Thrombozytenfunktionsdiagnostik bei Hunden mit inflammatorischen Erkrankungen und Optimierung der Messzeit des Multiplate Aggregometers

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Tierärztliche Hochschule Hannover

Thrombozytenfunktionsdiagnostik bei Hunden mit inflammatorischen Erkrankungen und Optimierung

der Messzeit des Multiplate® Aggregometers

INAUGURAL – DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von Monia Abid

Essen

Hannover 2011

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Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. R. Mischke Klinik für Kleintiere

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. R. Mischke

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. K. Feige

Tag der mündlichen Prüfung: 15.11.2011

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Meiner Familie

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„Klingt komisch, ist aber so.”

- Die Sendung mit der Maus -

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Ergebnisse dieser Dissertation wurden in Form eines Posters auf folgender Fachtagung präsentiert:

19. Jahrestagung der Fachgruppe „Innere Medizin und Klinische Labordiagnostik“ der DVG (InnLab 2011):

Thrombozytenfunktionsmessung mit dem Multiplate® analyser: Optimierung der Messzeit für canines Blut

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Inhaltsverzeichnis

I Einleitung ... 1

II Literaturübersicht ... 4

1. Thrombozytenfunktion ... 4

1.1. Interaktion der Thrombozyten mit dem Endothel ... 4

1.2. Aktivierung der Thrombozyten ... 5

1.2.1. Signaltransduktion ... 5

1.3. Sekretion der Granula-Inhaltsstoffe ... 6

1.4. Aggregation der Thrombozyten ... 6

1.5. Die Rolle der Thrombozyten für die Blutgerinnung (zellbasiertes Modell) ... 7

1.5.1. Initiation ... 7

1.5.2. Amplifikation ... 7

1.5.3. Propagation ... 8

2. Agonisten und ihre Thrombozytenoberflächenrezeptoren ... 8

2.1. Kollagen und Kollagenrezeptoren ... 8

2.2. Thrombin und Protease-aktivierte Rezeptoren ... 9

2.3. ADP und ADP-Rezeptoren ... 10

2.4. Eicosanoide ... 10

2.5. Epinephrin ... 11

3. Thrombozytenaggregationshemmer Clopidogrel ... 11

4. Thrombozytenfunktionsdiagnostik ... 12

4.1. Kapilläre in-vivo Blutungszeit ... 13

4.2. Plättchenfunktionsanalysator PFA-100 ... 13

4.3. Turbidimetrische Aggregometrie nach BORN ... 14

4.4. Vollblutaggregometrie ... 15

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5. Einfluss entzündlicher Erkrankungen auf die Thrombozytenfunktion ... 18

5.1. Übersicht vorhandener Studien ... 18

5.2. Pathogenese entzündlich bedingter Thrombozytendysfunktionen ... 24

5.2.1. Thrombozytopenie als Ursache der verminderten Aggregation... 24

5.2.2. Thrombozytenfunktions“erschöpfung“ ... 24

5.2.3. Anti-Plättchen Antikörper ... 25

5.2.4. Einfluss von Endotoxinen/Lipopolysacchariden (LPS) auf die Thrombozytenfunktion ... 25

5.2.5. Aggregationsinduktion durch zirkulierende Immunkomplexe... 26

5.2.6. Microbial surface components reacting with adhesive matrix molecules (MSCRAMMs) ... 26

III Material, Tiere und Methoden ... 28

1. Material ... 28

1.1. Geräte und Bezugsquellen ... 28

1.2. Reagenzien, Verbrauchsmaterial und Bezugsquellen ... 29

2. Studiendesign ... 30

3. Tiere ... 31

4. Blutentnahme ... 33

5. Probenbehandlung ... 33

6. Versuchsdurchführung ... 34

6.1. Kapilläre in-vivo Blutungszeit ... 34

6.2. Plättchenfunktionsanalysegerät (PFA-100) ... 34

6.3. Turbidimetrische Thrombozytenaggregationsmessung ... 35

6.4. Impedanzaggregometrie ... 35

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6.5. Thrombozytenzahl und Hämatokrit ... 36

7. Datenanalyse ... 37

8. Statistische Auswertungen ... 37

IV Manuskript I ... 38

Abstract ... 39

Introduction ... 40

Materials and methods ... 41

Results ... 44

Discussion ... 45

References ... 48

V Manuskript II ... 58

Abstract ... 59

Introduction ... 60

Materials and methods ... 61

Results ... 67

Discussion ... 68

Conclusion ... 75

References ... 76

VI Übergreifende Diskussion ... 83

VII Zusammenfassung ... 92

VIII Summary ... 95

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IX Literaturverzeichnis ... 97

X Tabellarischer Anhang ... 119

XI Danksagungen ... 151

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Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen

AA Arachidonsäure, arachidonic acid

ADP Adenosindiphosphat, adenosine diphosphate AS Arachidonsäure, arachidonic acid

ASS Acetylsalizylsäure, acetylsalicylic acid ATP Adenosintriphosphat, adenosine triphosphate AU Aggregationseinheit, aggregation unit

AUC Fläche unter der Kurve, area under the curve Ca²⁺ Kalzium, calcium

cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat, cyclic adenosine monophosphate ClF A Gerinnungsfaktor A, clotting factor A

cm Zentimeter, centimetre Col Kollagen, collagen

COX Zyklooxygenase, cyclooxygenase CT Verschlusszeit, closure time DG Diacylglycerol

EPCR endothelialer Protein C Rezeptor, endothelial cell protein c receptor EPI Epinephrin, epinephrine

et al. et alii (lat. und andere, and others) F Gerinnungsfactor, coagulation factor Fig Abbildung, figure

g Erdbeschleunigung (1 g = 9,81 m/s²), gravity

°C Grad Celsius, degree centigrade GP Glykoprotein, glycoprotein GV Gesamtvolumen, total volume Htk Hämatokrit, haematocrit

IgG Immunglobulin G, immunoglobuline G IL Interleukin, interleukin

IP₃ Inositol-1,4,5-Triphosphat, inositol-1,4,5-triphosphate kg Kilogramm, kilogram

Kol Kollagen, collagen

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L Liter, litre

LPS Lipopolysachharid, lipopolysaccharide

M Mol, mol

Max Maximum, maximum

MEA Mehrfachelektroden Aggregometrie, multiple electrode aggregometry mg Milligramm, milligram

min Minute(n), minute(s)

Min Minimum, minimum

mL Milliliter, millilitre mm Millimeter, millimetre

mmHg Millimeter Quecksilbersäule, millimeter mercury mmol Millimol, millimol

MSCRAMM microbial surface component reacting with adhesive matrix molecules

n Anzahl, number

NaCl Natriumchlorid, sodium chloride

p p-Wert (Irrtumswahrscheinlichkeit), p-value

PAR Protease-aktivierter Rezeptor, protease-activated receptor PFA Plättchenfunktionsanalysegerät, platelet function analyser PFP plättchenfreies Plasma, platelet free plasma

PIP2 Phosphoinositol-4,5-biphosphonat, phosphoinositol-4,5-biphosphate PSGL P-Selektin Glykoprotein Ligand, P-selectin glycoprotein ligand PRP plättchenreiches Plasma, platelet rich plasma

PTFE Polytetrafluorethylen, polytetrafluoroethylene SD Standardabweichung, standard deviation sec Sekunde(n), second(s)

SIRS systemisches inflammatorisches Response-Syndrom, systemic inflammatory response syndrome

Tab. Tabelle, table TF tissue factor

TNF Tumornekrosefaktor, tumor necrosis factor TV Gesamtvolumen, total volume

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TXA2 Thromboxan A2, thromboxane A2

TXB2 Thromboxan B2, thromboxane B2

vWF von Willebrand Faktor, von Willebrand factor VZ Verschlusszeit, closure time

µg Mikrogramm, microgram µL Mirkoliter, microlitre µm Mikrometer, micrometre µM Mikromol, micromol

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I Einleitung

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I Einleitung

Die Messung der Thrombozytenfunktion stellt eine wichtige Untersuchung im Rahmen der Diagnostik von Hämostasestörungen dar. Die am häufigsten verwendeten Verfahren sind die kapilläre in vivo Blutungszeit (NOLTE et al. 1997), die turbidimetrische Thrombozytenaggregationsmessung nach Born (BORN 1962) und die automatische Thrombozytenfunktionsanalyse mit dem Plättchenfunktionsanalysegerät PFA-100 (MISCHKE u. KEIDEL 2003).

Die erstmals 1980 beschriebene Impedanzaggregometrie mit Vollblut (CARDINAL u.

FLOWER 1980) war zunächst durch ihre relativ aufwendige Handhabung wenig praktikabel.

Diesem Nachteil wurde mit denen in jüngster Vergangenheit entwickelten Vollblut- Impedanzaggregometern Rechnung getragen. Das Messprinzip beruht auf der Zunahme des elektrischen Widerstands zwischen zwei Elektroden, wenn sich aggregierende Thrombozyten an diese anlagern (DYSZKIEWICZ-KORPANTY et al. 2005). Die Vorteile des Einsatzes von Vollblut im Gegensatz zur photometrischen Methode basierend auf plättchenreichem Plasma (PRP) bestehen in der weniger aufwendigen Probenvorbereitung und Anwesenheit aller Blutzellen. Dies bedeutet zum einen eine Zeitersparnis und zum anderen wird durch den Verzicht auf die Zentrifugation eine artifizielle Veränderung der Plättchenvolumen- Zusammensetzung verhindert (DYSZKIEWICZ-KORPANTY et al. 2005).

Eines der neueren Geräte, das sich dieses Messprinzips bedient, ist das Multiplate®

Aggregometer. Da es ursprünglich für den Einsatz in der Humanmedizin konzipiert wurde, fand in einer früheren Studie eine Anpassung verschiedener Parameter an Hundeblut statt (KALBANTNER et al. 2010). Eine entsprechende Überprüfung des Parameters Messzeit wurde hingegen bisher noch nicht durchgeführt. Die in der Humanmedizin empfohlene Messzeit von sechs Minuten wurde in der vorherigen Studie für Hundeblut auf 12 Minuten erhöht.

Das Ziel des methodischen ersten Teils der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss der Messzeit auf die Referenzwerte und die Sensitivität der Messergebnisse für Hundeblut zu ermitteln und zu prüfen, ob eine Verkürzung der Messzeit ohne negative Auswirkungen auf die Aussagekraft der Messergebnisse möglich ist.

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I Einleitung

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Entzündliche und infektiöse Erkrankungen, die eine häufige Ursache für eine Thrombozytopenie beim Hund darstellen (GRINDEM et al. 1991), können ebenso auch mit erworbenen Thrombozytenfunktionsstörungen einhergehen. Verschiedene Studien untersuchten die Thrombozytenfunktion bei Hunden mit bestimmten infektiösen Erkrankungen zumeist mit lediglich einer einzigen Methode, bei der es sich meistens um die turbidimetrische Aggregometrie handelte (CORONA et al. 2004; BRANDAO et al. 2006).

Daneben nutzten Studien zur Untersuchung der primären Hämostase auch die kapilläre Blutungszeit bei Hunden mit Leishmaniose (MORENO et al. 1998) und die Plättchenfunktionsanalyse mit dem Pättchenfunktionsanalysegerät PFA-100 bei Hunden mit experimentell induzierter Endotoxämie (YILMAZ et al. 2005). Die Mehrheit dieser Studien, die den Einfluss von experimentell induzierten und natürlich auftretenden entzündlichen Erkrankungen auf die Thrombozyten untersuchten, konnten eine beeinträchtigte Plättchenfunktion in vitro beobachten (JACOBS et al. 1986; HARRUS et al. 1996a;

VALLADARES et al. 1998). Einzelne Studien berichten aber auch von einer gesteigerten maximalen Aggregation bei Hunden mit Herzwurminfektion (BOUDREAUX et al. 1989).

Ebenso existieren im Bereich der Humanmedizin widersprüchliche Ergebnisse der turdidimetrischen Aggregometrie aus Studien mit septischen Patienten (GAWAZ et al. 1997;

YAGUCHI et al. 2004).

Infektiöse Erkrankungen können die primäre Hämostase über verschiedene Pathomechanismen beeinflussen. So kann die Bindung von sowohl zirkulierenden Immunkomplexen als auch Komplexen bestehend aus Clotting factor A (ClF A, einem adhäsivem Matrixmolekül grampositiver Bakterien), Fibrinogen und Antikörpern an den Thrombozyten eine frühe, systemische Aktivierung der Plättchen mit anschließender Agglutination und gesteigertem Verbrauch induzieren (LOUGHMAN et al. 2005). Des Weiteren können Endotoxine zum einen über Bindung an die Thrombozytenoberfläche (SABA et al. 1984; SALDEN u. BAS 1994) und zum anderen durch Modifikation der thrombozytären Rezeptoren (NYSTROM et al. 1994) zu einer direkten Beeinträchtigung der Plättchenfunktion führen.

Unabhängig von der Ätiologie kann jeder schwere und/oder fortgeschrittene entzündliche Prozess zu einer ausgeprägten systemischen Reaktion des Körpers führen. Ein systemisches inflammatorisches Response-Syndrom (SIRS) stellt eine ernste, möglicherweise

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I Einleitung

3 lebensbedrohliche Lage dar, die häufig mit Hämostasestörungen assoziiert ist und ein schnelles therapeutisches Handeln verlangt (HOPPER 2005).

Das Ziel des zweiten Teils dieser Arbeit war es, den Einfluss entzündlicher Erkrankungen aufgrund bakterieller und protozoischer Infektionen auf die Thrombozytenfunktion bei Hunden zu untersuchen. Dies geschah mittels verschiedener Globaltests und spezifischer Methoden, zu denen auch das im ersten Teil bearbeitete, relativ neue Multiplate® Impedanzaggregometer gehörte. Die Ergebnisse wurden mit denen einer gesunden Kontrollgruppe verglichen und darüber hinaus wurden die Ergebnisse von Patienten mit SIRS und ohne SIRS miteinander verglichen.

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II Literaturübersicht

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II Literaturübersicht

1. Thrombozytenfunktion

Thrombozyten sind in der Lage, kleine endotheliale Defekte durch die Formation eines primären Thrombus zu verschließen und dienen somit der Aufrechterhaltung der Gefäßintegrität (SCHARF 1997). Des Weiteren fördern sie die Heilung der Gefäßwandverletzung und spielen eine wichtige Rolle bei Entzündungsprozessen (GENTRY 1992).

1.1. Interaktion der Thrombozyten mit dem Endothel

Eine Verletzung der Gefäßwand führt zur Freilegung subendothelialer Strukturen, die aus Struktur- und Adhäsionsproteinen zusammengesetzt sind und deren Interaktion mit den Thrombozyten normalerweise durch das intakte Endothel verhindert wird (RUGGERI 1994).

Von Bedeutung für die primäre Hämostase sind v.a. Kollagene, Fibronektin und Laminin, sowie der von-Willebrand-Faktor (vWF), der vom Endothel sezerniert wird und im Fall eines Gefäßwanddefektes an das freigelegte Kollagen binden kann (JACKSON et al. 2000). Diese Faktoren bilden die Grundelage für die Adhäsion der Thrombozyten an den Defekt.

Die an der Adhäsion beteiligten Rezeptoren und Liganden sind abhängig von den vorherrschenden Scherkräften: in Bereichen mit niedrigen Scherkräften (venöses Gefäßsystem) ist die irreversible Bindung von Kollagen, Fibronektin und Laminin an die entsprechenden thrombozytären Integrine ausreichend, um eine Ansammlung und Adhäsion der Plättchen zu ermöglichen (KROLL et al. 1996). Bei hohen Scherkräften, wie sie im arteriellen Stromgebiet und in der Mikrozirkulation vorherrschen, sind Bindungen mit höherer Affinität erforderlich. In diesem Fall findet die Interaktion zunächst zwischen dem vWF und dem thrombozytären GPIb/IX/V-Rezeptor statt (REININGER et al. 2006). Im Anschluss erfolgt eine Stabilisierung der Plättchenadhäsion durch die bereits erwähnten irreversiblen Bindungen mit Kollagen, Fibronektin und Laminin (SIXMA et al. 1995). Die Adhäsion der Thrombozyten führt zum sogenannten „shape change“, einer Formveränderung der Zelle, die mit Ausbildung von Pseudopodien einhergeht. Sie führen zur Oberflächenvergrößerung und somit einer besseren Abdichtung des Defekts (GAWAZ 1999).

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5 1.2. Aktivierung der Thrombozyten

Die Aktivierung der Thrombozyten führt zu strukturellen und funktionellen Veränderungen der Zelle und ist Voraussetzung für den Ablauf der Aggregation. Sie wird zum einen durch den Adhäsionsvorgang selbst, zum anderen durch chemische Stimuli in Form von Agonisten induziert (GAWAZ 1999). Diese werden sowohl vom Thrombozyt selbst, als auch vom umliegenden Gewebe produziert und binden an spezifische Rezeptoren auf der Thrombozytenoberfläche. Neben dem bereits erwähnten „shape change“ und der Freilegung des GPIIb/IIIa-Rezeptors kommt es zu einer Umorientierung der Membranphospholipide. Von übergeordneter Bedeutung ist dabei die Translokation des Phosphatidylserins von innen nach außen, das als Bindungsstelle für aktivierte Gerinnungsfaktoren dient und maßgeblich an der Generierung von aktiviertem Faktor X und Thrombin beteiligt ist (ZWAAL u. SCHROIT 1997).

1.2.1. Signaltransduktion

Die Signaltransduktion dient der Weiterleitung von Reizen außerhalb der Zelle ins Zellinnere. Dabei sind in der Regel eine Vielzahl von Enzymen und „second messenger“

beteiligt. Im Rahmen der Thrombozytenaktivierung haben die verschiedenen Signaltransduktionswege alle eine Erhöhung der intrazellulärem Ca²⁺-Konzentration zum Ziel, die durch den Influx von extrazellulärem Ca²⁺ und der Degranulation erreicht wird (ROSENFELD u. GRALNICK 1997). Die drei Enzyme Phospholipase C, Phospholipase A2

und Adenylatzykalse sind daran maßgeblich beteiligt.

Zunächst bindet ein Agonist an seinen spezifischen thrombozytären Oberflächenrezeptor, die zur Gruppe der Guaninnukleotid-bindenden Proteine (G-Proteine) gehören. Das aktivierte G-Protein wiederum aktiviert zwei Enzyme: die Phospholipase C und die Phospholipase A2.

Die Phospholipase C führt zu einer hydrolytischen Spaltung des Membranphospholipids Phosphoinositol-4,5-biphosphonat (PIP₂) in Inositol-1,4,5- Triphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DG). Während IP3 zu einem Anstieg des intrazellulären Ca²⁺ führt, aktiviert DG die Proteinkinase C, welche über weitere Signalproteine zur Degranulation und der Aktivierung des GPIIb/IIIa-Rezeptors führt (BRASS et al. 1997).

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Die Phospholipase A2, zusätzlich durch die erhöhte Ca²⁺-Konzentration aktiviert, bedingt die Freisetzung von Arachidonsäure (AS) aus der Plasmamembran. Sie dient als Substrat für die Cyclooxygenase-1 (COX-1) und die Thromboxansynthetase, welche daraus Thromboxan A2 (TxA2) bilden. Neben der Degranulation bewirkt TxA2 auch eine Vasokonstriktion und agiert außerdem selbst als Agonist (BRASS et al. 1997).

Handelt es sich bei dem durch den Agonisten aktivierten G-Protein um ein inhibitorisches G-Protein, führt dies zu einer Hemmung der Adenylatzyklase, was eine erniedrigte zyklisches Adenosin-Monophosphat (cAMP)-Konzentration zur Folge hat. cAMP wirkt antagonistisch auf die Thrombozytenaktivierung (BRASS et al. 1997).

1.3. Sekretion der Granula-Inhaltsstoffe

Im Verlauf des Adhäsionsvorgangs kommt es zur Freisetzung der thrombozytären Granula-Inhaltsstoffe. Dies geschieht per Exozytose (Fusion der Granulamembran mit der Plasmamembran) und durch Verschmelzung der Granula mit dem offenen kanalikulären System (RENDU u. BROHARD-BOHN 2001). Die Degranulation ist abhängig von der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration, wobei jeder der drei verschiedenen Granulatypen eine andere Schwellenkonzentration aufweist, die überschritten werden muss. Dadurch bedingt werden zunächst die dichten Granula und dann die α -Granula, gefolgt von den Lysosomen freigesetzt (GAWAZ 1999). Folge der Degranulation ist die Verstärkung der Thrombozytenaktivierung, die Einleitung der Aggregation und die Rekrutierung weiterer Blutplättchen. Im Rahmen der Degranulation der α-Granula kommt es darüber hinaus zu einer Translokation des P-Selektins von der Granula-Membran auf die Thrombozytenoberfläche (PENG et al. 1994).

1.4. Aggregation der Thrombozyten

Die Aggregation umfasst den Vorgang der Koadhäsion zweier Thrombozyten (GAWAZ 1999). Eine zentrale Rolle spielt dabei der GPIIb/IIIa-Rezeptor der Blutplättchen.

Im Rahmen der Thrombozytenaktivierung werden Bindungsstellen für Fibrinogen am GPIIb/IIIa-Rezeptor freigelegt und es findet eine primäre Aggregation statt, bei der reversible Fibrinogenbrücken zwischen den Plättchen entstehen (RUGGERI 1994). Sobald es zur

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7 Degranulation der Thrombozyten kommt, verfestigen sich die Fibrinogenbrücken, es findet eine irreversible, sekundäre Aggregation statt (GAWAZ 1999).

Von entscheidender Bedeutung für den Prozess der Aggregation ist Ca²⁺, denn nur in Anwesenheit dieses Kations kann plasmatisches Fibrinogen an den GPIIb/IIIa-Rezeptor binden (SIESS 1989). Ca²⁺und auch Fibrinogen sind außerdem in den Granula gespeichert und liegen deshalb nach der Degranulation in besonders hoher Konzentration vor (MEYERS et al. 1982).

1.5. Die Rolle der Thrombozyten für die Blutgerinnung (zellbasiertes Modell)

Das in den letzten Jahren etablierte zellbasierte Modell der Hämostase hat deutlich gemacht, dass eine strikte Trennung von primärer und sekundärer Hämostase, wie es in der Vergangenheit üblich war, in vivo nicht gegeben ist. Der Vorgang der Blutstillung wird demnach in drei Phasen unterteilt, die überlappend ablaufen und als Initiation, Amplifikation und Propagation bezeichnet werden (HOFFMAN u. MONROE 2001; SMITH 2009).

1.5.1. Initiation

Ein Integritätsverlust des Endothels führt zur Freilegung tissue factor (TF)-tragender Zellen, die sich im Subendothel der Gefäßwand befinden. Physiologischerweise im Blut zirkulierender Gerinnungsfaktor (F) VIIa bildet einen Komplex mit dem freigelegten TF (SMITH 2009). Dieser Komplex aktiviert FX und FIX, woraufhin FXa an den Cofaktor FVa bindet und damit einen Prothrombinasekomplex erzeugt, der aus einer kleinen Menge Prothrombin Thrombin generieren kann (BECKER 2005). Der Prozess der Initiation findet bis hierhin auf der TF-tragenden Zelle statt. Während FXa nach Abspaltung von der TF- tragenden Zelle sofort durch Antithrombin und tissue factor pathway inhibitor inaktiviert wird, ist FIXa in der Lage zu dissoziieren und zur Thrombozytenmembran zu gelangen (ROBERTS et al. 2006).

1.5.2. Amplifikation

Das während der Initiation generierte Thrombin diffundiert in den Blutfluss und setzt weitere Mechanismen in Gang. Auf der Thrombozytenoberfläche führt Thrombin zur Aktivierung von FV und FXI und darüber hinaus wird FVIII mithilfe des Thrombins vom

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zirkulierenden vWF abgespalten und aktiviert (SMITH 2009). Während FVIIIa zu einer Amplifikation der Thrombingenerierung führt, induziert der isolierte vWF die Thrombozytenadhäsion (s. Kap. 1.2.) und –aggregation (s. Kap. 1.4.) (HOFFMAN u.

MONROE 2001). Außerdem bindet Thrombin direkt an Rezeptoren auf der Thrombozytenoberfläche und aktiviert dadurch die Blutplättchen. Diese vollziehen einen

„shape change“, erzeugen durch Umverteilung der Membranphospholipide eine negative geladene, prokoagulatorische Oberfläche, die zur Bildung weiteren Thrombins beiträgt und setzen den Inhalt ihrer Granula frei (s. Kap 1.3.) (ZWAAL u. BEVERS 1983).

1.5.3. Propagation

Die Degranulation der Thrombozyten führt zur Rekrutierung weiterer Blutplättchen, auf deren Oberfläche Liganden exprimiert werden, die die Aggregation induzieren (SMITH 2009). Durch Aktivierung weiterer Faktoren auf der Thrombozytenoberfläche kommt es zur Generierung größerer Mengen Thrombin, das letztendlich durch Abspaltung von Peptiden aus Fibrinogen Fibrin bildet (BECKER 2005).

2. Agonisten und ihre Thrombozytenoberflächenrezeptoren

Die Aktivierung der Thrombozyten wird durch verschiedene lösliche Substanzen induziert, den Agonisten. Über verschiedene Signaltransduktionswege führen sie letztendlich alle zu einer Aktivierung des GPIIb/IIIa-Rezeptors und damit der Freilegung der Fibrinogen- Bindungsstellen. Es existiert eine Vielzahl von Plättchen-aktivierenden Substanzen, darunter Kollagen, Thrombin, Adenosindiphosphat (ADP), AS, Ristocetin, Serotonin und Epinephrine, die je nach Spezies unterschiedlich potent sind. Alle bisher bekannten Agonist-spezifischen Rezeptoren auf der Thrombozytenoberfläche gehören zur Gruppe der G-Proteine (GENTRY 2000).

2.1. Kollagen und Kollagenrezeptoren

Das Subendothel der Gefäße enthält hauptsächlich Kollagen vom Typ I, III und VI (SAVAGE et al. 2001). Kommt es zu einer Verletzung des Endothels, werden

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9 Kollagenfibrillen freigelegt und können in Kontakt mit den Thrombozyten treten. Dabei binden sie direkt an spezifische Kollagenrezeptoren auf der Plättchenoberfläche und dienen somit sowohl der Adhäsion als auch der Aktivierung. Thrombozyten besitzen drei verschiedene Kollagenrezeptoren: das Integrin GPIb/IIa, den zur Immunoglobulin- Superfamilie gehörenden GPVI-Rezeptor und den von-Willebrand-Rezeptor (GPIb/IX/V) (FARNDALE 2006). Bindet Kollagen nun an einen entsprechenden Rezeptor, kommt es zur Freisetzung von AS aus der Plättchenmembran. Diese wird mit Hilfe der thrombozytären Zyklooxygenase (COX-1) in Thromboxan A2 umgewandelt, welches wiederum ein potenter Plättchenaktivator ist (YARDUMIAN et al. 1986).

2.2. Thrombin und Protease-aktivierte Rezeptoren

Thrombin ist eine Serinprotease, die Fibrinogen zu Fibrin spalten kann und einen der potentesten aggregationsinduzierenden Agonisten darstellt (SAVAGE et al. 2001). Es wird aus seinem inaktiven Vorläufer Prothrombin im Rahmen der Gerinnungskaskade generiert.

Dieser Vorgang wird maßgeblich durch die Anwesenheit aktivierter Thrombozyten gefördert, deren negativ geladene Membranphospholipide die Bildung des Prothrombinasekomplexes ermöglichen (QUINN 2005). Thrombozyten produzieren darüber hinaus selbst Thrombin, was einen amplifizierenden Effekt auf die Aggregation hat.

Thrombin bindet an thrombozytäre Protease-aktivierte Rezeptoren (PAR), die G- Protein gekoppelt sind (MOLINO et al. 1997). Insgesamt sind vier dieser Rezeptoren bekannt:

PAR-1, PAR-2, PAR-3 und PAR-4. Während PAR-2 nicht thrombin-sensitiv ist, wird PAR-3 nur auf Mäuse-Blutplättchen exprimiert (P. J. O'BRIEN et al. 2001). Humane Thrombozyten besitzen demnach PAR-1 und PAR-4, wobei sich die zwei Rezeptoren in ihrer Affinität für Thrombin unterscheiden (KAHN et al. 1999). PAR-1 wird bereits durch geringe Konzentrationen von Thrombin stimuliert und führt zu einer schnellen und kurzen Aktivierung, für die Stimulierung von PAR-4 sind höhere Konzentrationen erforderlich (SHAPIRO et al. 2000). Da Studien gezeigt haben, dass Thrombozyten von Hunden nicht in gleichem Maße auf humanes Thrombin reagieren wie menschliche Thrombozyten (DERIAN et al. 1995), scheint es Unterschiede in der Verteilung oder Sensitivität der PAR zu geben, die aber noch nicht hinreichend geklärt sind.

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Neben den mäßig affinen PA-Rezeptoren existiert noch ein weiterer, hochaffiner Rezeptor für Thrombin: der GPIb-Rezeptor, welcher Bestandteil des vWF-Rezeptors (GPIb/IX/V) ist (SOSLAU et al. 2001). Die Aktivierung dieses Rezeptors führt zu einer Hemmung der Fibrinogenspaltung durch Thrombin, steigert aber gleichzeitig die Aktivierung von PAR-1 (DE CANDIA et al. 2001; LI et al. 2001).

2.3. ADP und ADP-Rezeptoren

ADP ist ein Purinnukleotid, das in den dichten Granula der Thrombozyten gespeichert und von Erythrozyten und beschädigtem Endothel freigesetzt wird (GAARDER et al. 1961;

MEYERS et al. 1982). Canine Thrombozyten weisen eine sehr unterschiedliche Sensitivität gegenüber ADP auf, die im Verdacht steht rasseabhängig zu sein (NIELSEN et al. 2007), aber dennoch wesentlich höher ist als die humaner Blutplättchen (SOLOVIEV et al. 1999).

Auf der Thrombozytenoberfläche befinden sich drei verschiedene Bindungsstellen für ADP. P2Y₁ und P2Y₁₂ sind G-Protein-gekoppelte, purinerge Rezeptoren (JIN et al. 1998).

P2Y₁ induziert einen „shape change“, Ca²⁺-Freisetzung und aktiviert die Phospholipase C, während P2Y₁₂ die Adenylatzyklase hemmt (DANIEL et al. 1998). Die Bindung an beide Rezeptoren induziert letztendlich die Aggregation. Der P2X₁-Rezeptor hingegen ist ein Ionenkanal, an den sowohl ADP als auch ATP binden kann. Er ermöglicht den Influx von Ca²⁺, scheint aber keine bedeutende Rolle für die Aggregation zu spielen (SAVI et al. 1997).

Seine genaue Funktion ist noch nicht hinreichend geklärt.

2.4. Eicosanoide

Eicosanoide sind hormonähnliche Signalstoffe, die von einer Vielzahl von Zellarten und Geweben produziert werden. Dabei handelt es sich um Abkömmlinge mehrfach ungesättigter C20-Fettsäuren, insbesondere der AS.

Die aktivierte Phospholipase A2 setzt aus der Plasmamembran AS frei (QUINN 2005).

Diese dient als Substrat für die thrombozytäre COX-1, welche daraus als Zwischenmetabolit Prostaglandin (PG) H2 produziert. PGH2 wird mit Hilfe der Thromboxan-Synthetase in TxA2

umgewandelt (REILLY u. FITZGERALD 1993). TxA₂ ist eine labile Substanz, die eine kurze Halbwertszeit von nur ca. 30 s hat und schnell in das inaktive Thromboxan B₂ (TB₂) hydrolysiert wird (HALUSHKA et al. 1989).

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11 Es existieren zwei Isoformen von TxA2-Rezeptoren: TxR_α und TxR_β, die beide G- Protein-gekoppelt sind (PAUL et al. 1999). Während TxRα die Phospholipase C aktiviert, führt TxR_β zu einer Hemmung der Adenylatzyklase. Auch der TxA2-Vorläufer PGH2 ist in der Lage, die Rezeptoren zu stimulieren (HALUSHKA et al. 1995). In niedrigen Konzentrationen hat PGH2 einen amplifizierenden Effekt, während es in hohen Konzentrationen inhibitorisch wirkt (QUINN 2005).

Nicht alle Spezies sprechen in gleichem Ausmaß auf AS und TxA₂ an. Humane Thrombozyten reagieren insgesamt stärker als Thrombozyten domestizierter Tiere (GENTRY 2000) und auch innerhalb der Spezies Hund existieren Unterschiede, die erblich bedingt zu sein scheinen und evtl. rasseabhängig sind (NIELSEN et al. 2007; KALBANTNER et al.

2010). Auch der primäre Agonist hat einen Einfluss auf die TxA₂-Produktion: eine Aktivierung der Thrombozyten durch Kollagen oder Thrombin verursacht eine höhere TxA₂- Synthese als durch ADP (GENTRY 2000).

2.5. Epinephrin

Das Hormon Epinephrin (Adrenalin) wird im Nebennierenmark gebildet und in Stresssituationen freigesetzt. Neben einer Vielzahl anderer lebenswichtiger Funktionen spielt es auch eine Rolle im Rahmen der Thrombozytenaktivierung. Epinephrin bindet sowohl an thrombozytäre stimulierende α-Rezeptoren, die zur Hemmung der Adenylatzyklase führen, als auch an inhibitorische β-Rezeptoren (SOLOVIEV et al. 1999). Dies erklärt die unterschiedliche Sensitivität verschiedener Spezies gegenüber Epinephrin, da die Rezeptorendichte (α/β-Verhältnis) speziesabhängig ist (KERRY et al. 1984). Canine Thrombozyten sprechen nur sehr schlecht auf Epinephrine an (FEINGOLD et al. 1986), es kann lediglich den Effekt anderer Agonsiten amplifizieren (GENTRY 2000).

3. Thrombozytenaggregationshemmer Clopidogrel

Clopidogrel ist ein Thienopyridin, das den P2Y₁₂-ADP-Rezeptor blockiert. Dieses, zurzeit nur in Tablettenform verfügbare Medikament, stellt eine „prodrug“ dar, welche zunächst durch Cytochrom P450 in der Leber in ihren aktiven Metaboliten verstoffwechselt

(26)

12

werden muss (SAVI et al. 1994). Die dabei entstehenden Metaboliten sind beim Menschen bereits eingehend untersucht worden, beim Hund hingegen noch relativ unbekannt. Beim Menschen entstehen der aktive Metabolit R-130964, ein Thiolderivat, und der inaktive Metabolit SR 26334 (PEREILLO et al. 2002). Letzterer konnte auch bei mit Clopidogrel behandelten Hunden nachgewiesen werden, wenn auch in etwas niedrigeren Konzentrationen (BRAINARD et al. 2010).

Der aktive Metabolit des Clopidogrels bindet irreversibel an den P2Y₁₂-Rezeptor und führt zu dessen Inaktivierung (MUELLER et al. 2007). Dadurch wird die Hemmung der Adenylatzyklase antagonisiert, was zu einem erhöhten cAMP-Spiegel im Thrombozyten führt (SAVI et al. 2001). Clopidogrel hemmt die ADP-induzierte Sekretion der α-Granula und die Adhäsion am Subentdothel (GAWAZ 1999). Letztendlich führt all dies indirekt zur Hemmung der GPIIb/IIIa-Rezeptor-Aktivierung. Außerdem scheint Clopidogrel die Fibrinolyse zu steigern (GAWAZ 1999).

Die in der Humanmedizin gängige Dosierung von 75 mg/Tag führt nach 3–7 Tagen zu einem steady state (SAVCIC et al. 1999). In einer Studie von BRAINARD et al. (2010) wurde die Pharmakodynamik von Clopidogrel bei Hunden mittels Thrombelastografie, turbidimetrischer und Impedanzaggregometrie untersucht. Die Hunde erhielten Clopidogrel in einer Dosierung von 0,32–1,3 mg/kg/Tag über 3–5 Tage. Dabei zeigte sich, dass es bereits drei Stunden nach Therapiebeginn zu einer signifikanten Hemmung der ADP-induzierten Thrombozytenaggregation kommt und dass die Wirkdauer auch beim Hund ca. 24 Stunden beträgt, wobei eine vollständige Wiederherstellung der Plättchenfunktion ca. 7 Tage nach Absetzen des Medikaments erfolgte.

4. Thrombozytenfunktionsdiagnostik

Es existiert eine Vielzahl verschiedener Analyseverfahren zur Messung der Thrombozytenfunktion, aber nur wenige konnten sich bisher in der Routinediagnostik durchsetzen. Dies liegt u.a. daran, dass viele der Verfahren sehr aufwendig sind und eine schlechte Standardisierbarkeit aufweisen. Zu den am häufigsten verwendeten Verfahren gehören die kapilläre in-vivo Blutungszeit, die automatische Thrombozytenfunktionsanalyse

(27)

13 mit dem Plättchenfunktionsanalysegerät PFA-100, die turbidimetrische Thrombozytenaggregationsmessung nach Born und die Impedanzaggregometrie.

4.1. Kapilläre in-vivo Blutungszeit

Die Messung der kapillären Blutungszeit gehört zu den ältesten Verfahren der Thrombozytenfunktionsdiagnostik in der Humanmedizin (RAND et al. 2003). Der Test dient als Screeningverfahren zur Feststellung von Störungen der primären Hämostase aufgrund einer Thrombozytopenie, Thrombozytendysfunktion oder eines Mangels an vWF (MISCHKE u. KEIDEL 2003).

Beim Hund wird die Blutungszeit zumeist an der bukkalen Maulschleimhaut getestet, indem eine Inzision an der Innenseite der Lefze durchgeführt und die Zeit bis zum Stillstand der Blutung gemessen wird. Im Rahmen der Evaluierung der Methode durch JERGENS et al.

(1987) konnten verlängerte Blutungszeiten bei Hunden mit Thrombozytopenie, von- Willebrand-Erkrankung und Urämie, sowie nach Acetylsalizylsäure (ASS)-Verabreichung gemessen werden. Von Nachteil bei dieser relativ weit verbreiteten Methode ist die in der Regel erforderliche Sedation, da die Inzision schmerzhaft ist und demnach schlecht toleriert wird (FORSYTHE u. WILLIS 1989; BRASSARD u. MEYERS 1991) und die Schwierigkeiten, die sich beim Stoppen der Blutung im Fall einer ernsthaften Hämostasestörung ergeben.

In den 90er Jahren stellten NOLTE et al. (1997) eine Methode zur Messung der kapillären Blutungszeit an der Zehe von nicht-anästhesierten Hunden vor. Zur Evaluierung der Methode erfolgten Messungen der kapillären Blutungszeit und der Kollagen-induzierten maximalen Thrombozytenaggregation bei 11 klinisch gesunden Hunden, die zuvor intravenös ASS appliziert bekommen hatten. Dabei konnte eine reproduzierbare Verlängerung der Blutungszeit beobachtet werden. Die Vorteile dieser Methode sind die nicht erforderliche Narkose und die bessere, wenn auch nicht vollständige Standardisierbarkeit (zur Durchführung s. S. 34).

4.2. Plättchenfunktionsanalysator PFA-100

Die automatische Plättchenfunktionsanalyse mittels PFA-100 kann als ein Globaltest der primären Hämostase angesehen werden. 1985 stellten KRATZER und BORN erstmals ein

(28)

14

Verfahren zur in vitro Messung der Blutungszeit vor (KRATZER u. BORN 1985), auf dessen Prinzip auch der PFA-100 basiert. Dabei wird Vollblut unter einem Vakuum durch eine Kapillare gesaugt, an deren Ende sich eine Agonisten-beschichtete Membran befindet, die eine zentrale Öffnung aufweist und die Zeit bis zu deren Verschluss durch die Thrombozyten gemessen wird (s. S. 34). Aufgrund der Einbeziehung von hohen Scherkräften ist der PFA- 100 besonders sensitiv gegenüber Störungen des vWF (CALATZIS 2007). Der Vorteil gegenüber der in vivo Blutungszeit besteht in der besseren Standardisierbarkeit und einem geringeren Aufwand (MUELLER et al. 2009).

Da das Gerät ursprünglich für den Einsatz in der Humanmedizin konzipiert wurde, prüften verschiedene Studien seine Eignung für die Untersuchung von Hundeblut (CALLAN u. GIGER 2001; KEIDEL 2001). Dabei stellte sich heraus, dass der PFA-100 durchaus auch für die Untersuchung von Hundeblut geeignet ist, wobei eine der zwei verschiedenen Messzelltypen zu bevorzugen ist (Kollagen/ADP-Messzelle). CALLAN u. GIGER (2001) untersuchten im Einzelnen die Anwendbarkeit des Gerätes bei Hunden mit Thrombozytopenie, Thrombopathie und von-Willebrand-Erkrankung und konnten verlängerte Verschlusszeiten bei diesen Hunden feststellen. Aufgrund des signifikanten Einflusses des Hämatokrits auf die Messergebnisse ist der klinische Anwendbarkeit jedoch begrenzt (MISCHKE u. KEIDEL 2003).

4.3. Turbidimetrische Aggregometrie nach BORN

Die von BORN im Jahre 1962 vorgestellte turbidimetrische Aggregometrie basiert auf der Änderung der optischen Dichte von plättchenreichem Plasma (PRP) nach Zugabe eines aggregationsinduzierenden Agonisten. Diese Methode galt lange Zeit als „Goldener Standard“

in der Thrombozytenfunktionsdiagnostik, was insbesondere an der guten Standardisierbarkeit lag (HARRISON 2005). So kann die Thrombozytenzahl im PRP problemlos durch Verdünnung oder Aufkonzentrieren eingestellt werden, was es ermöglicht, die Thrombozytenfunktion unabhängig von quantitativen Einflüssen zu untersuchen. Nachteil dieser Methode ist die relativ aufwendige Probenaufbereitungszeit, die mehrere Zentrifugationsschritte umfasst und einige unerwünschte Nebeneffekte mit sich bringt. So werden größere Thrombozyten, die in der Regel besonders aktiv sind, häufig mit abzentrifugiert und es kann während der Zentrifugation zu Zellschädigungen kommen

(29)

15 (DYSZKIEWICZ-KORPANTY et al. 2005). Studien haben gezeigt, dass je nach Separationsmethode im Durchschnitt nur 61–90% der gesamten Thrombozyten in die Messung mit eingehen (PERSIDSKY u. LING 1982). Des Weiteren ist die Messung in lipämischem oder ikterischem Plasma nicht möglich (RAND et al. 2003). In einer Studie von MISCHKE et al. (2004), in der die Plättchenaggregation einer großen Anzahl klinisch gesunder Hunde gemessen wurde, zeigte sich, dass die turbidimetrische Methode besonders sensitiv gegenüber verminderter Aggregation ist. Dabei erwiesen sich Konzentrationen von >

25 µmol/L ADP, 10 µg/mL Kollagen und 1 IU/mL Thrombin als besonders geeignet, wohingegen die Agonisten Ristocetin und Epinephrin für die Untersuchung von caninem Plasma ungeeignet sind. Dies bestätigen Ergebnisse aus verschiedenen früheren Studien, die ebenfalls ein schlechtes Ansprechen caniner Thrombozyten auf Ristocetin (LEIS et al. 1980) und Epinephrin (CLEMMONS u. MEYERS 1984; FEINGOLD et al. 1986) im PRP beobachten konnten.

4.4. Vollblutaggregometrie

In den letzten 25 Jahren wurden immer wieder Methoden entwickelt, die die Aggregation im Vollblut messen (CALATZIS 2007). Der Vorteil gegenüber der Messung im PRP besteht, neben dem Wegfall der Zentrifugation und der damit einhergehenden Zeitersparnis, vor allem im Vorherrschen eines physiologischen Milieus. Studien haben den Einfluss von roten und weißen Blutzellen auf die Thrombozytenfunktion aufgezeigt. So konnten GAARDER et al. (1961) das Vorhandensein von ADP in roten Blutzellen und dessen Effekt auf die Plättchenadhäsion belegen. SANTOS et al. (1991) konnten in ihrer Studie an klinisch gesunden Menschen zeigen, dass Erythrozyten einen modulierenden Effekt auf die Thrombozytenreaktivität haben, indem sie zu einer gesteigerten Plättchenaktivierung, einer erhöhten Mobilisierung von AS aus dem Thrombozyten und einer vermehrten Ansammlung von AS in der zellulären Umgebung führen. Dies erklärt, warum beim Vollblutverfahren im Vergleich zum PRP eine höhere Menge an ADP zugesetzt werden muss, um eine Aggregation zu induzieren und auf der anderen Seite weniger AS nötig ist (SIESS 1989). Ebenso haben Leukozyten Einfluss auf die Thrombozytenfunktion: über ihren P-Selektin Glykoprotein Liganden (PSGL) binden sie an das auf der Oberfläche aktiver Thrombozyten exprimierte P- Selektin, was zu einer zusätzlichen Thrombingenerierung führt (BOUCHARD u. TRACY

(30)

16

2001). Ein weiterer Vorteil der Vollblutaggregometrie ist die Möglichkeit, auch ikterische oder lipämische Proben untersuchen zu können (INGERMAN-WOJENSKI et al. 1983).

Eine Studie von DYSZKIEWICZ-KORPANTY et al. (2005) verglich beim Menschen die turbidimetrische mit der Vollblutimpedanz-Aggregometrie. Dabei stellte sich die Aggregationsmessung im Vollblut als überlegen heraus, konnte doch anhand mehrerer Fallstudien eine verminderte Thrombozytenaggregation im Vollblut bei Patienten mit Thrombozytendysfunktionen bzw. unter Therapie mit Plättchenhemmern festgestellt werden, die bei der Untersuchung im PRP im Normalbereich lag. Insbesondere die Sensitivität gegenüber Plättchenhemmern, aber auch gegenüber erblichen und erworbenen Thrombozytendysfunktionen war im Vollblutverfahren höher.

Den ersten, erfolgversprechenden Ansatz zur Messung der Thrombozytenfunktion im Vollblut lieferten 1979 Cardinal und Flower mit der Impedanzaggregometrie. Das Prinzip dieser Methode basiert auf der elektrischen Widerstandserhöhung zwischen zwei Elektroden (CARDINAL u. FLOWER 1980). Kommen die Thrombozyten in Kontakt mit der thrombogenen Metalloberfläche der Elektroden, bilden sie eine Monoschicht auf diesen.

Durch Zugabe eines aggregationsinduzierenden Agonisten (z.B. ADP oder Kollagen) zu der mit Kochsalzlösung verdünnten Vollblutprobe kommt es zur Anlagerung weiterer Thrombozyten an die Monoschicht. Der sich dadurch ändernde Widerstand wird mit einem Schreiber grafisch dargestellt (CARDINAL u. FLOWER 1980).

Eines der neuesten Verfahren basierend auf der Impedanzaggregometrie ist die

„multiple electrode aggregometry“ (MEA). Alle vorherigen Verfahren bedienten sich wiederverwendbarer Elektroden, die nach jeder Messung gereinigt werden mussten, was eine potentielle Fehlerquelle darstellt (TOTH et al. 2006). Bei der MEA kommen Einweg- Messzellen zum Einsatz, die zwei Elektrodenpaare beinhalten. TÓTH et al. (2006) untersuchten in ihrer Studie u.a. den Einfluss der Thrombozytenzahl auf die detektierte maximale Aggregation und konnten keine Abhängigkeit feststellen, wobei allerdings alle gemessenen Proben eine Plättchenzahl aufwiesen, die nur innerhalb des Referenzbereichs schwankte. Des Weiteren konnte eine geringgradige spontane Thrombozytenaggregation, evtl. durch den Rührmagneten verursacht, beobachtet werden, die bei Verwendung von Hirudin als Antikoagulanz deutlich niedriger ausfiel als bei Citrat. Messungen mit der MEA wiesen eine relativ hohe interindividuelle Variabilität auf, die für den Agonisten ADP

(31)

17 besonders ausgeprägt war. Die Thrombozytenaggregation war bei Hirudin-antikoagulierten Proben signifikant höher als bei Citrat-antikoagulierten, was im Konsens mit einer anderen Studie steht, die den Einfluss von Antikoagulantien auf die Aggregationsmessung im Vollblut untersuchte (WALLEN et al. 1997).

In einer Studie von KALBANTNER et al. (2010) wurde erstmals systematisch die Eignung eines Impedanzaggregometers (Multiplate® Aggregometer) für die Messung von Hundeblut geprüft. Dabei wurden Referenzwerte etabliert (Tab. 1), verschiedene Antikoagulantien getestet und optimale Konzentrationen verschiedener aggregationsinduzierender Agonisten ausgearbeitet. Es stellte sich heraus, dass die Agonisten Ristocetin und „Thrombin-Rezeptor aktivierendes Peptid 6“ (TRAP-6) keine zuverlässige Aggregation beim Hund induzieren konnten. Für die weiteren Agonisten konnten optimale Konzentrationen von 10 µmol/L ADP, 5 µg/mL Kollagen und 1 mmol/L AS eruiert werden, die damit etwas höher als die für humanes Blut empfohlenen Konzentrationen liegen.

Hirudin erwies sich als Anitkoagulanz gegenüber Citrat und Citratpuffer überlegen, was mit Beobachtungen bei humanem Blut übereinstimmt. Die für humanes Blut empfohlene Messzeit von 6 min wurde in der Studie auf 12 min verlängert, um der Aggregationskurve das Erreichen eines Plateaus zu ermöglichen, sodass die tatsächliche, maximale Aggregation erfasst werden konnte.

Tabelle 1: Referenzbereiche der „area under the curve“ (AUC) und der maximalen Aggregation für die Messung von Hundeblut für verschiedene Agonisten in ihren optimalen Konzentrationen (KALBANTNER et al. 2010).

Agonist Referenzbereich

AUC (AU*min) max. Aggregation (AU)

ADP (10 µmol/L) 1481–3448 105–234

Kollagen (5µg/mL) 2017–3460 155–246

Arachidonsäure (1 mmol/L) 1011–3457 73,9–228

(32)

18

5. Einfluss entzündlicher Erkrankungen auf die Thrombozytenfunktion

5.1. Übersicht vorhandener Studien

In der Veterinärmedizin existieren einige wenige Studien, die den Einfluss entzündlicher Erkrankungen auf die primäre Hämostase beim Hund untersucht haben. Zur Messung der Thrombozytenaggregation wurde dazu in der Mehrzahl der Studien die turbidimetrische Aggregometrie verwendet (Tab. 2). Dabei ergaben die meisten Studien eine signifikant herabgesetzte Aggregation, die unabhängig vom eingesetzten Agonisten zu sein schien. So konnte bei Hunden mit Leishmaniose (VALLADARES et al. 1998; CORONA et al. 2004) und Ehrlichiose (HARRUS et al. 1996a; BRANDAO et al. 2006) eine im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant niedrigere Thrombozytenaggregation beobachtete werden.

Lediglich bei Herzwurminfektionen (BOUDREAUX et al. 1989) und in der frühen Phase der experimentell induzierten akuten Pankreatitis (LUKASZYK et al. 1989) war die Thrombozytenaggregation erhöht. Der Stichprobenumfang war bei vielen Untersuchungen relativ klein und bei dem untersuchten Krankheitsgeschehen handelte es sich zumeist um Infektionskrankheiten.

Hinsichtlich des Einflusses entzündlicher Erkrankungen auf die Thrombozytenzahl existieren unterschiedliche Ergebnisse (Tab. 3). Die Mehrzahl der Studien konnte eine signifikant erniedrigte Plättchenzahl beobachten (NAVARRO u. KOCIBA 1982;

HAUPTMAN et al. 1997; SCHETTERS et al. 2009), es wird jedoch auch vom Fehlen signifikanter Unterschiede berichtet (BOUDREAUX et al. 1989; MORENO et al. 1998; DE LAFORCADE et al. 2003; MORITZ et al. 2005).

Neben der turbidimetrischen Aggregometrie kamen weitere Untersuchungsverfahren zur Beurteilung der Plättchenfunktion beim Hund zum Einsatz (Tab. 4). Dies waren die kapilläre Blutungszeit, die bei Hunden mit Leishmaniose verlängert war (MORENO et al.

1998), der PFA-100, bei dem eine verlängerte Verschlusszeit bei Hunden mit Endotoxämie beobachtet werden konnte (YILMAZ et al. 2005), die Durchflusszytometrie, die eine erhöhte Expression von P-Selektin auf der Thrombozytenoberfläche von Hunden mit entzündlichen Erkrankungen detektierte (MORITZ et al. 2005) und die Thrombelastografie, deren

(33)

19 Messungen eine höhere Amplitude bei Hunden mit Parvovirose aufzeigten (OTTO et al.

2000).

Studien aus der Humanmedizin, die die Thrombozytenaggregation mittels turbidimetrischer Aggregometrie untersuchten (Tab. 5), konnten in Übereinstimmung mit den Ergebnissen bei Hunden eine verminderte Aggregation bei Menschen mit Endotoxämie bzw.

Sepsis nachweisen (SABA et al. 1984; YAGUCHI et al. 2004; WOTH et al. 2011). Die beobachtete verkürzte Verschlusszeit bei Untersuchungen mit dem PFA-100 von Menschen mit Sepsis und spontaner akuter Pankreatitis hingegen weicht von den Ergebnissen beim Hund ab (HOMONCIK et al. 2000; MIMIDIS et al. 2004).

(34)

20

Tabelle 2: Übersicht der Studien zur Messung der Thrombozytenfunktion mittels turbidimetrischer Aggregometrie bei Hunden mit entzündlichen Erkrankungen.

ADP = Adenosindiphosphat, AS = Arachidonsäure, Epi = Epinephrin, exp. = experimentell, klin. = klinisch, Kol = Kollagen

Studie n

(n Kontrolle) klin. exp. Erkrankung Agonisten Ergebnisse Boudreaux et al.

(1989) 28 (34) X Herzwurm-

infektion ADP, Kol

signifikant höhere ADP- und kollagen-induzierte maximale Aggregation im Vergleich zur Kontrollgruppe

Brandão et al.

(2006) 7 (3) X Ehrlichiose ADP/Epi,

Kol/Epi

signifikant niedrigere Thrombozytenaggregation bei beiden Agonistenkombinationen

Corona et al.

(2004) 30 (10) X Leishmaniose ADP, Kol signifikant niedrigere maximale Aggregation (Kollagen > ADP)

Harrus et al.

(1996a) 6 X Ehrlichiose ADP, Kol, Epi Hemmung der Plättchenaggregation bei 5 von 6 Hunden bei mindestens einem Agonisten

Jacobs et al.

(1986) 4 (3) X akute

Pankreatitis ADP, Kol, AS signifikant niedrigere Aggregation bei allen Agonisten

Lukaszyk et al.

(1989) 10 X akute

Pankreatitis ADP, AS

erhöhte Sensitivität der Thrombozyten für ADP bis 60 min nach Induktion, signifikant niedrigere Sensitivität nach 2h und 4h; keine Unterschiede bzgl. AS-induzierter Aggregation

Valladares et al.

(1998) 6 (2) X Leishmaniose Kol signifikant niederigere kollagen-induzierte Thrombozytenaggregation

(35)

21 Tabelle 3: Übersicht der Studien zum Einfluss verschiedener entzündlicher Erkrankungen auf die Thrombozytenzahl beim Hund.

exp. = experimentell, klin. = klinisch

Studie n

(n Kontrolle) klin. exp. Erkrankung Ergebnisse Boudreaux et al.

(1989) 28 (34) X Herzwurm-

infektion keine signifikanten Unterschiede de Larforcade et

al. (2003) 20 (28) X Sepsis keine signifikanten Unterschiede Harrus et al.

(1996a) 6 X Ehrlichiose

signifikant niedrigere Thrombozytenzahl mit

Tiefpunkt zwischen Tag 17 + 24 nach der Infektion

Hauptman et al.

(1997) 30 (320) X Sepsis

signifikant niedrigere Thrombozytenzahl bei septischen Hunden im Vergleich

zu nicht-septischen Jacobs et al.

(1986) 4 (3) X akute

Pankreatitis

keine signifikanten Unterschiede, aber signifikant

niedrigere Thrombozytenzahl bei erkrankten Hunden und Kontrollgruppe post OP

Lukaszyk et al.

(1989) 10 X akute

Pankreatitis

signifikant niedrigere Thrombozytenzahl bis 4 h nach

Induktion Moreno et al.

(1998) 26 (10) X Leishmaniose keine signifikanten Unterschiede Moritz et al.

(2005) 20 (20) X Entzündung keine signifikanten Unterschiede Navarro et al.

(1982) 5 (5) X Leptospirose

signifikant niedrigere Thromobozytenzahl, niedrigste Konzentrationen an Tag 2 + 4 nach Infektion, Ausgangsniveau an Tag 10 wieder erreicht Schetters et al.

(2009) 10 X Babesiose

dramatische Abnahme der Thrombozytenzahl proportional zur Infektionsdosis.

Valladares et al.

( 1998) 6 (2) X Leishmaniose

signifikant, fortschreitend niedrigere Thrombozytentzahl, Ausgangsniveau innerhalb von 6 Monaten nach Therapie erreicht Yilmaz et al.

(2005) 17 (8) X Endotoxämie

signifikant niedrigere Thrombozytenzahl mit Tiefpunkt 0,5 h nach Infektion

(36)

22

Tabelle 4: Übersicht der Studien zum Einfluss verschiedener entzündlicher Erkrankungen auf die Thrombozytenfunktion (außer turdidimetrische Aggregometrie) beim Hund.

CADP = Kollagen/ADP-Messzelle, CEPI = Kollagen/Epinephrin-Messzelle, exp. = experimentell, klin. = klinisch, MPC = mittlere Plättchenkonzentration, PFA = Plättchenfunktionsanalysegerät, VZ = Verschlusszeit

Studie n

(n Kontrolle) Klin. Exp. Erkrankung Tests Ergebnisse

Moreno et al.

(1998) 26 (10) X Leishmaniose kapilläre Blutungszeit

signifikante Verlängerung der Blutungszeit, insbesondere bei erkrankten Hunden mit hohen Kreatininwerten

Moritz et al.

(2005) 20/20 X

gemischtes Kollektiv an

entzündl.

Erkrankungen

Durchflusszytometrie (P-Selektin), MPC

zirkulierende, aktivierte Thrombozyten bei 60%

der Hunde mit entzündlichen Erkrankungen;

MPC sensitiver als P-Selektin zur Detektion von aktiverten Plättchen

Otto et al.

(2000) 9/9 X Parvovirose Thrombelastografie signifikant höhere maximale Amplitude im Vergleich zur Kontrollgruppe

Yilmaz et al.

(2005) 17 (8) X Endotoxämie

(E.coli)

PFA-100, Hämatokrit

verkürzte VZ 0,5 h (CADP + CEPI) und verlängerte VZ 1 h (CEPI) bzw. 2 h (CADP) nach Endotoxin-Applikation; bei hochdosiertem Endotoxin VZ auch nach 48 h noch verlängert;

keine signifikanten Veränderungen hinsichtlich Htk.

(37)

23 Tabelle 5: Übersicht der Studien zum Einfluss verschiedener entzündlicher Erkrankungen auf die Thrombozytenfunktion beim Menschen.

ADP = Adenosindiphosphat, AS = Arachidonsäure, CADP = Kollagen/ADP-Messzelle, CEPI = Kollagen/Epinephrin-Messzelle, Epi = Epinephrin, exp. = experimentell, klin. = klinisch, Kol = Kollagen, PFA = Plättchenfunktionsanalysegerät, VZ = Verschlusszeit

Studie n

(n Kontrolle) klin. exp. Erkrankung Tests Ergebnisse

Homoncik et al.

(2000) 20 (10) X Sepsis PFA-100 verkürzte VZ sowohl bei Messungen mit CADP als auch mit CEPI

Mimidis et al.

(2004) 16 (32) X akute

Pankreatitis ^PFA-100

verkürzte VZ bei Messungen mit CADP, keine signifikanten Unterschiede im Vergleich zur Kontrollgruppe bei Messungen mit CEPI

Saba et al.

(1984)

nicht

spezifiziert in vitro Endotoxämie

turbidimetrische Aggregometrie (ADP, Kol, AS)

signifikant niedrigere Plättchenaggregation bei allen Agonisten, Hemmung proportional zur Endotoxin- Konzentration

Whitworth et al.

(1989)

nicht

spezifiziert in vitro Endotoxämie

turbidimetrische Aggregometrie (ADP, Kol, EPI);

Impedanzaggregometrie (ADP, Kol)

Impedanzaggregometrie: signifikant höhere kollagen-induzierte Aggregation

turbidimetrische Aggregometrie: signifikant höhere epinephrin-induzierte Aggregation + signifikant niedrigere kollagen-induzierte Aggregation (S.enteritidis)

Woth et al.

(2011) 45 (30) X Sepsis

turbidimetrische Aggregometrie (ADP, Kol, Epi)

signifikant niedrigere Aggregation bei allen Agonisten

Yaguchi et al.

(2004) 47 (15) X Sepsis

turbidimetrische Aggregometrie (ADP, Kol, AS)

signifikant niedrigere Thrombozytenaggregation bei allen septischen Patienten, unabhängig vom verwendeten Agonisten; AS-induzierte Aggregation am deutlichsten erniedrigt

(38)

24

5.2. Pathogenese entzündlich bedingter Thrombozytendysfunktionen

5.2.1. Thrombozytopenie als Ursache der verminderten Aggregation

Viele entzündliche Erkrankungen sind mit einer Thrombozytopenie assoziiert (HAUPTMAN et al. 1997; VALLADARES et al. 1998; SCHETTERS et al. 2009). Diese kann das Resultat eines erhöhten Verbrauchs, einer beeinträchtigten Produktion oder einer gestörten Verteilung sein (FELDMAN et al. 1988). Darüber hinaus kann das Auftreten von Anti-Plättchen Antikörpern (s. Kap. 5.2.3.) eine Thrombozytopenie verursachen (TERRAZZANO et al. 2006). Eine Studie von GRINDEM et al. (1991) fand heraus, dass die Thrombozytopenie von 987 Hunden in 23% der Fälle entzündlich bzw. infektiös bedingt war.

Eine mögliche Thrombozytopenie ist außerdem von Interesse bei der Auswertung der Aggregationsmessungen. So konnte gezeigt werden, dass Thrombozytenzahlen unter 100 x10³/µL zu einer deutlichen Abnahme der turbidimetrisch erfassten Aggregation führen (RAND et al. 2003; ZHOU u. SCHMAIER 2005). Im Fall der Impedanzaggregometrie haben bereits Thrombozytenzahlen von unter 150 x10³/µL einen negativen Einfluss auf die Messergebnisse (MENGISTU et al. 2009).

Eine Thrombozyopenie ist sicherlich in vielen Fällen maßgeblich an einer verminderten Thrombozytenaggregation beteiligt (VALLADARES et al. 1998; YILMAZ et al. 2005), doch haben verschiedene Studien immer wieder gezeigt, dass auch in Fällen mit Thrombozytenzahlen im Normalbereich eine Hemmung der Plättchenfunktion auftritt (MORENO et al. 1998; MORITZ et al. 2005). Aus diesem Grund müssen weitere Mechanismen existieren, die eine gestörte Thrombozytenfunktion verursachen.

5.2.2. Thrombozytenfunktions“erschöpfung“

MORITZ et al. (2005) vermuten aufgrund des Nachweises einer erhöhten P-Selektin- Expression auf der Thrombozytenoberfläche, dass Hunde mit entzündlichen Erkrankungen vermehrt zirkulierende, aktivierte Thrombozyten aufweisen. Diese können in vitro teilweise hypofunktional erscheinen, da sie durch die vorangegangene Aktivierung in vivo refraktär gegenüber einer weiteren Aktivierung sind. Ähnliches konnte bei Menschen mit Morbus Crohn (COLLINS et al. 1994) und Sepsis (GAWAZ et al. 1995) beobachtet werden.

PEERSCHKE (1985) fand heraus, dass diese Refraktärphase mit einer gehemmten

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25 intrathrombozytären Ca²⁺-Mobilisation und dem Unvermögen, Fibrinogen zu binden einhergeht. Dies würde letztendlich in einer verminderten Aggregationsfähigkeit resultieren.

Andere Autoren bezeichnen dieses Phänomen als „Erschöpfung“ der Thrombozytenfunktion, die auch im Rahmen der caninen Ehrlichiose (BRANDAO et al. 2006) und bei Hunden mit akuter Pankreatitis (JACOBS et al. 1986) beobachtet wurde. Diese Thrombozyten zirkulieren weiterhin im Blut und beeinflussen somit mögliche Messungen in vitro (J. R. O'BRIEN 1978).

5.2.3. Anti-Plättchen Antikörper

Im Serum von an Ehrlichiose oder Leishmaniose erkrankten Hunden konnten Anti- Plättchen Antikörper nachgewiesen werden. Im Fall der Leishmaniose besteht ein Zusammenhang zwischen klinischem Stadium der Erkrankungen, der Thrombozytenzahl und dem Auftreten von Antikörpern (TERRAZZANO et al. 2006), während im Fall einer Ehrlichiose Anti-Plättchen Antikörper insbesondere in der akuten Phase vorhanden sind (HARRUS et al. 1996b). Die Eliminierung durch die Antikörper führt zu einer Thrombozytopenie, während eine Bindung der Antikörper an die Thrombozytenoberfläche, v.a. wenn diese an Rezeptoren erfolgt, eine Thrombozytendysfunktion hervorrufen kann. In einer weiteren Studie von HARRUS et al. (1996a) kam es aber auch dann zu einer Hemmung der Thrombozytenaggregation, wenn keine Antikörper mehr vorhanden waren. Diese Beobachtung spricht dafür, dass es weitere Faktoren geben muss, die zu einer Thrombozytenfunktionstörung führen.

5.2.4. Einfluss von Endotoxinen/Lipopolysacchariden (LPS) auf die Thrombozytenfunktion

Studien konnten zeigen, dass Endotoxine bzw. LPS über verschiedene Mechanismen Einfluss auf die Thrombozytenfunktion nehmen können (SABA et al. 1984; YAGUCHI et al.

2004; WOTH et al. 2011). So konnte gezeigt werden, dass Endotoxine in der Lage sind, direkt an Thrombozyten zu binden und auf diese Weise die Thrombozytenfunktion zu beeinträchtigen (SALDEN u. BAS 1994). Darüber hinaus können LPS das Endothel der Gefäßwand schädigen (HARLAN et al. 1983) und zu einer gesteigerten Expression von Adhäsionsmolekülen auf dem Endothel führen (JILMA et al. 1999) und im Speziellen die

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26

vermehrte Freisetzung von vWF induzieren (GRALNICK et al. 1989). Dies resultiert in einen erhöhten Verbrauch an Blutplättchen, was eine Thrombozytopenie zur Konsequenz hat. Ein weiterer Mechanismus wird von NYSTROM et al. (1994) beschrieben, die eine herabgesetzte Reaktionsfähigkeit der Thrombozyten von Patienten mit Endotoxämie gegenüber dem Agonisten Epinephrin feststellen konnten und dies auf einen Mangel an Adrenorezeptoren auf der Thrombozytenoberfläche zurückführten. Ähnliches konnte in einer Studie von SABA et al. (1984) für den Agonisten bzw. Metaboliten TxA₂beobachtet werden. Das stark reduzierte Ansprechen der Thrombozyten auf TxA2 scheint das Resultat einer Hemmung der Plättchendegranulation und einer Beeinträchtigung des Calciumtransports zu sein.

5.2.5. Aggregationsinduktion durch zirkulierende Immunkomplexe

Immunkomplexe sind in der Lage, über einen thrombozytären IgG-Rezeptor, den FcγIIA-Rezeptor, eine Agglutination der Plättchen zu induzieren (CLARK et al. 1982).

Antikörper des Immunkomplexes binden an den auf der Thrombozytenoberfläche exprimierten FcγIIA-Rezeptor und führen dadurch zu einer Agglutination der Thrombozyten (SJOBRING et al. 2002; JANCAR u. SANCHEZ CRESPO 2005). Zirkulierende Immunkomplexe wurden bereits im Rahmen der caninen Leishmaniose nachgewiesen (PUMAROLA et al. 1991; LOPEZ et al. 1996).

5.2.6. Microbial surface components reacting with adhesive matrix molecules (MSCRAMMs)

Auf der Oberfläche grampositiver Bakterien (insbesondere Staphylokokken) konnte eine Gruppe von Oberflächenadhesinen, sogenannte „microbial surface components reacting with adhesive matrix molecules“ (MSCRAMMs) identifiziert werden, die u.a. die Adhäsion an und Aktivierung von Thrombozyten bewirken können (PATTI et al. 1994). Zu diesen MSCRAMMs zählt auch der clotting factor A (ClF A), an den sowohl Fibrinogen als auch spezifische Antikörper binden können. Das gebundene Fibrinogen kann, da es aufgrund der Immobilisation eine Konformationsänderung erfährt, an den inaktiven GPIIa/IIIb-Rezeptor auf der Thrombozytenoberfläche binden und somit über Brückenbildung eine Vernetzung der Thrombozyten induzieren (PATTI et al. 1994). Des Weiteren führt der an den ClF A gebundene Antikörper über Bindung an den thrombozytären FcγIIA-Rezeptor zur Aktivierung

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27 des Thrombozyten (LOUGHMAN et al. 2005). Eine Studie von KERRIGAN et al. (2008) zeigte außerdem, dass die alleinige Bindung des Fibrinogen-ClF A-Komplexes an den Thrombozyten nicht ausreicht, um eine vollständige Aggregation zu induzieren. Erst die simultane Bindung von Fibrinogen und Antikörpern an den ClF A ermöglicht dies. Dieser Pathomechanismus kann somit letztendlich die Anzahl der refraktären Thrombozyten erhöhen und somit eine gehemmte in vitro Aggregation hervorrufen.

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III Material, Tiere und Methoden

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III Material, Tiere und Methoden

1. Material

1.1. Geräte und Bezugsquellen

Beckman Coulter GmbH, Krefeld Allegra™ 6 KR Centrifuge

Dynabyte Informationssysteme GmbH, München Multiplate® 5.0 Analyzer

ERKA. Kallmeyer Medizintechnik GmbH & Co. KG, Bad Tölz Pädiatrisches Sphygomanometer

Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Mannheim ACCU-CHEK Softclix® Classic

Rolf Greiner Biochemica GmbH, Flacht APACT 4

Siemens Healthcare Diagnostics GmbH, Eschborn Advia 120 Hematology System

Dade PFA-100

Sigma Laborzentrifugen GmbH, Osterode am Harz Sigma 1-14 Mikrozentrifuge

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29 1.2 Reagenzien, Verbrauchsmaterial und Bezugsquellen

B.Braun Melsungen AG, Melsungen Isotone Kochsalzlösung 0,9%

Softasept® N Hautdesinfektionsmittel Becton Dickinson GmbH, Drogheda, Irland

BD Microlance™ 3 sterile Kanüle 1,2 x 40 mm (18G x 1 ½ “) (rosa) Bioanalytic GmbH, Umkirch/Freiburg

Natriumcitratlösung 0,11 mol/L BioHit Oyj, Helsinki, Finnland BioHit Optifit Tip 350 µL

Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, Ingelheim am Rhein Finalgon® Capsicum Creme 26,5 mg/50 g

Brand Plastibrand® GmbH, Wertheim Pipettenspitzen 50-1000 μl, blau Pipettenspitzen 2-100 μl, gelb Dynabyte GmbH, München

Multiplate® ADPtest (Adenosindiphosphat) Multiplate® COLtest (Kollagen)

Multiplate® ASPItest (Arachidonsäure)

Dynabyte Informationssysteme GmbH, München Multiplate® 4,5 ml Hirudin Blood Tube

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Eppendorf AG, Hamburg

Einkanal Pipette Reference® (variabel) 10-100 μl, 100-1000 μl Einkanal Pipette Reference® (fix) 25 μl, 50 μl, 200 μl

Eppendorf Reaktionsgefäße 3810 (1,5ml) LABiTec GmbH, Ahrensburg

Micro cuvettes + Mixer micro (1x4mm)

Sarstedt Aktiengesellschaft & Co., Nürnbrecht

1,3 ml-Mikroprobengefäße mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (1,6 mg/ml) 1,3 ml-Mikroprobengefäße mit Tri-Natrium-Citrat-Lösung (0,13 ml Citratlösung) Röhre 10 ml, 95 x 16,8 mm, PS

S-Monovette® 3,8 ml 9 NC (PFA)

Siemens Healthcare Diagnostics GmbH, Eschborn DADE® PFA Collagen/EPI Test Cartridge

DADE® PFA Collagen/ADP Test Cartridge Terumo Europe N.V., Leuven, Belgien

Terumo® sterile Kanüle 0,9 x 40 mm (20G x 1 ½ “) (gelb) Verum Diagnostica GmbH, München

Multiplate® Messzellen

2. Studiendesign

Im ersten Teil der Dissertation wurden Messungen von 134 Proben von 117 Hunden mit unterschiedlichen Erkrankungen und 83 klinisch gesunden Hunden mit dem Multiplate®

Aggregometer durchgeführt. Dabei kamen 3 verschiedene Agonisten in ihren optimalen Konzentrationen zum Einsatz (s.u.) und die Parameter “area under the curve“ (AUC) und

“maximale Aggregation” wurden nach Testzeiten von 6 min, 8 min, 10 min und 12 min

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31 berechnet. Basierend auf den gesunden Hunden wurden Referenzwerte für die jeweiligen Messzeiten und Agonisten erstellt und die Messergebnisse der erkrankten Hunde in Relation dazu in erniedrigt, normal und erhöht eingeteilt. Die Verteilung innerhalb dieser Kategorien wurde zu den unterschiedlichen Messzeiten verglichen. Zusätzlich wurden 8 Proben mit definierter Aggregationsschwäche von 4 klinisch gesunden Hunden, die mit dem Thrombozytenaggregationshemmer Clopidogrel behandelt wurden, untersucht. Die Hunde erhielten Clopidogrel in einer Dosierung von 2–4 mg/kg/d per os an 3 aufeinanderfolgenden Tagen und die Blutproben wurden an Tag 3 und 4 entnommen. Da kein Effekt auf eine Kollagen-induzierte Aggregation zu erwarten war, wurden nur die Agonisten ADP und AS verwendet. Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte wie bereits beschrieben.

Im zweiten Teil der Dissertation erfolgte die Untersuchung der Thrombozytenfunktion 25 entzündlich erkrankter Hunde und einer Kontrollgruppe (n=27–69) mittels kapillärer Blutungszeit, automatischer Plättchenfunktionsanalyse mit dem

Plättchenfunktionsanalysegerät PFA-100, turbidimetrischer

Thrombozytenaggregationsmessung nach Born, Vollblutimpedanzaggregometrie mit dem Multiplate® Aggregometer, Thrombozytenzahl und Hämatokrit. Die Messergebnisse der erkrankten Hunde wurden mit denen der Kontrollgruppe verglichen. Die erkrankten Hunde wurden außerdem in zwei Gruppen eingeteilt: SIRS (n=15) und NonSIRS (n=10), basierend auf den Kriterien des systemischen inflammatorischen Response-Syndroms. Demnach mussten mindestens zwei der folgenden Befunde gegeben sein, um eine Zuordnung zur SIRS- Gruppe vorzunehmen: Herzfrequenz > 120/min, Atemfrequenz > 20/min, Körpertemperatur

< 38°C oder > 39°C, Leukozytenzahl > 18.000 oder < 5.000 (modifiziert nach HAUPTMAN et al., 1997). Die zwei Gruppen wurden miteinander verglichen.

3. Tiere

Die 117 erkrankten Hunde im methodischen ersten Teil der Arbeit waren Patienten der Kleintierklinik der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Sie umfassten 67 Patienten mit Neoplasien (22 maligne Lymphome, 10 Leukämien, 15 Karzinome (inkl. 4 Mammakarzinome), 7 maligne Histiozytosen, 3 Hämangiosarkome, 2 multiple Myelome und 8 Hunde mit jeweils 1 anderen Neoplasie), 14 Hunde mit nicht-neoplastischen Hepatopathien (7 portosystemische Shunts, 5 degenerative Hepatopathien und 2 andere), 18 mit lokalen oder