(10) Internationale VerdfTentiichungsnummer C12Q 1/68, (71) Anmelder (fur alle PCT/EP03/ Erfinder; und (75) Deutsch. Deutsch (DE).

InternationalesBuro

(43) InternationalesVerdffentlicbungsdatum

11.

Dezember2003

(11.12.2003)

PCT

iiiiii iiiiii iiiiiiiiiii iiiiiiiiiii

(10) InternationaleVerdfTentiichungsnummer

WO ^{03/102232 A2}

(51) Internationale Patentklassifikation⁷:

C12P19/34

(21) InternationalesAktenzeicben:

C12Q

1/68, (71)

PCT/EP03/05579 (22) Internationales Anmeldedatum:

27.Mai2003(27.05.2003) (72) (25) Einreicbungssprache:

(26) Verflffentlichungssprache:

Deutsch Deutsch (30) Angabenzur Prioritfit:

10224200.3 31.Mai 2002(31.05.2002)

DE

(75)

(74)

Anmelder (fur alle Bestimmungsstaaten mitAusnahme vonUS):

ARTUS

^-

GESELLSCHAFT FUR MOLEKU- LARBIOLOGISCHE DIAGNOSTIK UND

EN-

TWICKLUNG MBH

[DE/DE];Konigstrasse 4a, 22767 Hamburg(DE).

Erfinder;und

Erfinder/Anmelder (nurfur US): SCHEINERT, Peter [DE/DE]; Op'n Hainholz 86c, 22589 Hamburg (DE).

KRUPP, Guido[DE/DE];Rosenstrasse3, 24622 Gnutz (DE).

Anwaite:

VON MENGES,

Albrecht usw.; Uexkiill

&

Stolberg, Beselerstrasse4,22607Hamburg(DE).

[Fortsetzungaufder nachstenSeite]

(54)Title: AMPLIFICATION

OF

RIBONUCLEICACIDS

(54)Bezeichnung:

VERMEHRUNG VON RIBONUKLEINSAUREN

>

AAAAA

1.ReverseTranskription dermRNA

mit5'-((JT)_IIValsPrimer

AAAAA

•V«tT) u

2.RNasenzurRNA-Entfemung V(dT)„

3.dsDNAmit

DNA

Polymerase undBox-N6Primer

'V(dT)„

*B(dA)„

4:Denaturieren

•V(dT)_l3

^N6}

(Box.

->B(dA)ll

(57) Abstract: The inventionrelates to methodsforamplifying ribonucleic acids, comprising the following steps: (a) a

DNA

single strandisproduced from an

RNA

byreversetranscription withtheaidofa single-strandedprimer havinga defined sequence, anRNA-dependent

DNA

polymerase, anddesoxyribonucleoside triphosphates; (b) the

RNA

is removed; (c) a

DNA

duplex is

produced by means of a single-stranded primer comprising a box sequence, a

DNA

polymerase, and desoxyribonucleoside triphosphates; (d) the duplex is separated into single strands;

(e)

DNA

duplexes areproduced from one ofthe single strands obtainedinstep (d)bymeansofasingle-strandedprimerwhich comprisesthesequenceof apromoterinthe5'rangeandthesame definedsequenceasthe primerusedin step(a)in the3' range, a

DNA

polymerase,and desoxyribonucleoside triphosphates; (0 apluralityof

RNA

single strands, both ends ofwhich comprise defined sequences, areproducedbymeansof an

RNA

polymerase andribonucleosidetriphosphates.Theinvention alsorelates to kits foramplifying ribonucleic acids accordingtoone ofsaidmethods, said kits comprising the following components: at least one single-strandedprimer comprisingthesequenceofapromoter;(b) atleastonesingle-strandedprimercomprisingaboxsequence;(c) an RNA-dependent

DNA

polymerase; (d)desoxyribonucleoside triphosphates; (e) a DNA-dependent

DNA

polymerase; (f) an

RNA

polymerase;and_(g)ribonucleoside triphosphates.

O

(57)Zusammenfassung: DievorliegendeErfindungbetrifftVer- fahrenzurVermehrungvonRibonukleinsauren, dieSchritteumfas- sen,beidenenman(a) mittelseines Einzelstrang-Primersdefinier- terSequenz,einerRNA-abhangigen

DNA

Polymerase undDes- oxyribonukleosidtriphosphaten einenDNA-Einzelstrang durchre- verse Transkriptionauseiner

RNA

erzeugt;(b)die

RNA

entfernt;

(c)mittelseines Einzelstrang-Primers, der eineBox-Sequenzum-

fasst,einer

DNA

-PolymeraseundDesoxyribonukleosidtriphosphaten einenDNA-Doppelstrangerzeugt;

[Fortsetzungaufder ndchstenSeite]

1.REVERSETRANSCRIPTIONOF THEMRNAUSING5'-<DT)18VASA PRIMER

2.RNOSES FOR RNA REMOVAL

3.DSDNACOMPRISINGDNA POLYMERASE ANDBOX-N6PRIMER

A.DENATURE

WO ^{03/102232 A2} 9tw

(81) Bestimmungsstaateo(national): AE,AG, AL, AM,AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, BZ,CA,CH, CN, CO, CR, CU, CZ, DE,DK,DM,DZ, EC, EE,ES,FI,GB,GD, GE, GH,GM,HR,HU, ID,IL, IN,IS, JP,KE,KG,KP,KR, KZ, LC, LK, LR,LS, LT,LU,LV, MA, MD, MG, MK, MN,

MW,

MX,MZ,NI,NO,NZ,OM,PH, PL, PT,RO, RU,SC,SD,SE, SG,SK,SL,TJ,TM,TN, TR,TT,TZ, UA, UG,US,UZ, VC,VN,YU, ZA,ZM, ZW.

(84) Bestimmungsstaaten (regional): ARIPO-Patent (GH,

GM, KE,LS,

MW,

MZ,SD, SL, SZ, TZ,UG,ZM,ZW), eurasisches Patent(AM, AZ, BY,KG,KZ,MD,RU,TJ, TM),europaisches Patent (AT,BE,BG,CH,CY, CZ,DE,

DK,EE, ES,H,FR,GB,GR, HU,IE, IT,LU,MC, NL, PT,RO,SE,SI,SK,TR), OAPI-Patent(BF, BJ,CF,CG, CI,CM,GA,GN, GQ,GW,ML,MR,NE, SN,TD,TG).

Verdffentlicht:

—

ohneinternationalenRecherchenberichtunderneutzuver- dffentlichennachErhaltdesBerichts

ZurErkldrung der Zweibuchstaben-CodesundderanderenAb- kurzungenwirdaufdieErlddrungen ("Guidance Notes on Co- desandAbbreviations")amAnfangjederregultirenAusgabeder PCT-Gazetteverwiesen.

(d)den DoppelstranginEinzelstrangeauftrennt; (e) mittelseines Einzelstrang-Primers, derim5'-Bereich dieSequenzeinesPromo-

torsundim3*-Bereich dieselbedefinierteSequenz wiederPrimerin(a)umfasst,einer

DNA

-PolymeraseundDesoxyribonukleosidt- riphosphatenDNA-Doppelstrangeauseinemderin(d)entstandenen Einzelstrangen erzeugt;(f)mittelseiner

RNA

-Polymeraseund Ribonukleosidtriphosphaten eine Vielzahlvon

RNA

Einzelstrangen erzeugt, diean beidenEndendefinierteSequenzen umfassen.

Die Erfindungbetrifftferner Kits zurVermehrungvonRibonukleinsaurengemasseinemderobigenVerfahren,welchediefolgen- denBestandteileumfassen: mindestenseinen Einzelstrang-Primer, der dieSequenzeinesPromotersumfasst;(b)mindestenseinen Einzelstrang-Primer,der eineBox-Sequenzumfasst;(c)eineRNA-abhangige

DNA

-Polymerase;(d)Desoxyribonukleosidtriphos- phate;(e)eineDNA-abhangige

DNA

-Polymerase; eineRNA-Polymerase;und_(g)Ribonukleosidtriphosphate.

Vermehrung

vonRibonukleinsauren

DievorliegendeErfindungbetriffiVerfahrenzurVermehrung

von

Ribonukleinsauren, Schritteumfassend, beidenen

man

(a) mittels einesEinzelstrang-PrimersdefinierterSequenz, einer

RNA-abhangigen DNA-Polymera-

se

und

Desoxyribonukleosidtriphosphaten einen DNA-Einzelstrang durch reverse Transkrip- tionauseiner

RNA

erzeugt;

(b)

dieRNAentfemt;

(c) mittels eines Einzelstrang-Primers, der eine Box-Sequenz umfaflt, einer

DNA-Polymerase

und DesoxyribonukleosidtriphosphateneinenDNA-Doppelstrangerzeugt;

(d) denDoppelstranginEinzelstrangeauftrennt;

(e) mittels eines Einzelstrang-Primers, der im 5'-Bereich die

Sequenz

eines Promotors

und im

3-Bereich dieselbe definierte Sequenz wie der Primer in (a) umfaBt, einer

DNA-Polymerase

undDesoxyribonukleosidtriphosphaten

DNA-Doppelstrange

aus einemderin(d) entstandenen Einzelstrangenerzeugt;

(f) mittels einer

RNA-Polymerase

und Ribonukleosidtriphosphaten eine Vielzahl von

RNA-

Einzelstrangen erzeugt, diean beidenEndendefinierte Sequenzenumfassen.

Die vorliegende Erfindung betriffi ferner Kits, welche fur die Durchfuhrung der erfindungsgemaBen VerfahrennotwendigenBestandteile umfassen.

Im

StandderTechniksind eine VielzahlvonVerfahren zur

Vermehrung

vonNukleinsaurenbekannt.

Das

bekannteste Verfahren ist die Polymerase-Ketten-Reaktion ("polymerase chain reaction" oder

PCR),

welche Mitteder80er JahrevonKaryMullis entwikelt

wurde

(vgl. Saikietal., Science,Vol. 230_(1985),

1350-1354;

und EP

201 184).

Bei der PCR-Reaktion lagern sich Einzelstrang-Primer (Oligonukleotide mit einer Kettenlange

von

iiblicherweise 12 bis 24 Nukleotiden) an eine komplementare, einzelstrangige

DNA-Sequenz

an. Die Primer werden mittels einer

DNA-Polymerase

und den Desoxyribonukleosidtriphosphaten (dNTPs, namlich

dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

zueinem Doppelstrang verlangert.

Der

Doppelstrang wird durch Hitzeeinwirkung in Einzelstrange aufgetrennt Die Temperatur wird so weit gesenkt, dass sich

emeut

Einzelstrang-Primeran dieDNA-EinzelstrSngeanlagern. DiePrimerwerdendurch die

DNA-Polymerase

erneutzueinemZweitstrangelongiert.

Durch Wiederholung der obigen Schritteisteineexponentielle

Vermehrung

der Ausgangs-DNA-Strange mbglich, dadieReaktionsbedingungensogew&hltwerdenkonnen, dass ausnahezu

jedem

DNA-Einzel- strang bei jedem Reaktionsdurchlaufein Doppelstrang gebildet wird, der nachfolgend wieder in zwei Einzelstrange aufgespalten wird, welchewiederumalsMatrizefurweitereStrangedienen.

Nach

Vorschaltungeinerreversen Transkription,bei dermittelseinerRNA-abhangigen

DNA-Polymerase

einDNA-Einzelstrang(die sogenannte

cDNA)

auseiner

mRNA

gebildet wird, istdiePCR-Reaktion auch unmittelbaraufdie

Vermehrung

vonNukleinsauren ausgehendvoneiner

RNA-Sequenz

anwendbar(vgl.

EP201

184).

Zu

diesem Reaktions-Grundschema wurden in der Zwischenzeit eine Vielzahl

von

Alternativen entwickelt, die sich inAbhangigkeit des Ausgangsmaterials

(RNA, DNA,

Einzelstrange,Doppelstrange) unddesReaktionsproduktes (Vermehrungspezifischer

RNA-

oder

DNA-Sequenzen

ineinerProbe oder VermehrungallerSequenzen)voneinanderunterscheiden.

WO

^03/102232 13/05579

- ₂ -

In den ^letzten Jahren werden

zunehmend

sogenannte Microarrays, zur Analyse von Nukleinsauren verwendet. Dabei handelt es sich urn Tragerplatten auf denen eine Vielzahl unterschiedlicher Nukleinsaure-Sequenzen(meist

DNA)

inverschiedenenBereichengebundenwurden. Ublicherweise wird

in einembestimmten sehr kleinenBereichlediglich die

DNA

einerbestimmten Sequenzgebunden, wobei

einMicroarraybiszu mehrere 1000verschiedeneBereicheaufweisenund Sequenzenbindenkann.

Werden

dieseMicroarraysmit einer Vielzahlvonverschiedenen Nukleinsaure-Sequenzen(meist ebenfalls

DNA)

auseinerzu untersuchendenProbeunter geeignetenBedingungen(Salzgehalt,Temperatur,etc.) in Kontakt gebracht, so bilden sich komplementareHybride ausdeninderProbebefindlichenund den auf derPlatte gebundenen Sequenzen. Nicht-komplementare Sequenzen konnen abgewaschenwerden. Die Bereicheauf

dem

Microarray, welche DNA-Doppelstrange enthalten, werden ermittelt

und

ermoglichen einenRuckschluB aufdieSequenz und

Menge

derNukleinsaureinderAusgangsprobe.

Microarrayswerdenbeispielsweise inentsprechenden Verfahren zur Analyse desExpressionsprofils

von

Zellen, also der Analyse der Gesamtheit der von bestimmten Zellen exprimierten

mRNA-Sequenzen,

eingesetzt(vgl. Lockhartetal.,Nat. Biotechnol. 14(1996), 1675-1680).

Da

die

Menge

derfurdiese Analysezur Verfugungstehenden

mRNA

ublicherweisebeschrankt ist, sind speziell Verfahren zur

Vermehrung

von Ribonukleinsauren entwickelt worden, die anschlieflend mittels Microarraysanalysiert werden sollen.Dafiirwerden dieRibonukleinsaurengegebenenfalls durch reverse Transkriptionindiestabilere

cDNA-Form

uberfiihrt.

Verfahren, dieeinehoheAmplifikation einerRNA-PopulationeinzelnerZellenermoglichensollen,werden beispielsweise in

US

5,514,545 beschrieben. Bei diesem Verfahren wird einPrimer verwendet, der eine Oligo-dT-Sequenzund eine T7-Promotor-Regionaufweist. Die Oligo-dT-Sequenz lagert sich an die 3- Poly-A-Sequenz der

mRNA

an und initiiert so die reverse Transkription der

mRNA. Nach

alkalischer Denaturierung des

RNA/DNA-Heteroduplex

wirdderzweite

DNA-Strang

unterAusnutzungderHaarna- del-Struktur

am 3-Ende

der

cDNA

alsPrimer gebildetund mittels Nuklease SI

zum

linearen Doppel- stranggeoffhet.

Der

DNA-Doppelstrangdientanschlieflend alsMatrizefurdieT7-RNA-Polymerase. Die so erhaltene

RNA

dient

wiederum

alsPrimerfurcDNA-Synthese, wobei hexamereOligonukleotidebelie- biger Sequenz (sog. "random primer") verwendet werden.

Der

zweite

DNA-Strang

wird nach Hitzedenaturierung unter

Verwendung

der genannten T-7-01igo(dT>Primer erzeugt. Diese

DNA

kann erneutalsMatrizefurdie

T7 RNA-Polymerase

dienea

Alternativ dazu oflfenbart

US

5,545,522 dassaucheineinzigesPrimer-Oligonukleotidverwendet

werden

kann, urn eine hohe Vermehrungsrate zu erzielen. Dafur wird

cDNA

aus einer

RNA

durch reverse Transkription erzeugt, wobei einPrimer verwendetwird, der folgdendeElemente aufweist: (a) 5-dN2o, also beliebige Sequenz Ober eine LSnge von 20 Nukleotiden; (b) minimaler T7-Promotor; (c) Transkriptionsstartsequenz

GGGCG;

und (d) Oligo-dTu. Die Sythese des zweiten DNA-Stranges wird nach partiellem Verdau der

RNA

mittels

RNase H

durchgefiihrt, indem verbleibende

RNA-Oligonu-

kleotide als Primerfiir PolymeraseI dienen. Die

Enden

der so erhaltenen

DNA

werden mit

T4-DNA

Polymerasegeglattet.

Ein ahnliches Verfahren wird in

US

5,932,451 oflfenbart, bei

dem

^zusatzlich

^im

S'-proximalen Bereich nochzwei Box-Primersequenzenaddiert werden, die eindoppeltes Immobilisieren viaBiotin-Boxprimer ermoglichen.

Die genannten Verfahren zur

Vermehrung

von Ribonukleinsauren weisen jedoch Nachteile auf

So

erzeugen die Verfahren Populationen von Ribonukleinsauren, die in ihrer Zusammensetzung nicht der

Ursprungs-Populationentsprechen.Ein

Grund

dafiirbesteht inder

Verwendung

derT7-Promotor-01igo- dT-Primer, welche primar Ribonukleinsaure-Sequenzen aus

dem

3-Bereich der

mRNA

amplifizieren.

Ferner

wurde

experimentellbelegt, dass dieinden genannten Verfahren verwendeten, sehr langenPrimer (mehr als 60Nukleotide) dieBildung

von

Primer-Primer-Hybridenund eine unspezifische Amplication des Primers ermdglichen (Baugh et al., NucleicAcids Res., 29 (2001), e29). Die bekannten Verfahren erzeugen somit zunichtunerheblichem Anteil Artefakte, diebei der weiteren AnalysederNukleinsauren storen.

Der

vorliegenden Erfindung lag somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Vermehrung von Ribonukleinsauren zur Verfugung zu stellen, das eine gleichmaBige und vor allem eine gut reproduzierbareVermehrungder RibonukleinsaurenimAusgangsmaterialermoglicht.

DieseAufgabe wurde

nunmehr

durch Verfahren zur Vermehrung von Ribonukleinsauren gelSst, welche

Schritteumfassen,beidenen

man

(a) mittelseinesEinzelstrang-PrimersdefinierterSequenz, einer

RNA-abhangigen DNA-Polymera-

se

und

Desoxyribonukleosidtriphosphaten einen DNA-Einzelstrang durch reverse Transkrip- tionauseiner

RNA

erzeugt;

(b) die

RNA

^entfernt;

(c) mittels eines Einzelstrang-Primers, der eine Box-Sequenz umfaBt, einer

DNA-Polymerase und

DesoxyribonukleosidtriphosphateneinenDNA-Doppelstrangerzeugt;

(d) denDoppelstranginEinzelstrangeauftrennt;

(e) mittels eines Einzelstrang-Primers, der im 5'-Bereich die Sequenz eines Promoters

und im

3'-Bereich dieselbe definierte Sequenz wie der Primer in (a) umfaBt, einer

DNA-Polymerase

und Desoxyribonukleosidtriphosphaten

DNA-Doppelstrange

aus einemderin(d)entstandenen Einzelstrangenerzeugt;

und

(f) mittels einer

RNA-Polymerase

und Ribonukleosidtriphosphaten eine Vielzahl von

RNA-

Einzelstrangen erzeugt, diean beiden

Enden

definierteSequenzenumfassen.

ErfindungsgemaB

wurde

uberraschenderweise festgestellt, dass die genannte Kombination

von

Verfahrensschrittenzueinerbesonders gleichmaBigenAmplifikation derimAusgangsmaterialbefindlichen Ribonukleinsauren fiihit und gleichzeitig die Entstehung

von

Artefakten verhindert.

Das

erfindungsgemaBe Verfahren stellt somiteineVerbesserung der Verfahren zur

Vermehmng von

Nuklein- sauren dar und ermoglicht eine Verbesserung derVerfahren zur Analyse von Ribonukleinsauren mittels Microarrays.

GemaB dem

beschriebenen Verfahrenwerden bei der

Vermehrung

RNA-EinzelstrSnge erzeugt, welche

dieinverseSinnrichtung (antisenseSequenz)wiedas

RNA-

Ausgangsmaterialaufweisen.

GemaB

einerAusfuhrungsformder Erfindung

wurde

diealsMatrizein(a)dienende

RNA

ausZellen eines Organismus isoliert. Die Isolierung von

mRNA

aus Zellen eines vielzelligen Organismus ist besonders bevorzugtist.

Der

in(a)verwendeteEinzelstrang-PrimeristeinPrimer miteiner beliebigendefinierten Sequenz, d.h. er enthalt keine zufallige Abfolge von Nukleotiden.

Es

kdnnen auch

mehr

als ein definierter Primer

zum

Einsatz gelangen.

Der

ⁱⁿ (a) verwendete Primer umfaBt vorzugsweise eine Oligo-dT-Sequenz, also eine Sequenz, in der mehrere dT-Nukleotide aneiander gereiht sind. Dies weist den Vorteil auf, dass die Anlagening des

WO

^03/102232 13/05579

- ₄ -

PrimersimBereichder poly-A-Sequenzder

mRNA

^erfolgt. Es wird somitin der reversal Transkription nahezuausschlieBIich

mRNA

transkribiert.

ErfindungsgemaBist esbesonders bevorzugt, dasin (a) ein5'-(dT)i8V-Primer fur die reverse Transkrip- tion verwendet wird. Daninter wird ein Primerverstanden, der 18 dT-Desoxyribonukleotid-Monomere gefolgtvon einemeinzelnenDesoxyribonukleotid-MonomerandererArt(alsodA,

dC

oderdG, hierals

V

bezeichnet) aufweist. Dieser Primer ermoglicht eine reverse Transkription, die nahezu ausschliefilich

Sequenzen transkribiert, welche im unmittelbaren 5'-Bereich der Poly-A-Seqenz beginnen. Die

Verwendung

diesesPrimersunterdriickt somitdieBildung vonTranskriptions-Artefakten, welche durch Anlagening derublichenOligo-dT-PrimeringrofierenPoly-A-Bereichender

mRNA

beiden

im

Stand der Technik bekannten Verfahrenentstehen.

Alternativ dazu kann aber in(a) auch einPrimerverwendet werden, der eine

Homologie

zu eineroder mehreren bestimmten Sequenz(en) in der Probe aufweist. Bei entsprechenden Verfahren ist die VermehrungderRibonukleinsauren somitaufbestimmte Zielsequenzenbeschrankt.

ErfindungsgemaBistesbevozugtdie

RNA

inden

DNA-RNA-Hybriden

in(b)durch

RNase

aufeuspalten.

Dabeikonnenbeliebige

RNasen

verwendet werden. Die

Verwendung von RNase

Iund/oder

RNase H

^ist

bevorzugt. Dadurch werden ferner aile

RNAs

eliminiert, die beim ersten Schritt nicht in

cDNA

umgeschrieben wurden, insbesondere ribosomale

RNAs,

aberauch anderezellulare

RNAs,

dienicht den

fur

mRNA

charakteristischen Poly(A)-Schwanz haben. Die durch reverse Transkription entstandenen

DNA-RNA-Hybride

konnen auchdurch HitzeeinwirkungindieEinzelstrang-Formuberfiihrtwerden.Die

Verwendung

der

RNasen

weist denVorteil auf,dassdieublichenveise ebenfallsinderProbevorliegende genomische

DNA

nichtlinearisiertwirdund somitauchnichtalsHybridisierungspartner fur diePrimerin den nachfolgenden Schritten zur Verfiigung steht. Besondere Vorteile ergeben sich durch die

Verwendung

der

RNase

I, da diese leicht durch Hitze inaktiviert werden kann.

Das

erfindungsgemaBe Verfahrenhatgeradedie

Vermehrung

der Ribonukleinsauren

zum

Ziel;einestabile

RNase

kdnntediesem Zielentgegenwirkenund mussteumstandlichaus

dem

Reaktionsansatzentferntwerden.

In (c) wird ein Einzelstrang-Primer verwendet, der eine

Box-Sequenz

umfaBt.

Im Rahmen

der vorliegenden Erfindung wird eine

RNA-

oder

DNA-Sequenz

als

Box-Sequenz

bezeichnet,

wenn

diese eine definierte

Sequenz

mit einer

Lange von

10 bis 25 Nukleotiden aufweist, die nur eine geringe

Homologie

zu

Gensequenzen

aufweist, welche

von

den

Organismen

exprimiert werden,

von

denendiezuvermehrendeRibonukleinsaure

gewonnen

wurde.

Die geringe

Homologie

^einer potentiellen

Box-Sequenz

zu entsprechenden

Gensequenzen

kann experimentelldurch eine Standard Northern Analyse bestimmt werden. Dafur

konnen RNA-Proben

des Organismus, von

dem

die zu vermehrenden Ribonukleinsauren

gewonnen wurden

(bspw.

Pflanze, Mensch, Tier), elektrophoretisch aufgetrennt und auf eine

Membran

iibertragen werden.

Eine geringe

Homologie

liegt dann vor,

wenn

eine Hybridisierung mit einem markierten Oligonukleotid, das die

Box-Sequenz

aufweist, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen kein Hybridisierungsignal erzeugt. Stringente Bedingungen konnen beispielsweise durch

Waschen

nach der Hybridisierungmit 0,1 ^*

SSC, 0,1% SDS

fur

40

Minutenbei25

Grad

Celsiusrealisiertwerden.

Alternativzuder experimentellenVerifizierungder

Box-Sequenz kann

dieErmittlungeiner Sequenz, die nur eine geringe

Homologie

zu bekannten Gensequenzen aufweist, welche in Vielzellern exprimiert werden, uber

Datenbanken

erfolgen.

Im

Stand der Technik sind die bekannten Gensequenzen, welche in Vielzellern exprimiert

werden

in

Form von Datenbanken

allgemein zuganglich; entwederals

Gensequenzen

mitbekannterFunktionoder

-

falls dieseunbekannt ^ist

-

in

Form von

sogenannten^expressed sequence tags" oder

ESTs.

Eine Sequenz wird dabei als Sequenz bezeichnet, dienureinegeringe

Homologie

zu bekannten

Gensequenzen

aufweist,

und

istdemgemafl

als

Box-Sequenz

geeignet,

wenn

^diese im Vergleich zu alien in einer entsprechenden

Datenbank

gespeicherten Sequenzen uber die gesamte

Lange von

10 ^bis 25 Nukleotiden mindestens

20%,

vorzugsweise mindestens30 oder

40 %

Sequenzunterschiedeaufweist.

Das

heiCt, es sindmindestens 2 Sequenzunterschiede bei einer Gesamtlfcnge von 10 Nukleotiden vorhanden, bzw. 4 bei einer Gesamtlange von 20 Nukleotiden. Die Sequenzidentit&t, bzw. die Unterschiede zwischen zwei Sequenzen

werden

dabeivorzugsweiseunter

Verwendung

der

BLAST

Software ermittelt.

Eine bestimmte Sequenz kann somit

im

Hinblick aufeine bestimmte

Verwendung

als

Box-Sequenz

bezeichnet werden. Soil

mRNA

eines

Menschen

mit

dem

erfindungsgemaBen Verfahren vermehrt werden, so

muB

die beschriebene, geringe

Homologie im

Vergleich zu einer

humanen Datenbank

vorliegen oder die experimentelle Verifizierung der

Box-Sequenz gegen humane RNA-Sequenzen

uber ein Northern-Blot erfolgen. Soil

mRNA

^einer Pflanze mit

dem

erfindungsgemaBen Verfarhen vermehrt werden, so

muB

die beschriebene, geringe

Homologie im

Vergleich zur den Ribonukleinsauren der Pflanze gegeben sein. Eine Sequenz, die daher fur ein bestimmtes erfindungsgemaBes Verfahren als

Box-Sequenz

infrage

kommt,

kann in einem anderen Verfahren mdglicherweisenichtals

Box-Sequenz

verwendet werden.

Die

Box-Sequenz

wird

zudem

vorzugsweise so gewahlt, dass diese keineviralen Sequenzenumfafit und

zwar weder

kodierende noch regulatorische Sequenzen (Promotoren oder Terminatoren)

von

VirenoderBakteriophagen.

Die

Verwendung

eines Primers, der eine entsprechende

Box-Sequenz

umfaBt, in

dem

erfindungsgemaBen Verfahren bietet besondere Vorteile,

da

die Entstehung

von

Amplifikationsartefaktendeutlich reduziert wird.

Die

Box-Sequenz

befindet sichdabeiim 5'-Bereich des in (c)genutzten Primers.

Der

PrimerumfaBt ferner vorzugsweise eine

Sequenz von

3 bis 6 beliebigen Nukleotiden (N3-N6), sowie eine ausgewahlte Trinukleotidsequenz (wie z.B. TCT). Alternativ

kann

eine

Mischung

verschiedener TrinukleotidsequenzenTeildesPrimerssein.

Der

Primer, derdie

Box-Sequenz

umfaBt, weistvorzugsweiseeine

Lange von 40

Nukleotiden auf,

wobei eine

Lange

von etwa

30

Nukleotidenbesondersbevorzugtist.

GemaB

einer besonders bevorzugten Ausfiihrungsform der Erfindung wird in (c) ein Einzelstrang- Primer verwendet wird, der neben der

Box-Sequenz

eine besonders geeignete Sequenz

von

minde- stens 6 NukleotidenumfaBt.

Der

in (c) verwendeteEinzelstrang-Primer kannbeispielsweisediefol-

gende Sequenz

GCA TCA TAC AAG CTT GGT ACC N

3-<s

TCT

(27-30nt)aufweisen.

Als

DNA-Polymerase

in (c) und (e) kann eine beliebige

DNA-abh&ngige DNA-Polymerase

verwendet werden. Vorzugsweise wird eine Reverse Transkriptase verwendet. Besondere Vorteile des erfindungsgemaBen Verfahrens ergebensich,

wenn man

als

DNA-Polymerase

eineReverseTranskriptase verwendet, dadiese doppelstrangigeDNA-Bereichenicht auflost. Fur dieDNA-Polymerisationin(a), (c)

und (e) benotigt

man

ferner vierDesoxyribonukleosidtriphosphate, iiblicherweise

dATP, dCTP, dGTP

und

dTTP.

In (d) konnen dieDNA-Doppelstrangedurch beliebigeVerfahren in Einzelstrange aufgetrennt werden.

VorzugsweiseerfolgtdieAuftrennung durchHitzeeinwirkung.

WO

^03/102232 13/05579

-

₆ -

Der

in (e) eingesetzte Einzelstrang-Primer umfaBt einen Promotor. Eine Promotor-Sequenz ermoglicht die Bindung der RNA-Polymerase,

wodurch

die Synthese eines RNA-Stranges initiiert wird. Vor- zugsweiseverwendet

man

in (e)einen Einzelstrang-Primer, der dieSequenzeineshochspezifischen

RNA-

Polymerase-Promotors umfafit, wie T7,

T3

oder SP6. Beispielsweise hat ein Primer mit T7-Promotor folgendeSequenz,

ACT AAT ACg ACT CAC TAT A _g

^+I_g(dT)i8

V

(40^nt).

Die Auswahl derin

dem

erfindungsgemaBen VerfahreneingesetztenRNA-Polymerase(n) erfolgt in

Ab-

hangigkeitderin

dem

PrimervorhandenenPromotor-Sequenz.

Wurde

einPrimer mit Sequenzen derT7- Polymerase verwendet, so wirdeineT7-RNA-Polymeraseeingesetzt.

Fur die Bildung von Ribonukleinsauren benfttigt

man

femer Ribonukleosidtriphosphate; ublicherweise werden

ATP, CTP, GTP und UTP

eingesetzt.

Die erfindungsgemaBen Verfahren ermoglichen erstmals eine Starke spezifische

Vermehrung

der

RNA-Ausgangssequenzen,

bei der die Gesamtsequenz der

RNA-Population

reprasentiert wird. Die

Vermehrung

der

Ausgangs-RNA-Sequenz

erfolgt vorzugsweise

um

einen Faktor

von

mindestens 500,wobei eine

Vermehrung um

einenFaktor

von mehr

^als 1000 besonders bevorzugtist.

Von

der vorliegenden Erfindung werden schlieBlich auch Verfahren umfaBt, bei denen

man

den Einzelstrang-PrimerundPrimer-verursachte Artefakte(z.B.Dimere)entfernt, bevordie

RNA-Polymerase

zugegebenwird.

Eine weitere

Vermehrung

derRibonukleinsaurenkannin Verfahrenerzielt werden, beidenen

man im

AnschluBan(f):

(g) aus den in (0 erzeugten RNA-Einzelstrangen, einem Einzelstrang-Primer, der die Box-Sequenz umfaBt, einerRNA-abhangigen

DNA-Polymerase

undDesoxyribonukleosidtriphosphaten wird ein

DNA-EinzelstrangdurchreverseTranskription erzeugt;

(h) die

RNA

wirdentfernt;

(i) aus den in (h) erzeugten DNA-Einzelstr&ngen mittels eines Einzelstrang-Primers, der

im

5^1- Bereichdie SequenzeinesPromotors

und im

3'-Bereich dieselbe definierte Sequenz, wiederin (a) genutzte Primer umfaBt, einer

DNA-Polymerase und

Desoxyribonukleosidtriphosphaten

DNA-Doppel

strange erzeugt;

und

(j) mittels einer

RNA-Polymerase

und Ribonukleosidtriphosphaten eine Vielzahl

von RNA-

Einzelstrangenerzeugt.

Durch

diese Verfahrensvariante

werden

besondereVorteileerzielt. Diedefinierten

Enden

derin

dem

Verfahren

gemaB

(a) bis (f) erzeugten Ribonukleinsauren ermoglichen eine reverseTranskription in

DNA,

dieanschlieBend

wiederum

alsBasisfurweitere

RNA-Synthese von dem Promotor

ausgehend

dient.

Auf

diese

Weise

laBt sich die

Menge

der vermehrten Ribonukleinsaure nochmals

um

einen Faktorvonmindestens50 steigern.

Vorzugsweise wird dasVerfahren dabeiso durchgefiihrt, dass derin(i) genutzte Einzelstrang-Primer dieselbeSequenz wiederin (a)genutztePrimeraufweist.

Der

in (g) eingesetztePrimer kann identisch mit

dem

in (c) benutzten Primer ^sein. Alternativ dazu umfaBt der _{in (g)} eingesetzte Primer nur die wohldefinierte

Box-Sequenz

umfassen

und

nicht die unspezifischeren Elemente des Primers, die fiir (c) benotigt wurden.

Der

in (g) eingesetzte Primer

kann somitbeispielsweise die Sequenz

GCA TCA TAC AAG CTT GGT ACC

(21 nt)aufweisen.

Die in (h) erzeugte

RNA

kann mittels beliebiger im Stand der Technik bekannter Verfahren entfemt werden,wobeieineHydrolysemittelseiner

RNase

jedoch bevorzugtwird.

Vor

der Durchfiihningder Transkription(Schritte(f) und_(j)der erfindungsgemaBen Verfahren) kann es vorteilhaft sein, dieNukleinsauren nach im Stand derTechnik bekannten Verfahren zu reinigen. Dabei

sollten inersterLinieim UberschuBeingesetztePrimerund vondiesen abgeleitete Artefakte(z.B.Primer- Dimere)abgereinigtwerden.

Das

oben beschriebene erfindungsgemaBe Verfahren erzeugt ausschlieBlich RNA-Einzelstrange mit inverserSinnrichtung (sogenannteAntisense-Strange).

Vom Umfang

dervorliegendenErfindungwerden jedoch ebenfalls Verfahren erfaBt, die anschlieBend mittels im Stand der Technik iiblicher Verfahren (reverse Transkription,

PCR,

cDNA-Zweitstrangsynthese,Transkription,etc.) aus

dem

RNA-Einzelstrang inverser Sinnrichtung einen DNA-Doppelstrang, einen DNA-Einzelstrang beliebiger Sinnrichtung oder einen RNA-Einzelstrang mit Sinnrichting (sogenannter Sense-Strang) erstellen. Die genaue Art des Verfahrensproduktes hangtnaturlichinersterLinievonder geplanten

Verwendung

ab.

DievorliegendeErfindungbetrifftfemerKits,diealleReagentien zur

Vermehrung

vonRibonukleinsauren mittels des erfindungsgemaBen Verfahrens zurVerfugung stellen. Entsprechende Kitsumfassendie fol-

gendenBestandteile:

(a) mindestenseinen Einzelstrang-Primer, derdieSequenzeinesPromotorsumfaBt;

(b) mindestenseinen Einzelstrang-Primer, der eineBox-SequenzumfaBt;

(c) eineRNA-abhangige DNA-Polymerase;

(d) Desoxyribonukleosidtriphosphate;

(e) eine

DNA-abhangige

DNA-Polymerase;

(f) eineRNA-Polymerase; und

(g) Ribonukleosidtriphosphate.

Das

Kit umfaBt somit mindestens zwei verschiedene Einzelstrang-Primer, welche durch die oben beschriebenen

Merkmale

gekennzeichnet sind.

Das

Kit kann jedoch in Abhangigkeit der geplanten Verfahren

mehr

alszweiPrimerundauchweitereReagenzien umfassen.

Das

Kitkannzusatzlich

RNase

Iund/oder

RNase H

^umfassen.

Die in

dem

Kit vorliegende

DNA-Polymerase

ist vorzugsweise eineRevese Transkriptase oder eine andere

DNA-Polymerase,

welche die Eigenschaft hat, doppelstrangige

DNA-Breiche

nicht aufzuldsen.

Das

Kit kann ferner eine Zusammenstellung zur Markierung

von DNA

mit einer nachweisbaren Verbindung und einen oder mehrere DNA-Microarrays umfassen. Mit

dem

^Kit konnen somit alle Be-

standteile zur Durchfiihrung einer Expressionsanalyse angeboten werden. Ublicherweise werden die einzelnen

Komponenten

in getrennten Behaltern verpackt sein; es kann jedoch auch mGglich sein, Bestandteile, dieineinemVerfahrensschrittverwendet werden,gemeinsamineinenBehalterabzupacken.

DemgemaB

^betriffldievorliegendeErfindungfernerVerfahren zur Analyse

von

Nukleinsauren,bei denen

man

eineRibonukleinsaure gewinnt, mittels eines der erfindungsgemaBen Verfahren vermehrt undunter

Verwendung

einesMicroarraysanalysiert. DieRibonukleinsaurewird ublicherweisedurchIsolierungaus

WO

03/102232 •03/05579

- 8 -

einerbiologischenProbe gewonnen. Die durch das erfindungsgemafleVerfahren vermehrte Ribonuklein- saurekann vor AnalysemittelsMicroarrays durchreverse Transkriptionin

cDNA

uberfiihrtwerden.

Das

Verfahren ermoglicht die Analyse der

Menge

^und/oder Sequenz der

cDNA. Auch

die in den Zwischenschritten

gewonnen DNAs

konnen genutzt werden, bspw.

Um

^{durch Klonierung} eine reprasentative

Genbank

zu erhalten, inder die ^{in einer}biologischenoderineiner

im

Laborhergestellten Probeexprimierten

Gene

enthaltensind.

Das erfindungsgemaBe Verfahren wird in Fig.1 beispielhaft dargestellt: Zunachst wird ausgehend

von

RNA

die Synthese eines DNA-Einzelstranges durch reverse Transkription durchgefuhrt, wobei ein geankerter 01igo(dT)i8V-Primer verwendet wird. Dieses Vorgehen ermoglicht es, den

Ubergang

der Poly(A)-Enden der

mRNA zum

³-UTR-Bereich umzuschreiben.

Im

nachsten Schritt wirddie

RNA

^aus

dem RNA/cDNA-Heteroduplex

mittels

RNase H

^/

RNase

I eliminiertunddie restliche

RNA

(vorallem ribosomale

RNA)

durch

RNase

Ientfernt.

Die Synthese deszweiten, komplementarenDNA-Strangeswird zurEinfiihrungderBox-Sequenz durch

Verwendung

eines speziellen Primers genutzt.

Der

Primer besteht aus einemTeilabschnitt, in

dem

^3-9

beliebigeNukleotide aneinandergereiht wurden, und einemzweiten Teilabschnitt, derdie

Box-Sequenz

umfaBt.

Nach

Anlagerung des Primers erfolgt die AuflRillung

zum

Doppelstrang mittels der DNA-Polymerase.

Uberschiissiger Primer wird entfernt und nach Hitzedenaturierung des Doppelstranges wird die Temperaturabgesenkt,

wodurch

einPrimerhybridisieren kann, dereinen T7-Promotorund die Sequenz (dT)isV umfaBt. Ein weiterer

DNA-Strang

wird durch Elongation des Primers erhalten. AnschlieBend werden dieim UberschuB vorliegenden Primer sowie gegebenenfalls Primer-verursachteArtefakte (z.B.

Dimere) entfernt und dieAmplifikation der

RNA

erfolgt per invitro-Transkription ausgehend

von dem

T7-Promotor.

In Fig. lc wird das Verfahren zur

Vermehrung

von Ribonukleins&uren mittels der oben beschriebenen Schritte (g) bis(j)gezeigtUnter

Verwendung

einesPrimers,derdieBox-SequenzumfaBt,einerreversen Transkriptase und den

dNTPs

wird die in Schritt (f) erzeugte RibonukleinsSure revers transkribiert.

RNasen

verdauen den RNA-Strang. UnterEinsatz eines Primers, der einenPromotorund dieOligo-dT SequenzumfaBt wird ein zweiter

DNA-Strang

erzeugt, derals Matrize furdie

RNA-Polymerase

in der Transkriptiondjent.

Die Abfolge und detaillierte Durchfuhrung der Reaktionsschritte des erfindungsgemaBen Verfahrens werdennachfolgendbeispielhaft dargestellt:

A. ErsteAmpliflkationsrunde^(vgl.Fig. la, lb)

AL

ReverseTranskription

von

100

ng Gesamt-RNA

mit01igo(dT)i8V'Primer:

Erststrang-DNA-Synthese:

RNA(50ng/W): 2m

01igo(dT)uV(5pmol/m): 1.5 Ml !

dNTP-Mk(lOmM):

1

W

DEPC-H2O

3,5 Ml

4 Min. bei

65°C

ineinemThermocyclermitHeizdeckel(l)inkubierendannaufEisstellen

Erststrang-cDNA-Synthesemix 5x RT-Puffer

RNase-Inhibitor(20U/u|)

im

SuperscriptII(200 U/|4)

im

DEPC-H2O

^6jjJ

Den

Erststrang-cDNA-Synthesemix aufEis

zusammen

pipettierenund zu den Proben im Eisbad geben.

DieProbenanschlieBendindenauf

42°C

vorgewarmten Thermocyclerstellen.

Inkubationder Proben;

37°C/ 5Minuten 42°C/50 Minuten 45°C/10Minuten 50°C/10Minuten

70°C/15Minuten(zur Inaktivierung desEnzymes)

AnschlieBendProben aufEisstellen.

A2.Entfernung der

RNA

Entfernungder

RNA

aus

dem

Reaktionsansatz

Erststrang-cDNA

20

|il

1

RNase-Mix

(RNase

H/RNase

Ije5 U/ul)

M _J

v.

Bei

37°C

fur20 Minuteninkubieren, anschlieBend auf Eisstellen. ZurEntfernung der ribosomalen

RNA

wurdeaufdie

Verwendung

von

RNase A

verzichtet,dadieses

Enzym

nursehrschwer zu aktivierenist.

Die verwendete Rnase ^I kann an dieser Stelle optimal durch Inkubation bei

70°C

fiir 15 Minuten

vollstandig inaktiviertwerden.

A3. Doppelstrang

Template DNA

mit

Box-random-Primer und

mitT7-(cT),8

V

Random

Priming derErststrang

cDNA

mitBox-random-Primer

Erststrang-cDNA ²¹ uJ

j

dNTP-Mix

(10

mM)

1 Ml

Box-random-Primer(10pmol/P-1) 1

W

10xPolymerasePuflfer

6m

H2O ²⁰ m

Inkubation:

70°C/1 Minute 37°C/1 Minute

1 |ilReverseTranskriptase (5U/|J)zur Probegeben 37°C/30 Minuten

WO

03/102232

P^^03/05579

-

10

^-

Entfernungvon UberschuBPrimer

1 jiIExonukIeaseI(10U/nl) 37°C/5Minute

96°C/6Minuten

AnschlieBendProbenaufEisstellen.

Doppelstrang Template

DNA

mit T7-(dT)i*V 2jilT7-(dT)i8

V

Primer(lOpmol/fil)

70°C/1 Minute 42°C/1 Minute

1 piReverseTranskriptase(5U/nl) zurProbe geben 42°C/30 Minuten

Auf

37°Cabkiihlen

1 |il

T4 DNA-Polymerase

(lOU/ftl) 37°C/1 Minute

65°C/1 Minute

AnschlieBendProbenaufEisstellen.

Den Mix

aufdie Saulchen pipettieren und fur 1 Minute in einer Tischzentrifuge bei max.

Umdrehung

zentrifugieren.

Den

Durchlaufverwerfen, die Saulchenmit 500 ^|d Waschpufferauffiillen und wie oben

zentrifugieren.

Den

Durchlaufverwerfen, die Saulchen mit 200 Waschpufferauffiillen und wie oben

zentrifugieren.

Die Saulchen in ein neues 1,5 ml-Eppendorf-GefaB uberfuhren und mit 50 ^pi Elutions-Puffer auffiillen, eineMinute inkubierenund dann wie oben zentrifugieren.

Den

Elutionsvorgangeinmal wiebeschrieben wiederholen.

A5. Ethanol-Fallung dergereinigten

cDNA

DiePelletPaint™-Carrier-Stockl6sungnichtvortexenund

immer

dunkel aufbewahren. LangereLagerung

)ei-20°C,kleinereAliquotskonnenfurca. 1

Monat

bei

4°C

gelagertwerden.

Jffiojj^ng^ —

^-

_— ^{^^^^^^^}

Eluat

Carrier(PelletPaint™) Natrium-Acetat Alkoholabs

Den

Ansatz gut mischen (nicht vortexen) und die

cDNA

bei Raumtemperatur fiir 10 Minuten bei maximaler

Umdrehung

pelletieren.

Den

tJberstand abnehmen und das Pellet einmal mit 200 ^pi

70%

Ethanol waschen. 1 Minute wie oben zentrifugieren und den Uberstand vollstandig mit einer Pipette

entfernen.

Zum

Trocknen des Pellets das Eppendorf-GefaB fur ca. 5 Minuten geGflhet bei

Raum-

temperatur stehen lassen. Nicht in derspeedvac trocknen! AnschlieBend dasPellet in 8 nlTris-Puffer

(pH

8,5)losenund aufEisstellen.

A6. Amplifikationperinvifra-Transkription

Template

DNA

ATP/CTP/GTP/UTP _Oe

75

mM)

1OxPuffer

T7-RNA-Polymerase

8 pi 2 Ml

2Hi 2|ol

Alle Reaktionskomponenten auftauen und den Ansatz bei

Raumtemperatur,

menials

auf

Eis zusammenpipettieren, da der Spermidin-Anteil imReaktionspufFer zu einer Prazipitation des Templates fiihrenwurde.FurdieReaktion0,5 ml bzw.0,2 mlRnase-frei

PCR-Tubes

verwenden.

Die Transkription uber Nacht bei

37°C

in einem Thermocycler mit Heizdeckel oder ⁱⁿ einem Hybridisierungsofen inkubieren. 1-2 _nl des Ansatzes aufein natives 1,5%-Agarose-Gel auftragen.

An-

schlieBend 1 Ml

DNase

pro Reaktion zugeben und fur weitere 15 Minuten bei

37°c

inkubieren. Zur Reinigung der

RNA

das RNeasy-Kit

von

Qiagen benutzen und nach

dem

Protokoll zurRNA-clean-up vorgeben. Die

RNA

anschlieBend mit 2x50

DEPC-Wasser

eluierenund wiebei Schritt 6 beschrieben mitEthanolfallen.

Das

RNA-Pelletin5 id

DEPC-Wasser

Ibsen.

Die

RNA

^istjetzt fertig urn eine Markierung fiir die Microarray-Hybridisierung, bzw. urn eine zweite Amplifikationsrunde durchzufiihren.

B.Zweite Amplifikationsrunde(vgl.Fig. 1c)

Erststrang-DNA-Synthese:

RNAderl.Runde:

4

m

Box

Primer(5pmol/|4):

dNTP-Mix

(10

mM): im

DEPC-HzO

2pi

4Min.bei

65°C

ineinemThermocyclermitHeizdeckel(l)inkubierendann aufEisstellen

Erststrang-cDNA-Synthesemix

5xRT-Puffer 4

m

RNase-Inhibitor(20U/W)

mi

DEPC-H2O

5

m

Den

Erststrang-cDNA-Synthesemix aufEis

zusammen

pipettieren und zu den Proben im Eisbad geben.

Die ProbenanschlieBendinden auf

48°C

vorgewarmten Thermocyclerstellen.

WO

^{03/102232 13/05579}

-

12

^- Inkubationder Proben:

48°C/1Minute Abkuhlenauf45°C

1 nlReverseTranskriptase(5U/pJ)zurProbegeben 45°C/30 Minuten

70°C/15Minuten

AnschlieBendProbenauf Eisstellen.

B2.Entfernung der

RNA

Entfemungder

RNA

aus

dem

Reaktionsansatz

Erststrang-cDNA 20_Ml

RNase-Mix (RNase H/RNase

Ije 5 U/ul) 1 Ml

Bei 37°C fur

20

Minuteninkubieren,anschlieBend aufEis stellen. ZurEntfernungderribosomalen

RNA

wurdeaufdie

Venvendung

von

RNase A

verzichtet, dadieses

Enzym

nursehrschwerzu aktivierenist.

Die verwendete Rnase I kann an dieser Stelle optimal durch Inkubation bei

70°C

fiir 15 Minuten vollstandiginaktiviertwerden.

B3. Doppelstrang

Template DNA

mitT7-(dT)i₈

V ^Primer

Template

DNA

ausErststrang

cDNA

mitT7-(dT)igVPrimer

Erststrang-cDNA 21 ul

dNTP-Mix(lOmM)

luJ

T7-(dT)i8

V

Primer(10 pmol/Hl) 2uJ

10xPolymerasePuffer 6

m

H2O

20ul

Inkubation:

96°C/1 Minute 42°C/1 Minute

1 ulReverseTranskriptase (5U/ul) zurProbegeben 42°C/30 Minuten

Glattungder

dsDNA-Enden Auf

37°Cabkuhlen

1

MlT4DNA-Polymerase(10U/Ml)

37°C/3Minuten

96°C/15Minuten

AnschlieBendProbenauf Eisstellen.

34. Reinigungdcr

cDNA

roit

High-Pure PCR

PurificationKit (Roche)

Reaktionsmix Binding-buffer

Carrier(cot-1

-DNA,

WOng/pl)

50uJ 250^ul 3Ml

Den Mix

aufdie S&ulchen pipettieren und fur 1 Minute in einer Tischzentrifuge _bei max.

Umdrehung

zentrifugieren.

Den

Durchlaufverwerfen, die Saulchenmit 500 nlWaschpuffer auffullen

und

wie oben

zentrifugieren.

Den

Durchlaufverwerfen, die Saulchen mit 200 ^|J WaschpuflFer auffullen und wie oben

zentrifugieren.

Die Saulchen in ein neues 1,5 ml-Eppendorf-GefaB uberflihren und mit 50 ulElutions-Pufferauffullen, eine Minuteinkubieren und dann wie obenzentrifugieren.

Den

Elutionsvorgang einmalwie beschrieben wiederholen.

B5. Ethanol-Fallungdergereinigten

cDNA

DiePelletPaint™-Carrier-Stockl6sungnichtvortexenund

immer

dunkel aufbewahren.Langere Lagerung

bei-20°C,kleinereAliquotskonnenfurca. 1

Monat

bei

4°C

gelagertwerden.

Eluat

Carrier(PelletPaint™) Natrium-Acetat Alkoholabs

ioom

10Ml

220pi

Den

Ansatz gut mischen (nicht vortexen) und die

cDNA

bei Raumtemperatur fur 10 Minuten bei maximaler

Umdrehung

pelletieren.

Den

tfoerstand

abnehmen

und das Pellet einmal mit 200 Ml

70%

Ethanol waschen. 1 Minute wie oben zentrifugieren und den Uberstand vollstandig mit einer Pipette entfernen.

Zum

Trocknen des Pellets das Eppendorf-GefaB fiir ca. 5 Minuten geoffhet bei

Raum-

temperatur stehenlassen. Nicht in der speedvactrocknen! AnschlieBend dasPellet in 8

M

¹ Tris-Puffer

(pH

8,5)losenundaufEisstellen.

B6, Zweite Amplifikation perinvzftw-Transkription

Template

DANN

ATP/CTP/GTP/UTP

Qe 75

mM)

lOxPuffer

T7-RNA-Polymerase

8 Ml 2pi 2

m

2m1

Alle Reaktionskomponenten auftauen und den Ansatz bei

Raumtemperatur,

^niemals

auf

Eis zusammenpipettieren, da der Spermidin-Anteil im Reaktionspuffer zu einer Prazipitation des Templates

fiihrenwurde.FurdieReaktion0,5ml bzw. 0,2mlRnase-frei

PCR-Tubes

verwenden.

Die Transkription uber

Nacht

bei

37°C

in einem Thermocycler mit Heizdeckel oder in einem

WO

^{03/102232 13/05579}

- 14 -

Hybridisierungsofen inkubieren. 1-2 _\ji des Ansatzes aufein natives 1,5%-Agarose-Gel auftragen.

An-

schlieflend 1

^ ^DNase

pro Reaktion zugeben und fUr weitere 15 Minuten bei

37©c

inkubieren. Zur Reinigung der

RNA

das Rneasy-Kit von Qiagen benutzen und nach

dem

Protokoll zur RNA-clean-up vorgeben. Die

RNA

anschlieBend mit2x50 Ml

DEPC-Wasser

eluierenund wiebei Schritt 6beschrieben mit Ethanolfallen.

Das

RNA-Pelletin5fJ

DEPC-Wasser

losen.

Die

RNA

^ist jetzt fertig urn eine Markierung fur die Microarray-Hybridisierung, bzw.

um

eine weitere Amplifikationsrunde durchzufuhren(dieseerfolgtexaktwiein

B1-B6

beschrieben).

Patentanspriiche

1. Verfahren zur

Vermehrung

vonRibonukleinsauren, Schritteumfassend,beidenen

man

(a) mittels eines Einzelstrang-Primers definierter Sequenz, einer RNA-abhangigen

DNA-

Polymerase und Desoxyribonukleosidtriphosphaten einen DNA-Einzelstrang durch reverseTranskriptionauseiner

RNA

eizeugt;

(b) dieRNAentfernt;

(c) mittelseines Einzelstrang-Primers, dereineBox-Sequenzumfafit,einer

DNA-Polymerase

undDesoxyribonukleosidtriphosphateneinenDNA-Doppelstrangerzeugt;

(d) denDoppelstranginEinzelstrangeauftrennt;

(e) mittelseines Einzelstrang-Primers, derim 5-Bereichdie SequenzeinesPromoters

und im

3-Bereich dieselbe definierte Sequenz wie der Primer in (a) umfaBt, einer

DNA-

PolymeraseundDesoxyribonukleosidtriphosphatenDNA-Doppelstrangeauseinemderin (d)entstandenenEinzelstrangenerzeugt;

(f) mittels einer

RNA-Polymerase

undRibonukleosidtriphosphaten eine Vielzahl

von RNA-

Einzelstrangen erzeugt, dieanbeidenEndendefinierteSequenzenumfassen.

2. Verfahren

gemaB

Anspruch 1, bei

dem

RNA-Einzelstrange die inverse Sinnrichtung (antisense Sequenz)wiedasRNA-Ausgangsmaterialaufweisen.

3. Verfahren

gemaB

Anspruch 1 oder2, bei

dem

in (a)verwendeteEinzelstrang-Primer eine Oligo- dT-SequenzumfaBt.

4. Verfahren

gemaB

einemder Anspriiche 1-3, bei

dem man

^{in (a)} einen S'^dT^sV-Primer fiir die reverse Transkription verwendet, worin

V

^ein Desoxyribonukleotid-Monomer bezeichnet, das nicht

dT

ist.

5. Verfahren

gemaB

einemdervorstehendenAnspriiche, bei

dem man

die

RNA

ⁱⁿ(b)durch

RNase

hydrolisiert.

6. Verfahren

gemaB

einemdervorstehendenAnspriiche, bei

dem man

die

RNA

ⁱⁿ(b)durch

RNase

^I

und/oder

RNase H

^entfemt.

WO

03/102232 Pi 13/05579

-

16

^-

8.

9.

10.

11.

12.

13.

Verfahren gemafl einem der vorstehenden Anspruche, bei

dem

die Box-Sequenz mindestens 6 Nukleotideumfaflt, dienurgeringeHomologiezu bekanntenGensequenzenaufweisen,welchein Vielzellem exprimiertwerden.

Verfahren gemafl einem der vorstehenden Anspruche, bei

dem man

in (c) einen Einzelstrang- Primer verwendet, der neben der Box-Sequenz eine beliebige Sequenz

von

mindestens 6 Nukleotidenumfaflt.

Verfahren gemafl einem der vorstehenden Anspruche, bei

dem man

in (c) einen Einzelstrang- Primer folgender Sequenz

GCA TCA TAC AAG CTT GGT ACC NNN NNN TCT

(30 ^nt) venvendet.

Verfahren gemafl einem der vorstehenden Anspruche, bei

dem man

als

DNA-Polymerase

eine ReverseTranskriptaseverwendet.

Verfahren gemafl einem der vorstehenden Anspruche, bei

dem man

als Desoxyribonukleosid- triphosphate

dATP, dCTP, dGTP

und

dTTP

einsetzt.

Verfahren gemafl einem der vorstehenden Anspruche, bei

dem man

die DNA-Doppelstrangein (d) durch HitzeeinwirkunginEinzelstrange auftrennt

Verfahren gemafleinemder vorstehenden Anspruche,bei

dem

derin (e) eingesetzte Einzelstrang- PrimerdieSequenzdesT7-,T3-oderS6-RNA-Polymerase-Promotorsumfaflt

Verfahren gemafl einem dervorstehenden Anspruche, bei

dem man

^{in (e)} einen Einzelstrang- Primer verwendet,derneben derSequenzdesPromotorseine01igo(dT)-Sequenz

von

mindestens 8Nukleotidenumfaflt.

15. Verfahren gemafl einem der vorstehenden Anspruche, bei

dem man

in (e) einen Einzelstrang- PrimerfolgenderSequenz

ACT AAT ACg ACT CAC TAT A _g

⁺¹_g(dT)isV (40nt)verwendet.

- 17 -

16. Verfahren

gemaB

einem der vorstehenden Anspruche, bei

dem

die in (f) eingesetzte

RNA-

Polymerasedie

T7-RNA-Polymerase

ist.

17. Verfahren gemafleinemder vorstehenden Anspruche,bei

dem man

alsRibonukleosidtriphosphate

ATP,

CTP,

GTP und UTP

einsetzt

18. Verfahren gemafl einem dervorstehenden Anspruche, bei

dem

eine

Vermehrung

der Ausgangs-

RNA-Sequenz um

einenFaktorvonmindestens500,vorzugsweise

mehr

als1000erfolgt.

19. Verfahren

gemaB

einem der vorstehenden Anspruche, bei

dem man

im Anschlufl an (f) die folgendenSchrittezur weiterenVermehrungderRibonukleinsaurendurchfiihrt:

(g) aus den in (f) erzeugten RNA-Einzelstrangen, einem Einzelstrang-Primer, der die

Box-

Sequenz umfaflt, einer RNA-abhangigen

DNA-Polymerase

und Desoxyribonukleosid- triphosphatenwirdeinDNA-Einzelstrang durchreverseTranskription erzeugt;

(j) die

RNA

wirdentfernt;

(i) ausden in(h) erzeugtenDNA-Einzelstrangenwerden mittelseines Einzelstrang-Primers, der im 5-Bereich die Sequenz eines Promotors und

im

3-Bereich dieselbe definierte Sequenz, wie der in (a) genutzte Primer umfaflt, einer

DNA-Polymerase

und Desoxy- ribonukleosidtriphosphatenDNA-Doppelstrangeerzeugt;

und

(j) mittelseiner

RNA-Polymerase

und Ribonukleosidtriphosphateneine Vielzahl von

RNA-

Einzelstrangen erzeugt,

20. Verfahren gemafl einem der vorstehenden Anspruche, bei

dem

der in (i) genutzte Einzelstrang- PrimerdieselbeSequenz wiederin (e)genutztePrimer aufweist

21. Verfahren gemafl einem der vorstehenden Anspruche,bei

dem

die

RNA

^{in(h) mittelseiner}Rnase

hydrolysiertwird.

22. Verfahren gemafl einem der vorstehenden Anspruche, bei

dem

alle in _(j) erzeugten

RNA-

Einzelstrange inverse Sinnrichtung aufweisen.

WO

^{03/102232 03/05579}

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23. Kit zur Vermehrung von Ribonukleinsauren

gemaB

einem Verfahren der Anspriiche ¹ bis 20, welchesdiefolgendenBestandteile umfasst:

(a) mindestenseinen Einzelstrang-Primer, der dieSequenzeinesPromotorsumfaBt;

(b) mindestenseinen Einzelstrang-Primer, der eineBox-SequenzumfaBt;

(c) eine

RNA-abhangige

DNA-Polymerase;

(d) Desoxyribonukleosidtriphosphate;

(e) eine

DNA-abhangige

DNA-Polymerase;

(f) eineRNA-Polymerase; und (g) Ribonukleosidtriphosphate.

24. Kit

gemaB

Anspruch23,dasdreiverschiedene Einzelstrang-PrimerumfaBt

25. Kit

gemaB

Anspruch 23,in

dem

der Einzelstrang-PrimerderdiePromotor-Sequenz umfaBt auch eineOligo-dT-SequenzumfaBt.

26. Kit

gemaB

Anspruch23, in

dem

einEinzelstrang-Primer eine 5^f-(dT)i8V-Primer-Sequenz umfaBt, worin

V

einDesoxyribonukleotid-Monomerbezeichnet,dasnicht

dT

^ist.

27. Kitgemafleinemder Anspriiche23 bis26, das zusatzlich

RNase

Iund/oder

RNase H

umfaBt.

28. Kit

gemaB

einemder Anspriiche23 bis27, in

dem

einEinzelstrang-Primer die Sequenz des T7- oderS6-RNA-Polymerase-PromotorsumfaBt.

29. Kit

gemaB

einemder Anspriiche 23 bis28,daseinenEinzelstrang-Primer folgenderSequenz

ACT AAT ACg ACT CAC TAT A

_g⁺¹

_{g (dT)»V}

(40^nt)umfaBt.

30. Kit

gemaB

einem der Anspriiche 23 bis 29, welches dieReverse Transkriptase als

DNA-Poly-

meraseumfaBt.

31. Kit

gemaB

einemder Anspriiche 23 bis30,dasdie

T7-RNA-Polymerase

umfaBt.