Jn-m£ro-RNA-Replikation mit DNA-abhängiger RNA-Polymerase
aus E. coli
Von der Gemeinsamen Naturwissenschaftlichen Fakultät der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina
zu Braunschweig
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
genehmigte Dissertation
von
Axel Wettich
aus Göttingen
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Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1 2 Theoretische Grundlagen 7 2.1 Selbstorganisation und molekulare Evolution 7 2.1.1 Molekulare Selektion 8 2.1.2 Quasispezies 9 2.1.3 Sequenzraum und Wertelandschaft 11 2.2 /n-mtro-Evolutionsexperimente 12
2.2.1 /n-OTiro-RNA-Replikation — Selektion und Generierung replizieren- der RNA-Spezies 14 2.2.2 Analytisches Modell der m-m£ro-RNA-Replikation 17 2.2.3 Bekannte m-i«(ro-Replikationssysteme 22 2.2.4 Anwendungen in der evolutiven Biotechnologie 26 2.3 Multikanal-Glasfaser-Fluorimetrie 29 2.4 Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie 31 2.4.1 Theorie der FCS 32 2.4.2 Apparativer Aufbau 33 3 Material 37
3.1 Chemikalien, Enzyme, Nukleinsäuren, Bakterien-Stämme und Reagenzien- systeme 37 3.1.1 Chemikalien 37 3.1.2 Enzyme 38 3.1.3 Nukleinsäuren 39 3.1.4 Bakterien-Stämme 41 3.1.5 Reagenziensysteme 42
iii
3.2 Geräte und Maschinen 42 3.3 Sonstige Materialien 44 3.4 Puffer, Stammlösungen und Nährmedien 44 3.4.1 Puffer und Stammlösungen für die Enzympräparation 44 3.4.2 Puffer und Stammlösungen für die RNA-Replikationsexperimente . . 47 3.4.3 Puffer und Stammlösungen für mikrobiologische Anwendungen . . . 51 3.4.4 Puffer und Stammlösungen für elektrophoretische Anwendungen . . 52 3.4.5 Nährmedien für mikrobiologische Anwendungen 54 4 Methoden 57 4.1 Allgemeine molekularbiologische Methoden 57 4.1.1 Reinigung und Konzentrierung von Nukleinsäuren 57 4.1.2 Reinigung von Nukleinsäuren durch size-exclusion-HPLG 59 4.1.3 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 59 4.1.4 Chemiche Synthese von Oligodesoxyribonukleotiden 60 4.1.5 Automatische DNA-Sequenzierung 60 4.1.6 Radioaktives Markieren von Nukleinsäuren 62 4.1.7 Trichloressigsäure-Fällung 62 4.2 Gelelektrophoretische Methoden 63 4.2.1 Anwendung der Gelelektrophorese 63 4.2.2 Agarosegelelektrophorese 63 4.2.3 Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) 64 4.2.4 SDS-PAGE bei Proteinen 65 4.2.5 Sequenziergele 66 4.2.6 Elektroelution 67 4.2.7 Nukleinsäurenachweis in Elektrophoresegelen 68 4.2.8 Proteinnachweis in Elektrophoresegelen 69 4.2.9 Temperaturgradienten-Gelelektrophorese 69 4.3 Methoden bei der Enzympräparation 70 4.3.1 Präparation der E. co/i-RNA-Polymerase 70 4.3.2 Bakterienvorkultur 71 4.3.3 Bakterienproduktion im Fermenter 71 4.3.4 Bakterienaufschluß 72
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4.3.5 Polyethylenimin-Fällung 72 4.3.6 Ammoniumsulfat-Fällung und Dialyse 73 4.3.7 Chromatographische Reinigung 73 4.3.8 Ammoniumsulfat-Fällung 75 4.3.9 Aktivitätsbestimmung 75 4.3.10 Proteinbestimmung 75 4.4 Methoden bei den RNA-Replikations- und Produktanalyseexperimenten . . 76 4.4.1 Behandlung von Geräten und Lösungen bei Replikationsexperimenten 76 4.4.2 Präparation eines Poly-AUIC-Kopolymerisats 77 4.4.3 Präparation größerer Mengen replizierender RNA 78 4.4.4 Bestimmung der 5'-Endnukleotide 80 4.4.5 Bestimmung der 3'-Endnukleotide 81 4.4.6 Kinetische Messung der RNA-Replikation und der in-vitro-Run-off-
Transkription 82 4.4.7 Bestimmung der Bindungskonstante Kass des RNA-Enzym-Komple-
xes mittels FCS 83 4.5 /n-uiij-o-Manipulationen an Nukleinsäuren 83 4.5.1 5'- und 3'-Dephosphorylierung von Nukleinsäuren 83 4.5.2 5'-Phosphorylierung von Nukleinsäuren 84 4.5.3 3'-Endblockierung von RNA durch Oxidation mit Periodat 85 4.5.4 Hydrolyse von DNA mit Restriktionsendonukleasen 86 4.5.5 Primerdimerisierung 86 4.5.6 Alkalische Hydrolyse von RNA 87 4.5.7 Polyadenylierung von RNA 88 4.5.8 cDNA-Erststrang-Synthese 88 4.5.9 Polydesoxyadenylierung von ssDNA 90 4.5.10 cDNA-Zweitstrang-Synthese 90 4.5.11 DNA-Ligation 92 4.5.12 /n-mtro-Run-off-Transkription 94 4.6 Mikrobiologische Methoden 96 4.6.1 Transformation von E. coH-Bakterien nach Hanahan 96 4.6.2 Alkalische Plasmid-Minipräparation 97 4.6.3 Qiagen-Plasmid-Midi- und Minipräparaton 98
5 Ergebnisse 101 5.1 Präparation des Wo-Enzyms DNA-abhängige RNA-Polymerase aus E. coli 101 5.1.1 Wahl der Präparationsmethode 101 5.1.2 Chromatographische Reinigung 103 5.2 RNA-Replikation mit E. co/i-RNA-Polymerase 105
5.2.1 Erzeugung replizierender AUIC-RNA-Spezies durch Selektion aus ei- nem Kopolymerisat randomisierter RNA-Sequenzen 107 5.2.2 Erzeugung replizierender AUGC-RNA-Spezies durch Matrizen-freie
Langzeitinkubation 110 5.2.3 Strukturanalyse der replizierenden RNA-Spezies durch Temperatur-
gradienten-Gelelektrophorese 114 5.2.4 Sequenz-Analyse der Produkte der RNA-Replikation mit E. coli-
RNA-Polymerase 117 5.3 Kinetik der RNA-Replikation 120 5.3.1 Amplifikationsprofile bei der RNA-Replikation 121 5.3.2 Bestimmung der Syntheseraten bei der RNA-Replikation 124 5.4 Klonierung und Sequenzierung der RNA 127 5.4.1 Klonierung der replizierenden AUIC-RNA-Varianten 127 5.4.2 Sequenzen der replizierenden AUIC-RNA-Spezies 129 5.4.3 Klonierung der replizierenden AUGC-RNA-Varianten 131 5.4.4 Sequenzen der replizierenden AUGC-RNA-Spezies 134 5.4.5 Strukturelle Analyse der replizierenden AUGC-RNA-Spezies 136 5.5 Replikation transkribierter RNA-Moleküle 139 5.5.1 /n-uiiro-Run-off-Transkription mit T3-RNA-Polymerase 139 5.5.2 Replikationsexperimente mit Transkript-RNA 145 5.6 Kinetische Messung der RNA-Replikation im Multikanal-Glasfaser-Fluori-
meter 150 5.7 Bestimmung der Bindungskonstante Kass des RNA-Enzym-Komplexes . . . 156 6 Diskussion 163 7 Zusammenfassung 181 A Mathematische Gleichungen 183 A.l Berechnung der kinetischen Parameter der RNA-Replikation 183 A.2 Quantitative Analyse der Fluoreszenzsignale 184
Inhaltsverzeichnis
B Basenpaarungen 187 B.l Watson-Crick-Basenpaare 187 B.2 Wobble-Basenpaare 188 C Abkürzungen 189 Literaturverzeichnis 193
