Aus der Abteilung Pharmaforschung und Medizinische Biotechnologie des Fraunhofer Instituts für Toxikologie und Experimentelle Medizin.
Vitamin E in Heart Transplantation:
Effects on Cardiac Gene Expression
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von: Ingo Schulte aus Einbeck Hannover 2006
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 21.09.2006
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. Jürgen Borlak Referent/Referentin: PD Dr. med. Dirk Stichtenoth Korreferent/Korreferentin: Prof. Dr. med. Axel Haverich
Tag der mündlichen Prüfung: 21.09.2006
Promotionsausschussmitglieder: Prof. Dr. Hans Dieter Tröger Prof. Dr. Klaus Resch
Prof. Dr. Reinhard Schwinzer
Inhaltsverzeichnis
Seite
Originalpublikation 5
Abstract 6 (736*)
Introduction 6 (736*)
Materals and Methods 6 (736*)
Animals 6 (736*)
Anesthesia 7 (737*)
Heart Transplantation 7 (737*)
Explantation of Donor Hearts 7 (737*)
Transplantation of the Donor Hearts 7 (737*)
Functional control 7 (737*)
Vitamin E Treatment 7 (737*)
Plasma Preparation 7 (737*)
Determination of Vitamin E Plasma and Tissue Level 7 (737*) Sample Preparation, Total RNA Isolation 8 (738*)
cDNA Synthesis 8 (738*)
RT-PCR 8 (738*)
Measurement of Enzyme Markers in Plasma 9 (739*)
Statistical Analysis 9 (739*)
Results 9 (739*)
Effects of Vitamin E Treatment 9 (739*)
Vitamin E Plasma and Tissue Levels 9 (739*)
Effects of Vitamin E Treatment on Gene Expression 9 (739*) in Cardiac Tissue
Discussion 11 (741*)
References 14 (744*)
* Seitenangabe in der Originalpublikation
Inhaltsverzeichnis
Seite Deutschsprachige Zusammenfassung und Hintergrund 16
Einleitung 17
Probleme der Herztransplantation 17
Überblick Vitamin E 17
Metabolismus des Vitamin E 17
Antioxidante Verteidigungssysteme der Zelle 18 Ischämie/Reperfusionsschaden bei Herzerkrankungen 20 Klinische Studien zur Kardioprotektivität des Vitamin E 20
Vitamin E und Arteriosklerose 21
Vitamin E und Genexpression 22
Zielsetzung und Versuchsdesign 25
Material und Methoden 27
Herztransplantation 27
Vitamin E-Behandlung 28
Gewinnung von Blutplasma 29
Bestimmung des Plasma- und Gewebsspiegels des Vitamin E 29
Genexpressionsstudien 29
Statistische Auswertung 29
Ergebnisse 30
Plasma- und Gewebsspiegel nach Vitamin E-Behandlung 30
Genexpressionsanalyse 31
Diskussion 33
Genexpression einiger Strukturproteine des Herzens 33 während der Transplantation
Effekt der Vitamin E-Behandlung auf die antioxidanten 33 Enzymsysteme der Zelle
Effekt der Vitamin E-Behandlung auf die Zelladhäsionsmoleküle 34 Effekt der Vitamin E-Behandlung auf Transkriptionsfaktoren 35
Zusammenfassung 35
Zusammenfassung 37
Literaturverzeichnis 38
Inhaltsverzeichnis
Seite Anhang
Lebenslauf 41
Danksagung 43
Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nr. 5 und 6 PromO 44
Originalpublikation
Vitamin E in Heart Transplantation: Effects on Cardiac Gene Expression
Schulte I, Bektas H, Klempnauer J, Borlak J. Transplantation 2006 Mar; 81(5)
Deutschsprachige Zusammenfassung und Hintergrund
Vitamin E in Heart Transplantation: Effects on Cardiac Gene Expression
Schulte I, Bektas H, Klempnauer J, Borlak J. Transplantation 2006 Mar; 81(5)
Einleitung
Probleme der Herztransplantation
Im Jahre 1967 wurde erstmals ein menschliches Herz transplantiert. Seitdem hat sich die Herztransplantation von einem experimentellen Verfahren zu einer fest etablierten Therapie in der Behandlung der terminalen Herzinsuffizienz entwickelt. Indikationen zur Herztransplantation sind hauptsächlich die dilatative Kardiomyopathie und ischämische Herzerkrankungen. Durch die Weiterentwicklung der Organkonservierung und der Immunsuppression konnte die Zahl der längerfristig erfolgreich transplantierten Herzen in den letzten Jahren deutlich gesteigert werden. Hauptkomplikationen und Schädigungsmechanismen für das transplantierte Herz sind neben der akuten Abstoßungsreaktion die chronische Abstoßungsreaktion im Sinne einer Transplantatvaskulopathie und der Ischämie/Reperfusionsschaden während der Transplantation. Bei der transplantationsbedingten Vaskulopathie kommt es nach Monaten oder Jahren nach Transplantation zur Arteriosklerose der Koronarien des transplantierten Herzen mit letztlich deletären Folgen. Während der eigentlichen Herztransplantation durchläuft das transplantierte Herz zwei extreme Konditionen: Zunächst eine möglichst nicht länger als vier Stunden dauernde Ischämiezeit in einer Konservierungslösung ausserhalb des menschlichen Körpers, während der es nicht durchblutet wird, und später nach erfolgreicher Transplantation die Phase der Reperfusion. In dieser Phase entstehen im transplantierten Herzen vermehrt freie Sauerstoffradikale, die zu oxidativem Stress der Herzmuskelzellen führen (s.u.) (Thiemes Innere Medizin 1999).
Überblick Vitamin E
Das Vitamin E ist ein wichtiges nichtenzymatisches Antioxidans der Zelle. Seit seiner Entdeckung im Jahre 1922 als Reproduktionsfaktor bei Ratten (1) wurden dem Vitamin E immer neue Funktionen zugeschrieben, in dessen Folge es einen beinahe mystischen Charakter erhielt, Krankheiten vorbeugen zu können. Dem Vitamin E werden protektive Effekte bei der Prävention von kardiovaskulären Erkrankungen, Krebs und chronischen Entzündungen zugeschrieben (2).
Metabolismus des Vitamin E
Vitamin E umfasst α−, β−, γ−, und δ−Tocopherol und α−, β−, γ−, und δ−Tocotrienol, welche nach oraler Aufnahme im Darm resorbiert werden und über Chylomikronen in den
Blutkreislauf gelangen. In der Leber wird spezifisch α-Tocopherol in VLDL (very low density lipoprotein) sezerniert. Dieser Vorgang wird durch das α-TTP (α-tocopherol transfer protein) moduliert. Die übrigen Tocopherole und Tocotrienole werden zumeist über die Galle ausgeschieden. Der α-Tocopherol-Plasmaspiegel liegt beim Menschen normalerweise um die 25 µmol/L und kann, unabhängig von Menge und Dauer der Supplementierung, um den Faktor 2-3 angehoben werden. Die Aufnahme in extrahepatische Gewebe erfolgt über LDL- Rezeptoren. Ein Haupteliminationsprodukt des Vitamin E ist das α-CEHC (carboxyethylhydroxychroman), das über die Niere ausgeschieden wird (siehe auch Abbildung 1) (2).
Abb. 1 Die Tocopherole werden im Darm resorbiert und in Chylomikronen zu den peripheren Geweben transportiert. Nach Hydrolyse durch die Lipoproteinlipase (LPL) wird ein Teil der Tocopherole von peripheren Zellen aufgenommen, der größere Teil gelangt mit den restlichen Chylomikronen zu den Hepatozyten, die die Tocopherole über den LDL-Rezeptor (LDLR) aufnehmen. Das α-Tocopherol wird spezifisch vom α-TTP in VLDL sezerniert und gelangt schließlich über LDL zu den peripheren Zellen. Die restlichen Tocopherole werden über die Galle ausgeschieden. Die LDLs werden von den peripheren Zellen über den LDL-Rezeptor
aufgenommen. Das α-Tocopherol wird intrazellulär durch Tocopherol-assoziierte Proteine (TAPs) und
Tocopherol Bindeproteine (TBPs) zu seinen Wirkorten verteilt. In den Zellen moduliert das α-Tocopherol Wege der Signaltransduktion (z.B. Proteinkinase C) oder es nimmt direkten Einfluss auf die Genexpression. Ein Teil des Tocopherols wird zu CEHC metabolisiert und über die Niere ausgeschieden.
Antioxidante Verteidigungssysteme der Zelle
αTTP
Chylomikronen Tocopherol-
Ausscheidung über Galle
LDLR
LPL VLDL
Hepatozyt LDL
Intrazelluläre Verteilung durch TAPs und TBPs
Anreicherung in Zellorganellen
Metabolismus der Tocopherole
Modulation Signaltrans- duktion
Modulation Genexpression
Tocopherol-Metabolite (CEHCs)
periphere Zelle
Schon seit langem ist die antioxidante Wirkung des Vitamin E bekannt. Neben zellulären Verteidigungs- und Entgiftungssystemen, wie beispielsweise Superoxiddismutase (SOD), Glutathionperoxidase und Katalase, besitzen Zellen nicht-enzymatische Abwehrmechanismen wie Vitamin E, Vitamin C, Ubichinon und Glutathion zur Verhinderung des oxidativen Stresses der Zelle und radikalinduzierter Oxidationen (siehe auch Abbildung 2)(3). Freie Sauerstoffradikale sind hochreaktive Moleküle mit einem ungepaarten Elektron in der äußeren Hülle, die von Zellen in pathologischen Situationen vermehrt produziert werden. Der für die Zelle ansonsten lebenswichtige Sauerstoff wird zu einer hochtoxischen Substanz. Die Sauerstoffradikale schädigen die DNA der Zelle, indem sie verschiedene Basen modifizieren mit der Konsequenz von Strangbrüchen und Basenfehlpaarungen. Sie bewirken Oxidationen von Proteinen und Lipiden, die Integrität der Zellmembranen geht verloren. Vor diesen deletären Einflüssen wird die Zelle durch Antioxidantien geschützt. Die SOD katalysiert die Reaktion vom Superoxidanion O2- zum Wasserstoffperoxid H2O2, welches nachfolgend durch Catalase und Glutathionperoxidase entgiftet wird. Das Vitamin E verhindert als Radikalfänger die Peroxidation von mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFA) (4) und die Oxidation von LDL (5). Dabei reagiert das Vitamin E zum Vitamin E-Radikal, wird aber durch Vitamin C, Glutathion oder Ubichinon regeneriert.
Abb. 2 Sauerstoff- und Stickstoffradikale, die während einer Phase der Ischämie/Reperfusion gebildet werden, schädigen die Zelle auf vielfältige Weise. Antioxidantien, wie Vitamin E, SOD, Glutathionperoxidase (GPx) und Catalase schützen die Zelle vor den deletären Auswirkungen der freien Radikale. Die Antioxidantien werden teilweise durch andere Antioxidantien regeneriert, so z.B. das Vitamin E durch Vitamin C und die GPx durch die GRd (Glutathionreduktase).
Arginin
O2
Zellatmung Umweltfaktoren Enzymaktivität Reperfusion
O2- NOS NO
ONOO- Vitamin E ONOOH + Vit. E-Radikal
DNA-Schädigung Proteinoxidation Lipidperoxidation
Regeneration durch Glutathion, Ubichinon, Vitamin C
SOD H2O2 Catalase H2O + O2
H2O
GPx Regeneration
durch GRd
OH-
DNA-Schädigung Proteinoxidation Lipidperoxidation
Ischämie/Reperfusionsschaden bei Herzerkrankungen
In den Herzmuskelzellen entstehen freie Sauerstoffradikale vermehrt beim Ischämie/Reperfusionsschaden während eines Herzinfarkts, einer Bypass-Operation, der koronaren Ballondilatation, aber auch bei der Herztransplantation. Die verminderte Durchblutung des Herzens während der Ischämiephase führt zu einer O2-Mangelversorgung des Myokards. Die Versorgung der Herzmuskelzellen durch die aerobe Zellatmung ist stark eingeschränkt, da die energieliefernden mitochondrialen Vorgänge durch den sinkenden O2- Partialdruck blockiert sind. Die Zelle versucht Energieäquivalente aus anderen Quellen zu gewinnen. Bei den anaeroben Stoffwechselprozessen, die der Energiegewinnung dienen, entstehen saure Nebenprodukte, wie das Lactat, wodurch die eigentliche Homöostase der Zellen verändert wird. Wichtige Stoffwechselprozesse der Zelle werden auf das Nötigste herunterreguliert. In der Reperfusionsphase wird die vollständige Durchblutung des Herzens wieder hergestellt, und es kann zu immensen Schäden kommen. Das grosse Angebot frisch oxygenierten Blutes trifft auf ein Myokard in einem steady-state der absoluten Energie- und O2-Mangelversorgung. Die Herzmuskelzelle kann dieses toxische Angebot an Sauerstoff nicht bewältigen, und es entstehen vermehrt freie Sauerstoffradikale, welche die Zellmembranen, DNA und Proteine der Zelle schädigen. Die Fähigkeit des Vitamin E, Zellen vor den schädlichen Auswirkungen freier Radikale schützen zu können, führte zur Annahme einer kardioprotektiven Wirkung mit Verminderung des Ischämie/Reperfusionsschaden.
Klinische Studien zur Kardioprotektivität des Vitamin E
In den letzten Jahren wurden einige große placebo-kontrollierte prospektive Studien ausgewertet, deren Ergebnisse zu einem zweifelhaften Benefit führen. Die α-Tocopherol β- Carotene (ATBC) Study, die Cambridge Heart Antioxidant Study (CHAOS), die Gruppo Italiano per loStudio della Supervienza nell`Infarto miocardio (GISSI) Studie und die Heart Outcomes Prevention Evaluation (HOPE) Studie konnten einen konsistenten Benefit des Vitamin E bei kardiovaskulären Erkrankungen nicht belegen. Auch in der kürzlich veröffentlichten Women`s Health Study wird eine Vitamin E-Substitution für gesunde Menschen nicht empfohlen. Einzig in der MIVIT-Studie (multicenter pilot Myocardial Infarction and Vitamins trial) scheint die antioxidante Substitution mit Vitamin C + E einen positiven Effekt für Patienten mit akutem Myokardinfarkt zu haben. Deshalb wird eine kardioprotektive Wirkung des Vitamin E weiterhin heftig diskutiert (6-11). Es ist allerdings auch heftige Kritik am Design der großen Studien geäußert worden: So wurden keine Vitamin
E-Plasmaspiegel zu Βeginn der Studien bei den Patienten gemessen, und es fanden keine Kontrollen statt, die einen Anstieg des Plasmaspiegels nach oraler Supplementierung gesichert hätten. Die Studien sind größtenteils sekundäre Präventionsstudien, die Patienten wiesen zum Beginn der Studie zumeist schon fortgeschrittene arteriosklerotische Veränderungen der Koronarien auf. Das Vitamin E verhindert aber die Entwicklung der Arteriosklerose in frühen Stadien, indem es den Endothelschaden durch verminderte LDL- Oxidation und andere Prozesse (s.u.) verringert (2).
Vitamin E und Arteriosklerose
Einen positiven Effekt scheint das Vitamin E auf die Verhinderung der Entstehung und des Fortschreitens der Arteriosklerose zu haben. Vor einigen Jahren noch wurde dieser Effekt vor allem auf die antioxidante Wirkung des Vitamin E auf die Entstehung von oxidiertem LDL (oxLDL) zurückgeführt. Das oxLDL ist ein etablierter Risikofaktor in der Arterioskleroseentstehung und beeinflusst durch Förderung von Vasokonstriktion, Thrombozytenaggregation und Zytokinfreisetzung, im Sinne einer Gefäßentzündung, das Fortschreiten der arteriosklerotischen Läsionen (siehe auch Abbildung 3). Aufgrund gezielter Forschung wurde in den letzten Jahren die biologische Signifikanz des Vitamin E neu beschrieben. So scheint das Vitamin E durch eine Hemmung der Proteinkinase C, die für diverse zelluläre Signalkaskaden eine wichtige Rolle spielt, die Proliferation glatter Muskelzellen, die Monozytenadhäsion an Endothelzellen, die Zytokinfreisetzung und die Thrombozytenaggregation zu inhibieren. Durch Hemmung der Enzymaktivitäten der Cyclooxygenase 2 hat das Vitamin E eine ähnliche, wenn auch weniger stark ausgeprägte, Wirkung auf die Thrombozytenaggregation wie das Aspirin (12). In einer 2002 erschienenen placebokontrollierten Studie konnte gezeigt werden, dass die Substitution von Vitamin C und E die nach einer Herztransplantation häufig frühzeitig auftretende Arterioskleroseentstehung verhindert (13). Auch andere Studien zeigen positive Effekte des Vitamin E.
Abb. 3 In einem frühen Arteriosklerosestadium lagern sich Monozyten an die Endothelzellen der Gefäße an.
Dieses Manöver wird durch die Adhäsionsmoleküle ICAM und VCAM gefördert. Die Monozyten gelangen durch Diapedese in den subendothelialen Spalt und differenzieren dort zu Makrophagen. Die Makrophagen generieren durch die NADPH-Oxidase freie Radikale (ROS). Diese ROS inaktivieren das endothelial gebildete NO zum ONOO- -Radikal und bewirken die Oxidation von LDL zu oxLDL. Das oxLDL spielt eine
Schlüsselrolle in der Arterioskleroseentstehung. Es stimuliert die Expression von endothelialen
Adhäsionsmolekülen und des CD36-Rezeptors auf Makrophagen und glatten Muskelzellen. Über diesen Rezeptor wird das oxLDL in die Makrophagen internalisiert, die so zu Schaumzellen werden. Die glatten Muskelzellen werden zur Proliferation und zur Einwanderung in die Intima angeregt. Das oxLDL bindet an den Lox 1-Rezeptor (Lectin oxLDL Type 1-Rezeptor) und bewirkt eine vermehrte Zytokinsekretion der
Endothelzellen, welche u.a. die Thrombozytenadhäsion an das Endothel fördert. Im Endstadium der Arteriosklerose kommt es dann durch o.g. Vorgänge zu den typischen arteriosklerotischen Plaques im
Intimabereich und zu einer Vasokonstriktion des Gefäßes und zu Thrombenbildung im Bereich der Gefäßwand.
Vom Vitamin E ist bekannt, dass es auf vielfältige Weise diesen Prozessen entgegenwirkt. Es hemmt die Expression von endothelialen Adhäsionsmolekülen, die Entstehung von ROS und von oxLDL, die Expression des CD36-Rezeptors, die Proliferation glatter Muskelzellen und die Thrombozytenadhäsion ans Endothel.
Vitamin E und Genexpression
Wenig bekannt ist über den Einfluss des α-Tocopherol auf die transkriptionelle Regulation im Myokard. In den 80iger Jahren wurde erstmals die Modulation von Genen in Herzmuskelzellen durch Vitamin E beschrieben. Bis heute sind ungefähr 30 Gene bekannt, deren mRNA-Expression durch Vitamin E beeinflusst wird (siehe Tabelle 1). Diese Gene codieren für Proteine der extrazellulären Matrix, Apoptosefaktoren, Transkriptionsfaktoren, Zytokine, Wachstumsfaktoren, und für Proteine, die Einfluss auf den Zellzyklus nehmen oder für den Metabolismus in den Zellen mitverantwortlich sind (12). Einige dieser Gene spielen
ROS NO
ONOO LDL
ox LDL
Zytokinsekretion Thrombozytenadhäsion
CD36
Schaumzelle Makrophage
Monozyt
Intima
Endothel VCAM ICAM
Media Glatte Muskelzellen
Proliferation Lumen
Endothelschaden Lox 1-Rezeptor
bei der Arterioskleroseentstehung eine wichtige Rolle. So wird der CD36-Rezeptor, der die Aufnahme von oxLDL in glatte Muskelzellen der Arterien fördert, herunterreguliert. Durch Inhibition der Genexpression der Zelladhäsionsmoleküle VCAM-1 (vascular cellular adhesion molecule) und ICAM (intercellular adhesion molecule) wird die Adhäsion von Monozyten an die Endothelzellen der arteriellen Gefäße, ein wichtiger Faktor in der Arterioskleroseentstehung, verringert (12). Durch Induktion der Genexpression des αTTP reguliert das α-Tocopherol in gewissem Rahmen auch seinen Plasmaspiegel selbst (s.o.).
Kategorie Gene normale Funktion
Effect von α
αα α-
Tocopherol Rezeptoren CD36, SR-BI, SR-AI/II Aufnahme von oxLDL in die Zelle Inhibition Extrazelluläre Matrix E-Selektin, L-Selektin,
ICAM-1, Integrine, Mac- 1
Monozytenadhäsion an Endothelzellen
Inhibition
Kollagen α1,
Glycoprotein IIb
Thrombozytenadhäsion Inhibition
Wachstumsfaktoren CTGF Proliferation und Plaque- Stabilisierung
Induktion
inflammatorische Zytokine
TGF-β, Il-4, IL-1β Chemotaxis von Entzündungszellen
Inhibition
Zellzyklusregulation P27 Inhibition der Proliferation von glatten Muskelzellen der Gefäßwand
Induktion
cyclin d1, cyclin E Induktion der Proliferation von glatten Muskelzellen der Gefäßwand
Inhibition
Apoptose CD95L Apoptoseinduktion Inhibition
Bcl2-L1 Apoptoseinhibition Induktion
Transkription PPARγ Induktion der Transkription Induktion Metabolismus HMG-CoA-Reduktase Cholesterolsynthese Induktion
LDL-Rezeptor Aufnahme von LDL Induktion
α-TTP Regulation des Plasmaspiegels
von α-Tocopherol
Induktion
Tab 1 Effekte des α-Tocopherol auf die Genexpression von diversen Genen, die eine Rolle bei der Arterioskleroseentstehung spielen sollen. (Tabelle modifiziert nach: Munteanu, Zingg, Azzi. Anti-atherosclerotic effects of vitamin E – myth or reality? J Cell Mol Med 2004: 59-76
Auf welche Art und Weise Vitamin E die Genexpression moduliert ist bisher nicht geklärt. Es gibt verschiedene Theorien hierzu: a) Die Regulation der Genexpression könnte direkte Folge der Inhibition der Proteinkinase C oder des Transkriptionsfaktors ΝFκB (nuclear factor kappa B) sein. b) Der Effekt des Vitamin E auf die Genexpression wird über TAPs (tocopherol
associated proteins) vermittelt. Die TAPs wurden kürzlich entdeckt und sind für die intrazelluläre Verteilung des Vitamin E entscheidend. Es wird vermutet, dass diese TAPs das Vitamin E zu einem Kernrezeptor transportieren, oder durch Vitamin E aktiviert selbst als Transkriptionsfaktoren fungieren (2). c) Vitamin E beeinflusst die transkriptionelle Regulation über eine Veränderung des antioxidanten Zellstatus. Nachfolgende, Vitamin E unabhängige Reaktionen, die sich aus einem veränderten Redoxstatus der Zelle ergeben, sind für veränderte Genexpressionen verantwortlich.
Es sind sicherlich weiterführende Untersuchungen zur Klärung des Mechanismus nötig.
Zielsetzung und Versuchsdesign
Vom Vitamin E ist bekannt, dass es die Immunsuppression unter Cyclosporintherapie verbessert und so die Abstoßungsreaktion nach Herztransplantation verhindert (14). Ein vermindertes Auftreten der Transplantatvaskulopathie ist unter Behandlung mit Vitamin C und E ebenfalls kürzlich beschrieben worden (13). Durch seine antioxidanten Eigenschaften als Radikalfänger trägt das Vitamin E wesentlich zur Minimierung des Ischämie/Reperfusionsschadens bei (s.o.).
In meiner Promotionsarbeitarbeit habe ich den Einfluss des α-Tocopherol auf die Genexpression kardial exprimierter Gene während einer konkordanten Herztransplantation untersucht. Die Auswahl der Gene richtet sich nach folgenden Kriterien: Strukturproteine des Herzens, Transkriptionsfaktoren, Apoptosefaktoren, Stressmarker, Adhäsionsmoleküle und extrazelluläre Matrixproteine. (Liste der untersuchten Gene: Tabelle 1 Originalpublikation)
Gemeinsam mit der experimentellen Chirurgie (PD Dr. Bektas) wurden 24 Herztransplantationen an Ratten durchgeführt. Dabei wurde das Herz eines Spendertieres in den Bauchraum eines Empfängertieres transplantiert. Das Empfängertier lebte bis zum Zeitpunkt der Explantation der Herzen (Tag 3 oder Tag 14) mit zwei Herzen weiter. Wir unterteilten die Spender- und die Empfängertiere in vier verschiedene Gruppen und behandelten einige Gruppen mit Vitamin E vor der Transplantation des Herzens und einige zusätzlich noch nach der Transplantation. Das Vitamin E applizierten wir intramuskulär. Das Versuchsdesign wird im Material und Methoden-Teil detailliert beschrieben.
Folgende Fragen wurden gezielt untersucht:
1. Führt eine intramuskuläre Therapie mit α-Tocopherol zu signifikant höheren Plasmaspiegeln und Herzmuskelgewebsspiegeln?
2. Gibt es eine Korrelation zwischen dem Plasmaspiegel und dem Herzmuskelgewebsspiegel?
3. Hat die Behandlung mit Vitamin E vor einer Herztransplantation einen Effekt auf die Expression der von uns untersuchten Gene im Herzen? Wenn ja, ist dieser Effekt als kardioprotektiv anzusehen?
4. Hat die Behandlung mit Vitamin E nach einer Herztransplantation einen Effekt auf die Expression der von uns untersuchten Gene im Herzen? Wenn ja, ist dieser Effekt als kardioprotektiv anzusehen?
5. Welche Rolle spielt der Faktor Zeit für die Expression der von uns untersuchten Gene im Herzen nach Transplantation (Tag 3 vs. Tag14)?
6. Gibt es statistisch gesicherte Korrelationen zwischen Gewebsspiegeln im Herzen und der Regulation kardialer Gene?
Material und Methoden
Herztransplantation
Die Herztransplantationen wurden von PD Dr. Bektas in einem mikrochirurgischen Labor der Klinik für Allgemein-, Viszeral- und Transplantationschirurgie vorgenommen. Als optische Hilfsmittel dienen Lupenbrillen und Operationsmikroskope (siehe Originalpublikation für experimentelle Details). Männliche Lewis-Ratten dienen als Spender- und als Empfängertiere der durchgeführten Herztransplantation. Die Operation des Spendertiers wird unter intramuskulärer Fentanyl-Fluanison Anästhesie in einer Dosierung von 1 ml Hypnorm entsprechend 0,2 mg/kg Fentanyl und 10 mg/kg Fluanison durchgeführt.
Der Thorax des Spendertiers wird durch zwei senkrechte Inzisionen in der vorderen Axillarlinie und eine quere Inzision im Bereich des Zwerchfells weiträumig eröffnet. Nach breiter Eröffnung des Perikards werden Vena cava superior und inferior kurz vor Einmündung in den rechten Vorhof ligiert und distal der Ligatur durchtrennt. Aorta ascendens und Truncus pulmonalis werden jeweils quer durchtrennt. Die Lungenvenen werden am Eintritt in den linken Vorhof mit einer Massenligatur unterbunden und distal davon durchtrennt. Das Spenderherz wird entnommen und über Aorta ascendens und Truncus pulmonalis retrograd mit heparinisierter physiologischer Kochsalzlösung ausgespült. Das Herz wird bis zur Transplantation (ca. 30 min) in einer physiologischen Kochsalzlösung bei ca. 4 ° C aufbewahrt.
Die Operation des Empfängertiers erfolgt in Ketaminnarkose. Dosen von 80-120 mg/kg Körpergewicht werden je nach Wirkung wiederholt intraperitoneal appliziert. Mit einem Längsschnitt wird der Bauchraum des Empfängertiers eröffnet und die Aorta abdominalis und die Vena cava inferior werden dargestellt. Das Herz des Spendertiers wird nun in den Bauchraum des Empfängertiers transplantiert. Dabei wird die Aorta ascendens des transplantierten Herzens mit der Aorta abdominalis des Empfängertiers anastomosiert. Eine weitere Anastomose wird zwischen Truncus pulmonalis des Spenderherzens und Vena cava inferior des Empfängertiers gesetzt. Auf diese Weise kann der Koronarkreislauf des Spenderherzens wiederhergestellt werden, ohne dass das Herz am Empfängerkreislauf einen Einfluss hat. Nach erfolgreicher Anastomosierung wird der Bauchraum des Empfängertiers mit einer Naht verschlossen.
Der Erfolg der Operation wird jeden Tag anhand des Herzschlags des Spenderherzens durch Palpation des Bauchraums des Empfängertieres kontrolliert.
An Tag 3 oder Tag 14 nach erfolgreicher Transplantation werden die Empfängertiere erneut mit Ketamin narkotisiert und es werden das transplantierte Herz und das Herz des Empfängertiers entnommen und sofort bei –80°C für weitere Analysen schockgefroren.
Vitamin E-Behandlung
48 Ratten, je 24 Spender- und 24 Empfängertiere standen für die Untersuchungen zur Verfügung. Diese wurden in vier Gruppen unterteilt, je 6 Spender- und 6 Empfängertiere in einer Gruppe (siehe auch Abbildung 4). Die Tiere der Gruppe I wurden nicht mit Vitamin E behandelt, die Tiere der Gruppen II und III wurden mit Vitamin E bis zum Zeitpunkt der Transplantation mit insgesamt 6 Injektionen (je 30 mg dl-α-Tocopherolazetat intramuskulär pro Injektion) vorbehandelt, und die Tiere der Gruppe IV erhielten zusätzlich zur Vorbehandlung noch bis zu 6 Injektionen nach Transplantation. Die Vorbehandlung begann 14 Tage vor Transplantation (Transplantation zum Zeitpunkt 0), die Explantation der beiden Herzen erfolgt am Tag 3 oder am Tag14 nach Transplantation.
Abb. 4 Versuchsdesign (Erläuterungen siehe Text)
-14 -12 -9 -7 -4 -1 0 +1 +3 +5 +8 +10 +12 +14 days, vitamin E-treatment
group I n=6
group II n=6
group III n=6
group IV n=6
donor + Vit. E
donor and recipient + Vit. E
donor and recipient + Vit. E
without Vit. E
without Vit. E
without Vit. E
+ Vit. E without Vit. E
n=48
n=6
n=6
n=6
n=6
Gewinnung von Blutplasma
Zum Zeitpunkt der Transplantation bei den Spendertieren und zum Zeitpunkt der Explantation (Tag 3 oder Tag 14 nach Transplantation) bei den Empfängertieren wurde von uns heparinisiertes Blut aus der Pfortader gewonnen. Nach 10 minütiger Zentrifugation bei 5000rpm wurde das Plasma bei –20°C für weitere Analysen asserviert.
Bestimmung des Plasma- und Gewebsspiegels des Vitamin E
Plasma- und Gewebsspiegel des Vitamin E wurden mittels HPLC-Analytik in den Laboratorien der Firma Hoffmann-LaRoche bestimmt (siehe Originalpublikation für Details).
Genexpressionsstudien
Totale RNA wurde aus den transplantierten Herzen und den nativen Empfängerherzen mit einem Isolationskit nach einem Verfahren des Herstellers Macherey-Nagel gewonnen. Die Menge an RNA wurde photometrisch bestimmt und deren Integrität und Qualität mittels Agarosegelelektrophorese überprüft. Anschließend wurde die RNA durch reverse Transkription nach einem Protokoll der Firma Qiagen in cDNA umgeschrieben. Mit spezifischen Oligonukleotiden, die unter Zuhilfenahme eines Primerdesignprogrammes (Primer3, National Institutes of Health, USA) optimiert und mittels des Programmes BLAST 2.0 (National Center for Biotechnological Information, USA) verifiziert wurden, konnte in der semiquantitativen Genexpressionsanalyse die veränderte Genexpression im transplantierten Herzen nach Vitamin E-Behandlung untersucht werden.
Die Genexpressionsanalytik mittels PCR (polymerase chain reaction) erfolgte ausschließlich in der logarithmischen Amplifikationsphase („linearer Bereich“) und wurde für die quantitative Berechnung der Genexpressionsstärke durch das „Housekeeping-Gene“
Cyclophilin normalisiert. Die Amplifikationsprodukte wurden auf einem Agarosegel getrennt und durch Ethidiumbromid unter UV-Durchleuchtung sichtbar gemacht. Die weiteren Details einschließlich der Oligonukleotidsequenzen und der Genbank-Dateneinträge (Accession numbers) können der beigefügten Publikation entnommen werden.
Statistische Auswertung
Mit Hilfe eines SAS-Softwarepakets (Version 8.1) wurde eine Varianzanalyse durchgeführt.
Die Signifikanz wurde mit p<0,05 oder weniger festgelegt.
Ergebnisse
Nachfolgend werden die wesentlichen Ergebnisse der Promotionsarbeit zusammenfassend dargestellt.
Plasma- und Gewebsspiegel nach Vitamin E-Behandlung
Die Plasmaspiegel der mit Vitamin E behandelten Spendertiere wurden zum Zeitpunkt 0 der Transplantation gemessen. Alle behandelten Tiere hatten bis zu diesem Zeitpunkt 6 Injektion Vitamin E erhalten. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich die Plasmaspiegel der behandelten Tiere (Gruppe II-IV) gegenüber den unbehandelten (Gruppe I) von 5 mg/l auf 9 mg/l annähernd verdoppelt hatten.
Die Plasmaspiegel der Empfängertiere wurden zum Zeitpunkt 14 der Explantation der Herzen gemessen. Die Empfängertiere waren bis dahin nicht mit Vitamin E behandelt worden (Gruppe I), sie hatten 6 Injektionen bis zum Zeitpunkt 0 der Transplantation erhalten (Gruppe III), oder sie waren über den gesamten Zeitraum bis Tag 14 der Explantation mit insgesamt 12 Injektionen behandelt worden. Es zeigte sich erneut eine Verdopplung des Vitamin E- Plasmaspiegels der bis zum Tag 14 behandelten Tiere (Gruppe IV) gegenüber den unbehandelten Tieren (Gruppe I) von 4,5 mg/l auf knapp 9 mg/l. Die Tiere der Gruppe III (bis zur Transplantation behandelt, danach nicht mehr) wiesen einen Plasmaspiegel von 7,8 mg/l auf.
Es konnte also gezeigt werden, dass die Behandlung mit 6 Injektionen Vitamin E den Plasmaspiegel annähernd verdoppelt hat. Da ein weiterer Anstieg nach 12 Injektionen ausblieb, ist davon auszugehen das nach 6 Injektionen bereits ein steady-state erreicht war. Es konnte zudem gezeigt werden, dass nach Abbruch der Behandlung der Plasmaspiegel langsam wieder abfällt (Empfängertiere: Gruppe III vs. Gruppe IV), aber die Elimination des Vitamin E aus dem Körper der Tiere sehr langsam erfolgt, da auch 14 Tage nach Abbruch der Vitamin E-Behandlung noch nicht annähernd die Ausgangswerte wieder erreicht waren (Empfängertiere: Gruppe III vs. Gruppe I).
Die Vitamin E-Gewebsspiegel wurden im transplantierten Herzen und im Empfängerherzen jeweils am Zeitpunkt 14 der Explantation der Herzen gemessen. Die Gewebsspiegel wiesen einen ähnlichen dosisabhängigen Anstieg auf wie die Plasmaspiegel. Die Gewebsspiegel der Herzen der Gruppe IV-Tiere (Spender und Empfänger je mit 12 Injektionen behandelt) lagen annähernd doppelt so hoch wie die der unbehandelten Tiere der Gruppe I. Die Gewebsspiegel
der mit 6 Injektionen vorbehandelten Tiere (Gruppe III) lagen etwas unter denen der Gruppe IV.
Intramuskuläre Vitamin E-Applikation führt zu steigenden Plasma- und Gewebsspiegeln und kann so im Herzen Einfluss auf die Genexpression nehmen.
Genexpressionsanalyse
Eine Übersicht über alle in meiner Studie untersuchten Gene gibt Tabelle 1 der Originalpublikation. Wir untersuchten den Effekt der Vitamin E-Behandlung im Spender- und Empfängerherzen und fanden statistisch signifikante Korrelationen zwischen der Expression bestimmter Gene und dem Vitamin E-Gewebsspiegel im Herzen.
Wie Abbildung 3a der Originalpublikation zeigt, konnten wir für die transplantierten Herzen der Gruppen II und III eine statistisch signifikante Reduktion der Genxpression der Transkriptionsfaktoren c-fos, SP1 und MEF 2C nachweisen. Die Expression des Zelladhäsionsmoleküls PECAM1, des Strukturproteins Dystrophin und des antioxidanten Enzyms SOD1 nahm ebenfalls deutlich ab. Bei den nativen Herzen der Empfängertiere der Gruppe III konnten wir wie bei den Spenderherzen einen verminderten Transkriptionsgrad für MEF 2C, PECAM1 und SOD1 erkennen, zusätzlich waren noch die für den Transkriptionsfaktor H-ras, das Strukturprotein Troponin I und das Cytochrom P450 2J3 (CYP2J3) codierenden Gene reprimiert.
Abbildung 3b der Originalpublikation zeigt die statistisch signifikanten Änderungen der Expression bestimmter Gene für die Gruppe IV. Bei den Spenderherzen ist wiederum die Expression des MEF 2C nach kompletter Vitamin E-Behandlung reduziert, genauso wie die Expression der für die Zelladhäsionsmoleküle PECAM1 und ICAM1 codierenden Gene, die eine Rolle bei der Arterioskleroseentstehung spielen. Im Gegensatz dazu ist die Expression des proapoptotischen Gens Caspase 3 erhöht. Diese erhöhte Expression der Caspase 3 zeigt sich auch bei den Empfängerherzen der Gruppe IV. Interessant ist bei den Empfängerherzen auch die deutliche Reduktion der Expression des cardialen Stressmarkers ANP (atriales natriuretisches Peptid) nach Vitamin E-Behandlung. Ein inhibitorischer Effekt der Vitamin E-Behandlung zeigt sich auch für die Expression des Troponin I, des PECAM1, des Trankriptionsfaktors c-jun und des CYP2J3.
Wie Abbildung 3c der Originalpublikation zeigt, untersuchten wir den Faktor Zeit unabhängig von der Vitamin E-Substitutuion. Dieser Faktor sollte Erkenntnisse zum natürlichen Regenerationsprozess des Herzens bringen. Im Spenderherzen und im Empfängerherzen zeigte sich eine Hochregulierung der für die Strukturproteine α-MHC und α-cardiac actin
codierenden Gene am Tag 14 nach Transplantation. Die Expression des für das antioxidante Enzym SOD2 codierenden Gens war ebenfalls erhöht. Im Spenderherzen konnte zudem eine erhöhte Expression von α-skeletal actin und des antiapoptotischen Faktors bcl-2 14 Tage nach Transplantation nachgewiesen werden, während die Expression des Adhäsionsmoleküls VCAM1 reduziert war. Im Empfängerherzen zeigte sich eine verminderte Genexpression für das Strukturproteins β-MHC und eine vermehrte Expression der für Katalase und Bad codierenden Gene. Die Katalase spielt in der Zelle eine Rolle bei der Entgiftung freier Radikale und Bad ist ein Apoptosefaktor.
Einen Überblick über alle in der Genexpressionsanalyse nachgewiesenen statistisch signifikanten Effekt gibt Abbildung 4 der Originalpublikation. Abbildung 5 der Originalpublikation zeigt eine Korrelation zwischen den Gewebsspiegeln der Herzmuskelzellen und dem Transkriptionslevel ausgewählter Gene.
Diskussion
In der von mir durchgeführten Promotionsarbeit wurde der Einfluss der Vitamin E- Behandlung auf die Genexpression im transplantierten und im nativen Herzen des Empfängertiers untersucht. Im Gegensatz zu den meisten tierexperimentellen oder klinischen Studien konnte in meiner Promotionsarbeit gezeigt werden, dass intramuskulär appliziertes Vitamin E zu signifikant erhöhten Gewebsspiegeln im transplantierten und im nativen Herzen des Empfängertiers führt, die bei Weiterbehandlung auch dauerhaft erhöht bleiben. Es konnte eine Korrelation zwischen den Gewebsspiegeln und der Expression kardialer Gene aufgezeigt werden.
Genexpression einiger Strukturproteine des Herzens während der Transplantation
Es ist bekannt, dass die mRNA für die Strukturproteine α-MHC (myosin heavy chain), β- MHC, α-cardiac actin (c-actin) und α-skeletal actin (s-actin) in Stresssituationen des Herzens, wie z. B. in der Herzhypertrophie verstärkt exprimiert wird, wobei ein steigendes Verhältnis von β-MHC zu α-MHC und von s-actin zu c-actin als prognostisch ungünstig angesehen wird (15). In meinen Untersuchungen konnte im Zeitverlauf nach 14 Tagen nach Transplantation gegenüber 3 Tagen nach Transplantation eine erhöhte Genexpression von c-actin, s-actin und α-MHC im Spenderherzen gezeigt werden. Im nativen Herzen des Empfängertieres war die Genexpression von α-MHC und c-actin nach 14 Tagen ebenfalls erhöht. Dies spricht für eine deutliche Streßsituation im Herzen, welche so im Versuchsaufbau auch beabsichtigt war. Das deutlich gesunkene Verhältnis von β-MHC zu α-MHC und s-actin zu c-actin kann als Teil der beginnenden Regeneration des transplantierten Herzens nach einigen Tagen nach Transplantation angesehen werden. Ein Vitamin E-Behandlungseffekt auf die Expression der für diese Strukturproteine des Herzens codierenden Gene konnte nicht nachgewiesen werden.
Effekt der Vitamin E-Behandlung auf die antioxidanten Enzymsysteme der Zelle
Ein wichtiges Ergebnis meiner Promotionsarbeit ist der regulatorische Einfluss des Vitamin E auf die Genexpression der Cu/Zn-abhängigen, zytosolisch lokalisierten SOD1 und der Mn- abhängigen mitochondrialen SOD2. So zeigt sich für die transplantierten Herzen gegenüber Kontrollherzen ein Anstieg der SOD1 und 2, welcher für die SOD2 über die Zeit gesehen nach 14 Tagen im Spenderherzen aber auch im nativen Herzen des Empfängertieres stärker ist als nach 3 Tagen nach Transplantation. Wir führen diesen Effekt darauf zurück, dass das Herz während der Transplantation in starken oxidativen Stress gerät und versucht über eine erhöhte
mRNA-Expression der SOD dem entgegenzuwirken. Die Isoenzyme der SOD katalysieren beide die Reaktion vom Superoxid-Radikal zum H2O2 und vermindern so den oxidativen Stress der Zelle (3). Nach Vorbehandlung mit Vitamin E lässt sich eine signifikant verminderte Expression der SOD1 im Spenderherzen und im nativen Herzen des Empfängertieres zeigen. Vitamin E scheint den oxidativen Stress für das Herz zu vermindern, indem es der Entstehung von freien Sauerstoffradikalen entgegenwirkt, so dass das Herz nicht mit einer kompensatorischen Induktion der SOD-mRNA-Expression reagieren muss.
Allerdings kann dieser Effekt des Vitamin E auf die SOD-Genexpression nicht allein auf die antioxidanten Wirkungen des Vitamin E zurückgeführt werden, da die anderen antioxidanten Enzyme der Zelle, Katalase, Glutathionreduktase und Glutathionperoxidase unbeeinflusst durch die Vitamin E-Behandlung bleiben. Diese selektive SOD-Regulation findet möglicherweise auf einem bisher unbekannten Weg statt. Es ist zudem bekannt, dass Vitamin E eine Abnahme der Aktivität der vorhandenen SOD-Enzyme in Streßsituationen verhindert (16), so dass auch dies ein Grund für die verminderte Genexpression unter Vitamin E-Einfluss sein könnte, da bei erhöhter Aktivität der vorhandenen Enzyme die mRNA-Expression nicht gesteigert werden muss. Patienten, die eine verminderte SOD-Aktivität aufweisen, könnten von einer Vitamin E-Therapie profitieren (17).
Effekt der Vitamin E-Behandlung auf die Zelladhäsionsmoleküle
Ein weiterer interessanter Aspekt meiner Promotionsarbeit ist die verminderte Genexpression der Zelladhäsionsmoleküle ICAM1 und PECAM1 nach Vitamin E-Behandlung. Dieses Ergebnis stimmt gut mit publizierten Studien überein (18). Es wird vermutet, dass das Vitamin E, indem es die Genexpression dieser beiden Zelladhäsionsmoleküle senkt, die vermehrte Adhäsion von Leukozyten an Endothelzellen verhindert und somit antiinflammatorisch wirkt (19). Da diese beiden Zelladhäsionsmoleküle auch bei der koronaren Herzkrankheit oder in der Reperfusionsphase nach ischämischen Ereignissen vermehrt exprimiert werden (20-22), scheint das Vitamin E über eine Senkung ihrer Expression eine kardioprotektive Wirkung zu entfalten, die möglicherweise auch mit einer verminderten Arterioskleroseentstehung nach Bypass-OP oder Transplantation einhergeht und so das Überleben des Transplantats verlängert.
Vitamin E-Behandlung vermindert auch die Expression dieser beiden Zelladhäsionsmoleküle an der Oberfläche von Thrombozyten (23). Es ist bisher allerdings unklar, ob dieser Effekt allein zu einer Thrombozytenaggregationshemmung führen kann, oder ob die Hemmung der Thrombozytenaggregation durch Vitamin E doch eher über eine verminderte Entstehung
freier Radikale oder eine NO-Freisetzung geschieht (24, 25). Eine Hemmung der Cyclooxygenase 2 oder der Proteinkinase C durch das Vitamin E spielt möglicherweise auch eine Rolle (12). Die Proteinkinase C spielt eine wichtige Rolle bei zellulären Signalkaskaden, die zur Freisetzung von Zytokinen, Wachstumsfaktoren oder Hormonen führen. Das Vitamin E bewirkt die Inhibition der Proteinkinase C vermutlich über eine Aktivierung der Proteinphosphatase PP2A, was zu einer Dephospholierung und somit einer Aktivitätsabnahme der Proteinkinase C führt (2). Durch die Hemmung der Cyclooxygenase 2 und der Proteinkinase C wird die Entzündungsreaktion des Endothels und nachfolgend die Adhäsion der Thrombozyten vermindert.
Effekt der Vitamin E-Behandlung auf Transkriptionsfaktoren
In meiner Promotionsarbeit konnte ein Effekt des Vitamin E auf die Regulation der Genexpression einiger Transkriptionsfaktoren gezeigt werden. So wurden die Transkriptionsfaktoren MEF-2C, Sp1, c-fos, c-jun und H-ras im Spenderherzen oder im nativen Herzen des Empfängertieres oder in beiden vermindert exprimiert. Diese Repression der Transkriptionsfaktoren weist auf einen kardioprotektiven Effekt des Vitamin E hin, da bekannt ist, dass MEF2C außerhalb der Entwicklungsphase des Herzens nur im Rahmen von Herzerkrankungen vermehrt exprimiert wird (26). Die Genexpression von c-fos und c-jun ist beim Ischämie/Reperfusionsschaden nach cardiopulmonaler Bypass-OP erhöht (27), SP1 spielt bei hypertrophen Herzerkrankungen (28) eine Rolle und H-ras und c-fos werden bei dilatativer oder hypertropher Kardiomyopathie vermehrt exprimiert (29, 30). Durch die Verminderung der mRNA-Expression dieser Transkriptionsfaktoren beugt Vitamin E dem Entstehen kardialer Erkrankungen möglicherweise vor.
Zusammenfassung
Am Anfang meiner Promotionsarbeit standen 6 Fragen (siehe Abschnitt Zielsetzung und Modellauswahl), die im Laufe der Untersuchungen eindeutig beantwortet werden konnten.
Vitamin E-Substitution führt zu einem erhöhten Plasmaspiegel, und die Gewebsspiegel im Herzen korrelieren mit den Plasmaspiegeln. Vitamin E moduliert die Expression diverser Gene im Bereich Stress, O2-Entgiftung und Transkriptionsfaktoren. Die nachgewiesenen Effekte sprechen für eine kardioprotektive Rolle des Vitamin E im Rahmen einer Herztransplantation. Vitamin E scheint den kardialen Stress und den Reperfusionsschaden während einer Transplantation zu minimieren, was sich möglicherweise positiv auf die gefürchtete Transplantatvaskulopathie auswirkt. Durch meine Untersuchungen werden bisher
publizierte Studien teilweise bestätigt, aber auch ergänzt, indem ein relativ breites Wirkungsspektrum des Vitamin E auf die Expression kardialer Gene gezeigt wird.
Auf welche Weise das Vitamin E die Genexpression beeinflusst bleibt allerdings unklar. Zu den molekularen Wirkungen des Vitamin E sind auf der Ebene der Transkription sicherlich noch weitergehende Untersuchungen nötig, in denen zu klären sein wird, ob das Vitamin E selbst als Transkriptionsfaktor agiert, oder ob es andere Transkriptionsfaktoren aktiviert.
Aufgrund der diversen kardioprotektiven Effekte, die aus meiner Promotionsarbeit abgeleitet werden können, lässt sich eine neue Rolle des Vitamin E im Therapieregime nach einer Herztransplantation propagieren. Es scheint eine Überlegung wert zu sein, ob man generell bei Herzoperationen Vitamin E perioperativ zur Reduzierung des kardialen Stresses und für ein verbessertes kardiales Outcome geben sollte. Da für das Vitamin E keine wesentlichen Nebenwirkungen bekannt sind (31), sollten placebokontrollierte Doppelblindstudien am Menschen den Nutzen des Vitamin E im Rahmen von Herzoperationen verifizieren.
Zusammenfassung
Oxidativer Stress im Rahmen eines Ischämie/Reperfusionsschadens kann den Erfolg einer Herztransplantation gravierend beeinflussen. Die Fähigkeit des Vitamin E, Zellen vor den schädlichen Auswirkungen freier Radikale schützen zu können, führte zur Annahme einer kardioprotektiven Wirkung, die durch große klinische Studien bisher jedoch nur bedingt belegt werden konnte.
Wir untersuchten den Effekt einer Vitamin E-Behandlung auf die Expression kardialer Gene an einem Modell der konkordanten Herztransplantation bei Ratten. Die untersuchten Gene codieren für Transkriptionsfaktoren, Strukturproteine, antioxidante Enzyme, Zytokine, extrazelluläre Matrixproteine und Apoptosefaktoren der Herzmuskelzellen.
Die Behandlung der Spender- und Empfängertiere mit Vitamin E führte zu einem signifikanten Anstieg der Plasma- und Herzmuskelgewebsspiegel. Wir konnten eine statistisch signifikante Reduktion der Genexpression von Zelladhäsionsmolekülen, wie ICAM1 und PECAM1 sowie von Transkriptionsfaktoren, wie MEF2c und c-fos nachweisen, die bei der Entstehung von Arteriosklerose und anderen kardialen Erkrankungen eine wichtige Rolle spielen. Wir beobachteten eine Reduktion der Expression von Genen, die für antioxidante Enzyme, wie z.B. die SOD, codieren und von kardialen Stressmarkern, wie z.B.
dem ANP, nach Vitamin E-Behandlung. Wir korrelierten die Genexpressionsprofile mit den Herzmuskelgewebsspiegeln.
Unsere Untersuchungen weisen auf einen therapeutischen Effekt des Vitamin E bei Herztransplantationen hin und sollten durch weiterführende klinische Studien gestützt werden. Die unklaren molekularen Wirkmechanismen bedürfen ebenfalls weiterer Abklärung.
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Lebenslauf
Angaben zur Person
Name: Ingo Schulte
Anschrift: Am Clusberg 9 37574 Einbeck Tel.: 05561 971330 Geburtstag: 20.06.1977
Geburtsort: Einbeck Familienstand: ledig Nationalität: deutsch Konfession: evangelisch
Schulbildung
1983 – 1987 Grundschule Einbeck 1987 – 1989 Orientierungsstufe Einbeck 1989 – 1996 Gymnasium Einbeck
Abschluss: Abitur
Zivildienst
1996 – 1997 Lammetal-Werkstätten für Behinderte in Lamspringe
Beruflicher Werdegang
Studium
10/1997 – 10/1999 Studium der Humanmedizin an der Philipps-Universität in Marburg
10/1999 – 06/2004 Studium der Humanmedizin an der Med. Hochschule Hannover
Studienbegleitende Tätigkeiten
09/2000 Famulatur in der chir. Abteilung des Krankenhaus Einbeck 03/2001 Famulatur in der med. Abteilung des Krankenhaus Einbeck 08/2001 Famulatur in der Praxis für Augenheilkunde bei Dr. med.
Will-Friedbert Lohoff in Berlin
09/2001 Famulatur in der chir. Abteilung des Nenagh General Hospital in Nenagh/Irland
03/2002 Famulatur in der Praxis für Allgemeinmedizin bei Dr. med.
Karl Asmus in Sinntal-Sterbfritz
4/2003 – 8/2003 1. Tertial des Praktischen Jahres in der Chirurgischen Klinik des Krankenhaus Siloah in Hannover
08/2003 – 12/2003 2. Tertial des Praktischen Jahres in der Klinik für Anästhesie und Intensivmedizin des Vinzenzkrankenhaus in Hannover 12/2003 – 03/2004 3. Tertial des Praktischen Jahres in der Medizinischen Klinik des
Klinikum Salzgitter-Lebenstedt
Facharztweiterbildung
Seit 06/2004 Weiterbildung zum Facharzt für Anästhesie und Intensivmedizin im Albert-Schweitzer-Krankenhaus in Northeim
Promotion
Seit 2001 Promotion in der Abteilung für Pharmaforschung und Medizinische Biotechnologie (Leiter Prof. Dr. rer. nat. Jürgen Borlak) am Fraunhofer Institut für Toxikologie und Experimentelle Medizin in Hannover
Danksagung
Mein Dank gilt allen Mitarbeitern der Abteilung Pharmaforschung und Medizinische Biotechnologie des Fraunhofer Instituts für Toxikologie und Experimentelle Medizin, die mich mit Rat und Tat beim Entstehen dieser Dissertation unterstützt haben.
Insbesondere möchte ich Herrn Prof. Dr. Jürgen Borlak danken, der mir stets mit Rat und Tat zur Seite stand und ohne den diese Dissertation nicht möglich gewesen wäre.
Ich bedanke mich ebenfalls bei Herrn PD Dr. Hueseyin Bektas (Institut für Allgemein-, Viszeral- und Transplantationschirurgie), der die Herztransplantationen für mich durchgeführt hat.
Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nr. 5 und 6 PromO
Ich erkläre, dass ich die der Medizinischen Hochschule Hannover zur Promotion eingereichte Dissertation mit dem Titel Vitamin E in Heart Transplantation: Effects on Cardiac Gene Expression im Fraunhofer Institut für Toxikologie und Experimentelle Medizin, Abteilung Pharmaforschung und Medizinische Biotechnologie, unter Betreuung von Prof. Dr. rer. nat.
Jürgen Borlak und mit der Unterstützung von PD Dr. Husseyin Bektas, Klinik für Allgemein-, Viszeral- und Transplantationschirurgie der Medizinischen Hochschule Hannover, ohne sonstige Hilfe durchgeführt und bei der Abfassung der Dissertation keine anderen als die dort aufgeführten Hilfsmittel benutzt habe.
Ich habe diese Dissertation bisher an keiner in- oder ausländischen Hochschule zur Promotion eingereicht. Weiterhin versichere ich, dass ich den beantragten Titel bisher noch nicht erworben habe.
Ergebnisse der Dissertation wurden in folgendem Publikationsorgan veröffentlicht:
Transplantation, Volume 81, Number 5, March 15, 2006
Einbeck, den
