularisierung ein komplexes Zusammenspiel verschiedener Zytokine und Zellen abläuft. Bei genauer Betrachtung der Mechanismen, die der Vaskulogenese und der Angiogenese zugrunde liegen (Abb. 6 und Abb. 7), wird deutlich, dass sich diese teilweise überschneiden und daher nicht immer klar voneinander abgrenzen lassen. Es herrscht noch Bedarf an weiterer Forschung, um die Zusammenhänge im Detail zu erfassen und die Erkenntnisse über die Zytokin-Sekretion während der Vaskularisierung im Rahmen des Tissue Engineerings anwenden zu können.
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3 Material und Methoden
3.1 Material
3.1.1 Chemikalien
Aqua dest. Braun, Melsungen
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma, Steinheim
Tris Buffer 20 mM, pH 7.0 Roth, Karlsruhe
3.1.2 Kits
KitsDuoSet® ELISA Ancillary Reagent Kit2 #DY008, R&D Systems DuoSet® ELISA Human Angiopoietin-2 #DY623, R&D Systems DuoSet® ELISA Human IL-8/CXCL8 #DY208, R&D Systems DuoSet® ELISA Human eNOS #DY950-05, R&D Systems DuoSet® ELISA Human FGF basic/FGF2 #DY233, R&D Systems DuoSet® ELISA Human VEGF #DY293B-05, R&D Systems 3.1.3 Verbrauchsmaterialien
Einmalhandschuhe Nitril Sempercare Semperit, Wien, Österreich Pipettenspitzen FilterTips, Tip One®
(0,5-10 µl, 22-200 µl, 100-1000 µl)
StarLab Hamburg
Polypropylen (PP)-Röhrchen 50 ml Greiner Bio-One, Frickenhausen
Reaktionsgefäße Safe Lock Eppendorf, Hamburg
Serologische Pipetten (5 ml, 10 ml, 25 ml)
Greiner Bio-One, Frickenhausen 3.1.4 Gebrauchsmaterialien
Mehrkanalpipetten Eppendorf Research Plus (10-100 µl, 30-300 µl)
Eppendorf, Hamburg Pipetten Eppendorf Research
(0,5-10 µl, 1-100 µl, 20-200 µl, 100-1000 µl)
Eppendorf, Hamburg
Material und Methoden
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Pipettierhilfe Accu-jet pro Brand, Wertheim
3.1.5 Geräte
Computer Lenovo, Hongkong
Gefrierschrank Temperatur -20 °C Bosch, Gerlingen
GloMax®-Multi detection system Promega, Madison, USA Kühlschrank Temperatur 4 °C Bosch, Gerlingen
Vortex VF2 IKA-Werke, Staufen
3.2 Methoden
Die Isolation sowie Kultur der Zellen, deren Überstände in dieser Arbeit untersucht wurden, erfolgten in Vorarbeit in der Arbeitsgruppe von Frau Professor Brenner durch Heide-Katharina Bauer im Rahmen ihrer Dissertation (Bauer, 2017). Da die Kultur der Zellen eine unabdingbare Grundlage für die vorliegende Arbeit ist, wird ihr Vorgehen hier beschrieben.
3.2.1 Isolation der Fibroblasten
Zur Isolation der Fibroblasten wurde Mundschleimhaut aus der Mund-Kiefer- Gesichtschirurgie verwendet. Zuerst wurde die Probe gründlich desinfiziert, indem erst mit Ethanol 70 %, anschließend mit BODE Sterillium und dann erneut mit Ethanol 70 % für jeweils 15-20 Sekunden geschwenkt wurde. Das Bindegewebe wurde danach mechanisch vom Epithel getrennt und in 1-2 mm2 große Stücke geschnitten. Die Stücke wurden mit der Schnittfläche nach unten in 6-Well-Platten gelegt und in FAD-Medium kultiviert. Sobald Zellen vom Gewebe auswuchsen, wurde auf Fibroblasten-Medium umgestellt. Als 90 % des Wells bedeckt waren, wurden die Zellen nach Behandlung mit 0,25 % Trypsin/EDTA in Zellkulturflaschen überführt.
3.2.2 Isolation der endothelialen Vorläuferzellen
Zur Isolation der endothelialen Vorläuferzellen aus peripherem Blut wurde nach dem in der Arbeitsgruppe Brenner etablierten Protokoll vorgegangen (Schulze, 2016):
Als erstes wurden 6-Well-Platten mit einer Kollagen-I-Lösung beschichtet. Freiwilligen Probanden wurde über eine Venenpunktion peripheres Blut in Lithium-Heparin oder EDTA-
19 Röhrchen abgenommen. Das Blut wurde 1:1 mit Dulbecco‘s Phosphat buffered saline (DPBS), einer isotonischen Pufferlösung, verdünnt. In ein 50 ml-Reaktionsgefäß wurden 15 ml Ficoll- Histopaque-1077 gegeben. Dies ist eine Lösung, die geeignet ist, mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) über Dichtegradienten von den anderen Zellen des Blutes zu trennen. Auf die Ficoll-Histopaque-Lösung wurden vorsichtig 25 ml der Blut-DBPS-Mischung gegeben ohne dass sich die Flüssigkeiten vermischen. Danach erfolgte ein Zentrifugationsschritt. Die PBMC lagern sich nach der Zentrifugation zwischen Blutserum und Ficoll Lösung an. Diese Schicht wurde vorsichtig entnommen und in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Dort erfolgte eine 1:1 Verdünnung mit DPBS und eine erneute Zentrifugation.
Die gewaschenen PBMCs wurden in die 6-Well-Platten gegeben, aus denen vorher die Kollagen Lösung entfernt wurde. Es erfolgt die Kultur mit ECFC-Medium. Nach zwei bis sechs Wochen bildeten sich erste Zellkolonien, die in Gelatine-beschichtete Zellkulturflaschen ausgesät werden konnten. Alle isolierten Zellen wurden mit immunhistochemischen Färbungen an Cytospin-Präparaten eindeutig identifiziert.
3.2.3 Kultur der Zellen
Nach erfolgreicher Isolation der Zellen wurden diese bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit im CO2 -Inkubator inkubiert.
Es wurden unterschiedliche Ko- und Monokulturen durchgeführt, um die Überstände zu entnehmen und zu vermessen:
• Monokultur von Fibroblasten im Well
• Monokultur von ECFC auf der Geistlich Bio-Gide®-Membran
• Monokultur von ECFC im Well
• Kokultur von Fibroblasten und ECFC auf der Geistlich Bio-Gide®-Membran
• Kokultur von Fibroblasten und ECFC im Insert-System mit Kontakt
• Kokultur von Fibroblasten und ECFC im Insert-System ohne Kontakt
Die Bio-Gide®-Membran ist eine Kollagenmembran und hat eine Bilayer-Struktur mit einer zellokklusiven und einer porösen Seite. Vor der Besiedelung mit Zellen musste die Membran in Stücke mit Durchmessern von 6 mm gestanzt und die Seite markiert werden, um im Versuch die zellokklusive von der porösen Seite unterscheiden zu können. Sowohl die Fibroblasten als
Material und Methoden
20 auch die ECFC wurden auf die poröse Seite ausgesät. Für die Kulturen haben sich Zellzahlen von 5,6 * 104 /Membran für die Fibroblasten und 1,12 * 105 für die ECFC bewährt.
Das Insert-System ist ein System, das es ermöglicht, verschiedene Zellarten in einem Well zu kultivieren und unterschiedliche Medien zu verwenden (Abb. 8). Die Überstände können getrennt voneinander entnommen werden. Dieses System ermöglich Kokulturen, in denen sich die unterschiedlichen Zellen berühren oder Kokulturen, bei denen kein Kontakt zwischen den Zellen besteht. Die Porengröße der Inserts betrug 0,4 μm.
Abbildung 8: Insert-System
Kokultur im Insert-System ohne Kontakt (links): Im Insert wurden die ECFC kultiviert (rot) und im darunterliegenden Well die Fibroblasten (blau). Die Zellen stehen dabei nicht in direktem Kontakt. Kokultur im Insert-System mit Kontakt (rechts): Hierbei wurden die Fibroblasten auf der Unterseite des Inserts aufgebracht, wodurch die ECFC in direktem Kontakt mit den Fibroblasten stehen. Bei beiden Methoden ist es möglich, die jeweiligen Zellkultur-Überstände separat voneinander zu entnehmen und auf Zytokine und Wachstumsfaktoren zu untersuchen. Die Porengröße der Inserts betrug 0,4 μm.
24 Stunden vor Überstandentnahme wurden die Kulturen auf FCS-freies Medium umgestellt.
Dann wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten die Überstände entnommen, aliquotiert und bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C eingefroren. Diese Kokulturen wurden nicht nur mit ECFC, sondern auch mit HDMEC angelegt. Die Überstände der Kulturen mit HDMEC konnten bereits im Rahmen der Dissertation von Heide-Katharina Bauer untersucht werden. Die Überstände der Kulturen mit ECFC jedoch wurden erst in dieser Arbeit untersucht und nachfolgend mit den bereits vorliegenden Werten der HDMEC verglichen.
Für diese Arbeit waren die vorliegenden Überstände zu folgenden Zeitpunkten relevant und wurden verwendet: Nach Tag 1, 3, 7, 15 und 21.Vor Versuchsbeginn wurden alle Proben 1:10 verdünnt, um die Konzentrationen in einen messbaren Bereich zu bringen.
3.2.4 Im Rahmen dieser Arbeit durchgeführter ELISA
ELISA steht für Enzym linked Immunosorbent Assay. Dieses Nachweisverfahren stellt eine Enzymreaktion photometrisch dar. Zur Durchführung wurden Kits der Firma R&D Systems verwendet. Am ersten Tag wurden die Platten mit dem Capture-Antikörper beschichtet.
Hierfür wurden 100 µl des auf Arbeitskonzentration verdünnten Antikörpers in jedes Well gegeben. Die Platten wurden mit einer Folie fest verschlossen und über Nacht inkubiert.
21 Am nächsten Tag wurde zunächst die Antikörperlösung abgesaugt und jedes Well erneut drei Mal gewaschen. Danach wurden 100 µl Block Buffer pro Well hinzugegeben. Dieser blockierte in seiner einstündigen Inkubationszeit die freien Bindungsstellen. Bevor die Platten zum Auftragen der Proben bereit waren, musste der Block Buffer abgesaugt werden und erneut dreimal gewaschen werden. Pro Probe wurden in je zwei Wells 100 µl der Kulturüberstände in unterschiedlichen Verdünnungen pipettiert. Laut Protokoll hätten die Proben zwei Stunden inkubieren müssen. Aufgrund der Vorarbeiten und der notwendigen Vergleichbarkeit fand eine Abweichung vom Protokoll statt: Die Proben wurden über Nacht auf der Platte belassen.
In dieser Zeit konnten die untersuchten Proteine, die in der Probe enthalten waren, an ihren Antikörper auf dem Boden des Wells binden.
Am dritten Tag wurden die Proben abgesaugt und die Platte erneut dreimal gewaschen. Beim Waschen war es wichtig, darauf zu achten, dass der Waschpuffer durch Abklopfen wieder vollständig entfernt wird. Anschließend wurden 100 µl Detection-Antikörper pro Well aufgetragen. Dieser Antikörper ist an das Protein Biotin gekoppelt und bindet das zu messende Zytokin, das am Capture-Antikörper gebunden vorliegt. Es folgte eine zweistündige Inkubationszeit der verschlossenen Platte. Danach folgten erneut Absaugen und dreimaliges Waschen. Nun konnte auf die Probe 100 µl Streptavidin-HRP-Lösung pro Well aufgetragen werden. Streptavidin ist ein Protein, das an das Biotin des Detection Antikörper bindet. HRP (horseradish peroxidase) ist die Bezeichnung für das Enzym Meerettichperoxidase. Dieses Enzym ermöglicht den entscheidenden Farbumsatz für den Versuchsablauf eines ELISAs. Die 20-minütige Inkubation musste lichtgeschützt erfolgen.
Nachdem die Streptavidin-HRP Lösung abgesaugt und die Platte gewaschen worden war, konnten 100 µl Substrat-Solution aufgetragen werden. Diese enthält den Farbstoff, der durch HRP enzymatisch umgesetzt wird, wodurch ein blauer Farbstoff entsteht. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Stop-Solution beendet (Abb. 9). Die Platten wurden im Promega Reader bei 450 nm photometrisch gemessen. Die gemessenen Extinktionswerte konnten in Excel mittels linearer Regression in Konzentrationen umgerechnet werden. Es fanden nur Versuchsansätze Berücksichtigung, deren Bestimmtheitsmaß größer als 0,9 war. Es wurden die Standardabweichung und der Standardfehler berechnet sowie mittels T-Test Signifikanzen berechnet.
Material und Methoden
22
Abbildung 9: Durchführung ELISA
In die 96-Well-Platte, die mit dem Capture-Antikörper (grün) beschichtet wurde, werden pro Well 100 µl Probe mit dem zu bestimmenden Zytokin gegeben (1.). Der Antikörper bindet das nachzuweisende Antigen (lila) spezifisch. Nach der Inkubationszeit wird das ungebundene überschüssige Antigen abgewaschen und der Detection-Antikörper (rot) aufgetragen (2.). Dieser bindet an ein anderes Epitop des Zytokins als der Erstantikörper. Auf die nun entstandene Sandwich Struktur wird Streptavidin gegeben, an das HRP, eine Peroxidase, kovalent gebunden ist (3.). Das Streptavidin bindet an Biotin, das im Detection-Antikörper enthalten ist. Nun kann eine Substratlösung aufgetragen werden, die durch die Peroxidase enzymatisch umgesetzt wird (4.), wodurch ein blauer Farbstoff entsteht (5.). Durch Zugabe einer Säure wird die Reaktion beendet und die Farbe schlägt von blau in gelb um. Dieser Farbstoff kann nun photometrisch quantifiziert werden.
23
4 Ergebnisse
4.1 Einfluss der Kokultivierung auf die Zytokin-Sekretion durch ECFC und Fibroblasten
Sowohl in den Kulturüberständen der ECFC als auch in denen der Fibroblasten war Ang-2 das am stärksten sezernierte Zytokin. Da durch die Sekretion von Ang-2 in den Kulturüberständen so hohe Konzentrationen erreicht wurden, dass eine vergleichbare Darstellung mit den restlichen Zytokinen nicht möglich war, wird hier zuerst die Ang-2-Sekretion betrachtet und danach die restlichen Zytokine gemeinsam.
4.1.1 Ang-2
Außer an Tag 1 gaben die Fibroblasten in Kokultur mehr Ang-2 ab als die Fibroblasten in Monokultur (Abb. 10). Die Fibroblasten in Kokultur im Insert mit Kontakt sezernierten an Tag 1 ihre maximale Menge Ang-2 und erreichten damit eine Konzentration von 3.558 pg/ml.
Danach fiel die abgegebene Menge Ang-2 ab und sie erreichte Konzentrationen zwischen 1.568 pg/ml und 2.036 pg/ml. In der Kokultur mit ECFC im Insert-System ohne Kontakt wurde im Kulturüberstand der Fibroblasten an Tag 7 mit 4.340 pg/ml am meisten Ang-2 gemessen.
Auch an Tag 15 erreichten sie mit 3.274 pg/ml noch hohe Konzentrationen von Ang-2, bevor sie sich dann an Tag 21 mit 1.709 pg/ml an die Fibroblasten ohne Kontakt anglichen (Abb. 10).
Zu Beginn des Besiedelungszeitraumes war die Ang-2-Ausschüttung durch die ECFC in Monokultur höher als die der ECFC in Kokultur. Ab dem siebten Tag glich sich die Sekretion der Kokultur mit Kontakt und die der Monokultur an (Abb. 11). An Tag 15 stieg die Ang-2- Konzentration des Kulturüberstandes der ECFC in Kokultur mit Kontakt auf 10.390 pg/ml an und überwog damit die Sekretion der Monokultur um das Doppelte. Obwohl sie an Tag 21 zurückging, war die Ang-2-Konzentration mit 9.263 pg/ml immer noch deutlich höher als die der anderen Kulturen. Während die Ang-2-Sekretion der ECFC in Monokultur nach Tag 1 relativ konstant blieb, stieg die Sekretion durch die ECFC in Kokulturen über die Zeit an (Abb 11). Insgesamt war die Ang-2-Sekretion durch die ECFC deutlich höher als durch die Fibroblasten. Während in den Überständen der ECFC Ang-2-Konzentrationen bis über 10.000 pg/ml gemessen wurden, erreichten die Fibroblasten maximale Konzentrationen von knapp 4.500 pg/ml. Lediglich in der Kokultur im Insert-System ohne Kontakt sezernierten die Fibroblasten teilweise mehr Ang-2 als die ECFC.
Ergebnisse
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Abbildung 10: Ang-2-Sekretion durch Fibroblasten in Mono- und Kokultur
Dargestellt ist die Ang-2-Konzentration in den Kulturüberständen von Fibroblasten in Monokultur im Well sowie von Fibroblasten, die mittels Insert-System mit Endothelzellen kokultiviert wurden. Die Kokultivierung erfolgte sowohl ohne interzellulären Kontakt als auch mit interzellulärem Kontakt. Es erfolgte die getrennte Überstandentnahme im Insert (Endothelzellen) und unter dem Insert (Fibroblasten). Die Überstandentnahme erfolgte an den Tagen 1, 3, 7, 15 und 21. Die Überstände wurden mittels ELISA quantifiziert. Dargestellt sind die Werte aus drei Versuchsdurchläufen. Die Fehlerindikatoren geben den Standardfehler an
Abbildung 11: Ang-2-Sekretion durch ECFC in Mono- und Kokultur
Dargestellt ist die Ang-2-Konzentration in den Kulturüberständen von ECFC in Monokultur im Well sowie von ECFC, die mittels Insert-System mit Fibroblasten kokultiviert wurden. Die Kokultivierung erfolgte sowohl ohne interzellulären Kontakt als auch mit interzellulärem Kontakt. Es erfolgte die getrennte Überstandentnahme im Insert (Endothelzellen) und unter dem Insert (Fibroblasten). Die Überstandentnahme erfolgte an den Tagen 1, 3, 7, 15 und 21. Die Überstände wurden mittels ELISA quantifiziert. Dargestellt sind die Werte aus drei Versuchsdurchläufen. Die Fehlerindikatoren geben den Standardfehler an.
25 4.1.2 VEGF, IL-8, eNOS und bFGF
Das Zytokin, welches durch die ECFC in Monokultur am zweitstärksten sezerniert wurde, ist IL-8 (Abb. 12a). Auch wenn seine Sekretion durch die ECFC über die Zeit abnahm, war sie insgesamt immer deutlich höher als die IL-8-Sekretion der Fibroblasten in Monokultur (Abb. 12b). Diese sezernierten zu Beginn des Besiedelungszeitraumes noch stark IL-8. Dabei wurde in den Überständen der Fibroblasten in Monokultur eine Konzentration von knapp 850 pg/ml gemessen, während diese in den Überständen der ECFC bei knapp 2600 pg/ml lag (Abb. 12).
Nach Ang-2 war VEGF das Zytokin, das am zweitstärksten von den Fibroblasten in Monokultur sezerniert wurde (Abb. 10 und Abb. 12b). Auch wenn die VEGF-Sekretion durch die Fibroblasten in Monokultur zu allen Zeitpunkten der Kultur höher war als die der ECFC in Monokultur, nahm die VEGF-Sekretion über die Zeit zu. Während in den Überständen der Fibroblasten an Tag 15 die maximale VEGF-Konzentration von 664 pg/ml gemessen wurde (Abb. 12b), sezernierten die ECFC ein basales Level an VEGF und erreichten eine maximale VEGF-Konzentration von 147 pg/ml an Tag 2 (Abb. 12a).
Sowohl bei den ECFC als auch bei den Fibroblasten war in Monokultur an Tag 1 insgesamt eine stärkere sekretorische Aktivität zu beobachten als an den restlichen Tagen. Sie erreichten beide für die Zytokine IL-8, eNOS, bFGF und Ang-2 am ersten Besiedelungstag die höchsten Konzentrationen. Auch wenn die Sekretion von bFGF nach Tag 1 durch beide Zellen abnahm, war die bFGF-Sekretion der ECFC über den Verlauf stärker als die der Fibroblasten. Die eNOS- Sekretion pendelte sich bei den ECFC und den Fibroblasten über die Zeit auf einem ähnlich niedrigen basalen Level ein.
Ergebnisse
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Abbildung 12: Zytokin-Sekretion durch ECFC und Fibroblasten jeweils in Monokultur im Well
Dargestellt ist die Konzentration von VEGF, IL-8, eNOS und bFGF aus Kulturüberständen von ECFC (Abb. 12a) und Fibroblasten (Abb. 12b), die in Monokultur im Well kultiviert wurden. Die Überstandentnahme erfolgte an den Tagen 1, 3, 7, 15 und 21. Die Überstände wurden mittels ELISA quantifiziert. Dargestellt sind die Werte aus drei Versuchsdurchläufen. Die Fehlerindikatoren geben den Standardfehler an.
27 Trotz eines Abfalls der IL-8-Konzentration in den Kulturüberständen der ECFC an Tag 3 wurde IL-8 am zweitstärksten durch die ECFC in Kokultur mit Fibroblasten im Insert-System ohne Kontakt sezerniert (Abb. 13a). VEGF, eNOS und bFGF wurden von den ECFC in Kokultur im Insert-System ohne Kontakt (Abb. 13a) ähnlich wie in Monokultur (Abb. 12a) in einem konstanten basalen Level sezerniert. Eine gesteigerte endotheliale Sekretion konnte in Kokultur ohne Kontakt im Vergleich zur Monokultur nicht beobachtet werden.
Die gemessene Zytokin-Konzentration war in Kokultur im Insert-System ohne Kontakt in den Überständen der Fibroblasten insgesamt höher als die der ECFC (Abb. 13). Wie in Monokultur von Fibroblasten (Abb. 12b) war auch in der Kokultur ohne Kontakt VEGF nach Ang-2 das Zytokin mit den höchsten Konzentrationen (Abb. 13b). Zu den späteren Zeitpunkten der Besiedelung war die VEGF-Sekretion durch die Fibroblasten in Kokultur ohne Kontakt deutlich höher als die VEGF-Sekretion der Fibroblasten in Monokultur. In den Überständen auf der Seite der Fibroblasten wurden an den Tagen 7, 15 und 21 besonders viel VEGF und IL-8 sezerniert. Insgesamt fiel auf, dass die Fibroblasten in der Kokultur ohne Kontakt mehr IL-8, bFGF und Ang-2 sezernierten als in Monokultur. Die eNOS-Sekretion durch die Fibroblasten in Monokultur ohne Kontakt war über die Besiedelungszeit schwankend (Abb. 13b). An Tag 7 war die eNOS-Konzentration in den Überständen der Fibroblasten mit 630 pg/ml jedoch deutlich höher als die der ECFC.
Ergebnisse
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Abbildung 13: Zytokin Sekretion durch ECFC und Fibroblasten in Kokultur im Insert-System ohne Kontakt Dargestellt sind Konzentrationen von VEGF, IL-8, eNOS und bFGF in den Kulturüberständen aus Kokulturen von ECFC und Fibroblasten im Insert-System ohne Kontakt. Die Überstände der ECFC konnten im Insert (Abb. 13a) und die der Fibroblasten unter dem Insert (Abb. 13b) getrennt entnommen werden. Die Überstandentnahme erfolgte an den Tagen 1, 3, 7, 15 und 21. Die Überstände wurden mittels ELISA quantifiziert. Die Fehlerindikatoren geben den Standardfehler an.
29 In der Kokultur im Insert-System mit Kontakt war IL-8 -wie in den anderen Kulturüberständen von ECFC- das Zytokin, welches nach Ang-2 am zweitstärksten durch ECFC sezerniert wurde.
Zu Beginn des Besiedelungszeitraumes war die IL-8-Sekretion durch die Fibroblasten noch stärker, mit der Zeit überwog dann die Sekretion durch die ECFC. Dennoch war die IL-8- Sekretion durch ECFC in Monokultur höher als durch ECFC in Kokultur mit Kontakt. Die bFGF- Konzentration war außer an Tag 21 in den Kulturüberständen der ECFC (Abb. 14a) höher als in denen der Fibroblasten (Abb. 14b) und. Für bFGF konnte eine gesteigerte endotheliale Sekretion in Kokultur mit Kontakt im Vergleich zur Monokultur verzeichnet werden. eNOS wurde sowohl von den ECFC als auch von den Fibroblasten konstant auf einem basalen Level sezerniert. Hier gab zwischen dem Sekretionsverhalten beider Zellen wenig Unterschiede ; ebenso konnte keine deutliche Abweichung zwischen der eNOS-Sekretion von den Zellen in Monokultur zu den Zellen in Kokultur mit Kontakt verzeichnet werden.
Die VEGF-Sekretion durch die ECFC in Kokultur im Insert-System mit Kontakt war an allen Tagen so niedrig, dass in den Überständen nie eine höhere Konzentration als 150 pg/ml erreicht wurde. Die VEGF-Sekretion durch die Fibroblasten im Insert-System mit Kontakt nahm über die Zeit zu und erreichte ihren Höchstwert mit einer gemessenen Konzentration von 1.339 pg/ml an Tag 21. Sowohl IL-8 als auch bFGF wurden an Tag 1 von den Fibroblasten stärker ausgeschüttet, um an den Tagen 3,7 und 15 weniger sezerniert zu werden (Abb. 14b).
Beide Zytokine wurden an Tag 21 wieder in höheren Konzentrationen gemessen. Gegenüber der Monokultur steigerten die Fibroblasten in Kokultur mit Kontakt die Sekretion von VEGF, IL-8, bFGF und Ang-2.
Ergebnisse
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Abbildung 14: Zytokin Sekretion durch ECFC und Fibroblasten in Kokultur im Insert-System mit Kontakt Dargestellt sind Konzentrationen von VEGF, IL-8, eNOS und bFGF in den Kulturüberständen aus Kokulturen von ECFC und Fibroblasten im Insert-System mit Kontakt. Die Überstände der ECFC konnten im Insert (Abb. 14a) und die der Fibroblasten unter dem Insert (Abb. 14b) getrennt entnommen werden. Die Überstandentnahme erfolgte an den Tagen 1, 3, 7, 15 und 21. Die Überstände wurden mittels ELISA quantifiziert. Die Fehlerindikatoren geben den Standardfehler an.
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4.2 Einfluss der Kollagenmembran auf die Zytokin-Sekretion durch ECFC und Fibroblasten in Kokultur
4.2.1 VEGF
An Tag 1 überwog die VEGF-Sekretion in der Kokultur auf der Kollagenmembran gegenüber der Kokultur im Insert mit Kontakt (Abb. 15). Im Kulturüberstand der Kokultur auf der Membran wurde an diesem Tag eine Konzentration von 473 pg/ml erreicht. In den Kulturüberständen in den Inserts bei Kokultur mit Kontakt lag die Konzentration auf der Seite der Fibroblasten bei 78 pg/ml und auf der Seite der ECFC bei 44 pg/ml. An Tag 3 war kein wesentlicher Unterschied zwischen den Kulturen zu erkennen. Ab Tag 7 sezernierten die Fibroblasten im Insert mit Kontakt am meisten VEGF. Der Höchstwert von 1.340 pg/ml wurde an Tag 21 erreicht. Die ECFC im Insert produzierten an allen Tagen am wenigsten VEGF (Abb. 15).
Abbildung 15: VEGF-Sekretion durch ECFC und Fibroblasten in Kokultur auf der Kollagenmembran und in Kokultur im Insert-System mit Kontakt
Dargestellt ist die VEGF-Konzentration in Kulturüberständen von Fibroblasten und ECFC in Kokultur auf der Bio- Gide®-Membran sowie in Kokultur im Insert-System mit interzellulärem Kontakt. Die Kulturüberstände wurden im Insert (ECFC) sowie unter dem Insert (Fibroblasten) entnommen und somit die Sekretion der ECFC und der Fibroblasten getrennt beurteilt. Die Überstandentnahme erfolgte an den Tagen 1, 3, 7, 15 und 21. Die Überstände wurden mittels ELISA quantifiziert. Dargestellt sind die Werte aus drei Versuchsdurchläufen. Die Fehlerindikatoren geben den Standardfehler an.
