Medizinische Hochschule Hannover
Zentrum Physiologie, Institut für Molekular- und Zellphysiologie
Familiäre Hypertrophe Cardiomyopathie
Funktionelle Charakterisierung zweier Punktmutationen in der schweren Kette des Myosins von Einzelfasern des humanen M. soleus
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin an der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von
Dejan List geb. Vujević
aus Düsseldorf
August 2009
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 27.04.2010
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann
Betreuerin der Arbeit: Prof. Dr. rer. nat. Theresia Kraft
Referent: Prof. Dr. med. Dietmar Manstein Korreferent: Prof. Dr. Kai Wollert
Tag der mündlichen Prüfung: 27.04.2010
Promotionsausschussmitglieder:
Prof. Dr. Sigurd Lenzen
Prof. Dr. Evgeni Ponimaskin
Prof. Dr. Reinhard Schwinzer
Inhaltsverzeichnis
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I N H A L T S V E R Z E I C H N I S
INHALTSVERZEICHNIS ... 2
EINLEITUNG ... 4
FAMILIÄRE HYPERTROPHE CARDIOMYOPATHIE (FHC) ... 4
Definition ... 4
Histologie und Morphologie ... 4
Genetische Basis der FHC ... 8
PHYSIOLOGIE DES MUSKELS ... 10
Aufbau der Skelett- und Herzmuskulatur ... 10
Das Aktinmolekül (“dünnes Filament“) ... 11
Das Myosinmolekül („dickes Filament“) ... 12
DER QUERBRÜCKENZYKLUS ... 13
Der Querbrückenzyklus auf molekularer Ebene ... 15
Kinetik des Querbrückenzyklus ... 18
Kinetik der reversiblen Anheftung und Ablösung der Myosinköpfe an/von Aktin in den verschiedenen Zuständen ... 22
FRAGESTELLUNG ... 24
MATERIAL UND METHODEN ... 26
PATIENTEN UND MUSKELPROBEN ... 26
PRÄPARATION EINZELNER MUSKELBÜNDEL ... 27
Gewinnung von Einzelfasern ... 28
Montierung der Einzelfaser in die Versuchsapparatur ... 28
DIE VERSUCHSAPPARATUR ... 29
VERSUCHSABLAUF ... 32
Überprüfung der Myosinisoformen ... 32
Messung der maximalen isometrischen Kraft und der Geschwindigkeitskonstanten für den Kraftwiederanstieg ... 34
Messung der maximalen isometrischen Kraft bei verschiedenen Calciumkonzentrationen ... 35
Messung der maximalen lastfreien Verkürzungsgeschwindigkeit (Slacktest) ... 37
Inhaltsverzeichnis
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Messung der ATPase-Aktivität ... 39
Messung der Fasersteifheit ... 41
STATISTISCHE DARSTELLUNG DER GEWONNENEN DATEN ... 41
MATERIALIEN UND VERSUCHSLÖSUNGEN ... 43
ERGEBNISSE ... 46
MESSUNG DER MAXIMALEN ISOMETRISCHEN KRAFT ... 46
MESSUNG DER GESCHWINDIGKEITSKONSTANTEN FÜR DEN KRAFTWIEDERANSTIEG, KREDEV49 MESSUNG DER MAXIMALEN LASTFREIEN VERKÜRZUNGSGESCHWINDIGKEIT VMAX (SLACKTEST) ... 51
MESSUNG DER FASER-ATPASE-AKTIVITÄT ... 52
MESSUNG DER AKTIVEN STEIFHEIT IM RIGOR ... 54
MESSUNG DER ABHÄNGIGKEIT DER ISOMETRISCHEN KRAFT VON DER CALCIUM - KONZENTRATION ... 56
ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE ... 59
DISKUSSION ... 60
KRITISCHE BETRACHTUNG DER METHODEN ... 60
WELCHE MECHANISMEN LIEGEN DEN GEMESSENEN MUTATIONSEFFEKTEN ZUGRUNDE? ... 62
Converter-Mutation Arg 723 Gly ... 63
Mutation Arg 453 Cys, nahe der Nukleotidbindungstasche ... 65
Auswirkungen der Mutation Arg 453 Cys auf die Kraft-pCa-Kurve der Fasern .... 66
ZUSAMMENHANG ZWISCHEN MUTATIONSEFFEKTEN UND LOKALISATION DER MUTATIONEN IM MYOSINKOPF ... 67
BEZUG DER ERGEBNISSE ZUM PATHOMECHANISMUS VON FHC ... 69
Calciumempfindlichkeit der Muskelfasern ... 71
ZUSAMMENFASSUNG ... 72
LITERATURVERZEICHNIS ... 74
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ... 86
LEBENSLAUF ... 87
ERKLÄRUNG ... 89
DANKSAGUNG ... 90
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E i n l e i t u n g
Die Familiäre Hypertrophe Cardiomyopathie (FHC) ist eine autosomal-dominant vererbte Erkrankung des Herzens. Mit einer Prävalenz zwischen 1: 500 und 1: 1000 ist sie relativ häufig (Maron et al., 1995; Seidman und Seidman, 2001). Im englischen Sprachraum ist der Begriff HCM (Hypertrophic Cardiomyopathy) oder HOCM (Hypertrophic obstructive Cardiomyopathy) üblich. Als Ursache sind in erster Linie Mutationen in verschiedenen Genen, welche Proteine der Sarkomere kodieren, anzusehen. Heute sind mehr als 450 verschiedene Mutationen auf 16 Genen bekannt (Fokstuen et al., 2008). Als Erstbeschreiber dieser Erkrankung gilt Alfred Vulpian, der bereits im Jahre 1868 diese Krankheit beschrieb (Vulpian, 1868).
Familiäre Hypertrophe Cardiomyopathie (FHC)
Definition
Die Familiäre Hypertrophe Cardiomyopathie wird definiert als eine Erkrankung des Herzens, bei der es zu einer meist asymmetrischen Verdickung des Myokards des linken Ventrikels kommt (Abb. 1). Dabei gibt es scheinbar keine äußeren Ursachen für diese Verdickung. Es handelt sich also nicht um eine Hypertrophie des Myokards infolge anderer systemischer oder kardialer Erkrankungen, wie z.B. arterieller Hypertonus.
Histologie und Morphologie
Betrachtet man Herzmuskelzellen von an FHC erkrankten und verstorbenen Patienten unter dem Mikroskop, so ist die sonst vorhandene Struktur und Ordnung zum Teil aufgehoben (Abb. 2). Es fällt eine ungeordnete zelluläre Architektur mit verformten Myozyten und multiplen interzellulären Verbindungen auf (Maron 2002). Maron beschrieb, dass dieser
“cellular disarray“ bis zu 25 % der Ventrikelwand und 33 % des Septums einnehmen kann (Maron et al., 1987a; Maron et al., 1987b). Andererseits ist die Myokardhypertrophie nicht obligat im Zusammenhang mit Disarray. Disarray kann bereits vor der Muskelverdickung beobachtet werden (Varnava et al., 2000) und ist möglicherweise für die häufigen
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Herzrhythmusstörungen bei FHC – Patienten verantwortlich. In der Histologie wurden außerdem eine Zunahme des interstitiellen Kollagens des Myokards sowie eine Verminderung der Lumengröße der kleinen Gefäße bedingt durch die initiale Kollagenvermehrung in Intima und Media (“small – vessel disease“) beschrieben (Maron 1997). Durch diese Veränderungen wird die Durchblutungssituation des Myokards verschlechtert. Die Gefahr einer Myokardischämie ist erhöht. Als Folge kann es zu einer Fibrosierung des Areals kommen. Dies führt wiederum zu einer weiteren Verschlechterung der Pumpleistung des Herzens.
Abb. 1) Links: zeigt das Herz mit hypertrophem linken Ventrikel eines 12 Jahre alten Mädchens im Längsschnitt, das während eines Dauerlaufs an einem plötzlichen Herztod verstarb. Rechts: zeigt das Herz des Mädchens im Querschnitt (Hasegawa 1994)
Klinik und Befunde
Es gibt kein einheitliches oder typisches Symptom der hypertrophen Cardiomyopathie. So vielfältig die genetischen Ursachen der Erkrankung sind, so unterschiedlich fallen die klinischen Symptome aus. Diese reichen von völliger Beschwerdefreiheit bis zum plötzlichen Herztod. Dennoch gibt es Symptome, die bei relativ vielen Patienten zu beobachten sind. Zu
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diesen gehören Herzrhythmusstörungen bzw. Palpitationen, Belastungs- und selten auch Ruhedyspnoe, Brustschmerzen und gelegentlich Synkopen (Pellnitz et al., 2005). Letztere sind als Folge der Rhythmusstörungen und des damit möglichen Abfalls des Blutdruckes zu werten. Als gravierendste Komplikation der Krankheit ist der plötzliche Herztod zu sehen.
Patienten mit FHC haben ein deutlich erhöhtes Risiko, einen plötzlichen Herztod zu erleiden.
Tragisch ist die Tatsache, dass diese Patienten häufig bis dahin keinerlei Symptome aufweisen und dies die erste klinische Manifestation von FHC ist (Hughes 2004).
Abb. 2) Zelluläres Disarray in der Herzmuskulatur bei einem FHC-Patienten (Hasegawa 1994)
Diagnostik
Wie oben bereits erwähnt, gibt es viele unterschiedliche klinische Ausprägungen der FHC.
Gemeinsam haben sie jedoch die Untersuchungen, die zur Diagnose Familiäre Hypertrophe Cardiomyopathie führen. Das einfach durchzuführende Elektrokardiogramm (EKG) ist der erste Schritt. Das EKG zeigt oft typische Veränderungen im Sinne von Hypertrophiezeichen, überwiegend der linken Kammer. Ebenso sind Herzrhythmusstörungen zu finden. Eine weitere Maßnahme ist die Echokardiographie, kurz Echo, eine Ultraschalluntersuchung des Herzens. Mit dieser Untersuchung lassen sich Aussagen über Herzfunktion, Herzwanddicke,
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Septumdicke, Füllungs- und Auswurfverhältnisse machen. Typisch ist eine erkennbare Verdickung der linken Ventrikelwand oder des Septums, am häufigsten im apikalen Bereich gelegen. Beträgt die physiologische Dicke der Septumwand nicht mehr als 12 mm, so liegt diese bei der FHC zwischen 13 und 60 mm (Abb. 1). In letzter Zeit kam ein weiteres Hilfsmittel zur Diagnostik zum Zug, die Magnet – Resonanz – Tomographie (MRT). Diese ermöglicht etwas genauere Aussagen über anatomische Veränderungen von Patienten als das Echo. Abb. 3 zeigt den Unterschied in der Darstellung.
Abb. 3) Links: Echokardiographische Darstellung des linken Ventrikels. Der Signalverlust im Bereich der antero-lateralen Wand (Kunst et al. 2000) macht das Echokardiogramm nicht voll aussagefähig. Rechts:
die Darstellung mittels MRT erlaubt eine einfache und genaue Beschreibung der Morphologie aller Herzregionen und eine Aussage über die Hypertrophie der antero-lateralen Ventrikelwand (Kunst et al.
2000). (Abb. aus “MRI in the Diagnosis of Hypertrophic Cardiomyopathy”, Dr. M. Lombardi Pisa, Italy)
Therapie
Zurzeit stellt die medikamentöse Behandlung den wichtigsten Teil der Therapie dar. Dazu gehören vor allem Beta – Blocker (z.B. Metoprolol), Calcium – Antagonisten (z.B.
Verapamil) und Antiarrhythmika wie Amiodaron. Welches Präparat im Einzelfall verwendet werden sollte, hängt von den individuell ausgeprägten Symptomen und von eventuellen Nebenerkrankungen oder Kontraindikationen ab. Eine Applikation bei Kindern oder
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Verwandten von Betroffenen zur Prävention bleibt umstritten (Maron, 2002).
Bei medikamentös nicht ausreichend behandelbaren Rhythmusstörungen (Maron, 2002;
McKenna, 2000) oder bei Hypertrophie der linken Ventrikelwand von > 30mm (Spirito und Maron, 2001) ist die Implantation eines Kardioverter-Defibrillators zu erwägen. Chirurgische Eingriffe direkt am Herzen wie zum Beispiel eine Myektomie werden in bestimmten Zentren vorgenommen. Ihre Ergebnisse werden in Studien mit herkömmlichen Therapien verglichen (McRae 2007). Als weitere aktuelle Alternative zur Myektomie wird die Alkohol-Septum- Ablation (ASA) angesehen und in mehreren Arbeiten mit der Myektomie verglichen.
Genetische Basis der FHC
Die Zahl der bekannten Mutationen, die für die Familiäre Hypertrophe Cardiomyopathie verantwortlich sind, hat sich im Laufe der Jahre um ein Vielfaches erhöht. Zurzeit sind mehr als 450 Mutationen auf 16 verschiedenen Genen bekannt (Tab. 1; Fokstuen et al. 2008).
Zumeist handelt es sich um Punktmutationen, bei denen eine einzelne Aminosäure des betroffenen Proteins durch eine andere Aminosäure ausgetauscht wird. So sind Mutationen in vielen funktionell unterschiedlichen Proteinen bekannt. Vier Gene kodieren die Proteine der dicken Filamente: MYH7 für die «β-myosin heavy chain» (Übersicht in Palmiter und Solaro, 1997), MYH6 für die «α-myosin heavy chain» (β/α-MHC), MYL3 für die «essential myosin light chain» (MLC-1) (Marian und Roberts, 1998), MYL2 für die «regulatory myosin light chain» (MLC-2) (Marian und Roberts, 1998); fünf Gene kodieren die dünnen Filamente:
ACTC für das «a-cardiac actin» (a-cAct), TNNT2, TNNI3 und TNNC1 für die «cardiac troponins» T (Thierfelder et al., 1994), I (Kimura et al., 1997) und C (cTnT , cTnI und cTnC) und TPM1 für das a-Tropomyosin (Thierfelder et al., 1994). MYBPC3 kodiert für das «cardiac myosin- binding protein C» (cMyBP-C) (Bonne et al., 1995), welches im Sarkomer transversal angeordnet ist und Bindungsstellen für MHC und Titin hat. TTN kodiert für Titin, das dritte Filamentprotein und CRP3 das «muscle LIM protein» (MLP), welches ein Protein der Z-Zone ist und den kontraktilen Apparat stabilisiert. Kürzlich wurde eine FHC-assoziierte Mutation in der Promotorregion des Phospholamban Gens (PLN) beschrieben.
Möglicherweise ist MLP an einem intrazellulärem „stretch-sensing“-Mechanismus beteiligt (Knöll et al., 2002).
Auch Mutationen im nicht kodierenden Teil der DNA, z. B. an Splice Donor-Stellen und Insertions-Deletions-Polymorphismen, sind nachgewiesen worden (Rottbauer et al., 1997;
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Seidman und Seidman, 2001). Kürzlich wurde eine FHC-assoziierte Mutation in der Promotorregion des Phospholamban Gens (PLN) beschrieben (Minamisawa et al., 2003).
Mehr als ein Drittel der bekannten Mutationen betrifft die β-MHC, welche sich auf Chromosom 14 im MYH7-Gen befindet (Towbin und Bowles, 2002; Yu et al., 1993), ein weiteres Drittel entfällt auf das kardiale CMyBP (Tab. 1). Überwiegend handelt es sich um heterozygote Träger der Mutationen, homozygote Mutationen wurden nur in Einzelfällen beschrieben (Richard et al., 2000).
Tab. 1) Übersicht über die Lokus-Heterogenität bei familiärer hypertrophen Cardiomyopathie (FHC) aus Fokstuen et al., 2008
Die große Variabilität der Ausprägung der Erkrankung kann nicht alleine auf die vielen unterschiedlich lokalisierten Mutationen zurückgeführt werden. So kann es auch Schwankungen der Penetranz innerhalb derselben Familie geben. Die Ausprägung ist abhängig von Alter, Geschlecht, Lebensweise und Umweltfaktoren, desweiteren aber auch von noch unbekannten Faktoren. Diskutiert werden hier Gene, die die Calciumregulation (Bonne et al., 1998; Fatkin et al., 2000; Force et al., 1999; Haq et al., 2001; Ritter et al., 2002;
Semsarian et al., 2002; Towbin et al., 1999) und die Expression von Proto-Onkogenen modulieren (Kai et al., 1998). Desweiteren gibt es erhebliche Unterschiede in der Expressionsrate der mutierten Proteine. Dazu wird auf die Untersuchungen von Nier et al., 1999 und Schulte et al., 2002 verwiesen. Nier untersuchte den Anteil mutierten Myosins am Gesamtmyosin, das in den kontraktilen Apparat des Muskelgewebes von erkrankten Patienten eingebaut wird. Dabei ergaben sich z. B. für die Mutation Val 606 Met und Gly 584 Arg nur 12 bzw. 23% mutiertes Myosin und ein entsprechend großer Anteil nicht-mutiertes Myosin.
Schulte et al. fanden entsprechend geringere Anteile mutierter β-MHC-mRNA in den Muskelbiopsien (Schulte et al., 2002). Weitere Untersuchungen (unveröffentlicht) in der Arbeitsgruppe an verschiedenen Mutationen deuten auf eine Korrelation zwischen dem Anteil
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mutierten Myosins und dem Schweregrad der Erkrankung hin. Beispielweise sind Patienten mit den Mutationen Val 606 Met und Gly 584 Arg nahezu asymptomatisch, diese FHC- Mutationen sind als benigne anzusehen.
Zum besseren Verständnis der in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen zur Charakterisierung der Mutationen folgt nun die ausführliche Beschreibung der mikroskopischen Anatomie und Physiologie der quergestreiften Muskulatur und des Querbrückenzyklus auf molekularer Ebene. Anschließend wird zu den untersuchten Mutationen Stellung genommen.
Physiologie des Muskels
Das Muskelgewebe des Menschen ist grundsätzlich in zwei Arten zu unterteilen, in die quergestreifte Skelettmuskulatur und die glatte, unwillkürlich innervierte Muskulatur. Eine Sonderstellung hat das Herz, welches ein gemischtes Bild dieser beiden Gewebsformen darstellt. Grundsätzlich ist Herzmuskulatur aber quergestreifte Muskulatur. Die Skelettmuskulatur ist willkürlich innerviert, d.h. durch den Menschen beeinflussbar und kontrollierbar.
Aufbau der Skelett- und Herzmuskulatur
Bestandteile der Muskulatur sind einzelne Muskelfasern, welche zu Bündeln zusammengefasst sind. Die einzelne Muskelfaser besteht wiederum aus einzelnen Myofibrillen. Diese bestehen im Wesentlichen u.a. aus zwei kontraktilen Proteinen, Aktin und Myosin. Aktin ist in regelmäßiger Anordnung in den sogenannten Z – Scheiben verankert. Der Abschnitt zwischen zwei Z – Scheiben wird als Sarkomer bezeichnet und stellt gewissermaßen die kleinste funktionelle Einheit der Muskulatur dar. In der Mitte des Sarkomers liegen an die tausend „dicke“ Filamente pro Myofibrillenquerschnitt aus Myosin mit einem Durchmesser von etwa 10 nm. Betrachtet man eine Muskelfaser im Lichtmikroskop, erkennt man eine gewisse Hell – Dunkel – Bänderung der Sarkomere. Diese namensgebende Querstreifung basiert eben auf jener besonders regelmäßigen Anordnung der Aktin-und Myosinfilamente. Diese Besonderheit der Querstreifung findet sich nur in der Skelettmuskulatur und in der Herzmuskulatur. Abb. 4 zeigt den schematischen Aufbau einer Muskelzelle.
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Das Aktinmolekül (“dünnes Filament“)
Bei Aktin handelt es sich um ein globuläres Protein mit einem Molekulargewicht von 42 kDa.
Es wird in zwei gleich große Domänen unterteilt, welche wiederum jeweils in zwei Subdomänen gegliedert werden können. Die vier Domänen dienen der ATP- und ADP- Bindung sowie der Bindung mit Myosin (Holmes 1996). Die Aktinmonomere (G-Aktin) polymerisieren zu fibrillären Aktinfäden (F-Aktin). Im physiologischen Milieu entstehen die Aktinfilamente, welche durch hydrophobe Wechselwirkungen zusammengehalten werden.
Räumlich gesehen besteht das Aktinfilament aus zwei umeinander gewundenen perlförmigen Ketten. Elektronenmikroskopisch hat es daher die Form einer Doppelhelix. In regelmäßigen Abständen sind die Aktinfilamente mit Troponinmolekülen besetzt, während in den Längsrinnen zwischen den Ketten das Tropomyosin lokalisiert ist. Das Troponin ist in weitere Untereinheiten zu gliedern, das Troponin C (Calcium bindende Untereinheit), Troponin T (Tropomyosin-assoziierte Untereinheit) und Troponin I (inhibitorische 'Untereinheit). Sowohl das Troponin als auch das Tropomyosin sind wichtige Komponenten des Querbrückenzyklusses, der später genauer erläutert wird.
Abb. 4) Schematische Darstellung eines Muskels und Aufbau einer Muskelzelle (aus Klinke / Pape / Silbernagel, 5. Auflage)
12 Das Myosinmolekül („dickes Filament“)
Das Myosinmolekül der Skelettmuskulatur besteht aus zwei schweren (myosin heavy chain, MHC) und aus vier leichten Ketten (je zwei essential light chains, ELC und zwei regulatory light chains, RLC). Jeweils zwei leichte Ketten sind mit einer schweren Kette assoziiert, wobei es sich dabei jeweils um eine ELC und eine RLC handelt.
Jede schwere Kette kann in drei Abschnitte gegliedert werden, den Schaft, den Hals und den Kopf. Der Schaft wird auch als light meromyosin (LMM) bezeichnet (Abb. 5). Beide LMM verdrillen sich zu einer coiled-coil-Struktur und bilden somit eine α-Helix. Das heavy meromyosin (HMM) bilden der Kopf und die Halsregion, auch als S1-Fragment (Kopf) und S2-Fragment (Geeves & Halsall, 1987) bezeichnet. Limitierte proteolytische Spaltungen sowie proteinkristallographische Untersuchungen haben gezeigt, dass die Kopfregion (S1) eine ATP- , eine Aktin- und zwei Leichtketten-Bindungsstellen beinhaltet (Rayment et al., 1993). Die Übergangsregion zum Hals bezeichnet man als Hebelarm, bestehend aus dem Konverter (converter domain) und einer langen α-Helix assoziiert mit den beiden leichten Ketten (light chain binding domain). Der Konverter bildet eine Struktur am Übergang der katalytischen Domäne in die light chain binding domain (s. auch Abb. 8). Die converter domain umfasst die Aminosäuren 707 bis 774 (Houdusse et al., 1999).
Abb. 5) Schematische Darstellung eines Myosinmoleküls (nach Lowey et al., 1969)
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Der Querbrückenzyklus
Über 50 Jahre sind vergangen, seit A. F. Huxley und Niedergerke (Huxley und Niedergerke, 1954) ihre Gleitfilamenttheorie der Muskelfunktion vorstellten. Schnell wurde der Begriff des Querbrückenzyklus in Zusammenhang mit den molekularen Vorgängen bei der Generierung von Muskelkraft verwendet (Huxley, 1957).
Der Querbrückenzyklus (Abb. 6) stellt auf molekularer Ebene die Grundlage für Entwicklung von Muskelkraft dar. Genauer gesagt, beruht Muskelkontraktion auf der zyklischen Wechselwirkung von Myosinköpfen mit Aktinfilamenten unter Bindung und Spaltung von ATP und Abgabe der Reaktionsprodukte. Konformationsänderungen der Querbrücke werden auf das Aktinfilament übertragen und führen so zu einem Gleiten der Filamente oder zu Kraftentwicklung. Dabei kann man generell den Zyklus in eine Gruppe von hochaffinen Querbrückenzuständen und eine Gruppe von niedrigaffinen Querbrückenzuständen unterteilen.
In Abwesenheit von ATP ist der Myosinkopf fest an das Aktin gebunden. Dies wird auch als Rigorkonformation bezeichnet. Die Totenstarre (= rigor mortis) basiert auf dieser Tatsache, aus Mangel an ATP-Nachschub. Diese nukleotidfreie Konformation selbst ist ein hochaffiner Bindungszustand. Bei Anlagerung eines ATP-Moleküls an den Myosinkopf wird diese hochaffine Bindung aufgelöst. Der nächste Schritt ist die Spaltung des ATP-Moleküls, was strukturelle Änderungen im Myosinkopf zur Folge hat, im Wesentlichen in Form einer Kippung des Hebelarms. Dieser Vorgang wird als return-stroke oder „repriming“ des Myosinkopfes bezeichnet. Nach diesen Strukturumlagerungen kann der Myosinkopf wieder eine hochaffine Bindung mit dem Aktinfilament eingehen (hochaffiner Aktomyosinkomplex).
Auf diesen Schritt folgt nun der sogenannte Kraftschlag (power-stroke). Der erste Teilschritt des Kraftschlages stellt eine erneute Umorientierung des Hebelarms bei Abdissoziation des Phosphats aus dem aktiven Zentrum des Myosinkopfes dar. Dadurch werden Aktin- und Myosinfilament um einige nm gegeneinander verschoben. Die Abdissoziation von ADP geht mit einem weiteren Umklappen des Hebelarms einher. Dieser zweite Teilschritt komplettiert somit den Kraftschlag, indem das Verschieben der Filamente gegeneinander um wenige nm ergänzt wird. Nun befindet sich der Aktomyosinkomplex wieder in seiner am Anfang dargestellten Ausgangslage, der Rigorkonformation. Durch Binden eines ATP-Moleküls kann der Zyklus erneut durchlaufen werden.
Da gezeigt wurde, dass lediglich bei hochaffiner Bindung der Myosinköpfe ein Filamentgleiten stattfinden kann, während die niedrigaffinen Zustände nicht direkt zur
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Kraftentfaltung beitragen, werden die hochaffinen Zustände auch als “kraftgenerierend“ und die niedrigaffinen als “nicht-kraftgenerierend“ bezeichnet.
Abb. 6) Schematische Darstellung des Querbrückenzyklus, beginnend in der Rigorkonformation (I).
Durch Anlagerung eines ATP-Moleküls erfolgt die Auflösung des hochaffinen Aktomyosinkomplexes (II).
Es folgt der „return stroke“ (III) und durch die Spaltung von ATP kann das Myosin erneut eine hochaffine Bindung an das Aktin eingehen (IV). Es folgt nun der Kraftschlag („power stroke“) mit anschließender Rigorkonformation (I). (Fischer et al. 2005)
Für die Freigabe des Querbrückenzyklus (Abb. 7) spielt Calcium die entscheidende Rolle. Bei der quergestreiften Muskulatur erfolgt diese Freigabe über das Tropomyosin, welches die Bindungsstellen am Aktin kontrolliert, die die hochaffine Anlagerung der Myosinköpfe ermöglichen. In Anwesenheit von genügend Calcium werden diese Bindungsstellen freigegeben. Die Umlagerungen des Tropomyosins werden durch das Troponin gesteuert.
Durch Bindung von Calcium an die Troponin-C-Untereinheit wird die Umlagerung des Tropomyosins und damit die Aktivierung des Aktinfilaments (Aon) induziert und die hochaffine Bindung der Myosinköpfe ermöglicht. Wichtig ist hier noch der Effekt des Calciums, das bei diesen Vorgängen die Geschwindigkeitskonstanten für den Übergang der Querbrücken aus den nicht-kraftgenerierenden in die kraftgenerierende Zustände beeinflusst (Brenner 1988). Brenner und Chalovich (1999) konnten durch Messung eines Fluoreszenzsignals am Troponin I die Ursache für die Calcium-Abhängigkeit des Übergangs der Querbrücke von nicht-kraftgenerierenden Zuständen in kraftgenerierende Zustände charakterisieren und durch Modellrechnung überprüfen. Es zeigte sich, dass die Calcium-
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Abhängigkeit dieses Übergangs durch eine schnelle, calciumabhängige Einstellung des Gleichgewichtes zwischen den aktivierten (Aon) und nicht-aktivierten (Aoff) Aktin-Filamenten bedingt wird (Abb. 7).
Abb. 7) Schematische Darstellung der zwei Zustände der Querbrücke. Links der nicht-kraftgenerierende Zustand, Aktin ist hier nicht aktiviert (Aoff). Rechts, nach Zugabe von Calcium Übergang in den kraftgenerierenden Zustand, Aktin ist hier aktiviert (Aon). (aus Klinke / Pape / Silbernagel, 5. Auflage)
Die Geschwindigkeitskonstante für das Anschalten des Filaments wird hier als kon definiert, entsprechend beschreibt koff die Rückreaktion. Bei hoher Calcium-Konzentration ist kon groß, somit können die Querbrücken entsprechend schneller in die kraftgenerierenden Zustände übergehen.
Genaues Wissen über die Calcium-Sensitivität der aktiven Kraftentwicklung ist ein wichtiger Faktor, um die myokardiale Dysfunktion zu verstehen. Da die Bindung der Myosinköpfe an Aktin den Aktivierungsgrad der dünnen Filamente beeinflusst (Gordon et al., 1988), scheint es denkbar, dass Punktmutationen im Bereich der β-MHC funktionelle Veränderungen des Myosins verursachen und somit auch Einfluss auf den Aktivierungsgrad der dünnen Filamente ausüben.
Der Querbrückenzyklus auf molekularer Ebene
Die atomaren Strukturen der Myosin-Motordomäne, aber auch der Aktinmonomere und - filamente, sind gut erforscht. Mit Hilfe der Proteinkristallographie wurden in diesem Bereich wesentliche Fortschritte erzielt (Rayment et al., 1993; Holmes et al. 1990). Das strukturelle Rückgrat des Myosinmoleküls bilden Schaft (LMM) und Hals (S2-Fragment). Der Myosinkopf (S1-Fragment) ist für die Generierung von Kraft und Bewegung zuständig.
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Untersuchungen des Myosinkopfes zu verschiedenen Zeitpunkten des Querbrückenzyklus ermöglichen es, funktionelle Untereinheiten zu identifizieren und das komplexe Geschehen der Muskelkontraktion auf molekularer Ebene zu verstehen. Bisher konnten jedoch nur freie, also nicht an Aktin gebundene Myosinkopfdomänen proteinkristallographisch untersucht werden.
Zu unterteilen ist die Myosinkopfdomäne in N-terminale 25kDa-, 50kDa- und eine C- terminale 20kDa-Domäne. Diese Einteilung stellt jedoch keine funktionelle Unterteilung dar.
Stattdessen erhält man diese Untereinheiten unterschiedlichen Molekulargewichts (Mornet et al., 1981) wenn man die Subdomänen nach vorausgegangener Proteolyse der sie verbindenden Strukturen gelelektrophoretisch auftrennt.
Heute sind durch Proteinkristallographie etwa zwanzig verschiedene S1-Strukturen bekannt.
Die 50 kDa-Domäne lässt sich diesen Untersuchungen zufolge in zwei Subdomänen einteilen, eine upper und eine lower 50 kDa-domain (Abb. 8). Diese beiden Subdomänen sind an einem Ende durch eine loop miteinander verbunden. Die anderen Bereiche stehen nicht miteinander in Verbindung, bilden somit eine Spalte, welche als 50 kDa-cleft bezeichnet wird. Diese strukturelle Konformation kann man sich wie eine Art Scharniervorrichtung oder -gelenk vorstellen, mit der Gelenkachse auf der miteinander verbundenen Seite. Somit ist es möglich, dass sich die Spalte in einer offenen (“open“) oder in einer geschlossenen (“closed“) Position befindet (Houdusse et al., 1999). In der Nähe dieser Spalte, am “gelenknahen“ Pol, befindet sich die ATP-Bindungstasche, welche wiederum aus weiteren Elementen besteht, u.a. ein p- loop-Motiv und zwei als switch 1 und switch 2 bezeichnete Strukturen, welche an der Bindung des Nukleotids bzw. des γ-Phosphats beteiligt sind. Switch 1 und switch 2 können zwei Konfigurationen einnehmen, ebenfalls „open“ oder „closed“. Des Weiteren werden eine sogenannte relay-helix und der Konverter beschrieben (Abb. 8). Letztere spielen in den Positionsänderungen des Hebelarms eine wichtige Rolle. In mehreren Arbeiten wurden diesbezüglich kristallographische und biochemische Untersuchungen an einer Vielzahl von Myosin-Isoformen durchgeführt (Rayment et al., 1993; Fisher et al., 1995; Smith und Rayment, 1996; Gulick et al., 1997; Dominguez et al., 1998; Houdusse et al., 1999). Die
„open“-Konfiguration der 50 kDa-cleft geht mit einer Positionierung des Hebelarms in einer sog. „down“-Stellung einher. Der Verschluss der 50 kDa-cleft („close“) bewirkt eine Positionierung des Hebelarms einer der sog. „up“ oder „primed“-Stellung (Houdusse et al., 1999).
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Abb. 8) Struktur des Myosinkopfes (S1) – farblich hervorgehoben sind die regulatory light chain (RLC, magenta) und die essential light chain (ELC, gelb). Die bei der proteolytischen Spaltung entstehenden Fragmente sind grün (25k, N-terminales Ende), rot (50k) und blau (20k, C-terminales Ende) hervorgehoben. Die Aktinbindungsdomäne ist in weißer Farbe dargestellt. (Abb. Nach Rayment et al.
1993b)
Anhand des Wissens über die oben beschriebenen Elemente und ihre aus Kristallstrukturen abgeleiteten denkbaren funktionellen Eigenschaften, wird der Querbrückenzyklus in einem Modell von Holmes et al. (2004) wie folgt beschrieben.
Als Ausgangskonformation wird die fest an Aktin gebundene, nukleotidfreie Form des Myosinkopfes nach dem Kraftschlag genommen. Dabei befinden sich switch 2 und die 50 kDa-Spalte in der „open“ Stellung, die relay-helix ist „straight“ konformiert, der Hebelarm in der „tail down“-Stellung, auch post-power-stroke-Konformation genannt. Bindet nun ATP an den Myosinkopf, geht switch 2 in die geschlossene Konformation über. Dies bedingt durch aufkommende Spannungskräfte ein Abknicken („kinked“) der relay-helix (Holmes, et al., 2004) und folgend eine Kippung des Hebelarms um 60°, in die „tail up“-Position. Dies entspricht der bereits oben erwähnten return-stroke-Position. Durch die gleichzeitige Spaltung des ATP-Moleküls schließt sich die 50 kDa-Spalte zum Teil. Die pre-power-stroke-Stellung ist erreicht. Die Hydrolyseprodukte ADP und Pi sind weiterhin gebunden.
Bindet nun die Querbrücke an das aktivierte Aktinfilament, erfolgt ein Abfall der
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Nukleotidaffinität (Kraft et al., 1992, PNAS), bedingt durch weitere Konformationsänderungen, u.a. von switch 1. Dazu sei auf die Arbeiten von Yengo et al., 2002, Conibear et al., 2003 und Holmes et al., 2003 verwiesen. Der darauf folgende Kraftschlag findet unter Abgabe des Phosphats und ADP statt. Eine erhöhte Aktinaffinität des Myosinkopfes wird durch den vollständigen Verschluss der 50 kDa-Spalte ermöglicht. Das Schließen der Spalte zieht weitere Konformationänderungen von relay-helix (wieder
„straight“), Konverter und Hebelarm (wieder „tail down“) nach sich. Die oben beschriebene Ausgangkonformation ist wiedererlangt und ein neuer Zyklus beginnt.
Kinetik des Querbrückenzyklus
Es wird deutlich, dass die unterschiedlichen Phasen des Querbrückenzyklus mit unterschiedlicher Affinität des Myosins für Aktin einhergehen. Dieses Verhalten soll nun genauer erläutert werden.
Die Bindung von Nukleotid vermindert die Affinität des Myosins für Aktin. Umgekehrt wird die Nukleotidaffinität durch Aktomyosinbindung reduziert. Diese Befunde und die dazugehörigen Konformationsänderungen des Myosins spielen für die Funktion des Muskels eine wichtige Rolle (Holmes et al., 2003). Durch die Bindung von ATP an das Myosin kann letztendlich der Kraftschlag erfolgen. Dies setzt allerdings die zuvor erfolgte Abgabe des ADP voraus.
Es werden generell zwei Gruppen von Zuständen des Aktomyosinkomplexes unterschieden, die hochaffinen, strong-binding-states und die bei gleicher Ionenstärke niedrig-affinen weak- binding-states (Marston und Weber, 1975; White und Taylor, 1976; Highsmith, 1977;
Margossian und Lowey, 1978; Greene und Eisenberg, 1980a). Grundsätzlich können die Myosinköpfe sich in allen Zuständen kurzfristig vom Aktin ablösen und wieder anheften. Die Kinetik von Anheftung und Ablösung (k+, k-) ist charakteristisch für den jeweiligen Zustand und ist nicht zu verwechseln mit der Kinetik des Querbrückenzyklus, der von fapp und gapp
bestimmt wird und der weiter unten beschrieben wird. Neben einer geringeren Aktinaffinität zeigen die weak-binding-states eine schnellere Geschwindigkeitskonstante für die reversible Bindung und das Ablösen an bzw. von Aktin (White und Taylor, 1976; Stein et al., 1979;
Chalovich et al., 1981). Außerdem kann hier ein Binden an Aktin auch in Abwesenheit von Calcium beobachtet werden (Chalovich et al., 1981; Wagner und Giniger, 1981; Chalovich und Eisenberg, 1982; Wagner, 1984). Andererseits sind die strong-binding-states durch eine
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geringere Geschwindigkeitskonstante, zumindest für das Ablösen von Aktin (White und Taylor, 1976; Marston, 1982) und durch eine calciumabhängige hochaffine Bindung an Aktin (Greene und Eisenberg, 1980b) charakterisiert.
Der Übergang aus der Gruppe der weak-binding-states in die Gruppe der strong-binding- states, also in die kraftgenerierenden Zustände des Aktomyosinkomplexes, wird durch fapp
beschrieben (Abb. 9). Dabei kommt es zur Abgabe von Pi. Der Übergang aus den kraftgenerierenden, hochaffinen Zuständen in die niederaffinen Zustände unter ADP-Abgabe und ATP-Bindung wird durch gapp beschrieben (Brenner 1988, 1990). Man spricht hier von
„apparenten“ Geschwindigkeitskonstanten, da fapp und gapp jeweils für mehrere Reaktionsschritte im Querbrückenzyklus stehen.
Abb. 9) Das Schema zeigt den Übergang von den nicht kraft-generierenden in die kraft-generierenden Zustände während der isometrischen Kontraktion.fapp beschreibt den Übergang aus den weak-binding- states in die strong-binding-states unter Abgabe von Pi. gapp beschreibt den Übergang aus den kraftgenerierenden, hochaffinen Zuständen in die niederaffinen Zustände unter ADP-Abgabe und ATP- Bindung.
Bei isometrischer Kontraktion einer Muskelfaser sind kraftgenerierende und nicht- kraftgenerierende Komplexe im Fließgleichgewicht, man spricht auch von einem steady state.
Die isometrische Kraft F kann errechnet werden (Brenner 1988). Sie ist abhängig von dem Anteil der Querbrücken, die sich in kraftgenerierenden Zuständen befinden:
{1} F = n · Fmean · fapp / (fapp + gapp)
Dabei ist n die Zahl der insgesamt am Turnover beteiligten Querbrücken eines Halbsarkomers der untersuchten Faser. Fmean steht für die Kraft die von einer einzelnen Querbrücke in den strong-binding-states entwickelt wird. Einflussfaktoren auf die resultierende Kraft F können Fmean und fapp bzw. gapp sein. Steigt die von der einzelnen Querbrücke entwickelte Kraft
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(Fmean), erhöht sich folglich auch die resultierende Kraft F. fapp und gapp können in soweit Einfluss nehmen, als dass sie das vorhandene Fließgleichgewicht zu beiden Seiten beeinflussen können. Eine Erhöhung der Besetzung in den strong-binding-Zuständen, z.B.
durch eine Zunahme von fapp würde ebenso zu einer erhöhten Kraftentwicklung führen.
Aufgrund experimenteller Befunde wird angenommen, dass unter isometrischen Bedingungen alle Querbrücken (n) am Prozess der Kraftgenerierung teilnehmen, fapp jedoch abhängig von der Calciumkonzentration variiert (Brenner 1988).
Wird eine in der Versuchsapparatur eingespannte Muskelfaser während isometrischer Kontraktion kurzzeitig entlastet bzw. entdehnt (lastfreie Verkürzung) und anschließend wieder rasch in ihre Ausgangslänge zurückgedehnt, erfolgt bei der Entdehnung eine Umverteilung der Querbrücken in die weak-binding-states. Nach Rückdehnung kann man den Wiederanstieg der Kraft bis zum isometrischen steady-state verfolgen. Die Zeit, die die Faser benötigt, um 63 % (1 – 1/e = 0,6321) der maximalen Kraft zu entwickeln, entspricht der Zeitkonstanten τ.
Der Kehrwert der Zeitkonstanten τ entspricht wiederum der Geschwindigkeitskonstanten kredev für den Kraftwiederanstieg. Die Geschwindigkeitskonstante kredev wird von fapp und gapp bestimmt (Brenner 1988):
{2} kredev = fapp + gapp
Es konnte an schnellen Muskelfasern des Kaninchen-Psoas gezeigt werden, dass unter isometrischen Bedingungen bei unterschiedlichen Calciumkonzentrationen gapp = 1 ist (Brenner 1988), damit wird kred unter diesen Bedingungen von fapp bestimmt. Wie oben dargelegt, beschreibt fapp den Übergang der Querbrücken aus den niedrigaffinen, nicht- kraftentwickelnden Zuständen in die hochaffinen, kraftentwickelnden Zustände unter Abgabe von Pi. Zwischen kred und fapp besteht bei unterschiedlicher Calciumkonzentration eine proportionale Beziehung (Brenner und Eisenberg, 1986). Des Weiteren zeigte Brenner, dass eine Zunahme des Quotienten fapp/gapp eine zu geringeren Calciumkonzentrationen verschobene und steilere Beziehung zwischen Calciumkonzentration und normierter isometrischer Kraft ergibt (Brenner 1988). Dies bedeutet, dass sowohl eine Zunahme von fapp
als auch eine Abnahme von gapp eine erhöhte Calciumsensibilität der Faser zur Folge hat.
Grundsätzlich wird durch die Bindung von Calcium an das Troponin C eine Freigabe von Querbrückenbindungsstellen für hochaffine Bindung der Myosinköpfe am Aktin möglich gemacht. Diese Reaktion ist kooperativ, d.h. eine an Aktin gebundene Querbrücke erleichtert das Binden einer anderen Querbrücke an ein benachbartes Aktinmonomer. Die kooperative
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Eigenschaft beruht unter anderem auf der Tatsache, dass das Tropomyosin in einer End-zu- End-Verbindung vorliegt. Wenn eine regulatorische Einheit ausgeschaltet wird, hat dies Einfluss auf die benachbarte Einheit. Des Weiteren „helfen“ die Myosinköpfe mit, das Tropomyosin zu verschieben.
Auch die Steifheit S der Muskelfaser unter isometrischer Aktivierung zeigt eine ähnliche Abhängigkeit von n, fapp und gapp:
{3} S = n · Smean · fapp / (fapp + gapp)
wobei Smean für die mittlere Steifheit steht, die eine einzelne Querbrücke im krafterzeugenden Zustand zeigt. Die Fasersteifheit hängt jedoch nicht nur von den hier genannten Parametern ab, sondern auch von der Kinetik der reversiblen Anheftung und Ablösung der Querbrücken an bzw. von Aktin unter den jeweiligen Bedingungen (bzw. Ca++-Konzentration). Darauf wird im nächsten Abschnitt näher eingegangen.
Die Messung der ATPase-Aktivität gibt ebenfalls Aufschluss über fapp und gapp. Folgende Gleichung beschreibt die Abhängigkeit der ATPase-Aktivität der Muskelfaser von fapp und gapp:
{4} ATPase = n · b · (fapp · gapp) / (fapp + gapp)
Hier stehen b für die Anzahl der beteiligten Halbsarkomere und n für die am Turnover beteiligten Querbrücken pro Halbsarkomer.
Die hier erläuterten Prozesse und Gleichungen gelten lediglich für die reine isometrische Kontraktion einer Muskelfaser. Kommen wir nun zu den Verhältnissen während der isotonischen Kontraktion, d.h. bei Verkürzung der Muskelfaser.
Bei der isotonischen Kontraktion stellt nicht fapp den geschwindigkeitslimitierenden Faktor dar, sondern gapp, also der mit ADP-Abgabe verbundene Übergang von den strong-binding- states (kraftgenerierend) in die weak-binding-states (nicht-kraftgenerierend). Analog zur isometrischen Kontraktion, werden beim lastfreien Filamentgleiten die Begriffe f2 und g2
benutzt (Huxley, 1957; Brenner, 1988), wobei f2 dem isometrischen fapp und g2 dem isometrischen gapp entspricht. Die maximale lastfreie Verkürzungsgeschwindigkeit wird als
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Vmax angegeben. Vmax ist abhängig von g2. Unter Bedingungen, in denen ATP und Ca++
gesättigt vorliegen, ist eine Änderung von Vmax nur über eine Änderung von g2 möglich. Bei der reinen lastfreien Verkürzung (isotonische Kontraktion) spielt eine Änderung von f2
dagegen keine Rolle.
Erst bei den sogenannten isotonisch-isometrischen Kontraktionen hat f2 einen Einfluss auf die Kinetik. f2 bestimmt die Form der Beziehung zwischen Kraft und Verkürzungsgeschwindigkeit (Kraft-Geschwindigkeits-Beziehung; Brenner, 1988b). Je größer f2 ist, desto mehr Köpfe des Querbrückenzyklus nehmen an der Kraftentwicklung bzw. an der Verkürzung unter Last teil. Bei größerem f2 ist die Verkürzungsgeschwindigkeit bei gleicher Last höher.
Kinetik der reversiblen Anheftung und Ablösung der Myosinköpfe an/von Aktin in den verschiedenen Zuständen
Neben der Kinetik des Querbrückenzyklus, also des gesamten ATP-verbrauchenden und kraftgenerierenden Zyklus ist auch die reversible Anheftung und Ablösung der Querbrücken an / von Aktin, die in allen Querbrückenzuständen (weak-binding-state, strong-binding-state) möglich ist, ein charakteristischer Parameter, der durch eine Mutation verändert sein kann.
Die reversible Anheftung / Ablösung der Querbrücke beeinflusst die jeweilige Fasersteifheit.
Sie kann durch Messung der Fasersteifheit erfasst werden (Brenner, 1986 Habilitation). Zu diesem Zweck wird die zwischen Kraftaufnehmer und Längengeber befestigte Muskelfaser mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten rampenförmig gedehnt. Dabei wird die erzeugte Kraft der Faser registriert und die Anfangssteigung der Kurve (chord stiffness, Abb. 10) bzw.
der Quotient der Kraftänderung und Längenänderung der Faser bestimmt (Abb. 10). Dieser Quotient S ist ein Maß für den Widerstand, den die Faser einer elastischen Verformung entgegen setzt. Die Steifheit einer Faser hängt von der Dehnbarkeit der dünnen und dicken Filamente sowie von der Dehnbarkeit der Querbrückenelastizität ab. Vergleichbar ist dies mit einer Spiralfeder, bei der die Dehnung der Feder durch eine Kraft-Längen-Beziehung beschrieben werden kann. Außerdem hängt die Steifheit der Faser von der Zahl der beteiligten Querbrücken, der Kinetik der reversiblen Anheftung und Ablösung der Myosinköpfe und der Dehnungsgeschwindigkeit, mit der die Fasern gedehnt werden, ab. Daher wird die Fasersteifheit jeweils bei verschiedenen Dehnungsgeschwindigkeiten gemessen. Es ergibt sich für jede Bedingung (relaxiert, isometrisch aktiviert, Rigor) eine charakteristische Beziehung zwischen Steifheit und Dehnungsgeschwindigkeit.
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Abb. 11) Die Kristallstruktur eines Myosinkopfes (nach Rayment et al., Science 2003).
Blau = Motordomäne; gelb = alpha-Helix des Hebelarms, daran sind die leichten Ketten gebunden;
dunkelviolett = Converterdomäne; cyan (türkis) = essentielle leichte Myosinkette (ELC); grün = regulatorische leichte Myosinkette (RLC); rot = die Aminosäure, die in dieser Struktur von Myosin des Huhns (M. pectoralis) der Aminosäure Arg 723 Gly im humanen Myosin entspricht orange = die Aminosäure, die in dieser Struktur der Aminosäure Arg453 entspricht (Abbildung mit RasMol erstellt).
Abb. 10) Definition der Fasersteifheit für nicht-lineare plots von Kraftentwicklung gegenüber Dehnungsgeschwindigkeit {h.s. = Halbsarkomer} (aus Brenner 1988)
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Fragestellung
Die vorliegende Studie befasst sich mit der funktionellen Charakterisierung der Mutationen Arg 723 Gly und Arg 453 Cys, beides Punktmutationen im β-kardialen Myosin (β-Myosin).
Die Mutationen sind auf Chromosom 14 im MYH7-Gen lokalisiert. Innerhalb der schweren Kette des kardialen Myosins bilden die verschiedenen bisher bekannten Mutationen
"clusters". Sie konzentrieren sich dabei auf vier "hot spots": die Nukleotidbindungstasche, die Aktinbindungsregion, den Übergang zwischen Kopf-Domäne und essentieller leichter Kette (Konverter-Domäne) und die Region um die beiden reaktiven SH-Gruppen (Bonne, et al., 1998; Epstein, 1998; Rayment, et al., 1995; Redwood, et al., 1999). Während die Mutation Arg 723 Gly im Bereich der Konverter-Domäne des Myosinkopfes lokalisiert ist, befindet sich die Mutation Arg 453 Cys in der Nähe der Nukleotidbindungstasche (Abb. 11).
An dieser Stelle setzt die vorliegende Arbeit an. Ziel dieser Arbeit war es, festzustellen, ob die genannten Mutationen zu funktionellen Veränderungen führen. Welchen Einfluss hat die Mutation Arg 453 Cys auf die Kraftentwicklung der Muskelfaser, sind die Ergebnisse mit denen der Mutation Arg 723 Gly vergleichbar? In vorausgegangenen Arbeiten wurde gezeigt, dass die Mutation Arg 723 Gly eine gesteigerte Kraftentwicklung im Vergleich zur Kontrollgruppe zur Folge hat (Seebohm et al., 2007, 2009). Hat die unterschiedliche Lokalisation der Mutationen (Arg 723 Gly = Konverter-Domäne; Arg 453 Cys = Nähe Nukleotidbindungstasche) eine unterschiedliche Auswirkung auf die Kinetik des Querbrückenzyklus´ bzw. auf andere funktionelle Parameter zur Folge? Welche Bedeutung haben die hier mutierten Aminosäuren für die funktionellen Elemente des Myosinkopfes, in denen sie lokalisiert sind? Lassen sich aus den Untersuchungen Rückschlüsse auf die Pathogenese der FHC beiden betroffenen Patienten ableiten?
Um diese Fragen zu beantworten, wurden in der vorliegenden Arbeit vergleichende mechanische Untersuchungen an permeabilisierten Skelettmuskelfasern des M. soleus von FHC-Patienten und von gesunden Kontrollpersonen durchgeführt. Dies ist möglich, da beim Menschen die kardiale Myosinisoform auch in der langsamen Skelettmuskulatur exprimiert wird und somit das mutierte Myosin auch in langsamen Skelettmuskelfasern vorkommt (Nier et al., 1999; Cuda et al., 1993; Fananapazir et al., 1993; Malinchik et al., 1997; Yu et al., 1993). Messungen der maximalen isometrischen Kraft Fmax, der Geschwindigkeitskonstanten für den Kraftwiederanstieg kredev, der maximalen Verkürzungsgeschwindigkeit Vmax sowie der Faser-ATPase-Aktivität sind notwendig für Aussagen über Änderungen der Querbrückenkinetik.
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Messungen der Fasersteifheit werden durchgeführt, um Auswirkungen der Mutation auf Steifheit bzw. Rückstellkraft der einzelnen Querbrücken zu untersuchen. Hierbei ist insbesondere die Steifheit unter Rigorbedingungen interessant, da hier alle Querbrücken fest an Aktin angeheftet sind, sodass Änderungen der Rigorsteifheit direkt auf eine Änderung der Steifheit der einzelnen Querbrücken mit der Mutation hindeuten.
Die Abhängigkeit der maximalen isometrischen Kraft von der Ca++-Konzentration wird schließlich gemessen, um mögliche Auswirkungen der Mutation auf diesen für die kardiale Funktion wichtigen Parameter zu erlangen. In früheren Arbeiten war z. B. für die Mutation Arg 723 Gly eine verminderte Calciumempfindlichkeit der Muskelfasern beobachtet worden (Kirschner et al., 2005).
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M a t e r i a l u n d M e t h o d e n
Patienten und Muskelproben
Für die Messreihen wurden Muskelfasern von zwei verschiedenen FHC-Patienten und von gesunden Kontrollpersonen verwendet. Sämtliche verwendeten Muskelfasern waren Biopsien eines Muskels aus dem Bereich der Wadenmuskulatur, dem M. soleus, der einen besonders großen Anteil (ca. 80%) langsamer Muskelfasern (Typ I) mit β-kardialem Myosin enthält. Die Muskelfasern wurden mit Detergens behandelt, d.h. die Membran wurde permeabilisiert, ohne strukturelle Schäden an den kontraktilen Proteinen selbst zu verursachen. Die sogenannten “skinned fibres“ sind durch diesen Vorgang permeabel für Ionen und Stoffe, wodurch die experimentellen Bedingungen (z. B. Ca++-Konzentration oder Salzkonzentration) von außen durch Wechsel der Lösungen beeinflussbar wird.
Die erste Biopsie stammt von einem spanischen Patienten aus Barcelona, bei dem die Mutation Arg 723 Gly als Krankheitsursache identifiziert wurde (Enjuto et al., 2000). Klinisch zeigten sich bei diesem Patienten im Stadium einer NYHA IV im EKG neben einem bifaszikulären Block Zeichen einer linksventrikulären Hypertrophie. Echokardiographisch stellte sich ein deutlich vergrößerter enddiastolischer linksventrikulärer Durchmesser (LVDD) von 62 mm bei einer stark verminderten Auswurfleistung der linken Kammer (EF 35 %) dar. Die klinische und genetische Untersuchung dieses Patienten und seiner Familienmitglieder wurde durch die Arbeitsgruppe von Dr. Antonio Francino, sowie Dr. Francisco Navarro-López (Molecular Cardiology Laboratory, Hospital Clinic, University of Barcelona) durchgeführt.
Die zweite Biopsie stammt von einem englischen Patienten aus London. Bei ihm wurde als Ursache für FHC die Mutation Arg 453 Cys identifiziert, vermutlich wurde die Mutation von der ebenfalls erkrankten Mutter an ihren Sohn übertragen. Zum Zeitpunkt der Biopsieentnahme im Juni 1997 war der Patient 19 Jahre alt. Die Klinischen Merkmale waren im Alter von zwölf Jahren geprägt von Brustschmerzen im Stadium einer NYHA II. Im EKG waren Zeichen einer linksventrikulären Hypertrophie erkennbar. In der Echokardiographie betrug der maximale Wanddurchmesser des linken Ventrikels 23 mm (Normwert < 12mm), der Durchmesser des linken Vorhofs 32 mm (Normwert < 40). Des Weiteren wurde eine inkomplette anteriore systolische Bewegung der Mitralklappe beobachtet (Solomon et al., 1990).
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In vorausgegangenen Arbeiten war aufgefallen, dass die Erkrankung bei FHC-Patienten mit der Mutation Arg 453 Cys einen weniger gutartigen Verlauf aufwiesen und somit als maligne angesehen werden. Todesfälle, die in Beziehung zu FHC stehen, waren bei FHC-Patienten mit der Mutation Arg 453 Cys häufiger als bei vermeintlich benignen Mutationen, wie z. B. Val 606 Met. Bei 13 betroffenen Patienten kam es zu neun Todesfällen, sechs wurden mit einem plötzlichen Herztod erklärt. Das mittlere Alter zum Zeitpunkt des Todes betrug 30 ± 12 (Watkins et al., 1992).
Als Kontrollfasern wurden Biopsien aus dem M. soleus gesunder Probanden verwendet.
Nach gründlicher Aufklärung über Durchführung, Risiken und mögliche notwendigen Folgeeingriffe des Eingriffes zur Entnahme der Biopsien, willigten sowohl Patienten als auch Kontrollpersonen ein. Die Muskelentnahmen der Kontrollpersonen erfolgten mit Zustimmung der Ethik-Kommission der Medizinischen Hochschule Hannover (Voten Nr. 2228 und 2729) sowie der Zentren in Barcelona (Hospital Clinic) und London (St. Georges Hospital).
Die Gewinnung von Muskelbiopsien der Kontrollpersonen erfolgte in der Klinik für Plastische, Hand- und Wiederherstellungschirurgie der Medizinischen Hochschule Hannover unter Schmerzmedikation und Lokalanästhesie ohne Infiltration des Muskelgewebes. Die Entnahme der Biopsien des englischen beziehungsweise spanischen Patienten erfolgte an den jeweiligen chirurgischen Einrichtungen am St. Georges Hospital, London bzw. Hospital Clinic, Barcelona.
Präparation einzelner Muskelbündel
Die weitere Präparation des Muskelmaterials erfolgte nach einem von unserer Arbeitsgruppe vielfach angewandtem und publiziertem Protokoll (Brenner, 1983; Yu und Brenner, 1989; Kraft, et al., 1995; Köhler, et al., 2002). Umgehend nach der Gewinnung der Biopsie wurde diese in mehrere, ca. 5 – 20 mm lange Faserbündel mit einem Durchmesser von 1 – 3 mm zerteilt.
Anschließend wurden die Muskelbündel bei einer Temperatur von 2 -5 °C in skinning solution mit 0,5 % Triton-x-100 inkubiert (Eastwood, et al., 1979) und somit permeabilisiert. Dieser Prozess wurde nach 30 min. durch Austausch der Lösung mit Triton gegen eine Lösung ohne Triton beendet. In der Lösung ohne Triton inkubierten die Bündel für eine kurze Zeit. Anschließend wurden die Bündel in einer Sucrose-Reihe mit aufsteigender Konzentration von 0,5M, 1M, 1,5M und 2M für jeweils mindestens eine Stunde bei 2 -5 °C inkubiert. In den hier erwähnten Lösungen
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war Butandionmonoxin (BDM) und eine Reihe von Protease-Inhibitoren vorhanden. Dies gewährleistete eine optimale Konservierung der Muskelbündel und deren Eigenschaften, sowie eine optimale Relaxierung der Bündel während der gesamten Präparation, trotz hoher Calciumsensibilität der Fasern.
Vor der abschließenden Aufbewahrung in flüssigem Stickstoff wurden die Muskelbündel in flüssigem Propan schockgefroren, um Gewebestrukturen zu schonen und Gefrierartefakte zu minimieren.
Gewinnung von Einzelfasern
Um Einzelfasern aus den Muskelbündeln zu gewinnen, muss man zunächst diese Bündel aus dem zur Aufbewahrung benutzten flüssigen Stickstoff entnehmen und in Skinning solution mit 1,5 M Sucrose transferieren. Nach jeweils 30 minütiger Equilibrierung in Skinning solution mit 5 mM BDM bei 2-5°C und absteigender Sucrosekonzentration (1,5 M, 1 M, 0,5 M) wird das Bündel in sucrosefreier Lösung bei 4°C für maximal zwei Tage aufbewahrt.
Nun können aus dem aufgetauten Muskelbündel einzelne Muskelfasern isoliert werden. Dazu wird das Bündel in eine spezielle Plexiglaskammer mit skinning solution ohne BDM transferiert. Die Plexiglaskammer ist mit 2-Komponenten-Silikon (RTV 615 AB, Firma Dow Corning) ausgekleidet, was eine Befestigung sowohl des Bündels als auch der Einzelfasern ermöglicht. Unter einem Stereomikroskop (Wild, Heerbrugg, Schweiz) werden mit einer spitzen Pinzette aus dem Muskelbündel einzelne Fasern in Längsrichtung sorgfältig herausgezogen. Dabei dürfen die Fasern nicht überdehnt werden, was zu strukturellen Schädigungen der Muskelfaser führen würde.
Überdehnte Fasern wurden nicht für die mechanischen Versuche benutzt, da die strukturellen Schäden irreversibel sind.
Anschließend wird die Plexiglaskammer luftdicht verschlossen und bei 2 – 5 °C aufbewahrt. Die Einzelfasern können auf diese Weise über 3 – 4 Tage ohne messbaren Qualitätsverlust für Funktionsmessungen verwendet werden.
Montierung der Einzelfaser in die Versuchsapparatur
Für die Durchführung der Versuche wurde jeweils eine einzelne Muskelfaser zwischen Längengeber und Kraftaufnehmer der Versuchsapparatur montiert. Dazu wurde eine spitze Pinzette benutzt. Befestigt wurde die Faser mittels Gewebeklebers (Histoacryl Blau, Firma Braun Aesculab, Produktnr. 1050079). Auch dabei wurde streng darauf geachtet, die Faser nicht wesentlich über eine Sarkomerlänge von 2,4 µm zu dehnen. Nach dem ersten Kleben wurde die Muskelfaser in eine
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Vorrigor-Lösung von 2 -5 °C transferiert. In dieser Lösung erfolgte eine Versteifung der Enden der Muskelfaser mit 5%-igem Glutaraldehyd. Die steifen Enden sind in ihrer Funktion als künstliche Sehnen zu betrachten, was die Stabilität der Faserenden erhöht und damit zu einer stabileren Querstreifung (“striation pattern“) führt (Brenner, 1983). Anschließend erfolgte der Transfer in eine Relaxationslösung (Ionenstärke 120mM). In dieser wurde die an den Enden chemisch fixierte Faser ein zweites Mal mit Gewebekleber, wie oben beschrieben, nachgeklebt, um eine stabilere Befestigung an Kraftaufnehmer und Längengeber zu erlangen.
Für die Messungen musste die Faser zwischen Kraftaufnehmer und Längengeber so ausgerichtet werden, dass sie horizontal und gerade aufgespannt war. Durch Projektion eines Helium-Neon- Lasers auf die Faser konnte man ein Diffraktionsbild der Sarkomerenstruktur erzeugen. Alle Fasern wurden auf eine Sarkomerlänge von 2,4 µm gestellt. Nach Einstellen dieser Sarkomerlänge wurde die Gesamtlänge der Faser gemessen, abzüglich der fixierten Enden, da diese nicht zur Kontraktion der Faser beitrugen. Die Gesamtlänge der Faser geht in die Berechnung der Verkürzungsgeschwindigkeit ein. Unter der Annahme, dass menschliche Muskelfasern einen etwa elliptischen Querschnitt besitzen, wurde jeweils an der dünnsten und breitesten Stelle der Horizontaldurchmesser abgelesen (d1 = 2 r1, d2 = 2 r2). Nach der Formel {8} A = π · ½ d1 · ½ d2
wurde anschließend die Querschnittsfläche berechnet.
Die Versuchsapparatur
Die mechanischen Versuche wurden an einer von Prof. Dr. B. Brenner konstruierten Apparatur durchgeführt, welche für die aktuellen Versuche nicht modifiziert wurde. Bezüglich mechano- optischer und elektronischer Details sei daher auf die Habilitationsschrift von Prof. Dr. Brenner, die Dissertationsschrift von Dr. R. Stehle und weitere Publikationen der Arbeitsgruppe verwiesen (Brenner, 1983; Brenner, 1986; Yu und Brenner, 1989; Stehle, 1994; Kraft et al., 1995; Köhler et al., 2002). Die zwischen Längenmesser und Kraftaufnehmer eingespannte Muskelfaser konnte in drei verschiedene Kammern transferiert werden. Die Kammern wurden mit den unterschiedlichen Versuchslösungen befüllt. Mit dem über ein feedback-System adjustierbaren Längengeber konnte die Faser entsprechend gedehnt, entspannt oder bei konstanter Gesamtlänge gehalten werden. Über den Kraftaufnehmer konnte während der Versuchsreihen die Kraftentwicklung gemessen werden.
Für die Messung der ATPase-Aktivität wurde die bereits beschriebene Apparatur in ein geschlossenes Kreislaufsystem modifiziert. Die Versuchslösung zirkulierte mithilfe einer
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Rollerpumpe in diesem Kreislauf. Der Rollerpumpe nachgeschaltet war eine Durchflussküvette (GE Healthcare) mit einem Fassungsvolumen von 5 µl zur Messung der Absorption. Bevor die Versuchslösung die Messkammer (Durchflusskammer) erreichte, passierte sie den temperierten Kammerblock aus V4A-Stahl um die erwünschte Temperatur zu erreichen. In der Messkammer befand sich die montierte Faser. Nach durchqueren der Messkammer erreichte die Versuchslösung erneut die Durchflussküvette zur erneuten Messung der Absorption. Die Durchflussrate betrug 700 µl/min. Das Gesamtvolumen des Systems betrug nur 160 µl. Das kleine Volumen ist eine wesentliche Voraussetzung für die Messung des ATP-Umsatzes einer einzelnen Muskelfaser.
Abb. 12) Seitlicher Blick auf die Versuchsapparatur. Zwischen Längengeber und Kraftaufnehmer wird die Muskelfaser montiert und in die Messkammer gesetzt. Mit Hilfe des invertierten Mikroskops (Objektiv hier nicht in Beobachtungsposition) wird die korrekte Ausrichtung, sowie während des Versuchs die strukturelle Intaktheit der Faser überprüft.
31 Kalibrierung des Kraftaufnehmers
Die Kalibrierung des Kraftaufnehmers erfolgte zunächst mithilfe von Eichgewichten, man bekommt einen Kalibrierwert in mg/mV. Um später mit jeder gemessenen Faser am Ende des Experiments eine Kraftaufnehmerkalibrierung durchführen zu können, wurde diese Eichgewicht-Kalibrierung durch eine Spulenstromkalibrierung ersetzt. Dazu spannte man eine nicht-elastische Verbindung, z.
B. ein menschliches Haar, zwischen Längengeber (Hebel) und Kraftaufnehmer. Über die feste Verbindung zwischen Kraftaufnehmer und Hebel wird durch eine definierte Auslenkung des Hebels ein Kraftsignal erzeugt und gleichzeitig der Spulenstrom registriert. Das dabei registrierte Kraftaufnehmer-Signal in mV wird nun in mg umgerechnet. Man erhält so eine Kalibrierung, bei der eine definierte Hebelauslenkung (mV Spulenstrom) einem bestimmten Kraftsignal (mg) zugeordnet werden kann (mg Kraftaufnehmer/mV Spulenstrom).
Für die Kraftaufnehmer-Kalibrierung wird nach jeder Messung die Faser in Rigor als feste Verbindung zwischen Hebel und Kraftaufnehmer benutzt. Der Hebel wird wieder stufenweise ausgelenkt und Spulenstrom und Kraftsignal registriert. Man erhält so mV Kraftaufnehmer/mV Spulenstrom. Mit Hilfe der zuvor erstellten Kalibrierung (mg Kraftaufnehmer/mV Spulenstrom) kann die Kraftaufnehmer-Kalibrierung für die aktuelle Faser errechnet werden (mg/mV Kraftaufnehmer-Signal). Dies ist eine wichtige Voraussetzung zur Bestimmung der absoluten Kraftentwicklung der jeweiligen Faser. Zwischen den Versuchsreihen zeigten sich geringfügige Unterschiede der Kalibrierfaktoren was u.a. durch die geringfügig unterschiedliche Anklebeposition der Faser sowie die Klebermasse am Kraftaufnehmer bedingt ist. Bei Fasern, die bei der Kalibrierung rissen, konnte keine Einzelkalibrierung durchgeführt werden. Wurden diese Messergebnisse dennoch in die Statistik einbezogen, wurde für sie der Mittelwert der mit dem gleichen Kraftaufnehmer bestimmten Kalibrierfaktoren verwendet, um Absolutwerte zu berechnen.
Kalibrierung des Temperaturreglers
Um konstante und vergleichbare Bedingungen zu gewährleisten, wurde regelmäßig eine Kalibrierung des Temperaturreglers durchgeführt. Die Einstellung und Konstanthaltung der Temperatur erfolgte über einen Peltier-Element. Ein Peltier-Element ist ein elektronisches Bauelement, welches basierend auf dem Peltier-Effekt bei Stromdurchfluss eine Temperaturdifferenz erzeugt. Grundlage für den Peltier-Effekt ist der Kontakt von zwei Halbleitern, die ein unterschiedliches Energieniveau der Leitungsbänder besitzen. Abhängig von Stromstärke und -richtung kühlt sich eine Seite des Elements ab, während die andere Seite sich erwärmt. Der Strom pumpt sozusagen Wärme von einer Seite auf die andere und erzeugt eine
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Temperaturdifferenz zwischen den Platten. Die kühlende Seite ist an der Unterseite der Messkammer befestigt. Die auf der Gegenseite entstehende Wärme muss durch Kühlelemente mit Durchflusskühlung abgeführt werden. Durch Regelung der Stromzufuhr des Peltiers, kann die Temperatur der Kammer entsprechend beeinflusst werden. Mithilfe eines Digitalthermometers (HH-25TC Firma Omega) konnten den Reglerstufen die entsprechenden Temperaturen zugeordnet werden. Zusätzlich wurde vor und während jeder Messreihe regelmäßig die Temperatur kontrolliert und gegebenenfalls adjustiert.
Versuchsablauf
Alle Fasern der Versuchsreihen wurden zu Beginn der Messungen dem gleichen Ablauf unterzogen.
Zunächst wurde die Faser wie oben beschrieben zwischen Kraftaufnehmer und Längenmesser montiert. Anschließend wurde sie in eine sog. Voraktivierungslösung (wie Aktivierungslösung, nur ohne Ca++ transferiert. Es erfolgte eine 5 – 10 minütige Inkubation zur Äquilibration der Faser und zum Eindiffundieren von Enzymen, z.B. Kreatinphosphokinase. Darauf folgte der Transfer in eine Lösung mit hoher Ca++-Konzentration (pCa 4,5 entspricht 10-4 mol/l freies Ca++). Bei einer Temperatur von 10 °C erfolgte nun eine Messung der isometrischen Kraft. Anhand dieser Messung konnte zwischen langsamen und schnellen Muskelfasern differenziert werden. Dies wird nachfolgend ausführlich besprochen.
Anschließend wurden unterschiedliche Versuchsprotokolle an den Fasern durchgeführt, um z. B. die Calciumempfindlichkeit der Kraftentwicklung bei isometrischer Aktivierung (pCa-Kurve), die lastfreie Verkürzungsgeschwindigkeit Vmax und den ATP-Verbrauch unter verschiedenen Bedingungen zu messen. Aufgrund der Belastung der Fasern durch die Messungen war es nicht möglich, bei allen Fasern alle Parameter zu untersuchen. Die verschiedenen Versuchsprotokolle werden im Folgenden beschrieben.
Überprüfung der Myosinisoformen
In dieser Arbeit wurden funktionelle Eigenschaften des β-Myosins in Muskelfasern von zwei FHC- Patienten mit den Mutationen Arg 723 Gly und Arg 453 Cys, sowie von gesunden Kontrollpersonen untersucht. Da die kardiale Isoform der schweren Kette des Myosins (β-MHC) auch in der langsamen Skelettmuskulatur exprimiert wird (Cuda et al., 1993; Fananapazir et al., 1993; Nier et
