In-vivo-Studie über dezellularisierte Segmente der ovinen Aorta und der Arteria pulmonalis als
Aortenersatz
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Doktorgrades einer Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)
vorgelegt von Carolyn Hinz aus Templin
Hannover 2013
Gefäßchirurgie der Medizinischen Hochschule Hannover
Prof. Dr. Karl-Heinz Waldmann
Klinik für kleine Klauentiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter: Prof. Dr. Karl-Heinz Waldmann
2. Gutachter: Prof. Dr. Manfred Kietzmann
Tag der mündlichen Prüfung: 15.11.2013
Das Projekt wurde im Rahmen des Sonderforschungsbereiches 599, Teilprojekt R7 „Stabilisierende Magnesiumgeflechte zur Unterstützung von kardiovaskulärem Gewebeersatz im Hochdrucksystem“
ermöglicht, dass von der Deutschen Forschungsgemeinschaft gefördert wird.
Meinen Großvätern
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ... I
Abkürzungsverzeichnis ... V
1. Einleitung ... 1
1.1. Anatomie, Histologie und Funktion der Aorta ... 1
1.2. Ätiologie operationswürdiger Erkrankungen der Aorta ... 3
1.3. Historie der Aortenwandchirurgie ... 5
1.4. Ersatzmaterialen ... 6
1.4.1. Synthetische Implantate und deren Limitationen ... 6
1.4.2. Biologische Implantate und deren Limitationen ... 8
1.5. Die ideale Gefäßprothese... 8
1.6. Tissue Engineering ... 9
1.6.1. Biologische Forschungsansätze im Bereich Aortenersatz ... 10
1.6.2. Dezellularisierung als Methode des Tissue Engineering ... 11
1.7. Magnesium als Implantatmaterial ... 13
1.8. Schaf als Versuchstier ... 13
2. Ziel der Arbeit ... 15
3. Material und Methoden ... 16
3.1. Aufbereitung der Grafts ... 16
3.2. Dezellularisierung der Aorten- und Pulmonalarteriensegmente ... 16
3.2.1. Kontrolle der Dezellularisierung ... 19
3.3. Herstellung der Magnesiumspangen ... 19
3.4. In-vivo-Studie ... 20
3.4.1. Versuchstiere ... 20
3.4.2. Tierhaltung... 20
3.4.3. Gruppeneinteilung ... 21
3.4.4. Anästhesie ... 22
3.4.5. Operationsdurchführung ... 22
3.4.6. Klinische Befunderhebung während der Operationsdurchführung ... 24
3.4.7. Postoperative Betreuung der Tiere ... 25
3.4.8. Explantation der Grafts ... 25
3.5. Laborteil ... 27
3.5.1. Paraffinschnitte der Implantate und Explantate ... 27
3.5.2. Gefrierschnitte ... 27
3.5.3. Semidünnschnitte ... 27
3.5.4. Entparaffinisierung ... 28
3.5.5. Hämatoxylin-Eosin-Färbung ... 29
3.5.6. Pentachrom-Färbung nach Movat ... 30
3.5.7. Versilberung nach von Kossa ... 31
3.5.8. Färbung nach Pappenheim (May-Grünwald-Giemsa-Färbung) ... 32
3.5.9. Elastika-van-Gieson-Färbung ... 33
3.5.10. Siriusrot-Färbung ... 34
3.5.11. Toluidinblau-Färbung ... 34
3.5.12. Immunfluoreszenz-Färbungen ... 35
3.5.13. Bestimmung des Magnesiumgehaltes im Blut ... 36
3.5.14. Bestimmung des Magnesiumgehaltes in ovinen Organproben... 36
3.6. MRT... 37
3.7. Durchflussmessungen in der Aorta ... 38
3.8. µ-CT Analyse der Magnesiumspangen ... 38
3.9. Statistische Analysen ... 39
4. Ergebnisse ... 40
4.1. Auswertung der Implantate ... 40
4.1.1. Aortengrafts ... 40
4.1.2. Pulmonalarteriengrafts ... 40
4.2. Klinische Befunde während der Operationsdurchführung ... 42
4.3. Gesundheitszustand der Tiere ... 43
4.3.1. Verendete Tiere ... 45
4.4. Makroskopische Auswertung der Explantate ... 47
4.5. Histologie und Immunhistologie der Explantate ... 49
4.5.1. Auswertung der Gefäßkonstrukte nach einem Monat ... 49
4.5.2. Auswertung der Gefäßkonstrukte nach drei Monaten ... 52
4.5.3. Auswertung der Gefäßkonstrukte nach sechs Monaten ... 55
4.5.4. Gruppenübergreifende Auswertungen ... 58
4.5.5. Blutuntersuchung der Schafe ... 69
4.6. Magnesiumgehalte in unterschiedlichen Organproben ... 70
4.7. MRT... 70
4.8. Ergebnisse der Durchflussmessungen in der Aorta ... 72
4.9. Die Degradation der Magnesiumspangen ... 73
5. Diskussion ... 74
5.1. Schafmodell ... 75
5.2. Dezellularisierung ... 75
5.3. Operationsdurchführung ... 76
5.4. Klinischer Befund ... 77
5.5. Verendete Tiere ... 77
5.6. Makroskopie ... 78
5.7. Neointimabildung auf den Gefäßprothesen ... 78
5.8. Rebesiedelung der Gefäßprothesen ... 80
5.9. Neovaskularisation innerhalb der Gefäßprothesen ... 81
5.10. Remodellierung der Gefäßprothesen ... 82
5.11. Leukozyteninfiltration in die Gefäßprothesen ... 82
5.12. Degeneration der Gefäßprothesen ... 83
5.13. Einheilung der Magnesiumspangen in die Gefäßprothesen ... 83
5.14. Schlussbetrachtung ... 84
6. Zusammenfassung ... 85
7. Summary ... 87
8. Literaturverzeichnis ... 89
9. Anhang ... 109
9.1. Physiologische Daten des Schafes ... 109
9.2. Tiere ... 109
9.3. Klinische Daten ... 110
9.4. Rohdaten Neointima ... 114
9.5. Rohdaten Magnesium ... 117
9.6. Rohdaten Rebesiedlung ... 117
9.7. Rohdaten Gewichtsverlauf ... 119
9.8. Chemikalien, Labormaterialien und Geräte ... 121
9.9. Herstellung der Färbelösungen ... 126
9.9.1. HE-Färbung: ... 126
9.9.2. Pentachrom-Färbung: ... 126
9.9.3. Von Kossa Färbung: ... 127
9.9.4. Pappenheim-Färbung: ... 127
9.9.5. Siriusrot-Färbung: ... 127
9.10. Statistische Auswertungen ... 128
9.10.1. Neointimamessungen ... 128
9.10.2. Bestimmung der Rebesiedelung ... 130
9.11. Abbildungsverzeichnis ... 131
9.12. Tabellenverzeichnis ... 132
10. Lebenslauf ... 133
10.1. Danksagung ... 135
Abkürzungsverzeichnis
AAS Atomabsorptionsspektrometer
AG Aortengraft
DAPI 4,6-Diamidino-2-Phenylindole, dihydrochloride Dez. dezellularisiert
ECM Extrazelluläre Matrix
GAG Glykosaminoglykane
HE Hämatoxylin-Eosin
LEBAO Leibniz Forschungslaboratorien für Biotechnologie und künstliche Organe
Mg Magnesium
MHC2 Myosin heavy chain
MRT Magnetresonanztomographie
OP Operation
PBS(+) phosphatgepufferte Salzlösung (mit Gentamicin, Patricin, Penicillin-Streptomycin)
PET Polyethylenterephthalat
PGA Polyglykolsäure
PG Pulmonalarteriengraft
PU Polyurethane
PTFE Polytetrafluorethylen
SDS Natriumlaurylsulfat (Sodium dodecyl sulfat) SD Natriumdesoxycholat (Sodium desoxycholate) SMA Smooth Muscle Actin
VE-Cadherin Vascular Endothelial Cadherin VE-Wasser vollentsalztes Wasser
vWF von Willebrand Faktor
1. Einleitung
1.1. Anatomie, Histologie und Funktion der Aorta
Die ovine Aorta entspringt aus der linken Herzkammer. Nach dem Abgang über der Aortenklappe erweitert sie sich zum Bulbus aortae, aus dem die Koronararterien entspringen. Die Aorta steigt auf der rechten Seite des Truncus pulmonalis craniodorsal auf (Aorta ascendens) und bildet anschließend den Aortenbogen (Arcus aortae). Die Aorta ascendens steigt in ihrem weiteren Verlauf bis zur Wirbelsäule in Höhe des sechsten Brustwirbels auf und liegt dann etwas mehr links der Medianebene. Vom Mediastinum medium setzt sich die Aorta als Aorta descendens nach kaudal fort. In der Brusthöhle wird die Aorta namentlich zur Aorta thoracica, in der Bauchhöhle zur Aorta abdominalis. Durch den Hiatus aorticus, eine Öffnung im Zwerchfell, tritt sie in die Bauchhöhle über. Die Endaufteilung der Aorta erfolgt in Höhe der letzten Lendenwirbel (KÖNIG et al. 2005).
Abb. 1: Brusthöhlensitus eines Wiederkäuers von rechts
In rot dargestellt der Verlauf der Aorta, He=Herz, in blau dargestellt die Vena cava caudalis (STARKE et al. 2012).
Die Struktur von größeren Gefäßen unterscheidet sich im Hoch- bzw.
Niederdrucksystem des Kreislaufs und innerhalb der einzelnen Organe aufgrund deren unterschiedlicher Funktionen. Dennoch basiert der Wandbau dieser Gefäße auf einem gemeinsamen Grundbauplan. Man unterscheidet eine Intima (Tunica interna), eine Media (Tunica media) und eine Adventitia (Tunica externa).
Grundsätzlich unterscheidet man Arterien vom elastischen Typ und Arterien vom muskulären Typ.
vorherrschend aus gefensterten elastischen Fasern aufgebaut ist. Das Endothel wird von einem geschlossenen einschichtigen Endothelverband gebildet und einem verbreiterten Stratum subendotheliale unterlagert. Die kollagenen Bindegewebsfasern des Stratum subendotheliale stehen mit dem elastischem Gewebe der Tunica media in engem Kontakt. Die elastischen Faserbündel der Media nehmen mit einzelnen glatten Muskelzellen Verbindung auf und lassen so ein elastisch-muskuläres System entstehen. Arterien vom elastischen Typ schließen in hohem Maß elastische Fasern (Elastin+Myofibrillen) ein (LIEBICH 2004). Das elastische Netzwerk bildet konzentrische Schichten in der Tunica media, in das Lagen aus glatten Muskelzellen eingelagert sind. In einem Schnittbild von einem Blutgefäß liegen die glatten Muskelzellen in einer fischgrätenähnlichen Anordnung vor. Während einer Kontraktion reduzieren die glatten Muskelzellen das Lumen des Blutgefäßes. Kontrahierte Muskelzellen zeigen typischerweise korkenzieherähnlich geformte Zellkerne. Entlang der elastischen Mikrofibrillen findet man Kollagenfasern zwischen den elastischen Lamellen. Im Gegensatz zum Elastin und zu den elastischen Mikrofibrillen sind die Kollagenfasern nicht elastisch verformbar, sie setzen damit die Grenzen für die elastische Dehnbarkeit der Arterien. Als Komponenten der Kollagenfasern lassen sich hauptsächlich Kollagen Typ I und Typ III in der Tunica media identifizieren.
Die extrazelluläre Matrix (ECM) in der Tunica media wird hauptsächlich von glatten Gefäßmuskelzellen produziert. Diese glatten Gefäßmuskelzellen können sich in zwei verschiedene Phänotypen differenzieren. Generell kann man sie in kontraktile (differenzierte) oder in sekretorische (weniger differenzierte, migratorische) Muskelzellen einteilen. Welcher Phänotyp angenommen wird, ist abhängig von der umgebenden extrazellulären Matrix, Wachstumsfaktoren, Zytokinen und physiologischen und pathophysiologischen Situationen. Die meisten glatten Gefäßmuskelzellen haben einen differenzierten Phänotyp mit wenigen sekretorischen Granula und einem hohen Gehalt an α-Aktin. Letzteres ist die molekulare Grundlage für die Fähigkeit zu kontrahieren und das Ausüben der mechanischen Kräfte auf die perizelluläre Matrix. Der sekretorische Phänotyp ist charakterisiert durch die Fähigkeit zu proliferieren, zu migrieren und die ECM zu produzieren und zu sezernieren. Diese beiden Phänotypen können unter bestimmten physiologischen und pathophysiologischen Umständen ineinander übergehen (EBLE
an, die einer Überdehnung entgegen wirkt (LIEBICH 2004).
Abb. 2: Schematischer Aufbau der histologischen Strukturen eines Blutgefäßes
Die Aorta ist ein Leitgefäß sowie eine elastische Kammer für das Blut. Während der Kontraktion des Herzens dehnt sich die Aorta ascendens durch die Pulswelle des Blutes aus. Dabei vergrößert sich ihr Durchmesser und die Wandspannung steigt.
Die Aorta „speichert“ auf diese Weise einen Teil des ausgeworfenen Blutes.
Während der Diastole des Herzens und nach dem Schließen der Aortenklappe wird durch die elastischen Rückstellkräfte der Aortenwand der Durchmesser wieder reduziert und die Aorta gibt damit die „gespeicherte“ Blutmenge in den Kreislauf frei.
So wird die pulsatorisch ausgestoßene Blutmenge in eine kontinuierliche Strömung umgewandelt (= Windkesselfunktion) (KASSAB 2006).
1.2. Ätiologie operationswürdiger Erkrankungen der Aorta
Angeborene und erworbene Erkrankungen der Aorta des Menschen führen deutschlandweit jährlich zu etwa 7000 chirurgischen Eingriffen an der Hauptschlagader und damit zu einem hohen Bedarf an prothetischem Material (BRUCKENBERGER 2012). Die häufigsten Erkrankungen der Aortenwand sind in folgenden Tabellen zusammengefasst.
Tabelle 1: erworbene Erkrankungen
Erkrankung Merkmale
Arteriosklerose Kennzeichnend ist Verhärtung, Verdickung, Elastizitätsverlust und
Lumeneinengung der Aorta (KALANURIA et al. 2012; PSCHYREMBEL 2007) Aortenaneurysma Größenzunahme der Aorta die alle drei Wandschichten betrifft, in 10% der
Fälle nachfolgend Aortenruptur (KUIVANIEMI et al. 2012; PSCHYREMBEL 2007)
Aortendissektion Riss der Tunica intima mit Eindringen von Blut in tiefere Wandschichten, dadurch Trennung der Wandschichten, OP-Letalität 10-30% (INCE et al.
2007; PSCHYREMBEL 2007)
Aortenruptur Riss der Aorta aufgrund aneurysmatischer oder traumatischer Gefäßwandschädigung (INCE et al. 2007)
Tabelle 2: angeborene Erkrankungen
Erkrankung Merkmale
Marfan-Syndrom Häufigste erbliche Bindegewebsschwäche (autosomal-dominant)
Genmutation für Fibrillin-1-Synthese
Verminderung des Elastin Anteils in Geweben
Rarefizierung des gesamten Elastingerüstes in der Aortenwand
Zunehmende Wandsteifigkeit und verminderte Compliance der Aorta
In 75% der Fälle Todesursache durch Aortenruptur oder Aortendissektion (ECKSTEIN et al. 2011)
Ehlers-Danlos-Syndrom (vaskuläre Form, Typ IV)
Seltene autosomal-dominante Erbkrankheit
Mutation des Typ III Kollagens (COL3A1-Gen)
Mehrzahl der tödlichen Komplikationen sind Rupturen und/oder Dissektionen der thorakalen Aorta (ECKSTEIN et al. 2011)
Bei der akuten Aortendissektion wird die tatsächliche Inzidenz häufig unterschätzt, da viele Patienten vor Erreichen des Krankenhauses an unklarer Todesursache versterben (ECKSTEIN et al. 2011). In der Zeit von 2000-2011 hat die Hauptdiagnose Aortendissektion von 2242 auf 4885 Fälle pro Jahr in Deutschland zugenommen (STATISTISCHES BUNDESAMT 2013). Dagegen hat die Anzahl von Aortenaneurysmen ohne Lokalisation (rupturiert und nicht rupturiert) seit dem Jahr 2000 deutlich abgenommen (STATISTISCHES BUNDESAMT 2013). Die Inzidenz von Erkrankungen der Aorta betrug im Jahr 2011 34 Krankenhaus- Hauptdiagnosen/100.000 Einwohner. Davon entfielen 17,4% auf die Gruppe der Aortendissektionen, was einer Inzidenz von 5/100.000 Einwohnern in Deutschland entspricht (STATISTISCHES BUNDESAMT 2013). Laut dem Statistischen Bundesamt betreffen 17% aller Aortenaneurysmen-Hauptdiagnosen die thorakale Aorta und 49% die abdominale Aorta. Insgesamt betreffen 76,9% aller Aortenerkrankungen in deutschen Krankenhäusern das männliche Geschlecht
liegt bei Männern zwischen dem 45. und 75. Lebensjahr und bei Frauen zwischen dem 60. und 80. Lebensjahr. Ab dem 70. Lebensjahr ist die Inzidenz in beiden Geschlechtern nahezu identisch (ECKSTEIN et al. 2011).
Laut IRAD liegt das Risiko von Aortendissektionen für eine Aortenruptur bei 90%, wobei 75% davon ins Perikard oder ins Mediastinum rupturieren. Mittels operativer Therapie kann die Mortalität bei Aortenrupturen auf 10% nach einem Tag, auf 12%
nach zwei Tagen und auf 20% nach zwei Wochen gesenkt werden (HAGAN et al.
2000). Dagegen kann bei Dissektionen die operative Mortalitätsrate zwischen 15 und 85% schwanken (REHDERS et al. 2006). Dennoch führt die operative Therapie nicht immer zur vollständigen Heilung der Patienten. In einer umfangreichen Studie über einen Zeitraum von 14 Jahren konnte gezeigt werden, dass in ca. 13% aller durchgeführten operativen Eingriffe an der thorakalen Aorta eine erneute Operation erforderlich ist. Zum Einen können fortschreitende Aneurysmen, persistierende oder wiederkehrende Aortendissektionen oder ein falsches Aneurysma (von der Erweiterung sind nur die Intima und die Media betroffen) an den Nahtlinien eine erneute Operation erfordert, zum Anderen können Stenosen und Infektionen der eingesetzten Grafts auftreten und proximale oder wiederkehrende Aneurysmen distal des eingesetzten Grafts beobachtet werden und so eine Reoperation bedingen (CARREL et al. 1993).
1.3. Historie der Aortenwandchirurgie
Die Aortenchirurgie fand ihren Anfang in den fünfziger Jahren des 20. Jahrhunderts.
Begonnen hatten Cooley und De Bakey die Aortenchirurgie mit Abtragung sakkulärer Aneurysmen und Raffung von fusiformen Aneurysmen (COOLEY et al. 1952).
Komplexere Eingriffe waren zu diesem Zeitpunkt nicht möglich, da zum Schutz von Herz und Gehirn gegen perioperative ischämische Episoden bis dahin nur unzureichende Optionen und noch keine blutdichten Gefäßprothesen zur Verfügung standen (KARCK et al. 2009). 1956 gelang es mehreren Gruppen, einen gesamten Aortenbogenersatz mit dem Anlegen von temporären und permanenten extraanatomischen Kreislaufbrücken erfolgreich durchzuführen (BORST et al. 1964;
COOLEY et al. 1955; COOLEY et al. 1956; MULLER, Jr. et al. 1960). Seit den sechziger Jahren widmeten sich zahlreiche Chirurgen der chirurgischen Therapie der Aorta bei Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie (BORST et al. 1964; CRAWFORD
OTT et al. 1978). Ebenfalls in den sechziger Jahren gelang es De Bakey, ein Aneurysma im Aortenbogen erfolgreich durch einen Homograft zu ersetzen. Heberer gelang 1960 erstmalig der Ersatz der Aorta descendens unter extrakorporaler Zirkulation (DE BAKEY et al. 1957; HEBERER et al. 1960). 1968 ist es gelungen, in einer Operation einen separaten Ersatz von Aortenklappe (Starr-Edwards-Klappe) und einen separaten Aorta-ascendens-Ersatz mittels eines Teflongrafts durchzuführen (WHEAT, Jr. et al. 1964). Der erste gemeinsame Ersatz von Aortenbasis und Aorta ascendens folgte nur wenige Jahre später (BENTALL et al.
1968; SCHULTE et al. 1971). Die ersten chirurgischen Eingriffe an Aortenbasis und Aorta ascendens mit Erhalt der nativen Aortenklappe wurden in den Achtziger und Neunziger Jahren des 20. Jahrhunderts erprobt (DAVID et al. 1992). Leseche setzte 2001 erstmalig humane kryokonservierte aortale Homografts zur Behandlung von infizierten Aortenprothesen und mykotischen Aneurysmen ein (LESECHE et al.
2001). 2003 wurde von Karck die „frozen elephant trunk“-Technik zur Behandlung von thorakalen Aortenaneurysmen etabliert (KARCK et al. 2003). Dabei kann unter Verwendung der Chavan-Haverich-Hybridprothese in einer Operation gleichzeitig der Ersatz von Aorta ascendens und descendens durchgeführt werden, was dem Patienten eine mögliche Zweitoperation mit deren Risiken erspart (KARCK et al.
2003).
In den letzten 10 Jahren haben Stents oder sog. Endovaskulärprothesen zur Behandlung von Dissektionen und Aneurysmen der Aorta immer mehr an Bedeutung gewonnen. Der Vorteil der Endovaskulärprothesen liegt darin, dass ein minimal invasiver Eingriff ausreicht, um den Stent einzusetzen, was gerade bei multimorbiden und schwerstkranken Patienten indiziert ist, die einem offenen chirurgischen Einsatz nicht zugeführt werden können (CHAVAN et al. 2003; GREENBERG 2006;
GREENBERG et al. 2006; INCE et al. 2007; NIENABER et al. 2007).
1.4. Ersatzmaterialen
1.4.1. Synthetische Implantate und deren Limitationen
In den letzten 50 Jahren wurden im Wesentlichen zwei Polymere als synthetisches Implantatmaterial eingesetzt. Zum Einen werden das Polyethylenterephthalat (PET, Dacron®) und zum Anderen das Polytetrafluorethylen (PTFE, Gore-Tex®) eingesetzt
Die gestrickten Dacronfilamente müssen aufgrund ihrer hohen Porosität vor ihrer Verwendung mittels Gelatin, Kollagen oder Albumin gegen Durchblutung imprägniert werden (XUE et al. 2003).
Die Hauptnachteile bei prothetischen Gefäßersätzen aus Dacron sind das Risiko der Thromboembolie sowie das hohe Blutungsrisiko. Das Risiko der Thromboembolie lässt sich trotz einer konventionellen Antikoagulation nicht vollständig beheben (GRAETER et al. 1998). Die Dacronprothesen neigen dazu, sich nach längerer Zeit zu erweitern, was eine Minderung ihrer Stabilität mit sich bringt, bisher aber keine klinische Relevanz gezeigt hat (BLUMENBERG et al. 1991). Einige Behandlungen von Aortenaneurysmen sehen vor, die Dacronprothese in die Aorta einzusetzen und außen die eigentliche Aortenwand zu erhalten. Dabei wird beobachtet, dass keine Vereinigung des Grafts mit der anliegenden Aortenwand stattfindet. Nachfolgend stirbt das ursprüngliche Aortengewebe ab und bietet so einen Nährboden für Infektionen (ALTARABSHEH et al. 2012).
PTFE wird in Form einer Röhre verwendet, die sich aus unregelmäßig geformten Membranen zusammensetzt.
Die Schichtung von PTFE-Prothesen führt manchmal zu der Bildung eines dünnen Fibrinkoagulums auf der luminalen Oberfläche, das wiederum eine Ansiedlung von Endothelzellen nur schwer möglich macht (CHLUPAC et al. 2009). Die Hauptnachteile von Prothesen aus PTFE bestehen im Wesentlichen ebenfalls in der Gefahr der Thrombenbildung, einer späteren Stenose und einem Verschluss der Prothese durch eine Hyperplasie der Intima, insbesondere in Kleinkalibergefäßen.
Außerdem neigen diese beiden Prothesenarten zu Infektionen und ektopischer Kalzifizierung, und die Prothesen sind nicht in der Lage, mitzuwachsen, was die Prothesen besonders ungünstig für den Einsatz bei Kindern macht (BREUER 2011;
TORIKAI et al. 2008). Vor allem die unzureichenden Ergebnisse von beiden Polymeren bei kleinkalibrigen Gefäßprothesen aufgrund der Thrombogenität und der sich entwickelnden Intimahyperplasie stellen erhebliche Nachteile dieser Implantate dar (SAGBAN et al. 2009). Des Weiteren ist bei allen synthetischen Prothesen das Risiko einer oftmals unbeherrschbaren Infektion gegeben (CHLUPAC et al. 2009).
Als weitere Implantatmaterialien kommen Polyurethane (=PU) zum Einsatz. Sie zählen zu den elastischen Polymeren und bestehen aus einem kristallinen Monomer für ausreichende Stabilität, einem amorphen Monomer für die Flexibilität und einem
Generation der PU`s sind wenig hydrolytisch und oxidativ relativ stabil (XUE et al.
2003) und fördert damit eine schnelle Endothelialisierung und damit zu einer geringeren Neointimabildung. Der größte Vorteil ist, dass die Prothesen aus Polyurethanen im Gegensatz zu denen aus PTFE und Dacron ihre Dehnbarkeit beibehalten (CHLUPAC et al. 2009).
In den letzten Jahren haben sich auch sogenannte Zwischenformen entwickelt, die sich keiner Gruppe zuordnen lassen. Eine Form stellen die Bioprothesen von Medtronic Inc. (Minneapolis, USA) dar, die sich aus Schweinegewebe/Rindergewebe und einem Kunststoff-Stent zusammensetzen (KIRSCH et al. 2009; MAZZOLA et al.
2012; MISKOVIC et al. 2012).
1.4.2. Biologische Implantate und deren Limitationen
Der Goldstandard auf dem Gebiet der biologischen Implantate sind allogene native Gefäße, die als Transplantat eingesetzt werden. Es werden vor allem frische und kryokonservierte Homografts als Gefäßersatz genutzt. Die frischen Homografts neigen zu einem späteren Verfall als die kryokonservierten Homografts, bilden eher Aneurysmen und sind zusätzlich nur limitiert verfügbar. Die kryokonservierten Homografts neigen über die Zeit zu einer strukturellen Degeneration und zeigen eine durchschnittliche Nutzbarkeit von ca. 10 Jahren. Eine Anwendung bei jüngeren Patienten erfordert daher mindestens eine Reoperation (APER et al. 2008; VOGT 2011). Die langfristige Degeneration der biologischen Implantate ist schließlich die wesentliche, bisher ungelöste Limitation dieser Prothesen (GRAETER et al. 1998).
1.5. Die ideale Gefäßprothese
Artifizielle Blutgefäße, die aus lebendem Gewebe bestehen, stellen die ideale vaskuläre Prothese dar. Eine ideale Prothese muss über möglichst physiologische mechanische Widerstandskraft und Compliance verfügen, um langfristig hämodynamischem Stress standzuhalten. Der Graft darf nicht toxisch und nicht immunogen sein. Der Graft muss biokompatibel und jederzeit in verschiedenen Größen erhältlich sein. Außerdem sollte der Graft chirurgisch einfach zu handhaben sein. Er sollte möglichst keine thrombogenen Effekte auslösen. Der Graft muss sich in das Empfängergewebe integrieren und die Fähigkeit zum Wachsen haben, wenn
Weiteren spielen ein leichtes Herstellungsverfahren, die Lagerfähigkeit der Gefäßprothesen und die Bereithaltung für einen akuten Notfall sehr wichtige Rollen.
Derzeit erfüllt noch keine der verfügbaren Aortenprothesen diese Eigenschaften eines idealen Gefäßersatzes (WALPOTH et al. 2011).
Moderne Verfahren des Tissue Engineering bieten jedoch eine innovative Möglichkeit zur Herstellung biologischer Aortenprothesen, die die bisherigen Einschränkungen verfügbarer Grafts überwinden können.
1.6. Tissue Engineering
Langer und Vacanti haben Tissue Engineering als fachgebietsübergreifendes Arbeitsfeld beschrieben, dass Prinzipien der Technik und der Biowissenschaften zum Einsatz bringt. Dieses Gebiet soll die Entwicklung von biologischen Substituten ermöglichen, die Gewebefunktionen ersetzen, unterstützen und verbessern (LANGER et al. 1993).
Das grundsätzliche Prinzip des Tissue Engineering besteht darin, synthetische oder biologische Matrixgerüste zur in vivo oder in vitro Besiedelung mit autologen oder körperfremden Zellen zu nutzen. Dies ermöglicht idealerweise eine komplette physiologische Umwandlung des Substituts in das gewünschte Gewebe. Damit wären regenerative, nicht immunogene und zum Wachstum befähigte Prothesen verfügbar (LANGER et al. 1993; SCHILLING et al. 2011; TEEBKEN et al. 2007).
Des Weiteren wurde beschrieben, dass beim Tissue Engineering Methoden zum Einsatz kommen, die sich in drei Klassen einteilen lassen. Die erste Klasse beinhaltet das Tissue Engineering im klassischen Sinn, wobei Zellen vermehrt werden und in vitro eine Besiedlung von Matrices zur Herstellung von Geweben oder ganzen Organen vorgenommen wird. Eine weitere Klasse ist die Guided Tissue Regeneration. Hierbei gibt eine primär stabile, azelluläre Matrix, die Form des späteren Ersatzes vor. Wird diese Matrix in einen Empfänger implantiert, reift sie durch Besiedlung mit autologen Zellen in vivo zu einem funktionsfähigen Ersatz heran. Die letzte Klasse umfasst den Zelltransfer, der sich durch eine systemische oder lokalisierte Zellinjektion von autologen, allogenen oder xenogenen Zellen auszeichnet. Dies dient der Erhöhung der Zellkonzentration dieser spezifischen Zellen im Blut oder einer gezielten Region (TEEBKEN et al. 2007).
Gemäß den Prinzipien des Tissue Engineering kommen als biologische Matrizes dezellularisierte, tubuläre biologische Strukturen zum Einsatz. Für den Ersatz von geschädigten Aortensegmenten bieten sich wegen der physiologischen physikalischen Eigenschaften und Größenverhältnisse Aorten oder Pulmonalarteriensegmente von geeigneten Spendern an.
Zunächst wurden biologische Aortenprothesen in nicht orthotoper Position auf ihre Besiedlungsfähigkeit getestet. Nach subkutaner Implantation von dezellularisierten ovinen Aortenteilstücken (5x10mm2) in Ratten zeigte sich, dass die Aorten rebesiedelt wurden und die Rebesiedlung über einen Zeitraum von vier Wochen weiter anstieg. Als die Rebesiedlung stagnierte, kam es zum Zerfall der Matrix und nachfolgend zur Degeneration der Aortenteilstücke (WALLES et al. 2003a; WALLES et al. 2003b).
Bader testete ebenfalls dezellularisierte porcine Aortengerüste (1cm2) subkutan im Rattenmodell auf deren Rebesiedlungspotential. Nach sieben Tagen konnte eine Infiltration von einigen Immunzellen gezeigt werden, die jedoch deutlich geringer war als bei den unbehandelten Kontrollen, die aus nativen porcinen Aortenstücken bestanden (BADER et al. 2000).
Zum Anderen wurde auch der orthotope Ersatz von Aortensegmenten durch biologische Prothesen im Tiermodell erprobt. Zum Beispiel führte Allaire Versuche zum biologischen Aortenersatz mit dezellularisierten Xeno- und Allografts in der abdominalen Aorta bei der Ratte durch. Dabei zeigte sich nach zwei Monaten, dass die mit Natriumlaurylsulfat (SDS) behandelten Allografts nur eine geringgradige Infiltration von inflammatorischen Zellen aufwiesen und einen Erhalt der Elastinstruktur zeigten. Des Weiteren zeigten die dezellularisierten Allografts eine nicht-inflammatorische Neointimaverdickung, die aus glatten Muskelzellen bestand (ALLAIRE et al. 1994; ALLAIRE et al. 1996).
Liu implantierte zellfreie Aortenmatrices mit einer intakten Basallamina und testeten diese in Aorta-descendens-Position bei Ratten. Nach 20 Tagen zeigte sich eine Reduktion der elastischen Lamellen und daraus folgend eine nur geringe Einwanderungsbereitschaft von glatten Muskelzellen. Es konnte dementsprechend so gut wie keine Rebesiedlung beobachtet werden, dafür aber eine steigende Neointimaverdickung (LIU et al. 2004).
Pulmonalarterienteilstücke in Pulmonalarterien- und Aortenposition eingesetzt.
Ketchedjian konnte zeigen, dass nach 20 Wochen Zellen zwischen die Elastinlamellen eingewandert waren und eine partielle Endothelialisierung stattgefunden hatte (KETCHEDJIAN et al. 2005).
Lehr testete ebenfalls ovine dezellularisierte Pulmonalarterien in der thorakalen Aorta im Schafmodell. In diesem Versuch wurden nach vier Wochen in dem prothetischen Gefäßabschnitt eine neointimale Hyperplasie sowie, von der Adventitiaseite ausgehend, proliferierende glatte Muskelzellen beobachtet. Außerdem konnte eine Neovaskularisation in der Adventitia und der Media nachgewiesen werden (LEHR et al. 2011). Liu erprobte dezellularisierte Aorten vom fetalen Schwein im Vergleich mit dezellularisierten Aorten von adulten Schweinen in subkutaner Position im Schweinemodell. Es zeigte sich nur eine minimale Kalzifikation und Degeneration der dezellularisierten Aorten nach acht Wochen (LIU et al. 2008).
In den hier genannten Studien wurden sehr gute Ansätze im Bereich des Aortenersatzes durchgeführt, die jedoch einige Limitationen aufweisen. Zum Teil wurden die dezellularisierten Gefäße in vivo nur in heterotoper Position auf ihre Rebesiedlungsfähigkeit getestet. Für den klinischen Einsatz ist eine Überprüfung in orthotoper Position aber erforderlich. Zum Anderen wurden nur im Kleintiermodell dezellularisierte Aorten in orthotoper Position getestet. Das Kleintiermodell ist nur schwer auf die humane Anwendung übertragbar. Die Anwendung in den hier genannten Großtiermodellen bezieht sich wiederum nur auf Teilstücke von dezellularisierten Gefäßen und ist deswegen mit einem langstreckigen Ersatz ebenfalls nur schwer vergleichbar. Allen Projekten gemeinsam ist der zeitlich sehr kurze Einsatz in vivo, was eine Aussage über den Langzeiteinsatz dieser Gefäßersätze schwierig gestaltet.
1.6.2. Dezellularisierung als Methode des Tissue Engineering
Unter Dezellularisierung ist der Entzug von Zellen aus dem biologischen Gewebe oder Organ zu verstehen. Übrig bleibt die komplexe Mischung von strukturellen und funktionalen Proteinen, die die extrazelluläre Matrix (ECM) bilden (GILBERT et al.
2006). Das Ziel eines Dezellularisierungsprotokolls ist es, sehr effizient alle zellulären und nukleären Komponenten zu entfernen, zeitgleich aber alle negativen Effekte auf
erhaltenen ECM zu minimieren (GILBERT et al. 2006).
Derzeit existiert eine Vielzahl von physikalischen und chemischen Dezellularisierungsverfahren. Physikalische Verfahren nutzen die Effekte von hypertonischen und hypotonischen Lösungen, von Temperatur, der direkten Applikation von Kräften, Druck oder Elektroporation zur Lyse oder Entfernung von Zellen.
Physikalische Verfahren zeigen, dass die Ultrastruktur des Gewebes beschädigt wird und eine ausreichende Zellentfernung durch diese Verfahren allein nicht erreicht wird.
Chemische Verfahren umfassen die Behandlung von biologischen Geweben mit Säuren und Basen, Enzymen und Chelaten sowie die Anwendung von ionischen, nicht-ionischen und zwitterionischen Detergenzien (CRAPO et al. 2011).
Nachteilig ist, dass es bei der Nutzung von Säuren und Basen zur Schädigung der Quervernetzung oder zum gänzlichen Entfernen von Kollagen kommt. Das führt zu einer geringeren Strukturfestigkeit der ECM. Bei der Anwendung von Detergenzien kann es zur Zerstörung und zum Zerfall von Proteinen in der ECM sowie zur Eliminierung von Wachstumsfaktoren in Abhängigkeit von der Behandlungszeit kommen.
Enzymatische Dezellularisierungsverfahren können zur Zerstörung der Elastin- und Kollagenfasern führen und eine effektive Zellentfernung auf der Oberfläche bewirken, aber nicht im tiefer liegenden Gewebe. Bei der Anwendung von Seren ist ein großer Nachteil, dass immunogen wirkende Bestandteile der ECM, wie Phospholipide, gar nicht entfernt werden.
Allen Dezellularisierungsverfahren gemeinsam ist die mögliche Beeinträchtigung der originären Stabilität des Gewebes, so dass ein Einsatz der instabilen biologischen Grafts im Hochdrucksystem des Kreislaufs zunächst nicht empfohlen werden kann.
Eine passagere Stabilisierung der initial fragilen biologischen Prothesen über degradierbare Stützstrukturen z.B. aus Magnesium könnte deren Einsatz erweitern.
Metalle, die im menschlichen Körper vorkommen, sind vielversprechende Materialien für Implantate (WITTE et al. 2005; WITTE et al. 2006; XUE et al. 2003). Magnesium ist das zweithäufigste intrazelluläre Kation im Körper und ist an vielen wichtigen biochemischen Reaktionen beteiligt (BARBAGALLO et al. 2010). Zu den Magnesium beteiligten Reaktionen im Körper zählen die Reiz- und Erregungsübertragung und die Aktivierung vieler Enzyme (PFEFFER 2005). Magnesiumimplantate bieten eine vorübergehende mechanische Stabilisierung während der Heilung oder Wiederherstellung des geschädigten Gewebes im Körper (WITTE 2010). Magnesium und seine Legierungen wurden von vielen Autoren als degradierbares biologisches Implantatmaterial für geeignet befunden. Gerade in der Orthopädie haben sich diese Implantate als gut biokompatibel und leicht handhabbar erwiesen (WITTE et al. 2005;
WITTE et al. 2006; XU et al. 2007).
Die Degradation und Biokompatibilität von beschichteten Magnesiumlegierungen ist abhängig von deren Zusammensetzung und den spezifischen Eigenschaften des Wirtsgewebes in vivo (WITTE et al. 2006; WITTE et al. 2008; WITTE 2010).
Grundlegend ist es sehr schwer, das in vitro ermittelte Korrosionsverhalten der beschichteten Magnesiumlegierungen auf die unterschiedlichen anatomischen Lokalisationen, die unterschiedlichen lokalen Blutflüsse und den Wassergehalt in verschiedenen Geweben oder die verschiedenen mechanischen Gegebenheiten zu übertragen. Daher kann Aufschluss über ein exaktes Korrosionsverhalten von beschichteten Magnesiumlegierungen nur eine In-vivo-Studie in der spezifischen anatomischen Situation geben (WITTE et al. 2006; WITTE et al. 2008; WITTE 2010).
1.8. Schaf als Versuchstier
In der kardiovaskulären Forschung sind unterschiedliche Tiermodelle etabliert. Sehr oft werden Kleintiermodelle, wie Mäuse, Ratten und Kaninchen, eingesetzt. Vorteile dieser Kleintiermodelle liegen in der leichten Handhabbarkeit der Tiere, den geringen Versuchskosten und der Möglichkeit, das Genom, insbesondere bei Mäusen, zu manipulieren. Der Nachteil der Kleintiermodelle liegt darin, dass sich die anatomischen und physiologischen Gegebenheiten der Kleintiere nur ungenügend auf den Menschen übertragen lassen (ZARAGOZA et al. 2011).
abzubilden, kommen Großtiermodelle zum Einsatz. Dafür werden in Deutschland vorwiegend Schweine und Schafe als Modell genutzt. Natürlich haben auch Großtiermodelle einige Nachteile, wie das komplexe Handling der Tiere, spezielle Haltungsansprüche der Tiere, die chirurgische Ausrüstung, die sehr viel höheren Haltungskosten und die folglich geringere Tieranzahl pro Versuchsdurchgang (ZARAGOZA et al. 2011).
Schweine eignen sich aufgrund ihrer anatomischen Gegebenheiten sehr gut für Studien über Herzversagen. Schafe werden hauptsächlich als „Großtiermodell“ für Studien mit Herzklappenprothesen oder sonstigen Implantaten für Herz- und Blutgefäße sowie in der Orthopädie verwendet. Das Schafherz wird bezüglich Größe, Frequenz, Schlagvolumen und Druckverhältnissen als dem des Menschen ähnlich beschrieben. Nach Implantation von biologischen Herzklappenprothesen in junge Schafe zeigt sich, dass die biologischen Implantate zu einer akzelerierenden kalzifizierenden Degeneration neigen. Das Schaf dient daher als sogenanntes
„Mineralisationsmodell“, das sich ideal zur Überprüfung von Degenerationen anbietet (ANON. 2012).
2. Ziel der Arbeit
Die bisherigen verfügbaren synthetischen Aortenprothesen unterliegen zahlreichen Limitationen, so dass der Goldstandard für den Ersatz geschädigten Aortengewebes die Verwendung von kryokonservierten humanen Spendergefäßen ist. Allerdings sind diese Homografts nicht in ausreichender Menge verfügbar. Die Gewebezüchtung von regenerativen bioartifiziellen Grafts bietet daher vielversprechende neue Möglichkeiten, dem zunehmenden Bedarf an idealem prothetischem Material zu begegnen.
In dieser Arbeit wurde ein Vergleich zwischen dezellularisierten ovinen Aortengrafts und dezellularisierten ovinen Pulmonalarteriengrafts als Gefäßersatz in der thorakalen Aorta nach Implantation im Schafmodell durchgeführt. Dazu wurde die physiologische Integration und Umwandlung des Spendergewebes nach unterschiedlichen Implantationszeiträumen histologisch und immunhistochemisch charakterisiert. Außerdem wurden die Reaktionen des Wirtsgewebes auf eine unterstützende Magnesiumspange untersucht.
3. Material und Methoden
3.1. Aufbereitung der Grafts
Als Grafts wurden Aorten und der Truncus pulmonalis von Schafen verwendet. Die Grafts wurden im lokalen Schlachthof frisch entnommen, dazu wurden eine sterile chirurgische Pinzette, eine sterile chirurgische Schere sowie sterile Handschuhe verwendet. Die Entnahme des ovinen Truncus pulmonalis und der ovinen Aorta descendens erfolgte am gerade frisch entnommenen Geschlinge des zumeist adulten Tierkörpers. Zunächst wurde das Herz der Schafe umfasst und der Ursprung des Truncus pulmonalis aus der rechten Herzkammer aufgesucht. Der Truncus pulmonalis wurde von seinem Ursprung bis zu seiner Aufteilung in die zwei Pulmonalarterien entnommen. Danach wurde der Ursprung der Aorta aus der linken Herzkammer aufgesucht und der Verlauf der Aorta verfolgt bis hinter den Aortenbogen. Hinter dem Aortenbogen wurde die Aorta durchtrennt und ein ca. 10 cm langer Abschnitt der Aorta descendens entnommen. Anschließend wurden die entnommenen Grafts in einer phosphatgepufferten Salzlösung mit antibiotischen Zusätzen (=PBS+) zum Labor transportiert. Als antibiotische Zusätze wurden Gentamicin, Patricin und Penicillin-Streptomycin verwendet. Der Transport erfolgte in einer Kühlbox in 50 ml Reaktionsgefäßen. Im Labor wurden die Grafts unter der Sterilbank von Fett und Bindegewebe befreit.
3.2. Dezellularisierung der Aorten- und Pulmonalarteriensegmente
In dieser Arbeit wurde ein Verfahren bestehend aus chemischen und physikalischen Komponenten angewendet. Für das chemische Verfahren wurden zwei ionische Detergenzien benutzt. Als erstes Detergens wurde SDS verwendet, das die zytoplasmatischen und nukleären Zellmembranen auflöst. Das zweite Detergens ist Natriumdesoxycholat (SD), das mit dem gleichen Funktionsprinzip arbeitet. Als Nachteil dieser Methoden werden die Neigung zur Zerstörung der nativen Gewebestruktur, das Entfernen der GAG`s und die Schädigung des Kollagens angesehen. Nachfolgend wurde im Protokoll noch destilliertes Wasser eingesetzt,
um die Detergenzien aus dem Gewebe zu entfernen (CRAPO et al. 2011; GILBERT et al. 2006). Als physikalische Komponente kommt ein Schüttelapparat zum Einsatz, der die Flüssigkeit, in der die Gewebe liegen, ständig in Bewegung hält, um so alle Bereiche des Gewebes gut zu umspülen (CEBOTARI et al. 2010; LICHTENBERG et al. 2007; TUDORACHE et al. 2007).
Die präparierten Aorten und Pumonalarterien wurden einzeln in Schottflaschen überführt (siehe Abbildung 3 und 4) und mit Braunol fünf Minuten auf dem Schüttelapparat gespült. Anschließend wurde das Braunol abgegossen und die Schottflaschen mit PBS+-Lösung auf 150 ml aufgefüllt und für 20 Minuten auf den Schüttelapparat gestellt. Nach Ablauf dieser Zeit wurde das PBS+ durch 150 ml der Detergenslösung ersetzt. Die Detergenslösung wurde alle 12 Stunden gewechselt.
Die Aortensegmente wurden für 48 Stunden in der Detergenslösung inkubiert, während die Pulmonalarteriensegmente für 24 Stunden mit Detergenslösung inkubiert wurden. Die Detergenslösung setzte sich aus 0,5% SDS und 0,5% SD zusammen (5 g SDS + 5 g SD gelöst in destilliertem Wasser und auf einen Liter aufgefüllt).
Die Detergenslösung wurde anschließend durch endionisiertes Wasser ersetzt.
Insgesamt erfolgten zwei Spülungen mit destilliertem Wasser für je 12 Stunden.
Es schloss sich daran eine Spülprozedur in PBS+-Lösung, mit 11 Wechseln der Lösung alle 12 Stunden an. Der letzte Schritt umfasste das Waschen in PBS-Lösung ohne antibiotische Zusätze für 12 Stunden. Während des gesamten Protokolls wurden bei jedem zweiten Wechsel der Flüssigkeiten die Grafts auf links oder auf rechts gedreht, um von allen Seiten für die Lösungen gut zugänglich zu sein. Der gesamte Dezellularisierungsprozess fand bei Raumtemperatur auf dem Schüttelapparat (siehe Abbildung 3) statt.
Am Ende des Dezellularisierungsprotokolls wurde eine Kontrolle auf bakterielle Kontaminationen durchgeführt. Dazu wurden jeweils 9 ml Medium in ein 15 ml Reaktionsgefäß für jeden Graft pipettiert und 1 ml PBS-Lösung des jeweiligen Grafts.
Die Reaktionsgefäße mit der Lösung wurden für mindestens 24 Stunden im Brutschrank inkubiert. Nach Ablauf der 24 Stunden wurden 2-3 ml der Flüssigkeit in
eine Petrischale pipettiert und mikroskopisch auf Kontaminationen untersucht. War keine Kontamination auffindbar, wurden die Grafts in 50 ml Reaktionsgefäße überführt und in PBS+-Lösung bei 4°C aufbewahrt.
Abb. 3: Schüttelapparat (A) mit Schottflaschen und die Detailansicht (B)
Abb. 4: Schottflasche mit einer dezellularisierten Aorta
3.2.1. Kontrolle der Dezellularisierung
Zur Kontrolle der Dezellularisierung wurden nach Abschluss des Dezellularisierungsprotokolls ein ca. 0,5 cm großes Segment von der Aorta und ein 0,5 cm großes Segment von dem Truncus pulmonalis abgetrennt. Diese Segmente wurden entwässert und danach in Paraffin eingebettet (siehe Vorgehensweise unten). Lagen die Gefäßsegmente in kleinen festen Paraffinblöcken vor, wurden davon ca. 7 µm dicke Querschnitte der Gefäße angefertigt. Diese Querschnitte wurden dann auf Objektträger gezogen und getrocknet. Am nächsten Tag wurden histologische Färbungen (HE-Färbung und Pentachrom-Färbung) angefertigt. Die histologischen Präparate wurden unter dem Mikroskop betrachtet. Es wurde untersucht, ob noch Zellen im Präparat zu finden waren und ob die Struktur der extrazellulären Matrix gut erhalten war. Insbesondere ob die elastischen Lamellen noch intakt waren und der Kollagengehalt der Matrix noch dem eines nativen Gefäßes entsprach. Die Auswertung erfolgte mit der 40-fachen, 100-fachen und 200- fachen Vergrößerung ohne Öl.
3.3. Herstellung der Magnesiumspangen
In unserem Projekt wurden die biologischen Aortenprothesen von außen durch degradierbare Magnesiumstützstrukturen unterstützt. Die in diesem Versuch verwendeten Magnesiumspangen (siehe Abbildung 5) bestehen aus der Legierung LA63, d.h. aus 91% Magnesium, 6% Lithium und 3% Aluminium. Nach Fertigstellung mittels Wasserstrahltechnologie wurden die Spangen mit Magnesiumfluorid beschichtet. Die Herstellung der Magnesiumspangen und ihre In-vitro-Testung erfolgte im Institut für Werkstoffkunde der Leibniz Universität Hannover (BISKUP et al. 2009; BISKUP et al. 2010).
Abb. 5: LA63 Magnesiumspangen
3.4. In-vivo-Studie 3.4.1. Versuchstiere
In dieser Arbeit kamen Schwarzkopfschafe als Versuchstiere zum Einsatz, die vom Niedersächsischen Schafzuchtverein bezogen wurden. Der Tierversuch wurde vom Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES) nach §8 Tierschutzgesetz genehmigt (AZ 10/0272). Die Empfehlungen des National Institute of Health (USA) zum Umgang mit Versuchstieren („guide for the care and use of laboratory animals“, 1996) wurden beachtet. Die Tiere waren bei Einstallung zwischen drei und vier Monate alt und wogen zwischen 20 und 30 kg. Es wurden für den Versuch ausschließlich weibliche Tiere verwendet.
3.4.2. Tierhaltung
Die Haltung der Tiere erfolgte im Zentralen Tierlabor auf dem Gelände der Medizinischen Hochschule Hannover (Carl-Neuberg-Str.1, 30625 Hannover). Die Schafe wurden in einem halbüberdachten Offenstall untergebracht. Der überdachte Teil war mit Stroh eingestreut. Die Tiere wurden mit Heu und Wasser ad libitum sowie zweimal am Tag mit einer Portion handelsüblichem Schaffutter versorgt.
Außerdem standen den Tieren Minerallecksteine zur Verfügung. Für die Zeit vor und
nach der Operation standen gesonderte Ställe im Haupthaus des Tierlabors zur Verfügung. Die Ställe im Haupthaus waren vollklimatisiert bei einer Raumtemperatur von etwa 22 °C und wurden in zwölfstündigem Tag/Nacht-Rhythmus geführt.
3.4.3. Gruppeneinteilung
Die Tiere wurden in drei Hauptgruppen von jeweils sechs Schafen eingeteilt. In der ersten Gruppe betrug die Standzeit nach Implantation des Aortenersatzes einen Monat, in der zweiten Gruppe drei Monate und in der dritten Gruppe sechs Monate.
Die Hauptgruppen wurden jeweils in zwei Untergruppen à drei Schafe aufgeteilt. In der ersten Untergruppe erhielten die Versuchstiere eine Magnesiumspange zur Stabilisierung des biologischen Grafts, während die Kontrollgruppe dieses zusätzliche Implantat nicht bekam.
Tabelle 3: Gruppeneinteilung der Schafe
Gruppe Behandlung Standzeit Tiernummer Versuchsende erreicht
1a dezellularisiert 1 Monat 21430 Ja
66599 Ja
92286 Nein, nach 4 Wochen verendet
1b dezellularisiert mit Magnesiumspange
1 Monat 21438 Ja
21429 Ja
21439 Ja
2a dezellularisiert 3 Monate 21433 Ja
92282 Ja
92287 Ja
2b dezellularisiert mit Magnesiumspange
3 Monate 21437 Ja
66600 Ja
06221 Ja
3a dezellularisiert 6 Monate 21401 Ja
21407 Ja
21408 Ja
3b dezellularisiert mit Magnesiumspange
6 Monate 21402 Ja
21404 Nein, nach 8 Wochen verendet
21405 Ja
3.4.4. Anästhesie
Die Tiere erhielten 24 Stunden vor Operationsbeginn nur noch Trinkwasser, jedoch keine Nahrung mehr. Die Tiere wurden geschoren und es wurde ein venöser Zugang in die Vena cephalica antebrachii gelegt. Anschließend erfolgte eine Prämedikation mit Midazolam (Dosierung: 0,2 mg/kg i.v.). Midazolam ist ein Benzodiazepin, das dosisabhängig anxiolytisch, antikonvulsiv, zähmend (antiaggressiv), sedierend, hypnotisch und zentral muskelrelaxierend wirkt (LÖSCHER 2006). Danach erfolgte die Narkoseeinleitung mit Propofol (Dosierung: 4-6 mg/kg i.v. bzw. nach Bedarf, bis zum Erreichen des Intubationsstadiums) bis zum Erliegen des Schluckreflexes, damit die Tiere nachfolgend intubiert werden konnten. Propofol ist ein schnell- und kurzwirksames Injektionsnarkotikum, das zur Einleitung von Inhalationsnarkosen eingesetzt wird (LÖSCHER 2006). Zur weiteren Vermeidung von Aspiration der eigenen Pansenflüssigkeit wurde jedem Tier eine Pansensonde eingeführt.
Nachfolgend wurde die Narkose per Inhalation mit einem Gemisch aus Isofluran (Dosierung: 1,5-3% zur Aufrechthaltung der Narkosetiefe) und Sauerstoff (50%) aufrechterhalten. Isofluran erfüllt nahezu alle Anforderungen an ein ideales Inhalationsnarkotikum, da es sich durch eine schnelle An- und Abflutung, eine geringe Toxizität und eine hohe Wirkungspotenz auszeichnet (LÖSCHER 2006). Für die intraoperative Analgesie wurde nach der initialen Gabe von Carprofen (4mg/kg s.c./i.v.) zusätzlich Fentanyl (5-10 µg/kg alle 20-40 Minuten i.v.) injiziert. Zur intraoperativen Muskelrelaxierung wurde Atracurium (0,3-0,6 mg/kg i.v.) injiziert.
Zusätzlich wurde nach Eröffnen des Thorax eine interkostale Nervenblockade mit Carbostesin 0,25% (1,5 mg/kg) an fünf benachbarten Nervensegmenten durchgeführt.
3.4.5. Operationsdurchführung
Für die Implantation der Grafts im Bereich der Aorta descendens wurde eine linksseitige anterolaterale Thorakotomie im 5. Interkostalraum durchgeführt. Die thorakale Aorta wurde präpariert und einige der dorsalen Aortenabgänge wurden ligiert. Die kreuzende Vena azygos wurde ebenfalls ligiert. Zeitgleich wurde ein arterieller Katheter in den distalen Aortenbogen gelegt, um den arteriellen Blutdruck
während der Operation überwachen zu können. Nachdem die proximale und distale thorakale Aorta mit einem aorto-aortalen Bypass ohne Oxigenierung des Blutes versorgt wurde, konnte die thorakale Aorta abgeklemmt werden. Danach wurde ein Bereich von etwa 4 cm Länge reseziert. Die systemische Antikoagulation erfolgte durch die intravenöse Gabe von Heparin (400 I.E./kg). Parallel zur Vorbereitung der Wirtsaorta wurden die Segmente der dezellularisierten Aorta und der dezellularisierten Pulmonalarterie mit einer 4.0 RB1 Polypropylene Naht verbunden.
Aufgrund des im Vergleich zur Aorta des juvenilen Empfängertieres größeren Durchmessers des Pulmonalarteriengrafts wurde dieser in longitudinaler Richtung inzidiert, an einer Schnittkante um 0,5 cm gekürzt und schließlich mit einer Längsnaht wieder verschlossen, um den Durchmesser zu verringern.
Der aus der Verbindung der Segmente der dezellularisierten Aorta- und Pulmonalarterie entstehende Hybridgraft wurde mit einem 4.0 Einzel-Polypropylene- Faden mittels fortlaufender Nahttechnik an das proximale Ende der nativen Aorta descendens genäht und distal mit der nativen Aorta anastomosiert (siehe Abbildungen 6 und 7). Anschließend wurde bei den Tieren aus der Stichprobe eine stabilisierende Magnesiumspange um die implantierten dezellularisierten Allografts fixiert. In der Kontrollgruppe wurde auf diese stabilisierende Maßnahme verzichtet.
Nach Beendigung des aorto-aortalen Bypasses wurde eine Hämostase durch die Gabe von Protamin (400 I.E./kg) durchgeführt, um die gerinnungshemmende Wirkung des Heparins zu antagonisieren. Vor dem Verschließen des Brustkorbes wurde eine manuelle Belüftung der Lunge vorgenommen, um zu prüfen, ob während der Operation Atelektasen in der Lunge entstanden sind. Nachfolgend wurde die Brust anatomisch Schicht für Schicht verschlossen. Der Interkostalraum wurde mittels zweier nicht resorbierbarer Mersilene 2.0-Fäden verschlossen. Die darüber liegende Muskelschicht wurde mit Vicryl 0-Fäden mittels fortlaufender Nahttechnik verbunden. Die Haut wurde ebenfalls mit Vicryl 1.0-Fäden mit mehreren Donati- Nähten verschlossen.
Abb. 6: Zusammensetzung des Hybridgrafts
Abb. 7: Zusammensetzung des gesamten Gefäßkonstruktes
3.4.6. Klinische Befunderhebung während der Operationsdurchführung
Im Verlauf aller Im- und Explantationen wurden ausführliche klinische Daten während der Operationen erhoben. Im Abstand von 20-30 Minuten wurden das Atemzugvolumen (Tidalvolumen), die Beatmungsfrequenz und der Beatmungsdruck gemessen. Die arterielle Blutdruckmessung wurde nicht invasiv am Tier in rechter Seitenlage am linken Metakarpus unter Zuhilfenahme einer Blutdruckmanschette durchgeführt. Die Herzfrequenz wurde mit Hilfe eines Elektrokardiogramms mit der Dreiecksableitung nach Einthoven protokolliert. Die Narkose und deren Überwachung wurden mit dem Datex-Ohmeda-Äestiva-5-MRI-Gerät (Duisburg, Deutschland) durchgeführt. Außerdem wurden die Operationsdauer, die Zeit, die die Tiere an die Herz-Lungen-Maschine angeschlossen waren (= Maschinenzeit), die Zeit während derer die Aorta descendens vom Blutkreislauf abgeklemmt wurde (=
Klemmzeit) und der Zeitraum bis zur Extubation für jedes Tier protokolliert. Zusätzlich wurden bei jedem Tier mindestens zwei Blutgasanalysen während der Operation durchgeführt mit dem ABL 800 Flex (Radiometer GmbH, Laatzen, Deutschland), wobei der pH-Wert, der Sauerstoffpartialdruck, der Kohlendioxidpartialdruck, der
Bicarbonatgehalt, der Hämoglobin- und Hämatokrit-Wert und die Sauerstoffsättigung des Blutes ermittelt wurden.
3.4.7. Postoperative Betreuung der Tiere
Nach Abschluss der Operation wurden die Tiere weiterhin bis zum Einsetzen der eigenen Atmung manuell beatmet. Bei selbstständiger Atmung der Tiere wurden sie mittels eines Transportwagens in den vollklimatisierten Stall verbracht. Die Aufwachboxen waren großzügig mit Stroh eingestreut und mit einem zusätzlichen Kissen zur seitlichen Lagerung aus Stroh versehen. Zur Kompensation des Wärmeverlusts waren die Boxen mit Rotlichtlampen ausgestattet. Die Tiere blieben unter tierärztlicher Betreuung, bis sie selbstständig stehen konnten. In den folgenden drei Tagen nach der Operation wurden die Tiere zur Linderung möglicher postoperativer Schmerzen antiphlogistisch (Carprofen, Dosierung: 2-4 mg/kg s.c.), analgetisch (Buprenorphin, Dosierung: 10 µg/kg i.v.) und zur Infektionsprophylaxe antibiotisch (Penicillin-Streptomycin, Dosierung: 1Mio.IE/kg s.c.) versorgt. Es wurde täglich eine allgemeine Untersuchung durchgeführt. Dabei wurden vor allem Parameter, wie Atemfrequenz, Herzfrequenz, Körpertemperatur, allgemeines Verhalten und Fressverhalten, überprüft. Mindestens zwei Wochen verblieben die Tiere im Haupthaus des Tierlabors. Befanden sich die Tiere nach dieser Zeit in einem guten Allgemeinzustand, wurden die Operationsfäden gezogen. Nachfolgend wurden die Tiere dann wieder bis zum Versuchsende in die Offenstallhaltung überführt.
3.4.8. Explantation der Grafts
Zur Explantation der dezellularisierten Gefäßkonstrukte wurde bei den Schafen wie oben beschrieben eine Allgemeinanästhesie (unter Gabe von Propofol (4-6 mg/kg i.v.) und der weiteren Narkoseaufrechterhaltung mit Isofluran (1,5-3%)) durchgeführt.
Das Eröffnen des Operationsfeldes erfolgte durch eine linksseitige anterolaterale Thorakotomie im 5. Interkostalraum. Die thorakale Aorta wurde präpariert und anschließend wurde eine systemische Antikoagulation durch die intravenöse Gabe von Heparin (500 I.E./kg) herbeigeführt. Daraufhin erfolgte die Tötung der Schafe durch intravenöse Gabe von Release (Pentobarbital, Dosierung: 450mg-
900mg/10kg). Nach dem Herzstillstand wurden die Gefäßkonstrukte aus der Aorta descendens entnommen. Es folgte eine makroskopische Untersuchung der Konstrukte sowie eine ausführliche Fotodokumentation. Anschließend wurden die Gefäßkonstrukte mit Magnesiumspange unverzüglich auf Eis gelagert und zum µ-CT in das Institut für Werkstoffkunde der Leibniz Universität Hannover gebracht.
Alle Konstrukte wurden longitudinal eröffnet und die Lumenseite der dezellularisierten Gefäße beurteilt. Danach wurde das Präparat in drei gleich große Stücke längs geteilt und jede Längsprobe noch in fünf weitere Proben aufgeteilt (siehe Abbildung 8). Ein Drittel wurde in 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 molarem Natriumcacodylat pH 7,3 fixiert. Das zweite Drittel wurde in Tissue Tek®O.C.T.
eingebettet, in flüssigen Stickstoff eingefroren und bei -80°C gelagert. Das letzte Drittel wurde zur Anfertigung von Paraffinproben in 3,7% Formaldehyd in Wassert fixiert.
Abb. 8: Probenentnahme aus dem Gefäßkonstrukt
3.5. Laborteil
3.5.1. Paraffinschnitte der Implantate und Explantate
Für die Erstellung von Paraffinproben wurden von den Grafts vor der Implantation kleine dezellularisierte Arterienstücke mit sterilem Besteck abgetrennt. Diese Teilstücke wurden zusammen mit den explantierten Proben in 15 ml Reaktionsgefäße überführt und mindestens für 24 Stunden in 3,7% Formaldehyd in Wasser fixiert. Nach dem Waschen in VE-Wasser für zweimal 30 Minuten folgte eine zweimalige Lagerung in 25%igem Alkohol für jeweils 30 Minuten und zum Schluss eine zweimalige Lagerung in 50%igem Alkohol für jeweils 30 Minuten.
Mittels eines Gewebeinfiltrationsautomaten erfolgte die Entwässerung mit 75%igem Alkohol, 80%igem, 85%igem, 90%igem, 95%igem und 100%igem Alkohol für jeweils 30 Minuten. Nach dem Transfer über zweimal 30 Minuten in Isopropanol und Roticlear für weitere 30 Minuten wurden die Proben in flüssiges Paraffin für sechs Stunden sowie in den zweiten Paraffintank für 24 Stunden verbracht.
Nach dem Ausblocken wurden 7 µm dicke Schnitte der Gewebe am Mikrotom erstellt. Im Streckbad bei 37°C wurden die Paraffinschnitte geglättet und anschließend auf einen mit Eiweiß-Glycerin beschichteten Objektträger gezogen und zum Trocknen auf eine Wärmeplatte (40°C) gelegt.
3.5.2. Gefrierschnitte
Am Gefriermikrotom wurden 7 µm dicke Gefrierschnitte auf einen silanisierten Objektträger gezogen. Nach dem Trocknen konnten die Schnitte für entsprechende Färbungen verwendet werden oder in Objektträgerkästen bei -80°C gelagert werden.
3.5.3. Semidünnschnitte
Zur Anfertigung von Semidünnschnitten (0,5-2 µm Schnittdicke) wurden die dezellularisierten Gefäße in Epoxydharz, einem härteren Einbettungsmedium, eingebettet. Die Semidünnschnitte bieten lichtmikroskopisch ein besseres Auflösungsvermögen als die dickeren Paraffinschnitte. Zunächst wurden die Probenstücke in 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 mol/l Natrium-Cacodylat-Puffer bei pH 7,4 fixiert. Danach erfolgte eine Spülung der Proben mit 0,1 molarer Lösung von
Natrium-Cacodylat-Puffer ebenfalls bei pH 7,4 für 24 Stunden. Anschließend erfolgte eine Fixierung der Proben mit 2% Osmiumtetroxid in 0,1 molarem Natrium- Cacodylat-Puffer für zwei Stunden. Daraufhin wurde eine Dehydrierung der Proben in einer aufsteigenden Alkoholreihe (25%, 50%, 75%, 90%, 100%), weiter über Toluol und einer anschließenden Einbettung in Glycidether durchgeführt. Die Polymerisation der Proben wurde über 24 Stunden bei 40°C und für 48 Stunden bei 60°C durchgeführt. Nach der Trocknung der Proben wurden die Semidünnschnitte mit einem Ultramikrotom angefertigt.
3.5.4. Entparaffinisierung
Vor jeder Färbung muss eine Entparaffinisierung der Paraffinschnitte erfolgen. Dazu wurden die Objektträger für 30 Minuten bei 60°C erwärmt. Danach wurde die Entwässerung der Schnitte für zweimal 10 Minuten in Xylol begonnen. Dann folgte eine absteigende Alkoholreihe beginnend mit 100%igen Alkohol, weiter mit 90%igen Alkohol, 80%igen Alkohol und 70%igen Alkohol jeweils für zwei Minuten. Zum Schluss folgte ein kurzer Spülgang in destilliertem Wasser.
3.5.5. Hämatoxylin-Eosin-Färbung
Diese Färbemethode diente der Unterscheidung verschiedener Strukturen im Gewebe. Hämatoxylin ist ein Farbstoff, der, zu Hämalaun verarbeitet, saure Strukturen blau färbt. Dies sind vor allem die Zellkerne. Eosin färbt basische Strukturen wie die Proteine im Zytoplasma rot.
Zur Bestimmung des Ausmaßes der In-vivo-Rebesiedelung der dezellularisierten Grafts wurden die HE-gefärbten Schnitte nachfolgend in der 100-fachen und 200- fachen Vergrößerung unter dem Mikroskop beurteilt. Anschließend wurden mit Hilfe des Computerprogramms Axiovision Fotos erstellt und Messungen sowohl der Breite des zellfreien Bereiches der explantierten Gefäße sowie der Implantate bestimmt und diese danach in Bezug zueinander gesetzt.
3.5.6. Pentachrom-Färbung nach Movat
Diese Färbemethode diente der Auswertung der Struktur der dezellularisierten Gefäße. Kollagen wird bei dieser Färbung in Gelb, saure Glykosaminoglykane werden in hellblau, elastische Fasern in Rot, Zellkerne in blauschwarz und das Zytoplasma wird rötlich dargestellt.
Zur quantitativen Auswertung der Neointima wurden Fotos von den pentachromgefärbten Paraffinschnitten in der 100-fachen Vergrößerung unter dem Mikroskop erstellt. Anschließend wurde im Computerprogramm Axiovision eine Breitenmessung der Neointima durchgeführt.
3.5.7. Versilberung nach von Kossa
Die von Kossa Färbung diente dazu, Verkalkungen in den verwendeten biologischen Geweben darzustellen. In dieser Färbung stellen sich Zellkerne rot dar und die kalkhaltigen Areale werden schwarz. Wichtig bei dieser Färbung ist, dass die gesamte Färbung bei gleichen Lichtverhältnissen durchgeführt werden muss (unter einer Neonröhre). Zudem muss das Silbernitrat lichtgeschützt aufbewahrt werden, da es extrem lichtempfindlich ist.
3.5.8. Färbung nach Pappenheim (May-Grünwald-Giemsa-Färbung)
Die Pappenheim-Färbung wird normalerweise herangezogen, um die Zellen in Blutausstrichen anzufärben. In dieser Färbung werden das Zytoplasma und bei basophilen Granulozyten der Kern blau dargestellt. In orange-rot werden die Erythrozyten und eosiniphile Granulozyten angefärbt. In violett wird der Kern von neutrophilen Granulozyten dargestellt. Lymphozyten stellen sich ebenfalls ganz in blau dar, wobei die Monozyten in blau-violett angefärbt werden. Wichtig für die Durchführung der Färbung ist, dass das PBS die gesamte Zeit einen pH von 6,8 hat.
3.5.9. Elastika-van-Gieson-Färbung
Diese Färbung diente der Darstellung von elastischen Fasern. Die elastischen Fasern stellen sich blau-violett, die Zellkerne braun-schwarz und das kollagene Bindegewebe rot dar.
3.5.10. Siriusrot-Färbung
Die Färbung diente der Auswertung von den unterschiedlichen Arten von Kollagenen in den dezellularisierten Gefäßen. Die Schnitte sind nur unter dem Phasenmikroskop auswertbar, wo sich große Kollagenfasern in gelb-orange und dünne retikuläre Fasern in grün darstellen.
3.5.11. Toluidinblau-Färbung
Diese Färbemethode findet hauptsächlich Anwendung bei Semidünnschnitten, da die meisten anderen Farbstoffe nicht in der Lage sind, in das Epoxydharz einzudringen.
Die Toluidinblau-Färbung führt zu einer differenzierten Anfärbung biologischer Bestandteile in unterschiedlichen Blautönen. Für die Färbung wurde 1% Toluidinblau und 1% Di-Natrium-Tetra-Borat in destilliertem Wasser angefärbt. Danach wurden die Schnitte lichtmikroskopisch untersucht.
3.5.12. Immunfluoreszenz-Färbungen
Die Färbungen können sowohl mit Paraffinpräparaten als auch mit Kryopräparaten durchgeführt werden. Bei Paraffinproben muss zu Beginn eine Entparaffinisierung durchgeführt werden und danach eine Demaskierung der Schnitte bei 96°C in Citratpuffer für 20 Minuten. Bei den kryokonservierten Proben wird lediglich eine Fixierung in Aceton bei -20°C für vier Minuten vorgenommen. Nach der Probenvorbereitung wird für beide Probenarten folgendes Protokoll angewendet.
Tabelle 4: angewendete Antikörper
Verwendete Antikörper Verdünnung Firma
Polyclonal Rabbit anti-Human Von Willebrand-Factor (Code-Nr. A0082)
1:10000 DakoCytomation Denmark A/S, Glostrup, Dänemark
Monoclonal Mouse anti-Human Smooth Muscle Actin(Code-Nr. M0851)
1:100 DakoCytomation Denmark A/S, Glostrup, Dänemark
Rabbit polyclonal to smooth muscle Myosin heavy chain 2 (ab53219)
1:200 Abcam plc, Cambridge, England Mouse anti Sheep CD45 monoclonal
antibody
1:100 AbD Serotec, Raleigh, North Carolina (USA)