Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchungen zur sicheren Identifikation und zur Pathogenität garnelen- und humanpathogener Vibrio spp. in Aquakultur-Rezirkulationssystemen
zur Garnelenproduktion
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Julia Marlene Bauer
geb. Meder aus Fürth
Hannover 2020
Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. Dieter Steinhagen
Fachgebiet Fischkrankheiten und Fischhaltung Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Dr. Verena Jung-Schroers
Fachgebiet Fischkrankheiten und Fischhaltung Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. Dieter Steinhagen
Fachgebiet Fischkrankheiten und Fischhaltung, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover 2. Gutachter: Apl. Prof. Dr. Martin Runge
Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, Hannover
Tag der mündlichen Prüfung: 10. Juni 2020
Teile dieser Studie wurden von der Deutschen Bundesstiftung Umwelt – DBU, Osnabrück gefördert [AZ 30575-23].
Für Jonas
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 1
2 Literaturübersicht ... 2
2.1 Die Rolle von Vibrionen im Ökosystem ... 2
2.2 Die Bedeutung von Vibrionen in der Aquakultur von L. vannamei ... 5
2.3 Vibrio – Taxonomie und Biologie ... 7
2.4 Identifizierung von Vibrionen ... 13
2.5 Pathogenität von Vibrionen ... 18
2.6 Litopenaeus vannamei (Boone 1931) ... 21
3 Publikation 1... 23
4 Supplement zu Publikation 1 ... 72
5 Publikation 2... 75
6 Übergreifende Diskussion ... 111
7 Zusammenfassung ... 119
8 Summary ... 121
9 Literaturverzeichnis ... 123
10 Publikationsliste ... 133
Danksagung ... 137
Abkürzungsverzeichnis
% Prozent
‰ Promille
°C Grad Celsius
≤ kleiner gleich
µL Mikroliter
βHae β-Hämolyse
Abb. Abbildung
ADH Arginindihydrolase
AES Äsculin
AMY Amylase
ARA Arabinose
bp Basenpaare (base pairs)
bzw. beziehungsweise
ca. circa
cfu colony forming units
CIT citrate
cm Zentimeter
CSB Columbia Sheep Blood Agar DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTPs Desoxyribonukleosidtriphosphate et al. et allii (und andere)
EZBioCloud Datenbank mit 16S rRNA Sequenzen
fla Flagellin
g Gramm
GEL Gelatine
GLU Glukose
H2S Hydrogensulphid
IND Indol
INO Inositol
KbE Koloniebildende Einheiten
l Liter
L. Litopenaeus
LAC Lactose
LDC Lysindecarboxylase
MALDI-TOF MS matrixunterstützte Laser-Desorptions-Ionisation mit
Flugzeitmassenspektrometer- Detektion; Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry
MALT Maltose
MAN Mannitol
MANO Mannose
McC McConkey Agar
MEL Melobiose
ml Milliliter
mM Millimolar
MOB/mot Motilität
MR Methylrot
N2 Stickstoff
NCBI National Center for Biotechnology Information: Datenbank mit Sequenzen verschiedener Genloci
nm Nanometer
NO2 Nitrit
nm Nanometer
ODC Ornithindecarboxylase
OF-O/OF-F Oxidations-Fermentations-Test
ONPG o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid-Test
OX Oxidase
PCR Polymerasekettenrekation (polymerase chain reaction) PyrH Genlokus, der für die Uridylat Kinase kodiert
RAS Recirculating Aquaculture System; Rezirkulationsanlage
RHA Rhamnose
RNA Ribonukleinsäure
rRNA ribosomale Ribonukleinsäure
rpoD Genlokus von Bakterien, kann zur Identifizierung genutzt werden
SAC Saccharose
SAL Salicin
sog. sogenannte
SOR Sorbitol
Std. Stunde
SW schwärmendes Wachstum
T6SS1 Type VI Secretion System 1 T6SS2 Type VI Secretion System 2
Tab. Tabelle
TBE Tris-Boracic Acid-EDTA
TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar
TDA Tryptophan-Desaminase
TDH thermostable direct haemolysin toxS Pathogenitätsfaktor von V. cholerae toxR Pathogenitätsfaktor von V. cholerae
TRE Trehalose
TRH thermostable direct haemolysin (TDH)-related haemolysin
URE Urease
V. Vibrio
VP Vogas–Proskauer
VPI Vibrio cholerae Pathogenitäts Insel
XYL Xylose
Tabellenverzeichnis
Publikation 1
Tabelle 1 ... 30
Tabelle 2 ... 53
Tabelle 3 ... 57
Publikation 2
Tabelle 1 ... 81Tabelle 2 ... 83
Tabelle 3 ... 85
Tabelle 4 ... 90
Tabelle 5 ... 92
Tabelle 6 ... 94
Tabelle 7 ... 95
Abbildungsverzeichnis
Literaturübersicht
Abbildung 1 ... 4
Publikation 1
Abbildung 1 ... 35Abbildung 2 ... 37
Abbildung 3 ... 39
Abbildung 4 ... 41
Abbildung 5 ... 42
Supplement zu Publikation 1
Abbildung 1 ... 73Abbildung 2 ... 74
Supplemente
Publikation 1
Supplement 1 ... 61 Supplement 2 ... 64
Publikation 2
Supplement 1 ... 105 Supplement 2 ... 109 Supplement 3 ... 110
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1 Einleitung
Vibrionen spielen eine große Rolle im Mikrobiom von marinen Ökosystemen einschließlich Aquakulturen. Diese Bakterien sind Teil der Normalflora von Riesengarnelen, einzelne Spezies aber auch als Pathogen für diese Tiere und für den Menschen von großer Bedeutung. Das Ziel dieser Arbeit ist die Isolierung von Vibrionen aus verschiedenen Aquakultur-Kreislaufanlagen in denen Riesengarnelen der Art Litopenaeus vannamei produziert werden, mit dem Hauptziel eine geeignete Methode zur Identifizierung der Spezies zu finden (Publikation 1). Weiterhin soll eine Einschätzung der Pathogenität einzelner Isolate anhand spezifischer Pathogenitätsfaktoren vorgenommen werden, um hierdurch die Gefahr für schwerwiegende Infektionen abschätzen zu können (Publikation 2). Hierbei sollen die Ergebnisse dieser Studie und verschiedene Grunddaten zu den Themenbereiche Bakterien der Gattung Vibrio, die Riesengarnele L. vannamei, das Haltungssystem, das Mikrobiom im Haltungssystem, die Identifizierung und die Pathogenität der Bakterienisolate in einen großen Zusammenhang gestellt werden.
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2 Literaturübersicht
2.1 Die Rolle von Vibrionen im Ökosystem
Vibrionen spielen im Nährstoffkreislauf ihres Lebensraumes eine große Rolle. Als heterotrophe Organismen sind sie auf Stoffwechselprodukte (organische Substanzen) von Tieren und Lebewesen angewiesen. Sie bilden bei stabilen Temperaturbedingungen (v.a. tropische und subtropische Gebiete) stabile, große Populationen v.a. in Küstennähe. Aber auch in Tiefseegewässern sind Vibrio- Populationen mit einem Anteil von bis zu 40 % an der dortigen mikrobiellen Gemeinschaft vertreten (Urakawa and Rivera, 2006). Aus Sedimenten können Vibrionen leicht isoliert werden, diese können als Reservoir für Vibrionen dienen (Vezzulli et al., 2009).
In Regionen mit niedrigen Temperaturen bzw. in der Winterzeit kommt es zu einer Art Ruhestadium, in dem Vibrionen lebensfähig, aber meist nicht kultivierbar sind. In einer Studie konnten die untersuchten Vibrio-Isolate bei Temperaturen unter 10°C nicht mehr kultiviert werden (Austin et al., 1979) und in Laboruntersuchungen waren die meisten Isolate bei Temperaturen unter 4°C nicht kultivierbar (Buller, 2014). Hier stehen saisonale Unterschiede in den Populationen von Vibrio sp. im Vordergrund (Oliver et al., 1982, Austin et al., 1979), aber es können auch andere Faktoren im Zusammenhang mit der Ausbildung einer stabilen Vibrio-Population vermutet werden.
Vibrionen können eng mit marinem Zooplankton assoziiert sein (Kaneko and Colwell, 1975, Simidu et al., 1971, Sochard et al., 1979). So konnte im Inneren von Zooplanktern eine Anreicherung von Vibrionen bis 109 Zellen/g Plankton nachgewiesen werden, wohingegen im umgebenden Wasser lediglich bis 102 Zellen/ml gefunden werden konnte (Kaneko and Colwell, 1973). In eutrophierten Gewässern mit hoher organischer Belastung und starker Vermehrung von Phytoplankton kam es in diesen Regionen zu einer Verringerung der Vibrio- Populationen, wahrscheinlich durch Verdrängung von Zooplankton und durch besser angepasste Bakterienpopulationen wie z.B. Acinetobacter sp. und Moraxella sp..
Somit kann die Reduktion der Vibrio-Population auch einen Indikator für eine
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Verschlechterung des jeweiligen Ökosystems darstellen (Urakawa and Rivera, 2006, Simidu et al., 1971, Simidu et al., 1977). Jedoch zeigen andere Untersuchungen, dass der Anteil an Vibrionen an der gesamten mikrobiellen Gemeinschaft bei zunehmendem Nährstoffangebot auch ansteigen kann. Diese Zusammenhänge können anhand eines Dreiecksverhältnisses von Ruderal-, Stresstoleranz- und Konkurrenzstrategen beschrieben werden (Abb.1). Hierbei nimmt jede Bakterienpopulation Ihren Platz im Ökosystem ein und es entsteht eine Art Gleichgewicht, das zwar Schwankungen durch z.B. Temperatur, Nährstoffe, Tierbesatz und Lichtphase unterliegt, die jedoch in laufenden Systemen relativ gering sind. Nitrit-oxidierende Bakterien (NOB), wie Nitrospira sp. oder Nitrosomonas sp., die im Filter von Aquakulturanlagen erwünscht sind, müssen eher in der Gruppe der K- Strategen eingeordnet werden (Rurangwa and Verdegem, 2015), da sie ein sehr konstantes Nährstoffangebot, konstante Lebensbedingungen benötigen und sich nur langsam an veränderte Bedingungen anpassen. Sie vermehren sich langsam und breiten sich so weit aus, wie die idealen Bedingungen es zulassen. Bei Störungen der Bedingungen können sie schlecht überleben und regenerieren nur sehr langsam. Bakterien der S- Strategen sind einige Bakterienarten, die sehr spezielle Nischen einnehmen, sie sind sehr stresstolerant, vermehren sich nur langsam und breiten sich kaum aus. Jedoch übernehmen sie in jedem Ökosystem sehr spezielle Aufgaben, wie z.B. Bakterien, die Nitrit und Ammonium zu Stickstoffgas verstoffwechseln (AOB - Ammonium-oxidierende Bakterien) und somit Stickstoff aus Haltungssystemen entfernen können (Rajkumar et al., 2017, Ho et al., 2017). Im Gegensatz zu Ammonium-oxidierenden Bakterien (AOB) und Nitrit-oxidierenden Bakterien (NOB) mit einer Generationszeit von 16 bis 189 Stunden bzw. 18 bis 69 Stunden sind heterotrophe Bakterien mit Generationszeiten von durchschnittlich nur 2,7 Stunden klar im Vorteil und können schnell die wichtigen Bakterien in den oberflächlichen Biofilmanteilen ersetzten und somit die Nitrifikationsleistung des Biofilters beeinträchtigen (Rurangwa and Verdegem, 2015, Hansen and Olafsen, 1999). Vibrionen nehmen hier einen Platz unter den R- Strategen ein. Bei Veränderungen des Ökosystems sind R- Strategen im Vorteil, da sie sich schnell vermehren, sich schnell ausbreiten und sich von allem, was vorhanden ist, ernähren können.
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Normalerweise kommen Vibrionen in diesen Systemen vor ohne Erkrankungen auszulösen. Eine Verschiebung hin zu den R- Strategen durch Zerstörung von Biomasse oder ein starker Eintrag von Nährstoffen im Haltungssystem kann zu einer massenhaften Vermehrung der schnellwachsenden R-Strategen führen (Ho et al., 2017). Hierbei kann es dann im Folgenden zur bakteriellen Infektion bei Garnelen kommen. Erkrankungen von Riesengarnelen in Kreislaufanlagen werden oft von Bakterien der Gattung Vibrio ausgelöst und verlaufen in der Regel schwer mit hohen Verlusten (Jayasree et al., 2006, Kumar et al., 2014, Liu et al., 2004, Soto-Rodriguez et al., 2010).
Abb.1: Schematische Darstellung einer Dreiecksklassifikation der KRS-Strategie in vereinfachter Form; Originaldarstellung siehe (Ho et al., 2017)
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2.2 Die Bedeutung von Vibrionen in der Aquakultur von L. vannamei
Da Vibrionen ubiquitär in Brack- und Meerwasser vorkommen, sind sie auch in der Aquakultur von L. vannamei von Bedeutung. Hierbei muss zwischen extensiver und intensiver Aquakultur unterschieden werden. Weltweit werden die meisten Riesengarnelen in extensiver Aquakultur produziert und hier vor allem in Klimazonen, die eine Kultivierung im Freien ermöglicht (Südamerika, Asien). Bei der extensiven Produktion wird vor allem Wasser aus natürlichen Gewässern verwendet, das durch oft künstlich in Küstennähe angelegte Becken geleitet wird. Manchmal werden auch Teile von natürlich bestehenden Gewässern (Lagunen, Mangroven) eingezäunt, um die juvenilen Tiere darin großzuziehen.
Die intensive Produktion findet meist in Gebäuden in Kreislaufanlagen mit künstlich angesetztem Meerwasser, allerdings oft mit reduzierter Salinität (Brackwasser) statt.
In diesen Aquakulturen ist die Außentemperatur weniger entscheidend, da die Wassertemperatur des Haltungswassers z.B. durch Abwärme von Biogasanlagen konstant in einem für das Wachstum der Garnelen optimalen Bereich gehalten werden kann. Somit können Riesengarnelen auch in nordeuropäischen Ländern in Kreislaufanlagen produziert werden.
In beiden Aquakulturformen bilden Vibrionen einen großen Anteil an der Bakterienpopulation im Wasser und den Biofilmen des jeweiligen Haltungssystems und üben hier ihre Rolle als R-Strategen im Ökosystem Kreislaufanlage aus. Speziell in geschlossenen Kreislaufanlagen kann die Gesamtkeimzahl schnell in für Garnelen gefährliche Bereiche ansteigen, da in diesen Systemen normalerweise eine hohe Besatzdichte, hohe Fütterungsraten, sowie ein nur geringer Wasseraustausch angestrebt werden, um möglichst effizient zu wirtschaften. Insbesondere die hohe Verfügbarkeit von organischer Substanz aus nicht aufgenommenem Futter und aus den Faeces der Tiere kann eine starke Vermehrung von Bakterien im Haltungswasser bedingen. In diesen Anlagen ist es essentiell wichtig, die Mikroflora im Haltungssystem (Filterbakterien, Bakterien im Wasser aber auch in Biofilmen angesiedelte Bakterien) so stabil wie möglich und so divers wie möglich zu erhalten, da gerade die Diversität
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von Bakterien einen großen Einfluss auf die Stabilität des Systems und somit auf die Qualität des Wassers hat (Schreier et al., 2010, Leonard et al., 2000, Ho et al., 2017).
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2.3 Vibrio – Taxonomie und Biologie
Vibrionen sind in Meer-, sowie Süß- und Brackwasser ubiquitär vorkommende gramnegative, fakultativ anaerobe, gekrümmte, stäbchenförmige Bakterien (Buller, 2014), die mit mindestens einer polaren Geißel ausgestattet sind (Thompson et al., 2006).
Das Genus Vibrio gehört zusammen mit sieben anderen Genera (Allomonas, Catenococcus, Enterovibrio, Grimontia, Listonella, Photobacterium, Salinivibrio) (Thompson et al., 2006) zur Familie der Vibrionaceae in der Klasse der Gammaproteobakterien (Gopal et al., 2005). Die bisher 106 Spezies im Genus Vibrio können in sog. Kladen eingeordnet werden (Buller, 2014). Dies sind Gruppierungen von sehr eng miteinander verwandten Vibrio spp., die oftmals den gleichen Lebensraum besiedeln, so dass diese große Ähnlichkeit als Anpassung an eine ökologische Nische interpretiert werden kann (Thompson et al., 2005). Gegenwärtig sind 17 Kladen innerhalb des Genus Vibrio beschrieben, wie z.B. die Harveyi- Klade mit neun sehr eng verwandten Vibrio sp., die 86,7 – 96,0 % Übereinstimmung in einer 8-Gen-Multilocus-Sequenz-Analyse zeigten (Sawabe et al., 2013).
Vibrionen können vor allem im Brack-, See- sowie Tiefseewasser einen großen Teil der Normalflora ausmachen. Hier kann ihr Anteil an der gesamten bakteriellen Mikroflora bis zu 40 % betragen. Sie gehören zur intestinalen und dermalen Normalflora von verschiedenen marinen Organismen. Bei der weißbeinigen Garnele (Litopenaeus vannamei) konnten Vibrionen aus dem Verdauungstrakt, aber auch aus dem Hepatopankreas und aus der Hämolymphe von gesunden Tieren isoliert werden.
Hierbei ist eine symbiotische Beziehung zwischen Wirt und Bakterium von Bedeutung (Urakawa and Rivera, 2006). Es gibt aber auch pathogene Spezies der Gattung Vibrio, die bei Tier und Mensch zu Erkrankungen führen können. Infektionen beim Menschen entstehen entweder durch Wasserkontakt oder über kontaminierte Lebensmittel (Buller, 2014).
Vibrionen kommen aufgrund ihrer Zugehörigkeit zur Normalflora der Haut und des Verdauungstraktes von L. vannamei auch in Aquakultur-Kreislaufanlagen (recirculating aquaculture system - RAS) vor und haben hier grundsätzlich, als ubiquitär vorkommende Bakterien, die nützliche Aufgabe der Beseitigung von
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überschüssigen Nährstoffen bzw. zerfallender Biomasse (Ruderalstrategen) (Ho et al., 2017). Spätestens mit dem Tierbesatz werden Vibrionen in RAS eingebracht (Vandenberghe et al., 1999). Da in diesen Anlagen das biologische Gleichgewicht durch einen hohen Nährstoffgehalt und hohe Besatzdichten viel instabiler ist als in der Natur, können sie sich unter Umständen leicht massenhaft vermehren, sodass selbst nicht pathogene Spezies dann zu Infektionen führen können (Moriarty, 1997). Solche Infektionen können schnell zu Totalausfällen führen. Folgende Vibrionen sind in RAS von Bedeutung:
Die Harveyi-Klade
Viele für Riesengarnelen pathogene Vibrio-Spezies sind innerhalb der Harveyi-Klade eingeordnet. Zur dieser Klade gehören Vibrio alginolyticus, V. azureus, V. campbellii, V. communis, V. harveyi, V. mytili, V. natriegens, V. parahaemolyticus und V.
rotiferianus (Sawabe et al., 2013).
V. alginolyticus ist seit 1968 als eigenständige Spezies im Genus Vibrio anerkannt (Sakazaki, 1968) und nah mit V. parahaemolyticus verwandt. Es gibt sowohl Beschreibungen von Infektionen beim Menschen, als auch Infektionen von marinen Lebewesen. Bei Menschen reichen die Symptome von Wundinfektionen über Ohr- und Augeninfektionen bis hin zu sehr selten vorkommenden gastrointestinalen Infektionen und Sepsis (Schmidt et al., 1979, Blake et al., 1980, Uh et al., 2001, Lessner et al., 1985, Oksuz and Gurler, 2013). Meist sind Infektionen mit V. alginolyticus nicht lebensbedrohend (Blake et al., 1980). Infektionen sind sowohl bei Säugetieren (Delfine) (Schroeder et al., 1985), Muschellarven (Tubiash et al., 1970), Krabben (Lee et al., 1996) und Garnelen (Liu et al., 2004, Wang and Chen, 2005), aber auch bei anderen marinen Lebewesen beschrieben. Bei L. vannamei sind Infektionen mit hohen Verlustgeschehen v.a. in der extensiven Garnelenproduktion beschrieben (Jayasree et al., 2006). Jedoch kommt diese Spezies auch in der intensiven Produktion in RAS vor (Publikation 1: Bauer et al., 2018), sodass sie auch dort als Ursache für bakterielle Infektionen in Frage kommt. V. alginolyticus gilt als weltweit ubiquitär vorkommende Vibrio Spezies (Buller, 2014) und auch in RAS kommt diese Spezies als saprophytär lebendes Bakterium ubiquitär vor (Farmer and Hickman-Brenner, 2006).
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Vibrio parahaemolyticus wurde erstmals 1950 als Pasteurella parahaemolytica, von Patienten mit Lebensmittelvergiftung (durch gekochte und halb getrocknete Sardinen) in Osaka, Japan isoliert. Die Patienten zeigten Übelkeit und blutige Gastroenteritis.
272 Patienten verstarben bei diesem Krankheitsausbruch. Pasteurella parahaemolytica wurde dann 1963 in das Genus Vibrio als V. parahaemolyticus eingeordnet (Buller, 2014, Iida et al., 2006, Thompson et al., 2006). Grundsätzlich ist V. parahaemolyticus wegen der starken Humanpathogenität einzelner Isolate bekannt und erforscht, es ist jedoch auch als Krankheitserreger bei verschiedenen Tierarten beschrieben. Bei der Blaukrabbe (Callinectes sapidus) wurde dieses Bakterium bei offensichtlich gesunden Tieren nachgewiesen. Bei Krebstieren (z.B. Litopenaeus vannamei, Penaeus monodon), Seeohren (Halotis diversicolor) einigen Fischarten und dem südlichen Flussotter (Lontra provocax) ist es jedoch als pathogen beschrieben.
Eine Infektion kann zu hohen Mortalitäten, v.a. bei Larvenstadien von P. monodon (Buller, 2014), oder bei Seeohren zum sog. „Withering-syndrome“ mit vermindertem Wachstum und hohen Mortalitäten führen (Huang et al., 2001). Bei L. vannamei sind Nekrosen des Hepatopankreas mit erhöhten Mortalitäten (Soto-Rodriguez et al., 2015), aber auch Massenverluste durch nicht primär als pathogen eingestufte Isolate (opportunistische Pathogene) beschrieben (Kumar et al., 2014).
Vibrio harveyi wurde aufgrund des Erstnachweise bei einem Hai früher V. carchariae genannt (Grimes et al., 1984) und es ist ein für viele marine Lebewesen potentiell pathogenes Bakterium. Es kommt, wie auch V. alginolyticus, ubiquitär im marinen Ökosystem vor. V. harveyi ist bei einer Vielzahl von Tieren, die im Seewasser leben als Ursache von Infektionen beschrieben (Nishibuchi, 2006). Bei Krebstieren kommen Infektionen häufig vor. Durch eine Infektion mit V. harveyi können v.a. initial sog. „black spots“, stark melanisierte Stellen des Exoskeletts, auftreten, z.B. bei L. vannamei oder Penaeus japonicus. Bei L. vannamei tritt auch das „bright red syndrome“ als eine symptomatische Ausprägung einer Infektion mit diesem Erreger häufig auf. Hier steht eine, meist fleckige Rotfärbung der abdominalen Kutikula im Vordergrund. Bei anderen Arten, wie Penaeus monodon oder L. schmitti sind eine Beteiligung des Hepatopankreas und hämorrhagische Septikämien beschrieben. Bei der chinesischen weißen Garnele (Fenneropenaeus chinesis) und Schwimmkrabben (Portunus
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tuberculatus) sind Massenverluste bzw. Entwicklungsstörungen der Zoealarven beschrieben. V. harveyi- Infektionen sind auch bei vielen Fischarten beschrieben.
Hierbei steht oftmals eine Augensymptomatik, mit Exophthalmus, Trübung und Hämorrhagien, aber auch systemische Infektionen mit hohen Mortalitäten im Vordergrund (Buller, 2014). Systemische Infektionen mit V. harveyi führen bei vielen marine Lebewesen oft zu hohen Mortalitäten (Nishibuchi, 2006, Thompson et al., 2006).
Vibrio campbellii wurde erstmals aus Meerwasser vor der Küste Hawaiis isoliert und Benecka campbellii benannt (Baumann et al., 1971). Später wurde es dann in Vibrio campbellii umbenannt (Baumann et al., 1980). Aufgrund von Nachweisen in der Hämolymphe von gesunden Seespinnen (Maja brachydactyla) und in Umweltproben galt V. campbellii lange als nicht pathogen. Jedoch ist mittlerweile eine Pathogenität für Garnelen, Riesengarnelen (L. vannamei, P. monodon), Hummer (Panulirus ornatus) und Barramundi (Lates calcarifer) nachgewiesen (Cano-Gomez et al., 2011, Buller, 2014).
Vibrio rotiferianus wurde erstmals aus einer Rädertierchen-Kultur (Brachionus plicatus) in Gent, Belgien isoliert (Gomez-Gil et al., 2003). V. rotiferianus scheint zur Normalflora bei einigen aquatischen Lebewesen zu gehören und wurde z.B. in der Hämolymphe von gesunden Seespinnen (Maja brachydactyla) nachgewiesen. Auch in Aquakultursystemen konnte dieses Bakterium bereits nachgewiesen werden. Die Pathogenität ist noch nicht genau erforscht. Es wurde bei erkrankten Tieren nachgewiesen, allerdings zusammen mit einer Vielzahl anderer Vibrio spp. In Infektionsversuchen zeigten sich hohe Mortalitäten bei Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss) nach intramuskulärer Applikation und bei Artemia (Artemia nauplii) nach Badinfektion (Buller, 2014, Austin et al., 2005).
11 Weitere Spezies anderer Kladen
Vibrio tubiashii wurde erstmals in Japan von erkrankten Muschel- und Austernlarven isoliert. Diese Bakterien verursachen Nekrosen, aber auch systemische Infektionen (Vibriosen) bei juvenilen Weichtieren oder deren Larven. Infizierte Larven zeigen u.a.
abnormes Schwimmverhalten und Nekrosen (Thompson et al., 2006). In Infektionsversuchen konnten bei Regenbogenforellen nach intramuskulärer Injektion, Mortalitäten von bis zu 100 % beobachtet werden, je nachdem welche Infektionsdosis eingesetzt wurde. Auch bei Artemia nauplii ist V. tubiashii als pathogen beschrieben (Buller, 2014, Austin et al., 2005). V. tubiashii konnte in Haltungsanlagen für weißbeinige Riesengarnelen (L. vannamei) (Rebouças et al., 2011, Bauer et al., 2018), und aus der Hämolymphe von gesunden Seespinnen (Maja brachydactyla) isoliert werden (Gomez‐Gil et al., 2010). V. tubashii kann der Orientalis Klade zugeordnet werden und ist unter anderem eng verwandt mit V. orientalis, V. brasiliensis und V.
hepatarius (Sawabe et al., 2013).
Weitere Vibrio Spezies, wie V. xuii oder V. pelagius, werden oft aus Haltungssystemen oder von Tieren isoliert, jedoch seltener im Zusammenhang mit deutlichen Krankheitsanzeichen. V. pelagius wurde erstmals aus Seewasser von der Küste Hawaiis isoliert, ursprünglich Beneckea pelagia benannt (Baumann et al., 1971a) und ist nachweislich pathogen für Steinbutte (Thompson et al., 2006). V. xuii wurde erstmals aus einer Garnelen Aquakultur in China isoliert und ist bisher nicht als pathogen beschrieben (Thompson et al., 2003).
12 Humanpathogene Vibrionen
Einige Vibrio spp. sind als humanpathogen beschrieben. Hierzu gehören u.a. V.
cholerae, V. fluvialis, V. vulnificus und V. parahaemolyticus. Vibrio cholerae, V. fluvialis und V. parahaemolyticus sind als Verursacher von Gastroenteritiden, mit starken, oft blutigen Durchfällen und Erbrechen bekannt (Allton et al., 2006, Bellet et al., 1989, Ramamurthy et al., 2014). In schweren Verläufen kann eine Infektion zur Sepsis und zum Tode führen. V. vulnificus wird als „fleischfressendes Bakterium“, aufgrund seines bereits häufigen Nachweises bei Wundinfektionen (nekrotisierende Fasziitis und Zellulitis) beschrieben. Eine Infektion kann jedoch auch zur Septikämie mit schweren Verläufen führen (Inoue, 2006, Oliver, 2005, Oliver, 2013). Häufige Ursache für eine Infektion ist der Kontakt mit kontaminiertem Wasser, wie das Baden in kontaminierten Gewässern oder das Arbeiten in Aquakultur-Anlagen ohne Hautschutzmaßnahmen.
Besonders gefährdet sind hierbei Menschen mit bestehenden Hautverletzungen.
Gerade immunsupprimierte Menschen (Kinder, ältere Menschen, schwangere Frauen, Menschen mit Krankheiten, die das Immunsystem schwächen) sind für Infektionen grundsätzlich besonders anfällig. Somit können die meisten Wundinfektionen durch Vibrionen als Sekundärinfektion nach Verletzung bzw. durch Vorerkrankungen begünstigt eingestuft werden.
Auch durch V. cholerae, V. fluvialis und V. parahaemolyticus und anderen Vibrio spp.
sind Wundinfektionen beschrieben (Andersson and Ekdahl, 2006, Johnson et al., 1984, Varghese et al., 1996, Blake et al., 1980).
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2.4 Identifizierung von Vibrionen
Grundsätzlich stellt sich die Frage ob eine Speziesidentifizierung von ubiquitär vorkommenden Bakterien sinnvoll ist. Viele Erkrankungen bei Fischen und anderen in Aquakultur produzierten Tieren, wie L. vannamei werden von ubiquitär vorkommenden, fakultativ pathogenen Bakterien ausgelöst. Somit ist es hier nicht ausreichend nur obligat pathogene Bakterienspezies identifizieren zu können. Gerade deshalb ist es wichtig eine gute Identifizierungsmöglichkeit auch für Bakterien der Normalflora zu finden, um primär die Gefahr für die Tiere einschätzen zu können.
Hierbei muss jedoch bedacht werden, dass ein Nachweis einer potentiell pathogenen Vibrio sp. nicht bedeutet, dass Tiere zwangsweise erkranken müssen. Trotzdem kann eine sichere Identifizierung im Krankheitsfall helfen die Ursache schnell einzugrenzen bzw. präventiv helfen das System zu stabilisieren. Eine Identifizierung von Bakterien kann durch mehrere Möglichkeiten erfolgen.
Phänotypische Identifizierung
Die phänotypische Identifizierung von Bakterien umfasst ein großes Feld an Methoden die hier zum Einsatz kommen, wie Morphologie, Wachstum und Wachstumsbedingungen der Bakterien, sowie die Beurteilung von Stoffwechselvorgängen und die Zusammensetzung von z.B. Fettsäure- oder Eiweißmuster. Für dieses Projekt wurden zwei phänotypische Identifizierungsmethoden eingesetzt.
Die biochemische Identifizierung ist eine seit langem etablierte Methode. Hierbei werden die Bakterien hinsichtlich ihres Stoffwechsels untersucht. Die Fähigkeit bestimmte Stoffe (z.B. verschiedene Zuckerarten) als Energiegrundlage zu nutzen, der Nachweis einer bestimmten Enzymaktiviät oder die Bildung von Stoffwechselprodukten sind einige Charakteristika, die zur Identifizierung beitragen können (Rolle and Mayr, 2006). Für eine biochemische Identifizierung von zahlreichen Bakterienspezies gibt es bereits etablierte standardisierte Identifizierungssysteme. Für die Identifizierung von Vibrionen gibt es bislang zwar keine kommerziell erhältlichen Testsysteme, es gibt jedoch Empfehlungen für die Nutzung von kommerziellen
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Testsystemen, die in Kombination mit zusätzlichen Tests eine erfolgreiche Identifizierung erreichen sollen. So kann man z.B. das Schnellbestimmungssystem API 20E verwenden (Analytical Profile Index), das für die Identifizierung gramnegativer Bakterien, insbesondere Enterobacteriaceae entwickelt wurde (bioMerieux, Nürtingen, Deutschland). Außerdem können zusätzliche Tests (Buller, 2014) oder die Kombination verschiedener Einzeltests für bestimmte Vibrionen (Alsina and Blanch, 1994) Vorteile bringen. Die Zuverlässigkeit der Ergebnisse kann jedoch nur gewährleistet werden, wenn auch Reaktionsergebnisse von Vergleichsisolaten vorliegen. Da es hierfür keine zentrale Datenbank gibt wurden für diese Studie drei mögliche Identifizierungskombinationen verglichen (API 20E und die zugehörige Datenbank, die Empfehlungen nach Buller, 2014 und die Beurteilung der getesteten Reaktionsergebnisse in der Online-Datenbank www.microrao.com).
Eine neuere phänotypische Methode zur Identifizierung von Bakterien ist die Analyse anhand der jeweiligen Proteinmuster, die mittels Massenspektrometrie bestimmt und dann mit den in einer Datenbank hinterlegten Proteinmustern abgeglichen werden können. Hier kann das Verfahren der matrixunterstützten Laser-Desorptions- Ionisation mit Flugzeitmassenspektrometer-Detektion (MALDI-TOF: Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry) angewendet werden.
Die massenspektrometrische Identifizierung von Bakterien hat große Vorteile im Hinblick auf die praktische Durchführung, Schnelligkeit der Bearbeitung sowie der Anwendbarkeit bei großen Probenvolumina. Die Isolate müssen lediglich einige Stunden kultiviert werden um dann innerhalb von Minuten identifiziert werden zu können, sodass Ergebnisse bereits nach 12 – 24 Stunden nach Probenankunft vorliegen können (Wieser et al., 2012). Dies ist ein großer Vorteil gegenüber allen anderen Methoden zur Identifizierung. Bei der Identifizierung von Vibrionen ist jedoch zu bedenken, dass diese, um ein optimales Wachstum zu gewährleisten bei ca. 20 - 25 °C kultiviert werden sollten und ggf. eine längere Kultivierungsdauer benötigen als Bakterien, die bei 37°C kultiviert werden können. Nicht alle Vibrio-Spezies zeigen bei über 30°C ein gutes bzw. optimales Wachstum. Weiterhin kann es sein, dass die Kultivierungsdauer verlängert werden muss, da viele Vibrio-Spezies mindestens 48 Stunden oder länger benötigen, um eine deutliches Koloniewachstum zu zeigen
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(Buller, 2014). Das Vorliegen der Identifizierungsergebnisse kann somit bis zu 4 Tage betragen. Um Isolate nach massenspektrometrischer Analyse des Proteinmusters einer Bakterienspezies zuordnen zu können, ist es notwendig, dass in einer Datenbank Proteinspektren von relevanten Bakterienspezies vorliegen. Studien zeigten außerdem, dass auch die Anzahl der Spektren einer Bakterienspezies die Sicherheit einer Identifizierung erhöht. Je mehr Spektren, desto höher die Identifizierungsrate, bzw. die Qualität der Identifizierung (Erler et al., 2015).
Genotypische Identifizierung
Die genotypische Identifizierung von Bakterien ist in der aktuellen Forschung sicherlich eine viel verwendete Methode. Es gibt eine Vielzahl genetischer Loci, die eine gute Identifizierung von Bakterien erlauben. Hierbei wird ein spezifischer Genabschnitt mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) vervielfältigt, anschließend wird die DNA- Sequenz ausgelesen und mit Sequenzen in einer Datenbank verglichen (z.B. NCBI, EZBioCloud). Hierbei spielen konstitutiv exprimierte Gene, sog. Haushaltsgene (eng.:
housekeeping genes) eine bedeutende Rolle. Es handelt sich hierbei um nicht- regulierte Gene, die für z.B. Strukturproteine oder Enzyme codieren und im Stoffwechselkreislauf der Zelle benötigt werden (Ganten et al., 2001). Weiterhin sind Haushaltsgene grundsätzlich stark konserviert und unterliegen wenigen Veränderungen durch spezifische Anpassungen bei bestimmten Bakterien.
Die Sequenzierung des 16S rRNA Genlokus ist eine für alle Bakterien etablierte Methode der Identifizierung (Rolle und Mayr, 2006) und ist der am meisten analysierte Genlokus zur Identifizierung von Bakterien. Dieser Genlokus ist Teil der ribosomalen RNA von Bakterien und Archäen. Bakterien können anhand der Übereinstimmung der Nukleotidsequenz dieses Gens in phylogenetische Gruppen eingeteilt werden. Die Angaben über interspezifische Unterschiede in der Sequenz dieses Genlokus zwischen verschiedenen Bakterienspezies variieren stark (Clarridge, 2004) im Bereich von 0,2 und 2 % Abweichung, sodass bei einer Übereinstimmung der Nukleotidsequenz von über 98 % bzw. 99,8 % eine Spezieszuordnung eines Isolats möglich sein soll. Die Zuordnung zu einem Genus wird ab 95 % Sequenzübereinstimmung als möglich angesehen. Studien zeigen, dass für bestimmte
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Bakterien eine sehr hohe Übereinstimmung der Nukleotidsequenzen nötig ist (99,8 %) um eine Spezies eindeutig zu identifizieren (Fournier et al., 2003).
Das 16S rRNA Gen ist etwa 1500 Basenpaare lang und ist in Abschnitte von stark konservierten und variablen Regionen gegliedert. Bei der Identifizierung von Bakterien sind die variablen Regionen von Bedeutung (V1-V9) (Harwood, 2017). Die Qualität der Identifizierung kann, je nachdem wie lang der sequenzierte Abschnitt des Gens ist und in welchem Bereich des Gens sequenziert wurde, variieren. Die Untersuchungen in Publikation 1 wurden mit zwei viel verwendeten Primerpaaren durchgeführt und führten zur Sequenzierung der Genabschnitte V5-V8 (570 bp) und V1-V8 (1420 bp).
Unterstützend zur 16S rRNA Sequenzierung können auch Nucleotidsequenzen weiterer spezifischer Genabschnitte untersucht werden. Bei Vibrionen gibt es eine Reihe weiterer Haushaltsgene, die zur Identifizierung geeignet sind, unter anderen das für die Uridylat-Kinase (syn.: Uridinmonophosphat- Kinase) kodierende Gen PyrH.
Haushaltsgene gelten als stark konservierte Gene, die wenig Änderungen erfahren, da sie für die Produktion von zelleigenen Stoffen dienen, die die Zellfunktion aufrechterhalten (Ganten et al., 2001). Verschiedene Untersuchungen zeigen, dass dieser Genlokus zur Identifizierung genutzt werden kann (Pascual et al., 2010, Sawabe et al., 2013, Thompson et al., 2005), jedoch bei einigen Spezies (V. campbellii, V.
rotiferianus) keine Differenzierung ermöglicht. Davon abgesehen ist jedoch mit einer deutlich besseren Identifizierung zu rechnen, als mit der 16S rRNA Sequenzierung (Pascual et al., 2010). Eine Studie über die taxonomische Auflösekapazität (taxonomic resolution) (Pascual et al., 2010), bei der die intraspezifische Sequenzübereinstimmung der 16S rRNA Sequenzen mit 98,9 – 100 % und die interspezifische Sequenzübereinstimmung der 16S rRNA Sequenzen mit 97,6 – 99,9
% angegeben sind. Die Überlappung dieser Werte führt zu einer sehr ungenauen Identifizierungswahrscheinlichkeit. Für die Sequenzierung des PyrH Genlokus wurden hingegen Werte für die intra- bzw. interspezifische Sequenzübereinstimmung von 93,7 – 100 % bzw. 86,4 – 97,8 % angegeben, was eine höhere taxonomische Auflösekapazität bedeutet. Jedoch zeigt diese Studie auch, das andere Haushaltsgene, soweit sie in der jeweiligen Bakteriengattung exprimiert sind, eine viel
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bessere Identifizierung ermöglichen können (z.B. rpoD, toxR) (Pascual et al., 2010) als 16S rRNA oder PyrH- Sequenzierung.
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2.5 Pathogenität von Vibrionen
Die Pathogenität eines Erregers ist die Fähigkeit nach dem Wirtskontakt eine Infektion auslösen zu können und beim Wirt hierdurch Störungen des Allgemeinbefindens auszulösen. Somit steht die Pathogenität im Zusammenhang mit der Fähigkeit des Erregers eine Infektion auszulösen und mit der Unfähigkeit des Wirts sich gegen die Infektion zu wehren. Wie stark diese Fähigkeiten des Erregers zur Infektion ausgeprägt sind, kann mit der Virulenz des Erregers eingestuft werden (Rolle und Mayr, 2006).
Die Virulenz von Bakterien kann durch sogenannte Pathogenitätsfaktoren erhöht sein.
Ein wichtiger Pathogenitätsfaktor, über den viele Bakterien verfügen, ist die Motilität.
Beweglichkeit verschafft vielen Bakterien den Vorteil schneller Wirtskontakt herzustellen oder schneller zum Zielgewebe zu gelangen. Die Beweglichkeit von Bakterien wird durch Flagellen ermöglicht. Die Bewegung der Flagellen kann entweder zur Ortsbeweglichkeit (Taumeln) oder zur Vorwärtsbeweglichkeit führen. Hierzu gibt es verschiedene Anordnungen der Flagellen (monotrich, polytrich, gebündelt an einem oder beiden Polen etc.). Je nach Drehrichtung der Flagellen können die Bakterien zwischen einer gerichteten Vorwärtsbewegung und einer taumelden Ortsbewegung wechseln. Die Bewegungsrichtung ist häufig zufällig, jedoch können Richtung und Dauer der Vorwärtsbewegung durch Faktoren der Umgebung, wie z.B. dem Nährstoffangebot (Chemotaxis) oder dem Licht (Phototaxis) beeinflusst werden. Ist dieses niedrig, wird häufiger durch Taumeln die Richtung gewechselt (Fritsche, 2016).
Bei steigender Viskosität der umgebenden Flüssigkeit kann bei bestimmten Vibrionen die Ausbildung von lateralen Flagellen (peritiche Flagellen) induziert werden. Durch diese kann das Bakterium sich besser wenden, um Oberflächen zu besiedeln.
Einzelne Spezies sind in der Lage auch laterale Flagellen auszubilden wie V.
alginolyticus, V. parahaemolyticus oder V. harveyi (Thompson et al., 2006, McCarter, 2006). Die meisten Vibrionen tragen ein einzelnes, polar angeordnetes Flagellum.
Ein weiterer Pathogenitätsfaktor sind Bakterientoxine. Hierzu gehören eine Vielzahl von Exo- und Endotoxinen. Vertreter der Exotoxine, die bei Vibrionen von hoher Relevanz sind, sind Hämolysine. Diese wirken meist porenbildend (β-Hämolyse), sodass Zielzellen (Erythrozyten und andere Blutzellen) durch Kationeneinstrom entleert werden und sich auflösen. Hierbei wird meist eine Entzündungsreaktion
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ausgelöst (Rolle und Mayr, 2006). Hämolysierende Vibrionen sind unter anderen V.
parahaemolyticus, V. harveyi und V. fluvialis.
Eine der wohl bekanntesten, humanpathogenen Vibrio-Spezies ist V. cholerae. Es gibt eine Reihe an Faktoren, die zu dessen Virulenz beitragen. Hierzu gehört zum einen die Beweglichkeit mittels eines polar angeordneten Flagellums, jedoch besitzt V.
cholerae noch viele weitere Pathogenitätsfaktoren, die noch stärker zu dessen Virulenz beitragen. Hierzu gehört unter anderem das Cholera Toxin (CT), das zum Hauptsymptom einer Cholera-Infektion führt, einem hochgradigen Durchfallgeschehen das mit einem massiven Wasserverlust des erkrankten Patienten verbunden ist.
Hierfür dringt CT über komplexe Vorgänge an den Zellmembranen in die Zellen des Darmepithels und in Endosomen ein (Golgi-Apparat, Endoplasmatischen Retikulum) bis es sich schließlich im Cytosol der Zellen anreichert. Hier führt eine Untereinheit des CT zur verstärkten ADP-Ribosylierung des G- Proteins und somit zu einer gesteigerten Aktivität der Adenylatzyklase. Eine Anhäufung von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) und hierdurch eine massiv gesteigerte Sekretion von Ionen und Flüssigkeit aus dem Darmepithel ins Darmlumen sind die Folge (Prouty und Klose, 2006).
Auch V. parahaemolyticus verfügt über ein komplexes System der Pathogenität.
Hierbei sind mehrere Hämolysine, wie das thermostable direct haemolysin (TDH) oder das thermostable direct haemolysin related haemolysin (TRH) von Bedeutung, die zur Lyse von Blutzellen, aber auch durch ihre Zytotoxizität zu massivem Durchfall führen können. Jedoch spielen auch andere Faktoren eine große Rolle wie die Typ VI Sekretionssysteme (T6SS). Beispielsweise das T6SS1 verbessert das Wachstum und die Verbreitung von V. parahaemolyticus durch toxische Effekte auf andere Bakterien in der Umgebung, wie V. cholerae, Escherichia coli oder Pseudomonas aeruginosa, jedoch besonders in warmer Umgebung mit hoher Salinität (Iida et al., 2006) (Publikation 2).
Die genetischen Anlagen für Virulenz lassen sich, soweit der Stand der Forschung es erlaubt, einfach mittels PCR an beliebigen Isolaten untersuchen, sodass dies eine naheliegende und einfache Möglichkeit darstellt diese potentiell pathogenen Bakterien auf ihre mögliche Virulenz hin zu untersuchen. Inwieweit diese Untersuchungen als
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Präventionsmaßnahme in Aquakulturanlagen einsetzbar sind wurde in Publikation 2 näher untersucht.
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2.6 Litopenaeus vannamei (Boone 1931)
Die weißbeinige Garnele, Litopenaeus vannamei, wurde erstmals als Penaeus vannamei beschrieben (Boone, 1931) und gehört zur Familie der Penaeidae. Ein weiterer Vertreter dieser Familie ist die Tigergarnele (Penaeus monodon). Das natürliche Habitat von L. vannamei ist der östliche Pazifik, speziell die Küstengewässer Mexikos, Mittelamerikas bis zu den peruanischen Küstengewässern im Süden. Hier findet man diese Garnelenart in der epipelagischen Zone der Pazifikküsten in Wassertiefen bis 72 Meter (Holthuis, 1980). Wassertemperatur, sowie Salinität unterliegen jahreszeitlichen, bzw. wetterbedingten Schwankungen, jedoch liegen in diesen tropischen, marinen Habitaten die Wassertemperaturen das ganze Jahr bei 20°C oder höher und die Salinität bei ca. 34‰ (US Department of Commerce). Die Jugendstadien dieser Garnelenart (Postlarven, Juvenile, Subadulte) kann man in den Küstengewässern (Lagunen, Mangroven, Mündungsgebiete) finden, wohingegen die adulten Tiere vor allem zur Fortpflanzung auch in tiefere Gewässer wandern (Food and Agriculture Organization of the United Nations, 2018). Aufgrund der Wanderungen während der verschiedenen Lebensphasen ist diese Garnelenart extremen Schwankungen in den Umweltbedingungen ausgesetzt. Schwankungen der Wassertemperaturen zwischen 20 und 36 °C stellen eine Herausforderung für diese Tiere dar. Durch extreme Wetterbedingungen (Regenzeit, Trockenzeit) sind diese Tiere in den Lagunen- und Mangrovengebieten Veränderungen in der Salinität von 2 bis 60 ‰ ausgesetzt. Diese extremen Bedingungen haben zur Folge, dass für juvenile Lebensstadien eine natürliche Mortalität von bis zu 90 % beschrieben ist (Edwards, 1977).
Der Lebenszyklus von L. vannamei beinhaltet verschiedene Stadien. Aus den Eiern schlüpfen nach ca. 12 bis 18 Stunden Nauplien die sich nach 2 Tagen zu Zoealarven, nach vier bis fünf Tagen zu Mysislarven und nach weiteren drei bis vier Tagen zu Postlarven weiterentwickeln. Das Postlarvenstadium dauert 10 bis 15 Tage und beinhaltet viele Unterstadien (PL 1 bis PL 30) bis sich die Tiere schließlich zur subadulten und nach mehreren Monaten zur adulten Garnele entwickeln (Food and Agriculture Organization of the United Nations, 2018). Mit einer Größe von maximal 23cm gehören sie zu den sog. Riesengarnelen und sind eine der am häufigsten
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kultivierten und beliebtesten Garnelenarten weltweit. Sie werden in Mittel- und Südamerika (Brasilien, Ecuador, Mexiko, Venezuela, Honduras, Guatemala, Peru, u.a.), in Asien und Südostasien (China, Thailand, Indonesien, Vietnam, Malaysia, Taiwan, Indien, Philippinen u.a.) aber auch in den Vereinigten Staaten von Amerika gezüchtet (Food and Agriculture Organization of the United Nations, 2018).
Die Riesengarnele L. vannamei erfreut sich in Deutschland zunehmender Beliebtheit.
Laut FAO stieg die Produktion von L. vannamei in Deutschland von einer Tonne im Jahr 2010 auf acht Tonnen im Jahr 2017 (Food and Agriculture Organization of the United Nations, 2018). Die Entwicklungen der letzten Jahre lässt deutlich höhere Produktionsmengen für die Jahre 2018 und 2019 erwarten, da jährlich neue Kreislaufanlagen zur Produktion dieser Riesengarnelen hinzukommen. Somit stellen sie ideale Modelltiere für die Untersuchungen von Vibrionen in Kreislaufanlagen dar.
Im Rahmen dieses Projektes wurde versucht diese ubiquitär vorkommenden und nützlichen, aber auch potentiell problematischen Bakterien sicher zu identifizieren, um herauszufinden, ob potentiell pathogene Spezies in RAS vorkommen (Publikation 1).
Außerdem wurde durch ein Screening der Isolate auf das Vorhandensein genetischer Loci, die für Pathogenitätsfaktoren kodieren, versucht die potentielle Gefahr für bakterielle Infektionen in RAS einzuschätzen (Publikation 2).
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3 Publikation 1
Dies ist die publizierte Version des folgenden Artikels, der unter [https://doi.org/10.1111/jfd.12897] veröffentlicht wurde. Dieser Artikel darf für den nicht-kommerziellen Gebrauch, in Übereinstimmung mit der „Wiley Self-Archiving Policy“ [http://www.wileyauthors.com/self-archiving], verwendet werden.
This is the published version of the following article, which has been published at [https://doi.org/10.1111/jfd.12897]. This article may be used for non-commercial purposes in accordance with the Wiley Self-Archiving Policy [http://www.wileyauthors.com/self-archiving].
Bauer, J, Teitge, F, Jung, A, Adamek, M, Peppler, C, Steinhagen, D, Jung- Schroers, V, 2018. Recommendations for identifying pathogenic Vibrio spp. as part of disease surveillance programmes in Recirculating Aquaculture Systems for Pacific white shrimps (Litopenaeus vannamei), Journal of Fish diseases, DOI 10.1111/jfd.12897
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Recommendations for identifying pathogenic Vibrio spp. as part of disease surveillance programmes in Recirculating Aquaculture Systems for Pacific white shrimps (Litopenaeus vannamei)
Julia Bauer1*, Felix Teitge1, Lisa Neffe1, Mikolaj Adamek1, Arne Jung2, Christina Peppler3, Dieter Steinhagen1, Verena Jung-Schroers1
1 Fish Disease Research Unit, University of Veterinary Medicine Hannover, Hannover, Germany
2 Clinic for Poultry, University of Veterinary Medicine Hannover, Hannover, Germany
3 Polyplan GmbH, Bremen
* Corresponding author. tel.: +49 511 9538578; fax: +49 511 9538587.
Postal address: Fish Disease Research Unit, Centre of Infectious Diseases, University of Veterinary Medicine Hannover, Bünteweg 17, D-30559 Hannover, Germany
E-mail address: julia.bauer@tiho-hannover.de
Abstract
Due to their pathogenic potential, identifying Vibrio species from recirculating aquaculture systems (RAS) for Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) is of great importance to determine the risk for animal's as well as for the consumer's health. The present study compared identification results for a total of 93 Vibrio isolates, including type strains and isolates from shrimp aquaculture. Results from biochemical identifications, 16S rRNA sequencing, sequencing of the uridylate kinase encoding gene pyrH and analysis of the protein spectra assessed by MALDI‐TOF MS were compared. The results achieved by these different methods were highly divergent for many of the analysed isolates and for several Vibrio spp. difficulties in reliably identifying occurred. These difficulties mainly resulted from missing entries in digital databases, a low number of comparable isolates analysed so far, and high interspecific similarities of biochemical traits and nucleotide sequences between the closely related
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Vibrio species. Due to the presented data, it can be concluded that for identifying Vibrio spp. from samples in routine diagnostics, it is recommended to use MALDI‐TOF MS analysis for a quick and reliable identification of pathogenic Vibrio sp. Nevertheless, editing the database, containing the main spectra of Vibrio is recommended to achieve reliable identification results.
Introduction
Production of aquatic animals for human consumption in recirculating aquaculture systems (RAS) is increasing in European countries, especially because of environmentally sustainable and ecological aspects. RAS are mostly operated as secondary mainstays using waste heat from biogas plants and have a planned aquaculture production quantity of between five and 30 tonnes per year.
Pacific white shrimps (Litopenaeus vannamei) are one of the most frequently cultivated shrimp species worldwide. Their native habitats are regions of the Eastern Pacific from Central to South America where water temperatures are constantly above 20°C. The main producing countries of L. vannamei are located in North‐ and South America and Asia (FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS, 2017). Although in Germany the production of penaeid shrimps, like L. vannamei, in RAS has also increased over the last few years, most shrimps consumed in Germany are still reared in third countries and approximately 40,000 tonnes of shrimps and related species are imported annually. Overall, the import of frozen shrimps into the European Union ranks second in value after imported salmon (EUMOFA—
EUROPEAN MARKET OBSERVATORY FOR FISHERIES AND AQUACULTURE PRODUCTS, 2016). These imports often exceed maximum residue levels of pharmaceuticals set by German law because of different regulations regarding treatments of food animals in the exporting countries.
Hence, notifications in the German Rapid Alert System for food and feed show multiple reports on imported shrimps in 2016 and 2017, such as drug residues (tetracycline, nitrofuran, furazolidone, chloramphenicol, malachite green), bacterial contaminations (Salmonella sp., V. alginolyticus, V. cholera, V. vulnificus) or the preservative
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maximum levels (sulphide) being exceeded (FEDERAL OFFICE OF CONSUMER PROTECTION AND FOOD SAFETY, 2016, 2017). In many shrimp‐producing countries, prophylactic treatments against bacterial diseases are conducted on a routine basis, also using medications that are prohibited in many importing countries for use in food animals, such as malachite green (Wijegoonawardena & Siriwardena, 2000). For prophylactic treatments, also Watch List antibiotics are used (Holmström et al., 2003) and resistances in Vibrio spp. against reserve group antibiotics (Jeyasanta, Lilly, & Patterson, 2017) indicate a frequent use of these agents (World Health Organisation, W, 2017).
Considering the amount of annually imported shrimps into the EU and the mentioned problems in shrimp‐producing tropical countries, a regional production of L. vannamei would be a logical step towards achieving an ecological production. The intention to achieve ecological goals in aquaculture, such as reducing wastewater discharge from aquaculture plants and a reduction in the use of medication, and particular antibiotics, leads to a balancing act between saving resources and safeguarding animal health. A production of shrimps in RAS would allow a reduction of wastewater discharge but entails a more unstable biological balance than natural aquatic habitats, because of high stocking densities, low water exchange and high feeding rates. Therefore, the total bacterial count in the recirculating water may increase very quickly and even non‐
pathogenic bacteria can cause infections in shrimps. As part of the microflora of sea water, especially Vibrio spp. can often be found in high amounts in marine RAS (Urakawa & Rivera, 2006). When replicating very fast, Vibrio spp. are often the cause of bacterial infections in shrimps (Moriarty, 1997).
Vibrio spp. are prevailing organisms within the physiological microflora in marine environments and brackish waters. Around 80 species of Vibrio are described (Buller, 2014). Currently, 58 species of the genus Vibrio spp. have been divided into 14 clades according to results from a multi‐locus sequence analysis (Thompson et al., 2005;
Sawabe et al., 2013) to analyse and understand the evolution of these bacterial species. The amount of Vibrio spp. within the physiological microflora in marine and brackish habitats can reach up to 40% (Urakawa & Rivera, 2006).
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In L. vannamei, Vibrio spp. can be found on the skin, in the digestive tract, in the hepatopancreas and in the haemolymph of healthy animals. Usually, Vibrio spp. are introduced to RAS via the stocking of shrimps (Vandenberghe et al., 1999). Most of these Vibrio species are harmless for the animals, and a symbiotic relationship between these bacteria and the host is of great importance (Urakawa & Rivera, 2006).
Nevertheless, there are different species of Vibrio spp. that are known to have a pathogenic potential for shrimps and can cause mass mortalities, resulting in massive economic losses.
In many incidents of disease or mortality, a high number of particular species, such as V. harveyi or V. alginolyticus, can be detected (Vandenberghe et al., 1999). Especially, V. harveyi seems to be associated with the infection of larvae as well as adult shrimps and can cause massive losses in Penaeus spp. (Karunasagar, Pai, Malathi, &
Karunasagar, 1994) and specifically in L. vannamei (Zhou et al., 2012). Also, V. alginolyticus seems to cause bacterial infections in L. vannamei (Liu, Cheng, Hsu,
& Chen, 2004).
Several of the shrimp pathogenic Vibrio species have a zoonotic potential as well and are described as causative agents for clinical infections in humans. Human infections may either arise from a contact with contaminated water or due to the consumption of contaminated seafood (Buller, 2014). Three major Vibrio spp. responsible for human gastrointestinal infections were detected in seafood products in France (Robert‐Pillot, Copin, Himber, Gay, & Quilici, 2014). V. parahaemolyticus was detected in 31.1%, V. vulnificus in 12.6% and V. cholerae in 0.6% of the tested products, respectively, and 25% of the V. parahaemolyticus isolates were positive for specific virulence genes.
These facts point out the risk of food‐borne infections due to the consumption of insufficiently heated seafood products. Another Vibrio sp. with a high zoonotic potential is V. fluvialis. Infections can present with severe enteritis (Allton, Forgione, & Gros, 2006), including diarrhoea (Chowdhury et al., 2012), but also cases of cellulitis and cerebritis are described (Huang & Hsu, 2005). This makes V. fluvialis an emerging pathogen and a severe concern to public health (Igbinosa & Okoh, 2010; Ramamurthy, Chowdhury, Pazhani, & Shinoda, 2014).
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The health risks for shrimps, kept in RAS, as well as the zoonotic potential arising from specific Vibrio species, especially V. alginolyticus, V. fluvialis, V. harveyi, V. parahaemolyticus and V. vulnificus, underline the necessity for a rapid and accurate identification of these bacteria associated with shrimp aquaculture in order to prevent disease outbreaks and to maintain high product quality. In this study, we compared different diagnostic methods for identifying Vibrio spp. in general and especially for aforementioned species from shrimp aquaculture recirculation systems. Our aim was to identify a rapid diagnostic method to discriminate pathogenic Vibrio species from closely related environmental species in farmed shrimps.
Materials and Methods
Bacterial isolates
In total, 93 isolates of Vibrio spp. were analysed, whereof 82 isolates originated from different aquaculture facilities stocked with Pacific white shrimps (Litopenaeus vannamei) of different age groups and were collected during bacteriological examinations of the systems. Additionally, 11 type strains from the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSZM) were included in this study.
The isolates from RAS originated from water samples, swabs from the biofilm of RAS surfaces and swabs from the biofilm of shrimp surfaces. All samples were cultivated on Columbia sheep blood (CSB) agar, on Columbia sheep blood agar with the addition of 1.5% NaCl, and on Thiosulphate Citrate Bile Salts Sucrose (TCBS) agar (Oxoid Deutschland GmbH, Germany) at 25°C for 48 hr. Growing colonies were sub‐cultured on CSB agar at 25°C for a further 24 hr. Subcultures were morphologically described, and all colonies were separately dissolved in Veal Infusion Broth (Bacto Veal Infusion Broth, Becton, Dickinson and Company, New Jersey, USA) and stored at −80°C until further use. The type strains of different Vibrio spp. were processed in the same manner as the field isolates.
29 Molecular biological species identification Analysis of the 16S rRNA gene
Two different PCRs for the purpose of examining the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene were performed. With one PCR (Jiang, Gao, Xu, Ye, & Zhou, 2011), that should result in a secure species identification, almost the whole 16S rRNA gene sequence with a length of 1465 base pairs (bp) was analysed for all 93 Vibrio spp.
included in this study. The resulting sequence was trimmed to a length of 1420 bp (variable regions V1‐V8). The result of this 16S rRNA sequencing was used as a standard identification method, and additional methods applied were tested against the result achieved with this method (Clarridge, 2004).
DNA was extracted from single colonies of each bacterial isolate using a commercially available DNA extraction kit in accordance with the manufacturer's instructions (Qiagen, Hilden, Germany). The DNA concentration was measured using spectrophotometry (NanoDrop ND‐1000 Lab, Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany), adjusted to a concentration of 10 ng/μL with PCR grade water (Thermo Fisher Scientific) and kept at −20°C until further use. The PCR mixture consisted of 5x KAPA2G Buffer A (5 μl), 10 mM dNTPs Mix (0.2 mM each, 0.5 μl), forward and reverse primers (Jiang et al., 2011) (Table 1), each 10 mM (0.5 μl), 10 ng/μl of template DNA (5 μl) and 0.25 U/μl KAPA2G Robust HotStart Polymerase (0.05 μl) (VWR International GmbH, Erlangen, Germany). Nuclease‐free water was added to a final volume of 25 μl.
An endpoint PCR was performed using a thermocycler (SensoQuest, Göttingen, Germany) with the 27 f and 1492 r primers and PCR profile as listed in Table 1.
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Table 1Primers and PCR protocols used in this study 1 = initial denaturating;2 - 4 = cycles (denaturation, annealing, extension); 5 = final extension
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All PCR products were applied to a 1% agarose gel with the addition of 4 μl Gel Red Nucleic Acid DNA marker (Biotium, Inc., Freemont, USA) and 1x TBE (Tris‐boracic acid–EDTA) buffer. Afterwards, DNA amplicons were separated in an electrical field.
A DNA Ladder (100 base pairs (bp), Carl Roth GmbH, Karlsruhe) was used to determine the product size. Resulting bands were visualized under UV light at 302 nm.
PCR products that showed bands of the anticipated size were sent for sequencing to a commercial company and were sequenced from both sides (LCG genomics, Berlin, Germany). Sequences obtained from the samples were aligned using the multiple sequence alignment tool Kalign (Lassmann & Sonnhammer, 2005) and then subjected to phylogenetic analysis using the clustalW2 program and a neighbour joining algorithm available at https://www.ebi.ac.uk/Tools/phylogeny/simple_phylogeny/
(Larkin et al., 2007; Saitou & Nei, 1987; Kimura, 1980; McWilliam et al., 2013).
Resulting trees were visualized using FigTree v1.4.3.
In addition, a PCR was performed that amplifies a fragment of the 16S rRNA sequence of 720 base pairs. This PCR appeared more suitable for use in routine diagnostic, because it results in a smaller amplicon product which would require sequencing from only one side of the nucleotide. DNA extraction and PCR mixture were as described above, and the PCR was performed using the primer pair and PCR protocol reported by Wilson et al. (1990) as listed in Table 1. Sequences obtained with this PCR were trimmed to a length of 570 bp. Thus, a significantly shorter 16S rRNA sequence was obtained, which included only the variable regions V5‐V8 of the gene.
To identify Vibrio species, all obtained 16S rRNA nucleotide sequences were aligned to sequences from the EzBioCloud database (ChunLab, Inc., Seoul, Korea) as well as to sequences from the standard nucleotide BLAST (National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine, Bethesda, USA) database. All 16S rRNA sequences obtained during the current study are available at GenBank, as listed in Supporting Information Data S1.
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Analysis of the uridylate kinase encoding gene pyrH
A 469‐bp fragment of the nucleotide sequence of the uridylate kinase encoding gene pyrH was amplified. PyrH was chosen because most Vibrio spp. could be securely differentiated from each other by means of the pyrH sequence (Thompson et al., 2005). DNA extraction and PCR reaction mixture were as described above. The PCR was performed using forward and reverse primers and the PCR protocol described by Thompson et al. (2005) as listed in Table 1. Obtained DNA sequences were aligned to known pyrH sequences using the standard nucleotide BLAST database (National Centre for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine, Bethesda, USA, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). A phylogenetic tree was generated as described above. PyrH sequences obtained during this study are available at BankIt as detailed in Supporting Information Data S1.
Identification using mass spectrometry MALDI‐TOF
With MALDI‐TOF MS, bacteria can be identified according to their protein spectrum by mass spectrometry. For this analysis, all bacteria were grown as pure culture on CBS for 24 hr at 25°C. From each isolate, a single colony was applied in duplicate to a stainless steel target plate (MSP 96 target polished steel BC, microScout target, Bruker Corporation, Billerica, USA), air‐dried, and subsequently covered with 1 μl of the matrix solution (IVD matrix HCCA‐portioned, Bruker Corporation, Billerica, USA). As a reference, a bacterial test standard (IVD Bacterial Test Standard, Bruker Corporation, Billerica, USA) was applied on the target plate as well. Following air‐drying, the samples were analysed immediately using the Bruker microflex MALDI‐TOF system.
Mass spectra were acquired using the MALDI‐TOF MS spectrometer in a linear positive mode. The resulting protein spectra were compared to the Bruker Biotyper database using the MBT Compass Library (BTyp2.0‐Sec.Library 1.0) and the programs MBT compass and flexControl. Outputs of results were evaluated by Score Values: 2.3‐3.0: highly probable species identification, 2.0‐2.299: secure genus identification, 1.7‐1.99: probable genus identification, 0‐1.699: not reliable identification.
33 Biochemical Identification
The isolates were analysed by biochemical methods, using the manual microorganism identification systems API 20E (BioMerieux, Nuertingen, Germany) following the manufacturer's instructions except for incubation temperature, which was 25°C for all systems and the addition of 2% NaCl (w/v) in all test media. This identification system was applied because it is frequently used in laboratories when performing routine bacteriological diagnostics. The API strips were read after 24 hr and finally evaluated after 48‐h incubation time. Additionally, all isolates were also tested for β‐haemolysis, swarming of the bacteria on CSB agar, methyl red reaction, hydrolysis of aesculin, lactose, maltose, mannose, trehalose, xylose and salicin fermentation as well as growth on TCBS agar. All test media were supplemented with 2% NaCl (Table 3).
Bacterial characteristics were evaluated after an incubation of 24 hr at 25°C, and biochemical reactions were analysed after 48 hr of incubation at 25°C. Unclear or negative reactions were re‐evaluated after 72 and 96 hr of cultivation, respectively.
Species identification was performed by comparing the results with different databases, and a sample was assigned to the species with biochemical characteristics matching best to the test results. By using the apiweb database (BioMérieux sa, Lyon, France), an identification based only on the results of the Api 20E profiles was made.
This database contains biochemical characteristics of six Vibrio species (V. alginolyticus, V. cholerae, V. fluvialis, V. mimicus, V. parahaemolyticus and V. vulnificus). Additionally, all observed biochemical characteristics were compared to the identification tables provided by Buller that includes 78 different Vibrio species (Buller, 2014). Furthermore, the isolates were identified by using an online database (http://www.microrao.com/vibrio_ident.htm) which provides a tool for identifying Vibrio sp., considering up to 44 biochemical traits.
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Results
Species identification by sequencing the V1-V8 region of the 16S rRNA gene
By sequencing almost the complete 16S rRNA gene (V1‐V8 region), a total of 17 different species of Vibrio spp. could be identified among the 93 analysed Vibrio isolates (Table 2). Among the identified species were isolates of V. fluvialis, V. harveyi and V. parahaemolyticus. All but two type strains were identified correctly. The type strain of V. pelagius, DSM 21205, was misidentified as V. fortis, and the type strain of V. alginolyticus, DSM 2171, was misidentified as V. neocaledonicus. The phylogenetic tree generated by using the V1‐V8 sequences of the 16S rRNA gene shows a good differentiation between the different Vibrio clades (Figure 1). Two additional Vibrio species, V. hyugaensis (Urbanczyk, Ogura, Hayashi, & Urbanczyk, 2015) and V.
atypicus (Wang, Zhang, Yu, Wang, & Austin, 2010), showed a close relationship to members of the Harveyi Clade. Within the V. xuii cluster, one isolate identified as V.
japonicus could be found. One isolate was identified as V. hepatarius.
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Figure 1 Rooted phylogenetic tree on the basis of 16S rRNA gene sequences (V1‐
V8 regions); distance tree was generated with the clustalw2 program using neighbour joining algorithm, visualized using FigTree v.1.4.3
