der Medizinischen Hochschule Hannover
Angefertigt im Rahmen der strukturierten Doktorandenausbildung StrucMed
Der Interferon--Rezeptor 1 (IFNGR1) – ein genetischer Modulator der Mukoviszidose?
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Heike Christine Labenski
aus Hannover
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover Am 17.08.2010
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. Dr. Burkhard Tümmler Kobetreuer der Arbeit: Prof. Dr. Dirk Bumann
Referent: Prof. Dr. med. Norbert Krug
Koreferent: Prof. Dr. med. Manfred Stuhrmann-Spangenberg
Tag der mündlichen Prüfung: 17.08.2010
Meiner Familie
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung... 1
1.1 Mukoviszidose ... 1
1.2 Studien zur Untersuchung genetischer Modulatoren der CF-Erkrankung .. 4
1.2.1 Genetische Marker ... 4
1.2.2 Strategien zur Analyse genetischer Modulatoren ... 5
1.3 Die Europäische CF Zwillings- und Geschwisterstudie ... 6
1.3.1 Patienten der Europäischen CF Zwillings- und Geschwisterstudie... 6
1.3.2 Auswahl extremer Phänotypen... 7
1.4 Das Interferon--Netzwerk... 8
1.5 Vorarbeiten... 10
1.5.1 Transkriptomstudie ... 10
1.5.2 Analyse eines intragenischen Mikrosatelliten im IFNGR1... 11
1.6 Ziele der Arbeit ... 12
2 Patienten und Methoden ... 13
2.1 Patienten für den Vergleich von extremen Phänotypen... 13
2.2 Patienten für den Vergleich von klinischen Parametern mit dem Genotyp am Einzelmarker D6-133... 13
2.3 Patienten für den Vergleich des Genotyps am Einzelmarker D6-133 mit Transkriptomdaten aus Rektumschleimhautepithel... 14
2.4 Methoden ... 14
2.4.1 Isolierung von genomischer DNA aus K+-EDTA-Vollblut mittels Phenol/Chloroform-Extraktion ... 14
2.4.2 Feinkartierung des Interferon -Rezeptor 1-Gens (IFNGR1) durch Genotypisierung von Einzelnukleotidpolymorphismen ... 15
2.4.2.1 Auswahl der Einzelnukleotidpolymorphismen ... 15
2.4.2.2 Auswahl geeigneter Primer und Restriktionsenzyme ... 17
2.4.2.3 Die Polymerase-Kettenreaktion... 18
2.4.2.4 DNA-Gel-Elektrophorese... 19
2.4.2.5 Typisierung von Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLPs) .. 20
2.4.2.6 Auswahl von geeigneten SNPs für die Genotypisierung der Patientenkohorte ... 21
2.4.3 Statistische Analyse ... 22
2.4.3.1 Verwendung des CLUMP-Programms ... 22
2.4.3.2 Durchführung der Geschwisterkorrektur... 22
2.4.3.3 Der U-Test von Mann und Whitney ... 23
2.4.4 Herstellung eines 7 Kilobasen (kb) großen PCR-Produktes... 24
2.4.5 Sequenzierung des 7 kb-PCR-Produktes... 27
2.4.6 Aneinanderfügen der Sequenzierergebnisse ... 27
2.4.7 Internetressourcen... 28
2.4.8 Kartierung des c-Rel-Gens ... 29
2.4.9.5 Kernextraktion von Epithelzellen (T84-Zellen)... 34
2.4.10 Bradford-Assay zur Bestimmung der Proteinkonzentration im Extrakt ... 36
2.4.11 SDS-Polyacrylamid-Gel... 36
3 Ergebnisse ... 37
3.1 Analyse des Interferon -Rezeptor 1 - Gens als Modulator der Mukoviszidose ... 37
3.1.1 Auswahl informativer Einzelmarker ... 37
3.1.2 Evaluation der Allel-, Genotyp- und Haplotypverteilungen in den Erkrankungsgruppen CON+, CON- und DIS ... 39
3.1.3 Einfluss der typisierten Marker auf die Schwere der CF-Erkrankung ... 42
3.1.3.1 Einzelmarkeranalyse für den Vergleich zwischen CON+ und CON- ... 42
3.1.3.2 Haplotypenanalyse für den Vergleich zwischen CON+ und CON- ... 42
3.1.3.3 Vergleich zwischen CON+ und CON- nach Durchführung der Geschwisterkorrektur... 43
3.1.4 Einfluss der typisierten Marker auf die Intrapaar-Diskordanz bei CF... 45
3.1.4.1 Einzelmarkeranalyse für den Vergleich zwischen CONC und DIS ... 45
3.1.4.2 Haplotypenanalyse für den Vergleich zwischen CONC und DIS... 45
3.1.4.3 Vergleich zwischen CONC und DIS nach Durchführung der Geschwisterkorrektur... 46
3.2 Auswahl des zu sequenzierenden Bereiches und der verwendeten Patientenproben ... 48
3.2.1 Herstellung des 7 kb großen Produktes ... 49
3.2.2 Analyse der Sequenzierdaten ... 52
3.2.3 Einflussfaktoren bei der Herstellung eines großen PCR-Produktes ... 54
3.3 Ergebnisse der Internet-Datenbank-Analyse... 56
3.4 Kartierung des c-Rel-Gens mit Hilfe geeigneter Mikrosatelliten ... 67
3.5 Vergleich des Genotyps an SNP D6-133 mit den Ergebnissen der Transkriptomstudie ... 68
3.6 Vergleich des Genotyps am Einzelmarker D6-133 mit klinischen Parametern... 69
3.6.1 Einfluss des Genotyps am Einzelmarker D6-133 auf die Menge von IgA, IgE, IgM und IgG-Subtypen im Serum bzw. Speichel... 69
3.6.2 Zusammenhang zwischen dem Genotyp am Einzelmarker D6-133 und dem Alter der Erstinfektion bzw. der chronischen Kolonisation mit P. aeruginosa... 70
3.7 Transkriptionsfaktorbindungs-Experiment ... 72
3.7.1 Isolierung mononukleärer Blutzellen... 73
3.7.2 Kernextraktion ... 73
3.7.2.1 Kernextraktion der PBMCs ... 73
3.7.2.2 Kernextraktion der T84-Zellen ... 74
3.7.3 Zytoplasmaextraktion ... 75
3.7.3.1 Zytoplasmaextraktion nach Inéz Avedillo Díez ... 75
3.7.4 Proteinspektrum der Kern- und Zytoplasmaextraktionen... 76
3.7.5 Einflussfaktoren auf den Proteingehalt und das Proteinspektrum der Extrakte ... 77
4 Diskussion ... 79
4.1 Genetische Modulatoren der Mukoviszidose... 79
4.1.1 Der Interferon--Rezeptor 1 als Modulator ... 81
4.1.2 Strategie zur Kartierung kausaler Genvarianten... 82
4.2 Die Funktionalität der Intron 1-Polymorphismen... 83
4.3 Die Rolle von intragenischen Sequenzen bei der Regulation der
Genexpression ... 83
4.4 Der Einfluss des Genotyps an SNP D6-133 auf das Alter der Erstkolonisation bzw. der chronischen Kolonisation mit P. aeruginosa.... 85
4.5 Die Rolle von Transkriptionsfaktoren bei der Regulation der IFNGR1 – Expression... 87
4.6 Relevanz für die klinische Praxis... 93
5 Zusammenfassung ... 95
6 Literaturverzeichnis ... 97
7 Anhang ... 105
7.1 Puffer und Lösungen ... 105
7.1.1 Für die DNA-Isolierung ... 105
7.1.2 Für die DNA-Gelelektrophorese ... 105
7.1.3 Für das Direct Blotting ... 105
7.1.4 Für die PBMC-Gewinnung... 106
7.1.5 Für die Kernextraktion ... 106
7.1.6 Für den Bradford-Assay ... 107
7.1.7 Für das SDS-Gel ... 107
7.2 Vergleiche des EST-Sequenzen mit der Intron 1-Sequenz ... 108
Abkürzungsverzeichnis
A Adenin
bp Basenpaare
CF Cystische Fibrose
CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator CON+ konkordant mild erkrankte Patienten
CON- konkordant schwer erkrankte Patienten
CONC konkordant mild und konkordant schwer erkrankte Patienten
C Cytosin
DIS diskordant erkrankte Patienten DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
DZ dizygot
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EMSA Elektrophorese Mobility Shift Assay EST Expressed Sequence Tag
FEV1 forciertes expiratorisches Volumen pro Sekunde
FEV% alters- und geschlechtsunabhängige Beschreibung des FEV1
g Gravitationskraft
G Guanin
HWG Hardy-Weinberg-Gleichgewicht
IFNG Interferon-
IFNGR Interferon--Rezeptor IFNGR1 Interferon--Rezeptor 1 IFNGR2 Interferon--Rezeptor 2
kb Kilo-Basen
MZ monozygot
NCBI National Centre for Biotechnology Information PBMCs Peripheral Blood Mononuclear Cells
PIC Polymorphism Information Content PCR Polymerase Chain Reaction
RFLP Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus rpm rounds per minute
SNP Single Nucleotide Polymorphism
T Thymin
TF Transkriptionsfaktor
V Volt
Wf% Längensollgewicht
1 Einleitung
1.1 Mukoviszidose
Mukoviszidose, auch Cystische Fibrose (CF) genannt, ist die häufigste schwere, rezessiv vererbte Erkrankung in der kaukasischen Bevölkerung (Welsh et al., 2001).
Verursacht wird die CF-Erkrankung durch eine Mutation eines einzelnen Gens auf dem langen Arm des Chromosoms 7 (7q31.2), das für den Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) kodiert (Rommens et al., 1989).
Beim CFTR-Genprodukt handelt es sich um einen Chloridkanal, der ubiquitär in polarisierten Epithelzellen lokalisiert ist, und der eine Rolle bei der Regulation der Zusammensetzung der Sekrete aller exokrinen Drüsen spielt (Welsh et al., 1993).
Mehr als 1500 Mutationen im CFTR-Gen wurden bereits beschrieben. Die weltweit häufigste Mutation ist die F508del-Mutation, die sich bei ca. 70% der CF-Allele finden lässt und bei der eine Deletion eines Basentripletts zur Deletion der Aminosäure Phenylalanin in Exon 10 des CFTR führt (http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/), wodurch es zu einer Proteinfehlfaltung und dadurch zu einer Reifungsstörung des fertigen CFTR-Proteins kommt.
Da der durch Mutation veränderte CFTR-Chloridkanal ubiquitär lokalisiert ist, sind von der CF-Erkrankung zahlreiche Organsysteme wie der Respirationstrakt, das Pankreas, der Gastrointestinaltrakt, die Leber, der männliche Reproduktionstrakt und die Schweißdrüsen betroffen (Anderson et al., 1991).
Die pulmonale Beteiligung ist die Hauptursache für Morbidität und Mortalität der CF- Erkrankung (Chow et al., 1982) und manifestiert sich bereits in den ersten Lebensmonaten. Typisches Frühsymptom ist ein zunächst trockener, später produktiver chronischer Husten, im weiteren Verlauf wird das klinische Bild geprägt durch die zunehmende Obstruktion zunächst der kleinen, später auch der großen Atemwege. Ursache dieser Obstruktion ist eine verminderte Hydrierung des Bronchialsekrets, wodurch es zu einer Einschränkung der mukoziliären Clearance und dadurch zu einer Sekretanschoppung kommt. Diese Sekretansammlung in den
Insuffizienz, die durch die Gewebsschädigung entstehende pulmonal-arterielle Hypertonie und das daraus resultierende Cor pulmonale (Cystische Fibrose, 2001, Springer Verlag). Da allerdings Faktoren wie das Patientenalter bei Erstinfektion mit bakteriellen Pathogenen und die dadurch bedingte entstehende Symptomatik eine Rolle bei der Progredienz des klinischen Bildes spielen, ist die Schwere der Lungenbeteiligung der variabelste Aspekt des klinischen Phänotyps (Welsh et al., 2001).
Im Gegensatz zu der Lungenbeteiligung manifestiert sich eine Pankreasbeteiligung bereits pränatal. Etwa die Hälfte der CF-Patienten ist zum Zeitpunkt der Geburt pankreasinsuffizient. Die Entstehung der Pankreasinsuffizienz ist auf eine Erhöhung der Viskosität des Pankreassekrets zurückzuführen. Die dadurch entstehende Obstruktion der Ausführungsgänge führt zum einen zu einer verminderten Ausschüttung der Pankreasenzyme, aber auch die pankreatische Wasser- und Bicarbonatsekretion ist vermindert. Typische Symptome in den ersten beiden Lebensjahren sind durch eine Malabsorption besonders der Nahrungsfette bedingt, wodurch es zu chronischen Durchfällen (Steatorrhoe), mangelnder Gewichtszunahme und Gedeihstörungen kommt. Die progrediente Zerstörung des exokrinen Pankreas kann auch die endokrinen Inselzellen erfassen, was bei ca. 5%
der CF-Patienten zur Ausbildung eines sekundären Diabetes mellitus führt.
Bei nur etwa 10-15% der CF-Patienten bleibt die Pankreasfunktion komplett oder zumindest partiell erhalten, aber auch bei Pankreassuffizienz kommt es im jungen Erwachsenenalter bei ungefähr 10% der Patienten zu Komplikationen wie rezidivierenden Pankreatitiden (Cystische Fibrose, 2001, Springer Verlag).
Auch im Gastrointestinaltrakt führt die CF-Erkrankung zu Komplikationen, die wiederum bedingt sind durch einen fehlregulierten Transport von Wasser und Elektrolyten über die Zellmembran der Epithelzellen, wodurch auch im Darmlumen ein hypervisköser Schleim entsteht. Typisches erstes Symptom einer gastrointestinalen Beteiligung ist ein Mekoniumileus, der bei 10-15% der CF- Patienten direkt nach der Geburt auftritt. Aber auch im späteren Lebensalter kann es zu Komplikationen kommen, bei denen das Distale Intestinale Obstruktionssyndrom (DIOS) bei Patienten über dem 30. Lebensjahr eine große Rolle spielt und bei ca.
30% der Patienten auftritt (Cystische Fibrose, 2001, Springer Verlag).
Durchschnittlich bereits im Alter von 7-9 Jahren manifestiert sich bei 25-50% der CF- Patienten auch eine Leberbeteiligung im Sinne einer Leberzirrhose, wobei männliche
Patienten häufiger betroffen sind als weibliche (Scott-Jupp et al., 1991; Colombo et al., 2002).
Bei männlichen CF-Patienten lässt sich außerdem bei 95% eine Infertilität aufgrund von obstruktiver Azoospermie durch kongenitale Malformationen und Atrophien im Bereich des Reproduktionstrakts (Vas deferens) nachweisen (Welsh et al., 2001;
Cystische Fibrose, 2001, Springer Verlag).
Auch in den Schweißdrüsen manifestiert sich die CF, weswegen ein Schweißtest bei Patienten mit einer potentiellen Erkrankung einen Hinweis auf das tatsächliche Vorliegen einer CF liefern kann. Als Goldstandard gilt der sogenannte Pilocarpin- Iontophorese-Schweißtest nach Gibson und Cooke, bei dem über Iontophorese des Parasympathomimetikums Pilocarpin an einem Hautareal die Schweißproduktion stimuliert wird. Über ein Intervall von 30 Minuten wird der produzierte Schweiß gesammelt und anschließend dessen Elektrolytkonzentration, insbesondere die des Chlorids, bestimmt. Erhöhte Chloridkonzentrationen von mehr als 60 mmol/l in mindestens zwei voneinander unabhängigen Untersuchungen bestätigen bei begründetem Verdacht die Diagnose einer CF, bei einer Chloridkonzentration von unter 40 mmol/l wird eine typische CF ausgeschlossen. Werte dazwischen liegen in einem nicht aussagekräftigen Bereich, so dass weitere Diagnosemöglichkeiten hinzugezogen werden müssen. Möglich sind z.B. eine Messung der nasalen transepithelialen Potentialdifferenz (PD) am respiratorischen Epithel, bei der eine stärker negative PD auf das Vorhandensein einer CF-Erkrankung hinweist, oder Messungen von Ionenströmen an Rektumschleimhaut-Biopsien nach Stimulation der Chloridsekretion, bei denen bei CF-Patienten kleinere Signale in entgegengesetzter Richtung im Vergleich zu Non-CF-Probanden beobachtet werden können. Ein eindeutiger Beweis für das Vorliegen einer CF-Erkrankung liegt nach direkter molekularer Analyse des CFTR-Gens mit Nachweis einer Mutation vor (Cystische Fibrose, 2001, Springer Verlag).
Bis heute ist es leider noch nicht gelungen, eine kausale Therapie der CF- Erkrankung zu entwickeln. Zur Behandlung der pulmonalen Symptomatik gehören neben medikamentösen Strategien zur Mukolyse und Reduktion der Inflammation
1.2 Studien zur Untersuchung genetischer Modulatoren der CF- Erkrankung
Die Variabilität des Schweregrades der CF-Erkrankung von Patienten mit gleicher zugrunde liegender CFTR-Mutation impliziert, dass neben Umweltfaktoren auch andere Gene den klinischen Verlauf der Erkrankung modulieren. Seit einigen Jahren werden Studien unterschiedlicher Konzeption durchgeführt, um genetische Modulatoren der Mukoviszidose zu identifizieren und aus diesen Erkenntnissen neue therapeutische Strategien zu entwickeln. Voraussetzung zur erfolgreichen Identifikation genetischer Modulatoren ist dabei die möglichst umfangreiche Standardisierung der Umweltbedingungen, da der individuelle und der nationale sozioökonomische Status zur Zeit den größten Einfluss auf den klinischen Verlauf der CF-Erkrankung nehmen (Schlechter et al., 2001; Tümmler und Stanke, 2005).
1.2.1 Genetische Marker
Zur Identifikation von genetischen Modulatoren können verschiedene genetische Marker unterschiedlicher Aussagekraft verwendet werden, hierzu gehören Einzelnukleotidaustausche (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) und Mikrosatelliten.
Bei einem SNP handelt es sich um die Variation eines Basenpaares an einem definierten Locus, der in einer bestimmten Population bei mindestens 1% der Populationsmitglieder zu finden ist. Er wird auch als bi-allelischer Marker bezeichnet, da in diploiden Zellen an einem SNP zwei verschiedene Allele vorliegen können.
Durchschnittlich wird alle 100 bis 300 Basenpaare ein SNP im humanen Genom, sowohl im kodierenden als auch im nicht-kodierenden Bereich, vermutet. Die Allelfrequenz eines SNPs kann dabei aber in verschiedenen Populationen variieren.
Aus zwei nebeneinander lokalisierten SNPs können durch Betrachten des jeweiligen Allels auf nur einem Chromosom sogenannte Haplotypen konstruiert werden, die die Allelabfolge an benachbarten SNPs auf dem väterlichen und mütterlichen Chromosom beschreiben. Die Analyse von Haplotypen erhöht die Aussagekraft über einen genetischen Modulator, da die genetischen Informationen von nebeneinander
lokalisierten SNPs häufig gemeinsam vererbt werden und in diesen Bereich nur selten Rekombinationen stattfinden.
Bei Mikrosatelliten handelt es sich um meist nicht-kodierende DNA- Sequenzabschnitte, in denen sich zwei, drei oder vier Basenpaare wiederholen. Sie können als genetische Marker verwendet werden, da die Anzahl der Wiederholungen bei jedem Individuum variiert. Häufig handelt es sich dabei um alternierende Purin-/
Pyrimidinbasen wie (GC)n, (AT)n oder (CA)n. Da sie somit deutlich mehr Allele aufweisen können als die bi-allelischen SNPs, besitzen sie eine höhere Informativität.
1.2.2 Strategien zur Analyse genetischer Modulatoren
Häufigster Ansatz zur Identifikation eines genetischen Modulators ist die Durchführung einer Assoziationsstudie, bei der ein Zusammenhang zwischen dem Genotyp eines Kandidatengens und einem klinischen Phänotyp gesucht wird.
Grundsätzlich gibt es für die Realisierung einer Assoziationsstudie zwei verschiedene Ansätze.
Möglich ist, zunächst mit einer Genotypisierung der gewählten Patientenkohorte zu beginnen und sie in Abhängigkeit vom ermittelten Genotyp in Gruppen zu ordnen. Im Anschluss können die jeweiligen Gruppen dann mit phänotypischen Merkmalen verglichen werden. Bereits bei Analysen bi-allelischer SNPs allerdings werden heterozygote Genotypen oft mit einem homozygoten Genotyp in einer Gruppe zusammengefasst, was bei fehlender Kenntnis des molekularen Phänotyps zu zweifelhaften Ergebnissen führt. Mikrosatelliten können aufgrund ihrer Multiallelität für Analysen dieser Art gar nicht verwendet werden, da auch in diesem Falle verschiedene Allele in gemeinsame Gruppen zusammengefasst würden. Außerdem wird bei diesem Ansatz die Zusammensetzung der jeweiligen Gruppen mit jeder weiteren Testung verändert.
Studiendesign die Möglichkeit, Patienten mit extremen klinischen Phänotypen auszuwählen, wodurch die Informativität dieser Analyse erhöht wird (Tanksley, 1993).
Eine weitere Möglichkeit der Erhöhung der Aussagekraft einer Assoziationsstudie ist die Rekrutierung der Eltern der teilnehmenden Patienten, um familienbasierte Tests wie den „transmission desequilibrium test“ und die Bildung von Haplotypen (s. Kapitel 1.2.1) durchführen zu können (Mekus et al., 2003).
1.3 Die Europäische CF Zwillings- und Geschwisterstudie
Im Rahmen der Europäischen CF Zwillings- und Geschwisterstudie wurden zwischen 1995 und 1996 Zwillings- und Geschwisterkinder mit Cystischer Fibrose aus 158 CF- Zentren in 14 verschiedenen europäischen Ländern rekrutiert, um den Einfluss, den genetische Faktoren und Umweltfaktoren auf die Schwere der CF-Erkrankung haben, bewerten zu können.
Im Rahmen einer Assoziationsstudie wurden die Patienten zunächst anhand ihres klinischen Phänotyps gruppiert und anschließend isoliert für jedes Kandidatengen genotypisiert. Dieser Studienaufbau in Kombination mit der Durchführung familienbasierter Tests ermöglichte bereits die Identifikation zahlreicher Gene wie TNFRSF1A (Tumornekrosefaktor-Rezeptor Superfamilie 1A), -ENaC (- Epithelialer Natrium-Kanal), CLCA (Chloride Channel, Calcium-Activated), CD14 (Cluster of Differentiation 14) und CD95 (Cluster of Differentiation 95) als Modulatoren der CF- Erkrankung (Mekus et al., 2000; Ritzka et al., 2004; Kumar V, 2006; Stanke et al., 2006).
1.3.1 Patienten der Europäischen CF Zwillings- und Geschwisterstudie
Insgesamt wurden von 540 Zwillings- und Geschwisterpaaren klinische Parameter wie CFTR-Mutationstyp, Alter, Gewicht, Größe, Vitalkapazität, forciertes expiratorisches Volumen in einer Sekunde, Pankreasstatus und Kolonisierung mit Pseudomonas aeruginosa erhoben. Zwei sensitive klinische Parameter, die den Verlauf und die Prognose der CF-Erkrankung gut widerspiegeln, wurden ausgesucht,
um die Schwere der Erkrankung der Studienteilnehmer einschätzen zu können.
Gewählt wurden das Längensollgewicht als ein Parameter für den Ernährungsstatus des Patienten und das forcierte expiratorische Volumen in einer Sekunde (FEV1) als Parameter für den pulmonalen Status der Erkrankung. Da die Patienten in Bezug auf das Alter sehr heterogen waren, wurde ein Ansatz gewählt, in dem diese beiden Parameter mit Hilfe von Perzentilen dargestellt wurden, damit die Schwere der Erkrankung von Patienten alters- und auch geschlechtsunabhängig miteinander verglichen werden konnte.
Durch die Berechnung des aktuellen Gewichts als Prozentsatz des Gewichts, das ein Patient aufgrund seiner Größenperzentile aufweisen sollte, konnte das Längensollgewicht (wfh%) bestimmt werden (Prader et al., 1989).
Als Parameter für die Lungenfunktion wurde das FEV1 (in l) der Patienten bestimmt und wie bei Knudsen et al. beschrieben als Prozentsatz der Lungenfunktion einer gesunden Referenzpopulation angegeben (FEV1%pred). Um auch diesen Parameter alters- und geschlechtsunabhängig zu beschreiben, wurde er mit Daten von mehr als 20.000 CF-Patienten des „European CF registry report“ von 1995 verrechnet und als Perzentile ausgedrückt (FEVPerc).
Von 466 der 540 CF-Zwillings- und Geschwisterpaare konnte wfh% berechnet werden, von 318 Paaren ließen sich sowohl wfh% als auch FEVPerc bestimmen, von denen 114 F508del homozygot sind (Mekus et. al., 2000).
1.3.2 Auswahl extremer Phänotypen
Die Zuordnung der Patienten zu einer der drei großen Studiengruppen der konkordant mild, konkordant schwer und diskordant erkrankten Geschwisterpaare erfolgte anhand des aktuellen Standes ihrer Erkrankung, wobei sowohl FEVPerc als Parameter der pulmonalen Beteiligung als auch wfh% als Parameter der intestinalen Beteiligung gleich stark bewertet wurden.
Geschwisterpaare, bei denen die Werte für FEVPerc und wfh% jeweils oberhalb der
erkrankten Patienten (DIS) wurden Geschwisterpaare eingeordnet, bei denen einer von beiden einen schweren, das andere Geschwisterkind einen milden Krankheitsverlauf zeigte (Mittelwerte für wfh% und FEVPerc, bzw. Mittelwerte für die Intrapaar-Differenz s. Tabelle 1) (Mekus et. al., 2000).
Tabelle 1: Klinische Daten der F508del homozygoten Zwillings- und Geschwisterpaare der Erkrankungsgruppen CON+, CON- und DIS (1996)*
Mittelwerte für Mittlere Intrapaar-Differenz für
wfh% FEVPerc wfh% FEVPerc
CON + 107,9 53,5 6,5 19,0
CON - 90,7 15,9 6,0 13,5
DIS 94,3 32,3 19,9 47,9
* aus einem Beitrag von Dr. Stanke im Rahmen der European CF Conference 2006
Um auch Modulatoren der Intrapaar-Diskordanz bei CF identifizieren zu können, wurden die beiden Gruppen der konkordant mild und konkordant schwer erkrankten Patienten zusätzlich in eine gemeinsame Gruppe zusammengefasst (CONC).
1.4 Das Interferon--Netzwerk
Interferon- (IFNG), auch Typ-II-Interferon oder Immuninterferon genannt, ist ein Glykoprotein, an dessen Aufbau 146 Aminosäuren beteiligt sind und das in aktiver Form als Dimer vorliegt. Es gehört zur Familie der Zytokine und trägt somit zur lokalen und systemischen Organisation der angeborenen Immunität bei (Medizinische Mikrobiologie, Thieme Verlag, 2005).
IFNG wird hauptsächlich von CD4+- und CD8+-T-Lymphozyten und natürlichen Killerzellen nach Aktivierung durch Antigene, Mitogene oder Alloantigene gebildet, außerdem induzieren andere Zytokine wie z.B. Interleukin-12 und Interleukin-18 die IFNG-Synthese (Otani et al., 1999). Negativ regulatorische Einflüsse auf die Induktion der IFNG-Synthese konnten für Interleukin-4, Interleukin-10, TGF-ß und Glukokortikoide gezeigt werden (Fukao et al., 2001; Hochrein et al., 2001; Schindler et al., 2001; Sen et al., 2001).
IFNG wird in der Literatur weder als pro- noch als antiinflammatorisches Zytokin kategorisiert. Es zeigt wie die anderen Mitglieder der Interferon-Familie antivirale Aktivität, scheint aber im Gegensatz zu Interferon- und Interferon-, die fast ausschließlich antiviral wirken, eher eine immunmodulatorische Funktion sowohl bei unspezifischen als auch bei spezifischen Immunreaktionen zu besitzen (Medizinische
Mikrobiologie, Thieme Verlag, 2005). So bewirkt IFNG neben einer Aktivierung von Makrophagen, die zu einer gesteigerten Produktion von reaktiven Sauerstoff- und NO-Metaboliten und somit zu einer Unterstützung der zellulären Abwehr führt, auch eine verstärkte Expression von MHC-Molekülen der Klasse I und II, wodurch die Präsentation antigener Peptide verbessert wird. Weiterhin fördert IFNG den Immunglobulin-Klassenwechsel zu IgG und hemmt den Wechsel zu IgE, ein hemmender Einfluss besteht auch auf die TH2-Helferzellen (Biochemie des Menschen, Thieme Verlag, 2003; Medizinische Mikrobiologie, Thieme Verlag, 2005).
Die Wirkungen des IFNG werden über den Interferon--Rezeptor (IFNGR) an die Zielzellen weitergeleitet. Dieser Rezeptor wird von allen humanen Zellen mit Ausnahme der reifen Erythrozyten gebildet (Biochemie des Menschen, Thieme Verlag, 2003; Medizinische Mikrobiologie, Thieme Verlag, 2005). Er besteht aus zwei Domänen, die als Interferon--Rezeptor 1 (IFNGR1 = Ligand bindende Kette) und Interferon--Rezeptor 2 (IFNGR2 = Kette der Signaltransduktion) bezeichnet werden und zur Zytokin-Rezeptor-Familie der Klasse II gehören (Bazan et al., 1990; Thoreau et al., 1991).
Bindet IFNG als Dimer an den IFNGR, wird dieser durch Endozytose in die Zielzelle aufgenommen, die weitere Signaltransduktion erfolgt über die JAK/STAT-Kaskade.
Durch die Bindung des IFNG an den Rezeptor wird eine Phosphorylierung der dort lokalisierten Janus Kinasen (= JAK, JAK 1 am IFNGR1, JAK 2 am IFNGR2) induziert.
Durch diese Phosphorylierung wird eine Bindung von STAT 1-Proteinen (signal transducer and activator of transcription) ermöglicht, die nun durch die Janus- Kinasen phosphoryliert werden. Zwei STAT-Proteine schließen sich nun zu einem Dimer zusammen, das in den Nukleus transportiert werden kann. Dort wird in Abhängigkeit von der Zielzelle die Expression von verschiedenen Proteinen reguliert (Biochemie des Menschen, Thieme Verlag, 2003) (s. Bild 1).
IFNG IFNG
Zellkern mRNA
Bild 1: Vereinfachte schematische Darstellung der Signaltransduktion der JAK/STAT- Signalkaskade nach Bindung von IFNG and den IFNGR (angelehnt an Decker et al., 2002)
= IFNGR1 = IFNGR2 = JAK 1 = JAK 2 = Phosphat = DNA
mRNA = Symbol für Gene, deren Transkription durch die Bindung von IFNG aktiviert wird, z.B
iNOS (inducible Nitric Oxide Synthase), NRAMP1 (Natural Resistance-Associated Macrophage Protein 1), TAP 2 (Transporters Associated with Antigen Presentation)
= STAT 1
1.5 Vorarbeiten
1.5.1 Transkriptomstudie
In den Jahren 2003 und 2004 wurde die Studie „Genetische Modulatoren der Mukoviszidose im Gastrointestinaltrakt“ als Projekt C7 des SFB 621 durchgeführt. In dieser Studie wurde das Transkriptom von 17 CF-Patienten und 8 gesunden Probanden mittels eines Gen-Chips analysiert. Als zu untersuchendes Material wurde Rektumschleimhautepithel verwendet, da es sich um ein schnell regenerierbares Epithel ohne Sekundärveränderungen handelt, in dem viel CFTR exprimiert wird und das zusätzlich leicht zugänglich ist. Der verwendete Gen-Chip (U133A, Affymetrix) war so konzipiert, dass für jedes zu untersuchende Transkript verschiedene, voneinander unabhängige Messungen durchgeführt wurden, wodurch reproduzierbare Ergebnisse erzielt werden sollten. Jeweils 11 Oligonukleotidpaare wurden verwendet, um die Transkriptstärke eines Gens zu bestimmen (www.affymetrix.com). Für das Transkript des IFNGR1 wurden zwei verschiedene
Oligonukleotidkombinationen (Probesets) verwendet, weswegen pro Patient zwei Transkriptstärken für den IFNGR1 erhalten werden konnten.
Für das Transkript des IFNGR1 konnte in dieser Studie mit beiden Probesets gezeigt werden, dass es bei Patienten mit CF stärker exprimiert wird als bei den gesunden Probanden.
1.5.2 Analyse eines intragenischen Mikrosatelliten im IFNGR1
Um den IFNGR1 als möglichen genetischen Modulator der CF-Erkrankung zu identifizieren, wurde ein Mikrosatellit ausgewählt, um die Probanden der Europäischen CF Zwillings- und Geschwisterstudie an diesem Locus zu genotypisieren. Bei diesem Satelliten (D6IFNGR1Sat1) handelt es sich um eine CAn- Sequenz im Intron 5 des IFNGR1.
Die Verteilung der Satelliten-Allele wurde in den Gruppen der diskordant (DIS), der konkordant mild (CON+) und konkordant schwer (CON-) erkrankten Patienten evaluiert und miteinander verglichen. Für den Vergleich der Verteilungen in den Erkrankungsgruppen CON+ und CON- konnte kein Trend gefunden werden, ein signifikanter Unterschied zeigte sich aber beim Vergleich der Allelverteilung der konkordant Erkrankten (CONC) mit den DIS-Patienten (unkorrigiert p=0,00594) (unveröffentlichte Daten Stanke et al., s. Bild 2).
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Allelfrequenz
1.6 Ziele der Arbeit
Der IFNGR1 wurde aufgrund der Ergebnisse der in Kapitel 1.5 beschriebenen Vorarbeiten als Kandidatengen dieser Arbeit ausgewählt. Es sollte überprüft werden, ob der IFNGR1 zu den genetischen Modulatoren der CF-Erkrankung gehört und auf welchen theoretisch möglichen Mechanismen dieser modulatorische Einfluss beruhen könnte.
Zunächst sollte der modulatorisch wirksame Sequenzbereich des IFNGR1 durch eine Feinkartierung dieses Gens mittels SNPs genauer lokalisiert werden.
Mögliche SNPs sollten anhand ihrer Lokalisation innerhalb des Zielgens mithilfe einer amerikanischen Datenbank ausgewählt werden (s. Kapitel 2.4.2.1), wobei nicht nur SNPs im Promotorbereich oder in kodierenden Abschnitten des IFNGR1, sondern auch in nicht-kodierenden Bereichen genutzt werden sollten. Nur SNPs, für die durch die anschließende Genotypisierung einer Kontrollkohorte ausreichende Informativität gezeigt werden konnte, sollten für die Genotypisierung der Patientenkohorte Verwendung finden. Nach durchgeführter Genotypisierung sollten Allel-, Genotyp- und Haplotypfrequenzen in den drei Erkrankungsgruppen CON+, CON- und DIS ermittelt und miteinander verglichen werden. Auch ein Vergleich der Gesamtheit der konkordant erkrankten (CONC) mit den Patienten der DIS-Gruppe sollte durchgeführt werden, um auch Modulatoren der Intrapaar-Diskordanz ermitteln zu können. Für die einzelnen Verteilungen der Allel-, Genotyp- und Haplotypfrequenzen in den unterschiedlichen Gruppen sollten p-Werte bestimmt werden, um eine Aussage über die Signifikanz möglicher Verteilungsunterschiede treffen zu können.
Die auf diese Weise mögliche Identifikation eines oder mehrerer kausaler SNPs sollte Grundlage dafür sein, mögliche Funktionen dieser SNPs mittels Internetdatenbanken theoretisch analysieren zu können. Diese theoretischen Ergebnisse sollten im Anschluss an die Feinkartierung auch einen Hinweis über das weitere experimentelle Vorgehen im Rahmen dieser Arbeit geben.
Nächster Schritt zur Identifikation des zugrunde liegenden Mechanismus ist eine phänotypische Charakterisierung der kausalen SNP-Varianten mittels EMSA oder Western Blot.
Die auf diese Weise geplante Identifikation des IFNGR1 als Modulator der Mukoviszidose soll langfristig Grundlage für die Entwicklung neuer Therapieansätze und – strategien darstellen.
2 Patienten und Methoden
2.1 Patienten für den Vergleich von extremen Phänotypen
Bei der Patientengruppe, die für den Vergleich extremer Phänotypen (konkordant mild gegen konkordant schwer erkrankt, konkordant mild und schwer gegen diskordant erkrankt) für die Genotypisierung ausgewählt wurde, handelt es sich um eine Subgruppe der Patientenpopulation, die im Rahmen der Europäischen CF Zwillings- und Geschwisterstudie rekrutiert worden ist.
Von den 318 Zwillings- und Geschwisterpaaren, von denen das Längensollgewicht und das forcierte expiratorische Volumen in einer Sekunde bestimmt werden konnten, wurden 114 Paare ausgewählt, die homozygot für die in Europa am häufigsten auftretende F508del CFTR-Mutation waren. Sie wurden wie in Kapitel 1.3.2 der Einleitung beschrieben anhand des Schweregrades ihrer Erkrankung in Gruppen eingeteilt, zusätzlich wurde zwischen monozygoten (MZ) und dizygoten (DZ) Zwillings- und Geschwisterpaaren unterschieden. Von den 46 dizygoten Paaren, von denen DNA gewonnen werden konnte, konnten 10 Paare als konkordant schwer (CON-), 14 Paare als konkordant mild (CON+) und 22 Paare als diskordant erkrankt (DIS) klassifiziert werden.
Zusätzlich zu den DNA-Proben dieser Patienten wurden als technische Kontrolle die DNA-Proben von 7 monozygoten Zwillingspaaren und Proben von mindestens einem, meistens aber beiden Elternteilen der Paare genotypisiert. Proben von 5 Paaren ohne Zugehörigkeit zu einer der drei Erkrankungsgruppen wurden verwendet, von denen wichtige klinische Parameter wie Immunglobulin-Daten (s.
Kapitel 2.2) bekannt waren, so dass für die Genotypisierung eines Einzelmarkers insgesamt 215 DNA-Proben zur Verfügung standen.
2.2 Patienten für den Vergleich von klinischen Parametern mit dem Genotyp am Einzelmarker D6-133
weiterführende laborchemische Untersuchungen durchgeführt werden konnten. In diesem Rahmen konnten Parameter wie z.B. die Mengen von IgM, IgA, IgE und IgG- Subtypen in Serum bzw. Speichel, Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)- spezifische IgG-Subtypen oder auch das Alter der Erstkolonisation mit P. aeruginosa erhoben werden.
Zusätzlich zu den 5 bereits genotypisierten Patientenpaaren (s. Kapitel 2.1) wurden für einen Vergleich des Genotyps am Einzelmarker D6-133 weitere 91 Patienten dieser Studiengruppe genotypisiert (Bronsveld et al., 2001).
2.3 Patienten für den Vergleich des Genotyps am Einzelmarker D6- 133 mit Transkriptomdaten aus Rektumschleimhautepithel
In der 2003/2004 durchgeführten Transkriptomstudie des SFB 621, Projekt C7
„Genetische Modulatoren der Mukoviszidose im Gastrointestinaltrakt” wurde das epitheliale Transkriptom von Rektumschleimhautbiopsien von 17 CF-Patienten mittels eines Affymetrix Gen-Chips (U133A) mit dem einer gesunden Kontrollgruppe (8 Probanden) verglichen (s. Kapitel 1.5.1). Die an dieser Studie teilnehmenden Patienten wurden am SNP D6-133 genotypisiert, um ihren Genotypen mit der im Rahmen der Transkriptomstudie ermittelten Transkriptstärken des IFNGR1 zu vergleichen.
2.4 Methoden
2.4.1 Isolierung von genomischer DNA aus K+-EDTA-Vollblut mittels Phenol/Chloroform-Extraktion
(Für die Zusammensetzung der verwendeten Puffer und Lösungen s. Anhang).
In einem 50 ml-Reaktionsgefäß erfolgte die Zugabe von 40 ml Lysispuffer zu 3-5 ml K+-EDTA-Vollblut. Nach einer Inkubationszeit von 20-30 Minuten in einem Eisbad wurde 15 Minuten bei 600xg zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Sediment wurde mit 25 ml Lysispuffer resuspendiert, weitere 5 Minuten in einem Eisbad inkubiert, und nach fünfminütiger Zentrifugation bei 600xg konnte der
Überstand dekantiert werden. Es folgte eine Zugabe von 4 ml STE-Puffer mit SDS (0,5% w/v) und Proteinase K (0,25 mg/ml), und das Gemisch wurde über Nacht bei 56°C in einem Schüttelbad (Jürgens GFL) inkubiert.
Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurde es mit 3 ml Chloroform/Isoamylalkohol (29:1) und 3 ml TE-gesättigtem Phenol versetzt und 15 Minuten auf einem Schüttler vorsichtig gemischt.
Auf eine anschließende zehnminütige Zentrifugation bei 600xg folgte die Entnahme der unteren organischen Phase mit einer sterilen Pasteurpipette. Die Phenol/Chloroform-Extraktion wurde noch einmal wiederholt, zur Entfernung des verbleibenden Phenols wurde eine abschließende Extraktion mit 6 ml Chloroform durchgeführt. Nach Entnahme der organischen Phase wurde die verbleibende wässrige Phase mit 1/10 Volumenteilen 3 M Natriumcarbonat (pH 5,5) und 3-4 Volumenteilen eiskaltem Ethanol (99%) versetzt und auf Eis inkubiert.
Die ausgefallene DNA konnte in ein Eppendorfgefäß mit 1 ml Ethanol (70%) überführt werden. Nach einer Zentrifugation von 5 Minuten bei 12000xg wurde der Überstand verworfen, das Sediment anschließend zweimal mit Ethanol gewaschen und schließlich in 300-500 µl TE überführt.
Das Lösen der DNA erfolgte für 4 bis 6 Wochen bei 4°C.
Durch die Messung der optischen Dichte (OD) einer 1:25-Verdünnung bei 260 nm in einem Photometer (Hitachi U-3000 Spectrophotometer) konnte mittels des Lambert- Beerschen Gesetztes (E = x d x c) auf die Konzentration der DNA geschlossen werden.
2.4.2 Feinkartierung des Interferon -Rezeptor 1-Gens (IFNGR1) durch Genotypisierung von Einzelnukleotidpolymorphismen
2.4.2.1 Auswahl der Einzelnukleotidpolymorphismen
Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) für die Feinkartierung des IFNGR1 wurden
betreffenden Bereichs entnommen werden. Außerdem werden Allelverteilungen aufgeführt, die im Rahmen diverser Studien an unterschiedlichen Bevölkerungsgruppen evaluiert werden konnten.
Die 27 für die Feinkartierung ausgewählten SNPs lagen innerhalb eines Bereiches von 10573 bp in 5´-Richtung des Beginn des Exons 1 bis zu 368 bp in 3´-Richtung des Ende des Exons 7 und wurden anhand der für eine europäische Studienpopulation (HapMap-CEU, www.hapmap.org) ermittelten Allelverteilung ausgesucht. Die Evaluation dieser Allelverteilung erfolgte durch die Genotypisierung von 30 Elternpaaren und jeweils einem zugehörigen Kind, die in Utah wohnhaft sind, aber Vorfahren aus Nord-bzw. Westeuropa haben. Das sogenannte HapMap-Projekt, für das diese Studienpopulation eine Untergruppe darstellt, hat es sich zur Aufgabe gemacht, eine Haplotyp-Karte des menschlichen Genoms zu entwickeln, die gängige Muster von menschlichen DNA-Sequenzvariationen beschreibt. Ziel ist es, eine Datenbank zu erstellen, auf die Forscher auf der Suche nach Genen, die die Gesundheit, den Verlauf von Krankheiten und die Antwort des Organismus auf Medikamente und Umwelteinflüsse beeinflussen, zurückgreifen können.
Für den Fall, dass anhand dieser Population keine Allelverteilung ermittelt wurde, wurde auf die Allelverteilung einer anderen europäischen Studienpopulation (PGA- EUROPEAN-PANEL) zugegriffen, die an 24 Studienteilnehmer aus Utah und Frankreich ermittelt werden konnte.
Zunächst wurden SNPs mit Allelverteilungen gewählt, für die innerhalb der Studienpopulationen beide Allele in ähnlicher Häufigkeit ermittelt werden konnten (z.B. Allelfrequenzen A1;A2: 0,543;0,457). Für einen Bereich im Intron 1 des IFNGR1 wurden aber auch Sequenzabschnitte auf einen SNP untersucht, für die laut Datenbanken innerhalb der kaukasischen Bevölkerung nur eine der beiden möglichen Allelvarianten gefunden werden konnte, für die aber bekannt waren, dass in anderen Bevölkerungsgruppen (z.B. der afrikanischen Bevölkerung) beide Allelvarianten gefunden werden konnten. Auch diese Sequenzabschnitte wurde im Rahmen der Arbeit auf ihre Informativität untersucht, um die Markerdichte in diesem Bereich zu erhöhen.
4000bp
Bild 3: Lokalisation der ausgewählten Einzelmarker innerhalb des IFNGR1 auf Chromosom 6
= Exon, = Einzelmarker
2.4.2.2 Auswahl geeigneter Primer und Restriktionsenzyme
Für die Amplifikation der jeweiligen Abschnitte des IFNGR1 mittels Polymerase- Kettenreaktion, in dem die gewählten SNPs lagen, wurden mit Hilfe der Internet- Datenbank Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi) Primerpaare (Sinnstrangprimer A, Gegenstrangprimer B) so ausgewählt, dass Produkte mit einer Größe zwischen 100 und 297 Basenpaaren hergestellt werden konnten.
Aus der NE BioLab-Datenbank (www.neb.com) wurden Restriktionsenzyme ausgesucht, deren Erkennungssequenz eine Variante des SNPs beinhaltete. Konnte kein für den SNP passendes Restriktionsenzym gefunden werden, wurde durch Veränderung der Primersequenz die Sequenz innerhalb des zu amplifizierenden Produktes so geändert, dass der SNP erhalten blieb, die Umgebungssequenz aber der Erkennungssequenz angepasst wurde.
Tabelle 2: Charakterisierung der für die Genotypisierung des IFNGR1 verwendeten Einzelmarker
SNP rs-Nr.
(NCBI) Position im IFNGR1
Allelverteilung (NCBI)
A1;A2
Größe der PCR-Produkte
[bp] Enzym
Artifizielle Erkennungs- sequenz?
D6-O4 641029
5`-Richtung des
Promotors 0,125;0,875’ 113 StuI ja§
G-611A 1327474 Promotor 0,576;0,424’ 152 BfuCI ja“
D6-N38 17181457 Promotor 0,841;0,159* 129 HaeIII nein
C-56T 2234711 Promotor 0,35;0,65’ 172 BtsI nein
D6-113 7749390 Intron 1 0,438;0,562’ 174 Cac8I nein
D6-107 9376269 Intron 1 0,737;0,262’ 198 HpyCH4 III nein D6-
303N 10457020 Intron 1 a)’ 150 Hpy8 I nein
D6-302 17181688 Intron 1 a)* 200 HpyCH4 IV nein
D6-301 17181485 Intron 1 0,978;0,022* 188 BfaI nein
D6-133 1327475 Intron 1 0,867;0,133’ 279 MwoI ja~
D6-205 17181499 Intron 1 0,022;0,978* 208 Hpy188 III nein D6-204 4896245 Intron 1 nicht bekannt 216 HpyCH4 V nein
D6-203 12204754 Intron 1 0,092;0,908’ 150 SspI nein
D6-202 17175120 Intron 1 0,978;0,022* 248 AciI nein
D6-201 17175134 Intron 1 0,025;0,975* 164 HpyCH4 V nein
D6-207 17175294 Intron 1 a)* 160 RsaI ja=
D6-206 17175301 Intron 1 a)* 154 Cac8 I nein
D6-108 9376268 Intron 1 0,271;0,729’ 179 HphI nein
D6-101 9402879 Intron 1 0,25;0,75* 114 MseI nein
D6-
39/102 9389484 Intron 1 0,733;0,267’ 116 HinfI nein
D6-119 4896244 Intron 1 0,543;0,457* 183 FspI nein
D6-127 2025838 Intron 6 nicht bekannt 185 MnlI nein
D6-
147/37 11914 Exon 7 0,21;0,79* 166 BfaI nein
D6-P1 7759040 3´-Richtung des Exons 7
0,732;0,267’ 150 Hpy188 III ja+
* Allelfrequenz anhand PGA-EUROPEAN – PANEL ermittelt
’ Allelfrequenz anhand HapMap-CEU ermittelt
a) laut Datenbanken wurde für die kaukasische Bevölkerung nur eine Allelvariante gefunden
§ Gegenstrangprimer von GGTGATCTCAGCCACTACGC zu GGTGATCTCAGCCACTAGGC geändert
# Gegenstrangprimer von TTTTTCAGCCTGGTGTTTAG zu TTTTTCAGCCTGGTGCTTAG geändert
“ Gegenstrangprimer von CAATTCAGTGTCAAATCAGTTTAT zu CAATTCAGTGTCAAATCAGTTGAT geändert
~ Gegenstrangprimer von GGAGAAGACTATTTTCTGGTGACTTC zu GGAGAAGACTATTTTCTGGT GGCTTC geändert
= Gegenstrangprimer von TGAGCAAAGTCTCACCTGTTACTA zu TGAGCAAAGTCTCACCTG TTAGTA geändert
+ Gegenstrangprimer von TTGACTTACCACACAGATGTTTA zu TTGACTTACCACACAGATGTTCA geändert
2.4.2.3 Die Polymerase-Kettenreaktion
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde verwendet, um identische Kopien der gewählten IFNGR1-Sequenz herzustellen. Zunächst wurde für jedes Primerpaar eine Optimierung der PCR-Bedingungen in 96-Well-Platten durchgeführt, wobei nur die inneren 60 Wells für die Reaktion Verwendung fanden, um die Temperaturbedingungen der einzelnen Reaktionen so konstant wie möglich zu halten. Die äußeren Wells wurden mit H2O befüllt, um eine gleichmäßige Beheizung aller Wells zu gewährleisten.
Für einen 30 µl umfassenden Reaktionsansatz wurden zunächst je 5 µl (50 ng) von fünf laborinternen Kontroll-DNA-Proben vorgelegt. Ein Reaktionsgemisch mit 0,5 µM Primer A (Invitek), 0,5 µM Primer B (Invitek), 1x NH4-Reaktionspuffer (Invitek),
1,6 mM - 5 mM MgCl2 (Invitek), 0,8 mM dNTPs (Roth) und 0,4 U Taq-Polymerase (Invitek), das mit H2O auf 25 µl aufgefüllt wurde, wurde zugefügt und der Ansatz mit Paraffin überschichtet.
Es wurden auch Reaktionen mit dem Reaktionsverstärker Dimethylsulfoxid (DMSO, 3,3% des Reaktionsansatzes) durchgeführt, um die Bildung von Sekundärstrukturen der DNA-Matritze oder der Primer zu minimieren.
Die 96-Well-Platte wurde mit PCR-Folie (Eppendorf) dicht verschlossen.
Für alle PCR-Produkte, die zur Analyse der SNPs hergestellt wurden, wurde eine PCR-Maschine der Firma peqLab (advances primus 96) mit Deckelheizung und ein PCR-Protokoll verwendet, bei dem in der Optimierungsphase der PCR-Bedingungen nur die Hybridisierungstemperatur variiert wurde:
Tabelle 3: Protokoll zur Herstellung der PCR-Produkte für die Genotypisierung der Patientenkohorte
Anzahl der Zyklen Funktion Temperatur Dauer
1x Denaturierung 95°C 3 Minuten
35x Heizrate 1°C/Sekunde 30 Sekunden
Hybridisierung 60°C oder 65°C 1 Minute
Synthese 72°C 1 Minute
Denaturierung 92°C 30 Sekunden
1x Heizrate 1°C/Sekunde 30 Sekunden
Hybridisierung 60°C oder 65°C 1 Minute
Synthese 72°C 3 Minuten
1x Abschalten der Deckelheizung
1x Abkühlung 35°C 30 Minuten
1x Abkühlung 20°C
2.4.2.4 DNA-Gel-Elektrophorese
Um zu überprüfen, welche PCR-Bedingung für das verwendete Primerpaar am besten geeignet ist, wurde eine Gel-Elektrophorese durchgeführt.
Ein Agarosegel wurde mit 1x TBE-Puffer hergestellt, die PCR-Proben aufgetragen
durch die Interkalation des Ethidiumbromids in die DNA dessen Anregungsspektrum so verändert, dass sich die Fluoreszenz bei ultraviolettem Licht stark erhöht.
2
1 3 4
5 6 7 8
9 10 11 12
Bild 4: Ergebnis einer DNA-Gelelektrophorese am Beispiel der Produkte unterschiedlicher PCR-Bedingungen des Primerpaares für den Einzelmarker D6-101 im Intron 1 des IFNGR1 verwendete Proben: K13, K14, K15, K16, K18
1 = Hybridisierungstemperatur 60°C, 1,6 mmol MgCl2
2 = Hybridisierungstemperatur 60°C, 3,3 mmol MgCl2 3 = Hybridisierungstemperatur 60°C, 5 mmol MgCl2
4 = Hybridisierungstemperatur 60°C, 1,6 mmol MgCl2, 3,3% DMSO 5 = Hybridisierungstemperatur 60°C, 3,3 mmol MgCl2, 3,3% DMSO 6 = Hybridisierungstemperatur 60°C, 5 mmol MgCl2, 3,3% DMSO 7 = Hybridisierungstemperatur 65°C, 1,6 mmol MgCl2
8 = Hybridisierungstemperatur 65°C, 3,3 mmol MgCl2
9 = Hybridisierungstemperatur 65°C, 5 mmol MgCl2
10 = Hybridisierungstemperatur 65°C, 1,6 mmol MgCl2, 3,3% DMSO 11 = Hybridisierungstemperatur 65°C, 3,3 mmol MgCl2, 3,3% DMSO 12 = Hybridisierungstemperatur 65°C, 5 mmol MgCl2, 3,3% DMSO
2.4.2.5 Typisierung von Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLPs)
Die 5 PCR-Produkte einer Bedingung mit den deutlichsten Banden ohne Nebenprodukte wurden für eine Spaltung mit einem vorher bestimmten Restriktionsenzym ausgewählt. Zu 15 µl des PCR-Produktes wurden 5 µl Restriktionsansatz mit 1U Enzym (NEB), 2 µl zu dem Enzym zugehörigen 10x Puffer, H2O und wenn nötig 0,2 µl bovines Serumalbumin (10 mg/ml) zugefügt, mit Paraffin überschichtet und bei enzymabhängiger Temperatur über Nacht inkubiert.
Die Verdauprodukte wurden auf ein Agarosegel (s. Bild 5) aufgetragen und wie bereits in Kapitel 2.4.2.4 beschrieben analysiert.
1 2 3 4 5 6
Bild 5: Ergebnis einer RFLP-Typisierung am Beispiel des Primerpaares für den Einzelmarker D6-101 mit dem Restriktionsenzym MseI
PCR-Bedingung: Hybridisierungstemperatur 60°C, 3,3 mmol MgCl2
1 = ungespaltene Vergleichsprobe 2 = Probe K13, Genotyp 1-2 3 = Probe K14, Genotyp 1-1 4 = Probe K15, Genotyp 2-2 5 = Probe K16, Genotyp 2-2 6 = Probe K18, Genotyp 2-2
2.4.2.6 Auswahl von geeigneten SNPs für die Genotypisierung der Patientenkohorte
Anhand der Verteilung der Allele bei den 5 laborinternen Kontroll-DNA-Proben wurde auf die Informativität des SNPs geschlossen. Wenn bei den 5 Kontroll-DNA-Proben nur einer der drei möglichen Genotypen erkennbar war, wurde der SNP als uninformativ abgelehnt. SNPs, bei denen mindestens 2 der 3 möglichen Genotypen innerhalb der 5 Kontroll-DNA-Proben erkennbar waren, wurden für die Genotypisierung der 215 Patienten ausgewählt.
2.4.3 Statistische Analyse
2.4.3.1 Verwendung des CLUMP-Programms
Aus den evaluierten Genotypen der Patienten wurden Haplotypen konstruiert und sowohl die Allelverteilung als auch die Genotyp- und Haplotyp-Verteilungen der konkordant schwer, konkordant mild und diskordant erkrankten Geschwisterpaare miteinander verglichen. Um zu überprüfen, ob Unterschiede in den Verteilungen signifikant waren, wurde zunächst das CLUMP-Programm verwendet. Hierbei handelt es sich um ein Programm, das auf einer Simulationsstrategie basiert und für genetische Fall-Kontroll-Assoziationsstudien entwickelt wurde, bei denen in beliebigen Spaltenzahlen (kx2) kleine Beobachtungszahlen miteinander verglichen werden sollen (Sham and Curtis, 1995).
2.4.3.2 Durchführung der Geschwisterkorrektur
Für die Berechnung der p-Werte durch das CLUMP-Programm werden die Genotyp-, Allel-, und Haplotypfrequenzen beim Vergleich der Verteilung in den drei Erkrankungsgruppen als voneinander unabhängige Ereignisse gewertet. Da es sich aber um Zwillings- und Geschwisterkinder handelt, deren Genotyp innerhalb einer Familie voneinander abhängig ist, ist eine Korrektur der sogenannten Geschwisterabhängigkeit notwendig.
Diese Geschwisterkorrektur wurde freundlicherweise von Dr. Tim Becker am Institut für Medizinische Biometrie, Informatik und Epidemiologie in Bonn (IMBIE Bonn), durchgeführt (Knapp M, Becker T, 2003; Becker T, Knapp M, 2004; Becker et al., 2005).
Weiterhin ist eine Korrektur notwendig, da beim Vergleich der Haplotypenverteilungen mittels CLUMP unterschiedlich große Gruppen verglichen werden, da durch eventuell nicht ermittelbare Genotypen der Eltern (fehlende DNA, Nichtfunktionieren der Typisierungsreaktion) die maternalen und paternalen Hayplotypen der Kinder nicht immer evaluiert werden konnten. Durch eine Strategie basierend auf einer Korrektur für multiples Testen innerhalb einer Familie sind diese
Haplotypen durch Tim Becker konstruierbar, so dass ein Vergleich von Gruppen gleicher Größe möglich wird.
2.4.3.3 Der U-Test von Mann und Whitney
Für den Vergleich des Genotyps am Einzelmarker D6-133 und dem Alter der Erstinfektion und der chronischen Kolonisation mit P. aeruginosa wurde für die Berechnung der p-Werte der U-Test von Mann und Whitney verwendet. Bei diesem Test handelt es sich um einen nichtparametrischen Rangtest, der zur Überprüfung herangezogen werden kann, ob zwei voneinander unabhängige Stichproben aus der gleichen Grundgesamtheit stammen.
Für diesen Test wurden die Patienten anhand ihres Genotyps am SNP D6-133 in 2 Stichprobengruppen unterteilt. Beim 1. Vergleich wurde das Alter der Patienten mit dem Genotyp 1-1 (= n1) mit dem Alter der Patienten verglichen, die sowohl den Genotyp 1-2 als auch 2-2 (= n2) trugen. Bei einem weiteren Vergleich wurde das Alter der Patienten, die den Genotyp 1-1 oder 1-2 (= n1) trugen mit dem Alter der Patienten mit dem Genotyp 2-2 (= n2) gegenübergestellt.
Für diese Vergleiche erfolgte für die Patienten eine Zuteilung von Rangzahlen in Abhängigkeit vom Alter und ihrer Position in der Gesamtgruppe. Diese Rangzahlen wurden innerhalb der Einzelgruppen summiert, woraufhin eine Kennziffer U berechnet werden konnte, die angab, wie häufig einem Beobachtungswert aus der Stichprobe vom Umfang n2 ein Beobachtungswert aus der Stichprobe vom Umfang n1 vorausging. Die Beurteilung der Signifikanz eines U-Wertes erfolgte abschließend anhand einer Tafel für das GAUSSsche Integral, aus der entsprechende p-Werte abgelesen werden konnten (Weber E, 1986).
2.4.4 Herstellung eines 7 Kilobasen (kb) großen PCR-Produktes
Da für die Herstellung eines Produktes dieser Größenordnung andere Taq- Polymerasen und Reaktionsansätze und veränderte PCR-Protokolle verwendet werden als für die Herstellung der deutlich kleineren PCR-Produkte, die im Rahmen der Feinkartierung des IFNGR1 hergestellt wurden, wird sie in einem separaten Kapitel beschrieben.
Die Primerpaare für die Herstellung des 7 kb umfassenden Produktes wurden mit Hilfe der Primer3-Datenbank entwickelt und die PCR-Bedingungen für 2 Primerpaare mit unterschiedlichen Hybridisierungstemperaturen optimiert. Für den Fall, dass mit beiden Primerpaaren kein PCR-Produkt hergestellt werden konnte, wurden parallel die PCR-Bedingungen für zwei Primerpaare optimiert, mit denen Teilprodukte des Zielproduktes hergestellt werden konnten.
D6-S01 D6-S02
D6-SKP1
D6-SKP2
1000 bp
Bild 6: Positionen der Primer für die Herstellung des 7 kb großen PCR-Produktes
Tabelle 4: Produktgröße der Primerpaare für die Herstellung des 7 kb großen PCR-Produktes Primerbezeichnung Produktgröße in bp
D6-S01 7016
D6-S02 6978
D6-SKP1 3461
D6-SKP2 4061
Verwendung fanden zwei verschiedene Enzyme, die Goldstar Standard Polymerase (Eurogentec), die laut Herstellerangaben in der Lage sein sollte, bis zu 12 Kilobasen (kb) DNA synthetisieren zu können, und die DAp-Goldstar (Eurogentec), für die bei hoher Prozessivität und hoher Ausbeute eine Syntheseleistung von bis zu 30 kb angegeben wurde. Die PCR-Reaktionen fanden sowohl in 96-Well-Platten als auch in mehrreihigen PCR-Reaktionsgefäßen statt. Verwendung fand eine PCR-Maschine der Firma peqLab (advances primus 96).
Es wurden zunächst pro Reaktionsansatz 5 µl (50 ng) von genomischen, laborinternen Kontroll-DNA-Proben verwendet, mit 25 µl Reaktionsansatz versetzt und mit Paraffin überschichtet. Die nach der Optimierung verwendete Patienten-DNA wurde in Menge und Konzentration variiert.
Um vorzeitige Interaktionen der Primer untereinander und mit der DNA-Matritze im Reaktionsansatz zu verhindern und um die Aktivität der Polymerase bis zum Beginn des PCR-Programms zu unterbinden, wurden alle Bestandteile der Reaktionsansätze nach dem Auftauen sowie die fertigen Ansätze selber auf Eis gelagert.
Für die Goldstar Standard beinhaltete ein Reaktionsansatz 3,3 mM-11,4 mM MgCl2 (Invitek), 0,5 µM Primer A (Invitek), 0,5 µM Primer B (Invitek), 0,8 mM dNTPs (Roth), 1x Reaktionspuffer (Eurogentec), 1,5 U Goldstar Standard (Eurogentec), 3,3 % DMSO bzw. 0,8-1,2 M Betain, mit H2O wurde auf 25 µl aufgefüllt.
Für die DAp-Goldstar wurde ein Reaktionsansatz mit 3,3 mM-11,4 mM MgCl2 (Invitek), 0,5 µM Primer A (Invitek), 0,5 µM Primer B (Invitek), 0,8 mM dNTPs (Roth), 1x Reaktionspuffer (Eurogentec), 0,75 – 1,5 U DAp-Goldstar, und 0,5x-1,8x enzymeigenem Reaktionsverstärker gewählt, der mit H2O auf 25 µl aufgefüllt wurde.
Für alle Primerpaare wurde zunächst ein triphasisches Programm mit einer Hybridisierungstemperatur von 65°C, einer Synthesetemperatur von 72°C und einer Denaturierungstemperatur von 95°C getestet, wobei die Synthesezeit für das 7 kb große Produkt 7 Minuten und für die beiden kleineren Teilprodukte 4 Minuten betrug.
Für die ersten 10 Zyklen (exemplarisch in Bild 7 dargestellt) wurde eine Denaturierungsddauer von 1 Minute gewählt, die in weiteren 25 Zyklen auf 30 Sekunden reduziert wurde.
Für die Herstellung des 7000 bp großen Produktes wurde im weiteren Verlauf auch ein biphasisches Programm getestet, bei dem Hybridisierungs- und Synthesetemperatur konstant für 8 Minuten pro Zyklus bei 68°C blieben. Auch hier wurde in den ersten 10 Zyklen (exemplarisch in Bild 7 dargestellt) mit einer Denaturierungszeit von 1 Minute pro Zyklus begonnen, die nach 10 Zyklen auf 30 Sekunden pro Zyklus reduziert wurde.
50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
0 2 4 6 8 10 12 14
Minuten
Temperatur
Bild 7: Schematische Darstellung der ersten 10 Zyklen des triphasischen und des biphasischen PCR-Programms (Temperatur in °C)
= triphasisches PCR-Programm, = biphasisches PCR-Programm
Die PCR-Produkte wurden auf 0,8% Agarosegel übertragen, bei 30 V über Nacht bzw. 120 V für 3 Stunden auf dem Gel getrennt und nach Färbung mit Ethidiumbromid und anschließender Entfärbung mit Hilfe von UV-Licht sichtbar gemacht.
Um die im Anschluss geplante Sequenzierung zum einen so kostengünstig wie möglich durchzuführen, zum anderen auch DNA zu sparen, wurde ein großes PCR- Produkt zwei kleineren Teilprodukten vorgezogen, weshalb nach ersten erfolgreichen Optimierungen nur noch am Produkt des Primerpaares D6-S01 weitergearbeitet wurde.
Zur Überprüfung, ob das entstandene Produkt auch das Zielprodukt darstellt, wurde eine Restriktionsspaltung des entstandenen Produktes durchgeführt. Mit Hilfe der NEB-Datenbank wurden Enzyme ausgewählt (SpeI, EcoRI, BstAPI), die das Produkt jeweils an 2 Stellen spalten sollten. Die Enzyme wurden mit entsprechenden Puffern und zugehöriger Temperatur über Nacht mit 15 µl des PCR-Produktes inkubiert und im Anschluss auf ein 0,8% Agarose-Gel übertragen. Mit Hilfe des -BstE II- und des 2-Log-Standards (NEB) konnten entstandene Fragmente ihrer Größe nach zugeordnet und mit dem theoretisch erwarteten Ergebnis verglichen werden.
Spe I EcoR I BstAP I EcoR I BstAP I
1 7016 bp
Spe I
Bild 8: Spaltorte der Restriktionsenzyme für das PCR-Produkt des Primerpaares D6-S01
Nach einem Vergleich der Produktmuster nach Spaltung durch die gewählten Restriktionsenzyme mit einem theoretisch zu erwartenden Muster wurde das PCR- Produkt als Zielprodukt identifiziert. Es wurden 4 Patienten ausgewählt, von denen mit den optimierten Bedingungen ein PCR-Produkt mit dem Primerpaar D6-S01 hergestellt werden konnte.
2.4.5 Sequenzierung des 7 kb-PCR-Produktes
Die Sequenzierung wurde nach dem Strangabbruch-Verfahren (Sanger et al., 1977) von der Firma QIAGEN (Hilden) durchgeführt.
Zusätzlich zu den beiden terminalen Primern, mit denen das Produkt hergestellt werden konnte, wurden mit Hilfe der Primer3-Datenbank Sequenzen von 22 internen Sequenzierprimern entwickelt, die in Abständen von etwa 300 Basenpaaren auf dem codogenen und dem nichtcodogenen Strang binden sollten. Alle Primer bildeten Startpunkte der Sequenzierungsreaktionen, wodurch sich überlappende Sequenzdaten erhalten werden konnten.
D6-S01-A
D6-S01-B
300 1500
1800
2100 2400
2700 3000 600
900 1200
3300 4500
3600
3900 4200
5700 5400
5100
4800 6700
6400 6100
1000 bp
Bild 9: Primerpositionen innerhalb des Sequenzierproduktes
2.4.6 Aneinanderfügen der Sequenzierergebnisse
Für jeden verwendeten Sequenzierprimer erhält man durch die Sequenzierung nach dem Strangabbruch-Verfahren eine Sequenz zwischen 600-800 bp, die die Anfangssequenz des Folgeprimers überlappt. Diese Sequenzabschnitte wurden durch das Programm „CodonCode-Aligner“ (CodonCodeCorporation) erkannt und in
