Zur Biogenese von Mitochondrien

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Über d e n E i n b a u v o n Aminosäuren i n i s o l i e r t e fciito-c h o n d r i e n d e s F l u g m u s k e l s d e r W a n d e r h e u s fciito-c h r e fciito-c k e ( L o c u s t a m i g r a t o r i a ) und d e r R a t t e n l e b e r INAUGURALDISSERTATION z u r E r l a n g u n g d e s D o k t o r g r a d e s d e r N a t u r w i s s e n s c h a f t l i c h e n Fakultät d e r Ludwig-Maximilians-Universität München v o r g e l e g t v o n . / a l t e r N e u p e r t a u s G e r m e r i n g München 1 9 6 7

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INHALTSVERZEICHNIS S e i t e 1. E i n l e i t u n g 1 2 . P l a n 5 3. E r g e b n i s s e 7 3 . 1 . Versuche z u r C h a r a k t e r i s i e r u n g d e s E i n b a u s y s t e m s 7 3.1.1. üsmolarität d e s Eediums 7 3.1.2. pH-Abhängigkeit d e s E i n b a u s 9 3.1.3. B e d a r f an Aminosäuren 11 3.1.4. Ze itabhängigke i t d e s E i n b a u s 18 3.1.5· Abhängigkeit d e s E i n b a u s von d e r I v l g+ + K o n z e n t r a t i o n 19 3.1.6. Abhängigkeit d e s E i n b a u s von d e r f h o s p h a t -i o n e n k o n z e n t r a t -i o n 2 0 3 . 1. 7 · B e r e i t s t e l l u n g d e r E n e r g i e für den E i n b a u 21 3.2. Einfluß von Hemmsubstanzen d e r c y t o

-p l a s m a t i s c h - r i b o s o m a l e n P r o t e i n 

s y n t h e s e a u f den E i n b a u 2 7 v

3.3. Abhängigkeit d e s E i n b a u s von d e r s t r u k t u r e l l e n

I n t a k t h e i t d e r h . i t o c h o n d r i e n 29 3.4-, Untersuchungen z u r l i e g u l a t i o n des E i n b a u s 32

3.4.1. Abhängigkeit d e r Einbauaktivität vom

E n t w i c k l u n g s z u s t a n d d e r fcitochondrien 32 3.4.2. E i n b a u i n L . i t o c h o n d r i e n aus h y p e r t h y r e o t e n R a t t e n 34 3.5. Ausschluß von F e h l e r q u e l l e n 36 3.5.1. Nachweis d e s E i n b a u s i n P e p t i d k e t t e n 3 6 3·5·2. Ausschluß m i k r o s o m a l e r B e t e i l i g u n g am E i n b a u 3 7 3.5*3. Ausschluß b a k t e r i e l l e r B e t e i l i g u n g am E i n b a u 4 0 3.6. Q u a n t i t a t i v e B e t r a c h t u n g d e s E i n b a u s 44 3 . 7 . L o k a l i s i e r u n g d e s Einbauproduktes 45

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3 . 7 . 1 . F r a k t i o n i e r t e E x t r a k t i o n 45 3.7.2. Trennung d e r M i t o c h o n d r i e n i n

äußere und i n n e r e Membran 47 3.7.2.1. " S w e l l i n g - s h r i n k i n g " V e r f a h r e n 48

3.7.2.2. D i g i t o n i n Methode 56 3.7.2.3- P o l y a c r y l a m i d g e l e l e k t r o p h o r e s e von

i n n e r e r und äußerer Membran 57

3.7·3· I n c u b a t i o n d e r v e r s c h i e d e n e n F r a k t i o n e n d e s " S w e l l i n g - s h r i n k i n g " V e r f a h r e n s 6 0 4 . E x p e r i m e n t e l l e r T e i l 63 4 . 1 . I s o l i e r u n g von K i t o c h o n d r i e n und Mikrosomen 63 4 . 2 . F u n k t i o n s z i i s t a n d d e r M i t o c h o n d r i e n 64 4 . 3 . I n c u b a t i o n s - und Waschprozeduren 64 4 . 4 . I n v i v o M a r k i e r u n g von L o c u s t e n 7 0 4 . 5 . Fraktionierungsmethoden . , 7 0 4 . 6 . Bestimmungsmethoden 73 4 . 7 . Verwendete M a t e r i a l i e n und Apparate 76

5 . D i s k u s s i o n 7 S 6 . Zusammenfassung 87 7 . L i t e r a t u r v e r z e i c h n i s 89 8 . V e r z e i c h n i s d e r Abkürzungen 94

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1. E i n l e i t u n g

Das S t u d i u m d e r B i o g e n e s e von M i t o c h o n d r i e n - zellulärer U n t e r  e i n h e i t e n v o n f u n k t i o n e l l und m o r p h o l o g i s c h s p e z i f i s c h e r O r g a  n i s a t i o n - k a n n s i c h a n z w e i Gruppen von F r a g e s t e l l u n g e n o r i e n  t i e r e n :

1) Auf welchem Wege werden neue M i t o c h o n d r i e n i n den Z e l l e n ge b i l d e t und w a c h s e n h e r a n ?

2) Wie w i r d d i e s e r Prozeß g e s t e u e r t , d e r g e s t a l t , daß d e r A n t e i l d e s Chondrioms a n d e r zellulären S u b s t a n z e i n s p e z i f i s c h e r b i o l o g i s c h e r P a r a m e t e r i s t ?

Im H i n b l i c k a u f b e i d e g e n a n n t e n P r o b l e m k r e i s e i s t w a h r s c h e i n  l i c h , daß autonome Mechanismen d e r M i t o c h o n d r i e n m i t e x t r a  m i t o c h o n d r i a l e n S y s t e m e n d e r Z e l l e k o o p e r i e r e n .

B i s e t w a 1960 i n t e r e s s i e r t e n s i c h f a s t ausschließlich morpho l o g i s c h a u s g e r i c h t e t e B i o l o g e n für d i e s e F r a g e n . M i k r o s k o p i s c h e und e l e k t r o n e n m i k r o s k o p i s c h e Beobachtungen führten z u e i n e r V i e l z a h l v o n T h e o r i e n , so etwa e i n e r E n t s t e h u n g v o n M i t o c h o n  d r i e n d u r c h Umbildung d e r Kernmembran, d e s e n d o p l a s m a t i s c h e n R e t i k u l u m s , d e s G o l g i a p p a r a t e s oder d e r Plasmamembran

E r s t a l s a u s b i o c h e m i s c h e n U n t e r s u c h u n g e n k l a r wurde, daß äußere Membran, i n n e r e Membran und M a t r i x d e r M i t o c h o n d r i e n s p e z i f i s c h e S t r u k t u r und F u n k t i o n haben, wurde begonnen, m i t b i o c h e m i s c h e n Methoden d a s P r o b l e m d e r E n t s t e h u n g v o n M i t o  c h o n d r i e n z u v e r f o l g e n . I n d e r f o l g e n d e n A u f s t e l l u n g s i n d d i e w i c h t i g e n S c h r i t t e d e r s e i t d e m e i n s e t z e n d e n E n t w i c k l u n g a u f  gezählt: 1958 SIMPSON [2] b e r i c h t e t über e i n e n g e r i n g e n a b e r s i g n i f i k a n t e n E i n b a u r a d i o a k t i v e r Aminosäuren i n i s o l i e r t e L e b e r , H e r z und S k e l e t t m u s k e l m i t o c h o n d r i e n . D i e s e r Prozeß i s t im G e g e n s a t z zum m i c r o -s o m a l e n E i n b a u u n e m p f i n d l i c h gegen R i b o n u c l e a -s e . 1961 E s e r s c h e i n e n d i e e r s t e n d e t a i l l i e r t e n U n t e r  s u c h u n g e n über d i e Bedingungen d e s E i n b a u s r a d i o  a k t i v e r Aminosäuren i n d a s P r o t e i n v o n R a t t e n -l e b e r m i t o c h o n d r i e n (ROODYN [3D , TRUMAN [ 4 ] ) .

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D i e i n v i t r o S y n t h e s e r a t e i s t j e d o c h , v e r g l i c h e n m i t d e r i n v i v o z u b e o b a c h t e n d e n , m i n i m a l . ROODYN [53 w e i s t n a c h , daß s i c h i n d e r löslichen P r o t e i n f r a k t i o n n a c h i n v i t r o E i n b a u v o n m a r k i e r  t e n Aminosäuren n u r e i n e g e r i n g e s p e z i f i s c h e Radioaktivität f i n d e t . Cytochrom c , M a l a t d e h y d r o -g e n a s e und K a t a l a s e werden n i c h t im i n v i t r o S y s t e m s y n t h e t i s i e r t . E i n e b e s o n d e r s hohe s p e z i  f i s c h e Radioaktivität f i n d e t s i c h i n e i n e r m i t D e t e r g e n s präparierten L i p o p r o t e i n f r a k t i o n d e r m i t o c h o n d r i a l e n Membranen [ 6 ] .

1963 LUCK [ 7 ] beobachtet b e i d e r V e r f o l g u n g v o n Mito c h o n d r i e n i n e i n e r C h o l i n m a n g e l m u t a n t e v o n Neuro-s p o r a c r a Neuro-s Neuro-s a , d i e m i t r a d i o a k t i v e m C h o l i n m a r k i e r t wurde, über mehrere G e n e r a t i o n s z y k l e n , d a ß s i c h d i e Radioaktivität s t a t i s t i s c h über sämtliche M i t o c h o n d r i e n v e r t e i l t . E i n e Vermehrung d e r M i t o  c h o n d r i e n d u r c h T e i l u n g g e w i n n t d a d u r c h a n Wahr-s c h e i n l i c h k e i t . BROSEMER e t a l . [ 8 ] w e i s e n Wachstum v o n M i t o c h o n  d r i e n n a c h . B e i d e r E n t w i c k l u n g d e s F l u g m u s k e l s d e r W a n d e r h e u s c h r e c k e b e o b a c h t e n s i e K o n s t a n z d e s M u s t e r s m i t o c h o n d r i a l e r Enzyme t r o t z großer q u a n t i t a t i v e r U n t e r s c h i e d e i n d e r m o r p h o l o g i s c h e n E r s c h e i n u n g s f o r m d e r M i t o c h o n d r i e n . NASS e t a l . [ 9 ] f i n d e n m i t H i l f e h i s t o c h e m i s c h e r Methoden DNA-Fasern i n M i t o c h o n d r i e n . 1964 E i n e R e i h e d e t a i l l i e r t e r U n t e r s u c h u n g e n über d e n E i n b a u v o n Aminosäuren i n i s o l i e r t e M i t o c h o n d r i e n w e i s e n a u f A n a l o g i e n im Mechanismus v o n m i t o c h o n  d r i a l e r und m i k r o s o m a l e r P r o t e i n s y n t h e s e h i n KROON [ 1 0 ] . LUCK e t a l . [ 1 1 ] f i n d e n RNA-Synthese i n i s o l i e r  t e n N e u r o s p o r a M i t o c h o n d r i e n .

1965 Das Vorkommen e i n e r RNA-Polymerase i n M i t o c h o n  d r i e n w i r d d u r c h WINTERSBERGER [ 1 2 ] und NEUBERT [133 bestätigt. Das Vorkommen von t r a n s ferRNA und A m i n o a c y l R N A S y n t h e t a s e n i n H e f e

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3 -m i t o c h o n d r i e n e r s c h e i n t w a h r s c h e i n l i c h [ 1 4 ] . M i t o c h o n d r i a l e DNA m i t v o n d e r Kern-DNA u n t e r  s c h i e d l i c h e m S e d i m e n t a t i o n s v e r h a l t e n w i r d i s o  l i e r t (LUCK e t a l . [ 1 1 ] , BORST e t a l . [ 1 6 ] ) . 1966 D i e E x i s t e n z e i n e r m i t o c h o n d r i a l e n DNA-Poly-m e r a s e w i r d n a c h g e w i e s e n (WINTERSBERGER [ 1 7 ] , SIMPSON e t a l . [ 1 8 ] ) . D i e m i t o c h o n d r i a l e DNA w i r d c h a r a k t e r i s i e r t : S i e b e s i t z t i n sämtlichen u n t e r s u c h t e n O r g a n i s m e n e i n M o l e k u l a r g e w i c h t v o n c a . 10·10 , i s t d o p p e l

-strängig ringförmig und h a t e i n e Länge v o n 5·4μ (KROON e t a l . [19],NASS [ 2 0 ] ) .

LUCK w i e d e r h o l t den k l a s s i s c h e n MESELSON-STAHL-V e r s u c h für m i t o c h o n d r i a l e DNA und f i n d e t g r u n d  sätzlich ähnliches V e r h a l t e n w i e für Kern-DNA, e i n H i n w e i s a u f d i e mögliche Fähigkeit m i t o c h o n  d r i a l e r DNA z u r Übertragung g e n e t i s c h e r I n f o r  m a t i o n [ 1 5 ] · D e r E i n b a u v o n r a d i o a k t i v e n Aminosäuren i n i s o  l i e r t e M i t o c h o n d r i e n e r f o l g t i n v i e r "bis fünf Banden d e r e l e k t r o p h o r e t i s c h a u f g e t r e n n t e n u n  löslichen Membranproteine (HALDAR e t a l . [ 2 1 ] , SEBALD [ 2 2 ] ) . E x p e r i m e n t e m i t H e L a - Z e l l e n s p r e c h e n dafür, daß C y t o c h r o m c an den c y t o p l a s m a t i s c h e n Ribosomen s y n t h e t i s i e r t w i r d [ 2 1 ] . 1967 M u t i e r t e m i t o c h o n d r i a l e DNA w i r d i n den c y t o  p l a s m a t i s c h e n " p e t i t e c o l o n i e s " M u t a n t e n v o n S a c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e g e f u n d e n (SLONIMSKI e t a l . [ 2 3 ] ) . Unabhängigkeit im z e i t l i c h e n R e p l i k a -t i o n s v e r h a l -t e n v o n m i -t o c h o n d r i a l e r und Kern-DNA w i r d n a c h g e w i e s e n (NEUBERT [ 2 4 ] ) . SWIFT [ 2 5 ] i d e n t i f i z i e r t i n M i t o c h o n d r i e n r i b o -s o m e n a r t i g e P a r t i k e l m i t einem D u r c h m e -s -s e r v o n 1 2 0 - 150 £. M i t o c h o n d r i a l e Ribosomen d i e s e r

Größe m i t einem v o n den c y t o p l a s m a t i s c h e n B i b o -somen abweichendem S e d i m e n t a t i o n s v e r h a l t e n ( 5 5 S )

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w e r d e n a u s L e b e r m i t o c h o n d r i e n i s o l i e r t ( O ' B R I E N e t a l . [ 2 6 , 2 7 3 ) . E s f o l g t d i e Gewinnung m i t o c h o n  d r i a l e r Ribosomen a u s N e u r o s p o r a c r a s s a [ 2 8 , 2 9 ] , RNA vom b a k t e r i e l l - r i b o s o m a l e n Typ ( 1 6 S und 2 3 S ) w i r d a u s L e b e r m i t o c h o n d r i e n d a r g e s t e l l t (KROON [ 3 0 ] } H y b r i d i s i e r u n g s v e r s u c h e s p r e c h e n dafür, daß w e n i g s t e n s e i n T e i l d e r m i t o c h o n d r i a l e n RNA d u r c h T r a n s s c r i p t i o n m i t o c h o n d r i a l e r DNA e n t s t e h t (FUKUHARA [ 3 1 , 3 2 ] ) . I n N e u r o s p o r a c r a s s a und i n R a t t e n l e b e r w i r d d i e E x i s t e n z m i t o c h o n d r i a l e r t r a n s f e r - R N A s n a c h g e w i e s e n (BARNETT e t a l . [ 3 3 ] , SIMPSON e t a l [ 3 4 ] ) , w e i t e r h i n d a s Vorkommen s p e z i  f i s c h e r m i t o c h o n d r i a l e r A m i n o a c y l - R N A - S y n t h e t a s e n [ 3 5 ] . D e r B e g i n n d i e s e r A r b e i t fällt i n d i e j e n i g e P h a s e d e r b e s c h r i e  b e n e n E n t w i c k l u n g , i n d e r s i c h d i e b i o l o g i s c h e S i g n i f i k a n z d e r i n v i t r o S y n t h e s e m i t o c h o n d r i a l e r P r o t e i n e a b z e i c h n e t e .

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2. P l a n

vVie e i n g a n g s g e s a g t , k o o p e r i e r e n autonome Mechanismen d e r M i t o c h o n d r i e n m i t e x t r a m i t o c h o n d r i a l e n S y s t e m e n . D a h e r d a r f

s i c h d a s Studium d e r B i o g e n e s e von M i t o c h o n d r i e n n i c h t n u r a u f d i e Abläufe i n d e r i n t a k t e n Z e l l e e r s t r e c k e n , s o n d e r n e s muß a u c h d e r V e r s u c h unternommen werden, den b i o g e n e t i s c h e n Prozeß a n i s o l i e r t e n M i t o c h o n d r i e n i n v i t r o z u u n t e r s u c h e n . I n d i e s e m S i n n e wurde i n d e r v o r l i e g e n d e n A r b e i t d e r E i n b a u r a d i o a k t i v m a r k i e r t e r Aminosäuren i n m i t o c h o n d r i a l e P r o t e i n e v e r f o l g t . Zunächst wurde u n t e r s u c h t , d u r c h w e l c h e B e d i n g u n g e n d e s I n c u -b a t i o n s m e d i u m s s i c h d a s zelluläre M i l i e u s u -b s t i t u i e r e n läßt. Das I n h a l t s v e r z e i c h n i s g i b t A u s k u n f t über d i e v e r s c h i e d e n  a r t i g e n P a r a m e t e r . Neben den K o n z e n t r a t i o n e n d e r I o n e n und M e t a b o l i t e wurde d e r B e d a r f a n Aminosäuren und d e r e n g e g e n  s e i t i g e B e e i n f l u s s u n g e i n e r e i n g e h e n d e r e n B e t r a c h t u n g u n t e r  zogen. An Hand e i n e r o p t i m a l e n oder z u m i n d e s t s t a n d a r d i s i e r  t e n V e r s u c h s a n o r d n u n g wurde d a r a u f h i n d e r Einfluß v o n Hemm s u b s t a n z e n und d i e Abhängigkeit d e s E i n b a u s von d e r s t r u k  t u r e l l e n I n t a k t h e i t d e r M i t o c h o n d r i e n u n t e r s u c h t , und d e r Ausschluß v o n w e s e n t l i c h e n F e h l e r q u e l l e n durchgeführt. D i e Klärung d e s S y s t e m s im d e r z e i t i g e n S t a n d d e r E r f o r s c h u n g w i r d d u r c h E x p e r i m e n t e z u r R e g u l a t i o n d e s E i n b a u s und z u r q u a n t i  t a t i v e n B e t r a c h t u n g d e r ^ i n b a u r a t e a b g e s c h l o s s e n . D i e s e U n t e r s u c h u n g e n wurden a n z w e i v e r s c h i e d e n e n T y p e n v o n M i t o c h o n d r i e n durchgeführt, w e l c h e E x t r e m e m i t o c h o n d r i a l e r O r g a n i s a t i o n repräsentieren, u i e b e t r a c h t e n d a s J i i i t o c h o n d r i u m a l s e i n e E i n h e i t . I n einem z w e i t e n T e i l w i r d n a c h d e r B i o g e n e s e e i n z e l n e r E l e  mente d e s M i t o c h o n d r i u m s g e f r a g t . Wir bestätigten, daß im i n v i t r o S y s t e m r a d i o a k t i v e Aminosäuren n u r i n d i e F r a k t i o n d e r unlöslichen Membranproteine e i n g e b a u t werden. D i e s e F r a k  t i o n b e i n h a l t e t j e d o c h d i e s t r u k t u r g e b u n d e n e n P r o t e i n e s o w o h l d e r I n n e n - a l s a u c h d e r Außenmembran. D e s h a l b wurde i n d e n d a r a u f f o l g e n d e n E x p e r i m e n t e n d a s V e r h a l t e n d e r b e i d e n Membranen g e t r e n n t u n t e r s u c h t , m i t dem E r g e b n i s , daß i n v i t r o Aminosäuren

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n u r i n e i n z e l n e F r a k t i o n e n d e r i n n e r e n Membran i n k o r p o r i e r t w e r d e n . E s i s t k l a r , daß d a s i n v i t r o S y s t e m n u r e i n e n s e h r eingeschränkten T e i l d e r B i o g e n e s e von M i t o c h o n d r i e n erfaßt

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-7-3. E r g e b n i s s e D i e i n d i e s e r A r b e i t v e r w e n d e t e n A r t e n v o n M i t o c h o n d r i e n v o n e x t r e m v e r s c h i e d e n e m Typ s i n d : d i e M i t o c h o n d r i e n d e s F l u g  m u s k e l s d e r W a n d e r h e u s c h r e c k e ( L o c u s t a m i g r a t o r i a ) und d e r R a t t e n l e b e r . S i e u n t e r s c h e i d e n s i c h i n z w e i e r l e i H i n s i c h t :

1 ) Wie b e r e i t s erwähnt, repräsentieren d i e F l u g m u s k e l m i t o c h o n -d r i e n ( S a r k o s o m e n ) -den " C r i s t a - T y p " , -d i e L e b e r m i t o c h o n -d r i e n den " M a t r i x - T y p " . 2 ) Das M i t o c h o n d r i u m d e s F l u g m u s k e l s w i r d im V e r l a u f d e s L e b e n s d e s I n s e k t e s e i n m a l g e b i l d e t . D i e s e E n t w i c k l u n g e r  f o l g t i n z e i t l i c h e r K o o r d i n a t i o n m i t d e r E n t w i c k l u n g d e s F l u g m u s k e l s . Sämtliche M i t o c h o n d r i e n d e s Organs b e f i n d e n s i c h j e w e i l s im g l e i c h e n E n t w i c k l u n g ε z u s t and. D i e M i t o  c h o n d r i e n d e r R a t t e n l e b e r h i n g e g e n h a b e n e i n e n T u r n o v e r ( c a . 10 Tage H a l b l e b e n s z e i t [ 3 6 ] ) . Im Organ gehen l a u f e n d M i t o c h o n d r i e n z u Grunde und werden d u r c h neue e r s e t z t . E i n w e i t e r e r V o r t e i l i n d e r g l e i c h z e i t i g e n B e n u t z u n g d i e s e r v e r s c h i e d e n e n O b j e k t e l i e g t d a r i n , daß s i c h d a s L o c u s t e n -s y -s t e m b e -s o n d e r -s für v e r g l e i c h e n d e i n v i v o - i n v i t r o U n t e r  suchungen e i g n e t , d a s R a t t e n l e b e r s y s t e m h i n g e g e n wegen d e r l e i c h t e n Verfügbarkeit großer Mengen v o n M i t o c h o n d r i e n z.B. V o r t e i l e b e i d e r V e r f o l g u n g d e s E i n b a u p r o d u k t e s b i e t e t . 3.1« V e r s u c h e z u r C h a r a k t e r i s i e r u n g d e r E i n b a u s y s t e m e 3.1.1. Osmolarität d e s I n c u b a t i o n s m e d i u m s

Das M i t o c h o n d r i u m s t e l l t e i n o s m o t i s c h e s S y s t e m d a r . Nach den gegenwärtigen K e n n t n i s s e n s t e h t d i e i n n e r e Membran im V o r d e r g r u n d , d i e den " M a t r i x r a u m " umschließt. I n t a k t h e i t v o n M i t o c h o n d r i e n i s t n u r gewährleistet, wenn s i e s i c h i n einem - z u m i n d e s t annähernd - i s o s m o t i s c h e n Medium b e f i n d e n . Z u r E r z e u g u n g v o n Osmolarität wurde entweder KCL o d e r

S u c r o s e v e r w e n d e t . K C l e r s c h e i n t d e s h a l b günstig, d a d a s d i e M i t o c h o n d r i e n umgebende I o n e n m i l i e u d e r Z e l l e v o r a l l e m d u r c h hohe K+ K o n z e n t r a t i o n g e k e n n z e i c h n e t i s t ( c a . 100 mM), und w e i t e r h i n f r i s c h i s o l i e r t e M i t o c h o n d r i e n a n M e t a l l i o n e n

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t e i n e n t h a l t e n [371 . Abb. 1 und Abb. 2 z e i g e n d i e Abhängig k e i t d e s E i n b a u s v o n r a d i o a k t i v e m L e u c i n bzw. I s o l e u c i n von d e r K a l i u m c h l o r i d k o n z e n t r a t i o n im I n c u b a t i o n s m e d i u m . 500. Ipm / m g Protein 0,03 0,06 0,09 0,12 0,15 [M] 0,18 KCl Ipm /mg Protein — I — 40 160 mM KCl Abb. 1. Abhängigkeit d e s E i n b a u s von 1 4 - C - I s o l e u c i n i n i s o l i e r t e L o c u s t e n m i t o -c h o n d r i e n von d e r K C l Kon z e n t r a t i o n . ( V e r s u c h s b e  d i n g u n g e n s i e h e 4 .3 . 1 . ) Abb.2. Abhängigkeit d e s E i n b a u s von 1 4 - C - L e u c i n i n i s o l i e r t e R a t t e n l e b e r n i t o -c h o n d r i e n v o n d e r K C l Kon z e n t r a t i o n . ( V e r s u c h s b e  d i n g u n g e n s i e h e 4 .3 . 1 . )

Für b e i d e Typen f i n d e t s i c h e i n ausgeprägtes Optimum. ".Venn man z u d i e s e n I o n e n d i e im I n c u b a t i o n s m e d i u m w e i t e r v o r h a n  d e n e n I o n e n d a z u r e c h n e t , erhält man im F a l l e d e r L o c u s t e n -m i t o c h o n d r i e n e i n e Os-molarität von 277 -mos-molar, i-m F a l l e d e r H a t t e n l e b e r m i t o c h o n d r i e n e i n e s o l c h e v o n 235 mosmolar. Abb. 3 z e i g t d a s V e r h a l t e n , wenn wie h i e r b e i L o c u s t e n -m i t o c h o n d r i e n - S u c r o s e z u r E r z e u g u n g von I s o t o n i e v e r w e n d e t wurde.

I n b e i d e n Fällen e r w e i s t s i c h , daß e h e r e i n h y p o t o n e s Medium für d e n E i n b a u günstig i s t . Dafür s c h e i n t d i e m i t l e i c h t e r S c h w e l l u n g v e r b u n d e n e höhere Permeabilität d e r Membranen v e r  a n t w o r t l i c h z u s e i n . W e s e n t l i c h e r Grund für den s t a r k e n

(12)

9

-Ipm/mg Protein

0.30 0.40 Μ Sucrose

Abb. 3. Abhängigkeit d e r E i n b a u r a t e von 1 4 - C - I s o l e u c i n i n i s o l i e r t e L o c u s t e n m i t o c h o n d r i e n von d e r üucrose-k o n z e n t r a t i o n . ( V e r s u c h s b e d i n g u n g e r l s i e h e 4 .3 . 1 . )

A b f a l l d e r Einbauaktivität n a c h höheren K o n z e n t r a t i o n e n im F a l l e d e s K a l i u m c h l o r i d s , d e r b e i Verwendung von o u c r o s e n i c h t z u b e o b a c h t e n i s t , dürfte s e i n , daß d u r c h d i e erhöhte I o n e n  stärke des Lediums e i n e Zerstörung d e r S t r u k t u r d e r m i t o c h o n  d r i a l e n Membranen s t a t t f i n d e t , d i e e i n e Eröffnung d e s M a t r i x -raums z u r F o l g e h a t . E i n V e r g l e i c h d e r E i n b a u r a u e n b e i j e  w e i l s o p t i m a l e r K C l - bzw. B u c r o s e k o n z e n t r a t i o n und g l e i c h e n E i n b a u b e d i n g u n g e n z e i g t n u r g e r i n g e U n t e r s c h i e d e . 3.1.2. pH-Abhängigkeit de s E i n b a u s A l s w e s e n t l i c h für d i e E r z i e l u n g o p t i m a l e n E i n b a u s e r w i e s s i c h d a s pH d e s I n c u b a t i o n s m e d i u m s (Abb. 4 und Abb. 5 ) . S o  wohl b e i L o c u s t e n - a l s a u c h b e i R a t t e n l e b e r m i t o c h o n d r i e n f a n d s i c h e i n e ausgeprägte pH-Abhängigkeit. D i e L a g e d e r

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Abb. 5 · Abhängigkeit d e s E i n b a u s von 1 4 — C - L e u c i n i n R a t t e n l e b e r m i t o c h o n d r i e n vom pH d e s I n c u b a t i o n s -mediums. ( V e r s u c h s b e d i n g u n g e n s i e h e 4. 3 . 1 . )

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1 1

-Optima i s t j e d o c h i n den b e i d e n Fällen um e i n e p H - E i n h e i t v e r s c h i e d e n .

3.1*3» B e d a r f a n Aminosäuren

Wenn d e r gemessene E i n b a u e i n e r e i n z i g e n Aminosäure tatsäch l i c h d i e N e u s y n t h e s e von P e p t i d k e t t e n repräsentiert, s o l l t e d i e s e r E i n b a u v o n d e r A n w e s e n h e i t d e r a n d e r e n benötigten Aminosäuren abhängig s e i n . F r i s c h i s o l i e r t e R a t t e n l e b e r m i t o -c h o n d r i e n e n t h a l t e n f r e i e Aminosäuren. D i e K o n z e n t r a t i o n e n d e r e i n z e l n e n Aminosäuren s i n d i n Tab. 1 a u f g e z e i c h n e t ( s i e h e a u c h [ 3 8 ] ) . Werden d i e s e M i t o c h o n d r i e n b e i 32°C i n c u b i e r t , so e r f o l g t e i n e F r e i s e t z u n g v o n Aminosäuren ( T a b . 1 ) , d i e i n i h r e m Ausmaß v o n e i n e r Aminosäure z u r a n d e r e n v a r i i e r t . I n c u b . Z e i t 0 30 6 0 [ m i n ] a l a 0.44 0.38 0 . 5 2 a r g 0 . 0 0. 0 0.0 a s p 0.43 0.93 1.63 c y s - S H 0.0 0.0 0.0 g l u 0. 7 2 2.04 1.48 g i y 0.79 2.24 3.06 h i s 0.69 0.41 1.06 i l e u 0.0 0. 7 1 0.78 l e u 0.49 ₁_{. 1 7} 1.41 l y s 0.44 0.95 1.49 met 0.0 0.0 0.0 p r o 0.0 0.0 0.0 s e r 0.45 0 . 5 1 0.40 t h r e o 0.24 0. 7 1 0.84 t r y 0.0 0 . 0 5 0.12 v a l 0.44 0.94 1.24 Tab. 1. G e h a l t a n f r e i e n Aminosäuren v o n f r i s c h i s o l i e r t e n R a t t e n l e b e r m i t o c h o n d r i e n und n a c h I n c u b a t i o n s z e i t e n v o n

30 und 60 min. b e i 32°C. (πιμΜοΙ Aminosäure/mg P r o t e i n ) ( V e r s u c h s b e d i n g u n g e n s i e h e 4.6.4.)

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V</ie j e d o c h Abb. 6 und Abb. 7 v e r a n s c h a u l i c h e n , r e i c h e n d i e s e Mengen b e i w e i t e m n i c h t a u s , um den E i n b a u d e r z u g e s e t z t e n r a d i o a k t i v e n Aminosäure m i t o p t i m a l e r G e s c h w i n d i g k e i t z u e r  l a u b e n .

Ipm /mg Prettin Ipm/mg Protein

2.0 3.0 Aminosäurengemisch (mg /ml] 100 200 300 u g / m l Aminosäurengemisch Abb. 6. Abhängigkeit d e s E i n b a u s v o n 1 4 - C - I s o l e u c i n i n L o c u s t e n m i t o c h o n d r i e n v o n d e r Aminosäurenkonzen t r a t i o n . ( V e r s u c h s b e d i n g u n g e n s i e h e 4 . 3 . 1 . ) Abb. 7· Abhängigkeit d e s E i n b a u s v o n 1 4 - C - L e u c i n i n R a t t e n l e b e r m i t o c h o n d r i e n von d e r Aminosäurenkonzen t r a t i o n . ( V e r s u c h s b e d i n g u n g e . s i e h e 4 .3 . 1 . )

D u r c h Zugabe v o n Aminosäurengemischen, d e r e n Zusammensetzung i n T a b . 2 w i e d e r g e g e b e n i s t , k o n n t e s o w o h l für L o c u s t e n -a l s -a u c h für R -a t t e n l e b e r m i t o c h o n d r i e n e i n e beträchtliche S t e i g e r u n g d e s E i n b a u s e r z i e l t werden. B e i e i n e r r e l a t i v h o h e n K o n z e n t r a t i o n l i e g t d a b e i d a s Optimum für L o c u s t e n m i t o  c h o n d r i e n . D i e s mag e i n e n p h y s i o l o g i s c h e n S a c h v e r h a l t w i e d e r  s p i e g e l n , d a s i c h im F l u g m u s k e l v o n L o c u s t a e i n e ungewöhnlich h o h e K o n z e n t r a t i o n v o n f r e i e n Aminosäuren f i n d e t [ 3 9 ] , d i e n a h e b e i d e r O p t i m a l k o n z e n t r a t i o n d e s i n v i t r o E i n b a u s l i e g t ( 1 . 6 mg/ml). D i e K o n z e n t r a t i o n e n d e r f r e i e n Aminosäuren i n d e r R a t t e n l e b e r l i e g e n ähnlich w i e i n dem g e z e i g t e n i n v i t r o V e r s u c h w e s e n t l i c h n i e d r i g e r [ 4 0 ] .

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1 3

-ASG, AüG„ A ü GT ASG,

a l a 1, ,0 1. 0 l y s _{0. .5} _{0 . 7 5} a r g 0 . . 1 2 5 0 . 5 met _{0, .5} _{0 . 25} a s p υ. _{• 5} _{0 . 7 5} phe 0, . 1 2 5 0 . 5 a s p NR2 0, .25 0 . 35 pro 0. .25 0 . 25 c y s _{0. .25} _{0 . 25} opro 0 . .0 0 . 05 g l u 1, ,0 0 . 7 5 s e r 0 . . 7 5 0 . 5 g l u NH2 0. . 7 5 0 . 35 t h r e o ü. .5 0 . 5 g i y 1. .0 0 . 7 5 t r y Ü. _{. 1 2 5} _{0 . 25} h i s _{0. • 2 5} c . 25 t y r 0 . .25 ü. _{2 5} l e u 0. .375 _{0 . 5} v a l 0 . .5 0 . 5 i l e u _{0, .375} _{0 . 5}

Tab. 2 . Zusammensetzung d e r Aminosäurengemische z u r I n c u b a  t i o n von L o c u s t e n m i t o c h o n d r i e n (ASGj,) und R a t t e n l e b e r m i t o  c h o n d r i e n ( A S G R ) . D i e Z a h l e n geben d i e m o l a r e n Verhältnisse an. D i e Z u s a m m e n s t e l l u n g d e r Gemische e r f o l g t e i n A n l e h n u n g an [ 4 1 ] .

G e n a u e r e n E i n b l i c k i n d i e Bedürfnisse d e s S y s t e m s s o l l t e e i n e U n t e r s u c h u n g d e r Wirkungen d e r e i n z e l n e n Aminosäuren a u f den E i n b a u r a d i o a k t i v e r Aminosäuren i n i s o l i e r t e R a t t e n l e b e r m i t o  c h o n d r i e n gewähren. D i e s e V e r s u c h e wurden j e w e i l s für z w e i v e r  s c h i e d e n e r a d i o a k t i v e Aminosäuren 1 4 C L e u c i n und P r o l i n -durchgeführt ( T a b . 3 und Tab. 4 ) . Dabei wurde d i e j e n i g e E i n  b a u r a t e , d i e e r z i e l t wurde, wenn j e w e i l s d i e a n g e z e i g t e Amino säure a u s dem G e m i s c h w e g g e l a s s e n wurde, i n }o d e r j e n i g e n a u s  gedrückt, d i e b e i A n w e s e n h e i t d e s vollständigen Aminosäuren g e m i s c h e s e r h a l t e n wurde. D i e r a d i o a k t i v e Aminosäure, d e r e n E i n b a u gemessen wurde, war n i c h t im Aminosäurengemisch v e r t r e t e n E s s t e l l t e s i c h h e r a u s , daß n u r b e i W e g l a s s e n e i n i g e r Amino säuren ( A l a n i n , P r o l i n bzw. L e u c i n , M e t h i o n i n , S e r i n V a l i n ) e i n beträchtliches A b s i n k e n d e r E i n b a u r a t e z u b e o b a c h t e n i s t , während d a s W e g l a s s e n d e r M e h r z a h l d e r Aminosäuren k e i n e Wirkung v e r u r s a c h t e , und zwar sowohl wenn d e r E i n b a u v o n mar k i e r t e m L e u c i n a l s a u c h von m a r k i e r t e m P r o l i n v e r f o l g t wurde. Die E f f e k t e w a r e n größer, wenn L e u c i n r a d i o a k t i v e i n g e s e t z t wurde.

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30 min 60 min 30 min 6 0 m: a l a 24.2 _{2 7 . 3} l y s 1 2 5 . 8 9 1. 6 a r g 9 0. 9 8 7 . 8 met 4 7 . 6 2 8. 6 a s p 1 0 3 . 6 9 7 . 3 phe _{1 1 1 . 3} 1 0 0 . 1 a s p NH2 9 1. 8 93.2 p r o 1 3 . 9 17.4 c y s 97.2 96.4 opro 1 1 0 . 9 86.4 g l u 1 1 1 . 8 1 2 2. 8 s e r 36.3 1 9. 7 g l u NH2 1 0 7 . 4 1 0 0 . 0 t h r e o 1 1 1 . 7 9 5. 7 g i y 1 1 3 . 9 92.2 t r y 9 0. 0 95.4 h i s 1 0 4. 3 1 0 0 . 1 t y r 1 3 0 . 4 1 0 0 . 6 l e u v a l _{5 1 . 5} 6 4 . 4 i l e u 8 3 . 7 8 1. 7

Tab. 3 . Abhängigkeit des E i n b a u s von 1 4 - C - L e u c i n i n i s o l i e r t e R a t t e n l e b e r m i t o c h o n d r i e n . v o n d e r A n w e s e n h e i t d e r e i n z e l n e n Aminosäuren im I n c u b a t i o n s m e d i u m . D i e j e n i g e E i n b a u r a t e , d i e n a c h 3 0 bzw. 60 min m i t dem vollständigen Aminosäurengemisch e r z i e l t wurde, wurde z u 100/o g e s e t z t . Die Z a h l e n i n d e r T a b e l l e geben i n % d i e j e n i g e E i h h i u r a t e an, d i e s i c h b e i W e g l a s s e n d e r j e w e i l i g e n a n g e z e i g t e n Aminosäure e r g a b . . V e r s u c h s b e d i n g u n g e n s i e h e 4. 3 . 1 .

30 min 60 min 30 min 60

a l a 56 52 l y s 110 _{1 1 7} a r g 110 113 met 7 3 85 a s p 106 120 phe 102 120 a s p Μ ί2 81 101 p r o c y s 110 99 opro 1 0 5 104 g l u 104 _{1 1 7} s e r 56 46 g i u m2 108 129 t h r e o 119 96 g i y 102 111 t r y 102 110 h i s 107 101 t y r 1 0 5 1 0 3 l e u 57 66 v a l _5§ 64 i l e u 102 112

Tab.4. Abhängigkeit d e s E i n b a u s von 1 4 - C - P r o l i n i n i s o l i e r t e R a t t e n l e b e r m i t o c h o n d r i e n v o n d e r A n w e s e n h e i t d e r e i n z e l n e n Aminosäuren im I n c u b a t i o n s m e d i u m . D a r s t e l l u n g d e r Werte wie i n Tab. 3 · (Versuchsbedingungen s i e h e 4 . 3 . 1 . J

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-15-Wie Abb. 8 und Abb. 9 z e i g e n , b e o b a c h t e t man Sättigungskurven, wenn man d i e für d e n E i n b a u v o n 1 4 - C - L e u c i n " e s s e n t i e l l e n " Aminosäuren i n s t e i g e n d e n K o n z e n t r a t i o n e n s u b s t i t u i e r t . Abb. 8 s t e l l t d i e Abhängigkeit d e r E i n b a u r a t e d e s L e u c i n s von d e r A l a n i n k o n z e n t r a t i o n d a r . E i n a n a l o g e s E x p e r i m e n t , b e i dem P r o l i n a u s dem Amino säure g e m i s c h f o r t g e l a s s e n bzw. i n s t e i g e n d e n K o n z e n t r a t i o n e n z u g e s e t z t wurde, z e i g t K u r v e 1 i n Abb. 9. A u f d i e s e r G r u n d l a g e v e r m i t t e l t K u r v e 2 i n Abb. 9 e i n e r e c h t i n t e r e s s a n t e I n f o r m a t i o n . H i e r i s t nämlich d e r E i n b a u von P r o l i n i n G e g e n w a r t v o n L e u c i n i n s e i n e r Abhängigkeit von d e r K o n z e n t r a t i o n d e s P r o l i n s d a r g e s t e l l t worden. Abb. 8. Abhängigkeit d e r E i n b a u r a t e v o n 1 4 - C - L e u c i n von d e r A l a n i n k o n z e n t r a t i o n . ( V e r s u c h s b e d i n g u n g e n s i e h e 4.5.1.) Abb. 9. K u r v e 1: Abhängigkeit d e r E i n  b a u r a t e v o n 1 4 - C - L e u c i n v o n d e r P r o l i n k o n z e n t r a t i o n . . K u r v e 2: Abhängigkeit d e r Menge d e s e i n g e b a u t e n P r o l i n s von d e r P r o l i n k o n z e n t r a t i o n . ( V e r s u c h s b e d i n g u n g e n s i e h e 4.5.1.) Abb. 10 erläutert d a s V e r f a h r e n : B e i g l e i c h b l e i b e n d e r D o s i s v o n 1 4 - C - P r o l i n wurde s t e i g e n d i n a k t i v e s P r o l i n z u g e s e t z t , so daß d i e G e s a m t k o n z e n t r a t i o n a n P r o l i n v a r i i e r t e . Aus d e n i n Abb. 10 d a r g e s t e l l t e n Meßwerten und d e r j e w e i l i g e n s p e z i f i s c h e n

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Aktivität d e r Aminosäure im I n c u b a t i o n s m e d i u m e r r e c h n e n s i c h d i e i n K u r v e 2 Abb. 9 d a r g e s t e l l t e n Werte.

Man e r k e n n t , daß d i e Abhängigkeit d e s L e u c i n e i n b a u s ( K u r v e 1 ) und d i e Abhängigkeit d e s P r o l i n e i n b a u s ( K u r v e 2 ) v o n d e r K o n z e n t r a t i o n d e s P r o l i n s d u r c h K u r v e n ähnlicher G e s t a l t d a r 

g e s t e l l t werden. Man k a n n d a r a u s schließen, daß L e u c i n und P r o l i n i n einem b e s t i m m t e n Verhältnis z u e i n a n d e r e i n g e b a u t w e r d e n , d a s b e i v e r s c h i e d e n e n P r o l i n k o n z e n t r a t i o n e n im Medium k o n s t a n t i s t . , 1 0.1 0.2 yMol/m' Prolin

Abb. 10 Abhängigkeit d e r s p e z i f i s c h e n Aktivität von R a t t e n l e b e r m i t o c h o n d r i e n von d e r s p e z i f i s c h e n A k t i  vität d e s z u g e s e t z t e n P r o l i n s . ( V e r s u c h s b e d i n g u n g e n s i e h e 4. 3 . 1 . ; E i n e q u a n t i t a t i v e Angabe h i n s i c h t l i c h d i e s e s Verhältnisses k a n n a l l e r d i n g s a u f Grund d i e s e r E x p e r i m e n t e n i c h t gemacht w e r d e n . E r s t e n s l i e g t im E x p e r i m e n t z u r K u r v e 1 Abb. 9 d i e L e u c i n k o n z e n t r a t i o n n i c h t im Sättigungsbereich ( 1 . 3 μΜ zuge g e b e n e s L e u c i n ) im G e g e n s a t z z u r K u r v e 2 Abb. 9 ( 7 0 μΜ zuge g e b e n e s L e u c i n ) . Z w e i t e n s muß angenommen werden, daß d i e z u  g e g e b e n e n P r o l i n k o n z e n t r a t i o n e n i n Abb. 1 0 bzw. Abb. 9 Kurve n i c h t d i e a k t u e l l e n P r o l i n k o n z e n t r a t i o n e n im Medium im V e r  l a u f d e r I n c u b a t i o n repräsentieren. R a t t e n l e b e r m i t o c h o n d r i e n

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1 7

-e n t h a l t -e n -e i n -e g-enüg-end hoh-e Aktivität an P r o l i n o x i d a s -e um K o n z e n t r a t i o n e n von P r o l i n im Sättigungsbereich d e r K u r v e n i n Abb. 9 im V e r l a u f d e r I n c u b a t i o n e r n i e d r i g e n z u können [ 4 2 j .

Q u a n t i t a t i v e Angaben über den E i n b a u e i n i g e r w e i t e r e r v e r  s c h i e d e n e r Aminosäuren enthält Tab. 5i und zwar s o w o h l für R a t t e n l e b e r - a l s a u c h für L o c u s t e n m i t o c h o n d r i e n . E s fällt a u f , daß b e s o n d e r s d i e I n c u b a t i o n m i t den Aminosäuren G l u t a  minsäure und Asparaginsäure v e r g l i c h e n m i t L e u c i n und I s o l e u c i n e i n e s e h r n i e d r i g e s p e z i f i s c h e Radioaktivität d e s M i t o -c h o n d r i e n p r o t e i n s z u r F o l g e h a t . Mögli-cherweise w e r d e n d i e s e Aminosäuren v i e l s c h n e l l e r m e t a b o l i s i e r t a l s i n P r o t e i n e i n  g e b a u t . Z u r B e r e c h n u n g d e r Mengen d e r e i n g e b a u t e n Aminosäuren wurden d e s h a l b n u r d i e Aminosäuren L e u c i n und I s o l e u c i n h e r a n  gezogen, d i e d i e s e r s t a r k e n M e t a b o l i s i e r u n g n i c h t u n t e r l i e g e n . πιμο e i n g e b a u t e R a d i o  aktivität/mg P r o t e i n / h b e i 1μο/πι1 I n c u b . Med. μμΜοΙ e i n g e b a u t e Amino säure/mg P r o t e i n / h im bättigungsbereich d e r b e  t r e f f e n d e n Aminosäure. R a t t e n l e b e r L o c u s t e n R a t t e n l e b e r L o c u s t e n -m i t o c h o n - -m i t o c h o n d r i e n -m i t o c h o n - -m i t o c h o n  d r i e n d r i e n d r i e n l e u 9. 7 3 . 1 29, .1 i l e u 8.2 8.9 _31..8 phe 9. 3 p r o 2. 3 0.2 s e r 2.2 a r g 1.4 a s p 0.2 _{0 . 3} g l u 0.08

Tab. 5· E i n b a u v o n v e r s c h i e d e n e n 14—G-Amino säuren i n i s o  l i e r t e R a t t e n l e b e r - und L o c u s t e n m i t o c h o n d r i e n . D i e a n g e g e  b e n e n Z a h l e n s t e l l e n M i t t e l w e r t e d a r . Zugrunde g e l e g t wurden Messungen im o p t i m a l e n I n c u b a t i o n s m e d i u m und u n t e r Berück s i c h t i g u n g d e r i n i t i a l e n S y n t h e s e g e s c h w i n d i g k e i t . ( V e r s u c h s  b e d i n g u n g e n s i e h e 4. 3 . 1 . )

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D i e Tab. 5 g i b t d i e u n t e r Sättigungsbedingungen und u n t e r Berücksichtigung d e r i n i t i a l e n S y n t h e s e g e s c h w i n d i g k e i t e r  m i t t e l t e n Werte w i e d e r . D i e Werte für d e n L e u c i n u n d I s o -l e u c i n e i n b a u i n R a t t e n -l e b e r m i t o c h o n d r i e n wurden u n t e r

i d e n t i s c h e n B e d i n g u n g e n e r m i t t e l t , s o daß man schließen d a r f , daß L e u c i n und I s o l e u c i n e t w a i n g l e i c h e m Verhältnis e i n g e  b a u t w e r d e n . B e m e r k e n s w e r t i s t f e r n e r d i e beträchtlich höhere S y n t h e s e g e s c h w i n d i g k e i t i n d e n L o c u s t e n m i t o c h o n d r i e n , d i e , w i e später g e z e i g t w i r d ( A b s c h n i t t 3 . 4 . 1 . ) , vom E n t w i c k l u n g s  z u s t a n d d e r M i t o c h o n d r i e n abhängt.

L a u t T a b . 3 werden auch s o l c h e Aminosäuren e i n g e b a u t , deren A n w e s e n h e i t im I n c u b a t i o n s m e d i u m den E i n b a u n i c h t s t i m u l i e r t . D i e Klärung d i e s e r E f f e k t e i n dem außerordentlich komplexen S y s t e m g a n z e r M i t o c h o n d r i e n , h a t z u m i n d e s t d i e f o l g e n d e n , s i c h möglicherweise überschneidenden, größtenteils u n b e k a n n t e n P a r a m e t e r zu. berücksichtigen: D i e Nutzung d e r zugegebenen Aminosäuren a l s S u b s t r a t e d e r A t m u n g s k e t t e , v e r s c h i e d e n e P e r  meabilitäten d e r v e r s c h i e d e n e n Aminosäuren für d i e m i t o c h o n  d r i a l e n Membranen und v e r s c h i e d e n e M i c h a e l i s k o n s t a n t e n für d i e e i n z e l n e n m i t o c h o n d r i a l e n A m i n o a c y l - R N A - S y n t h e t a s e n . 3.1.4. Zeitabhängigkeit d e s E i n b a u s E i n w e i t e r e s K r i t e r i u m z u r B e u r t e i l u n g d e s p h y s i o l o g i s c h e n C h a r a k t e r s d e s E i n b a u p r o z e s s e s s t e l l t d i e E i n b a u k i n e t i k d a r . U n s p e z i f i s c h e A d s o r p t i o n s o l l t e k e i n e Zeitabhängigkeit z e i g e n . I n Abb. 11 und Abb. 12 s i n d t y p i s c h e E i n b a u k u r v e n für L o c u s t e n -und R a t t e n l e b e r m i t o c h o n d r i e n d a r g e s t e l l t . D e r E i n b a u i n L o c u s t e n m i t o c h o n d r i e n i s t d a d u r c h g e k e n n z e i c h  n e t , daß s e i n e G e s c h w i n d i g k e i t i n n e r h a l b e i n e r S t u n d e a u f etwa 1/ 3 a b s i n k t . B e i R a t t e n l e b e r m i t o c h o n d r i e n beobachtet man e i n a n d e r e s V e r h a l t e n : D i e E i n b a u k i n e t i k durchläuft e i n Maximum, d a s j e n a c h Präparation b e i 60 b i s 120 min l i e g e n k a n n . O f f e n s i c h t l i c h f i n d e t g l e i c h z e i t i g m i t d e r S y n t h e s e e i n Abbau d e s r a d i o a k t i v m a r k i e r t e n P r o t e i n s s t a t t , d e r ab d e n g e 

n a n n t e n Z e i t e n überwiegt. V e r a n t w o r t l i c h dafür dürften d i e i n d e r L e b e r v o r h a n d e n e n L y s o s o m e n s e i n , d i e u n t e r den üblichen Präparationsbedingungen i n d i e M i t o c h o n d r i e n f r a k t i o n g e l a n g e n . Auch d a s Vorkommen v o n p r o t e o l y t i s c h e n Enzymen i n M i t o c h o n

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1 9

-d r i e n w i r -d -d i s k u t i e r t [ 4 3 ] . D e r e n Nachweis i s t j e -d o c h s e h r s c h w i e r i g z u e r b r i n g e n , d a e i n e s a u b e r e A b t r e n n u n g d e r L y s o -somen a u s e i n e r Mitochondrienpräparation d e r R a t t e n l e b e r gegenwärtig n i c h t möglich e r s c h e i n t . Außerdem muß man e i n e u n s p e z i f i s c h e A d s o r p t i o n v o n p r o t e o l y t i s c h e n Enzymen a n d e n m i t o c h o n d r i a l e n Membranen i n B e t r a c h t z i e h e n . D i e s e r i n g l e i  c h e r Weise v o n WHEELDON e t a l . [ 4 4 ] b e o b a c h t e t e Z e r f a l l d e s m a r k i e r t e n m i t o c h o n d r i a l e n P r o t e i n s i s t v o n d i e s e n A u t o r e n näher u n t e r s u c h t worden und d a s A u f t r e t e n v o n r a d i o a k t i v e n s a u r e n P e p t i d e n n a c h g e w i e s e n worden. i p m / m g P r o l e i n 15 30 45 l n k u b o t i o n n . i t ( m i n ) Abb. 1 1 . Zeitabhängigkeit d e s E i n b a u s v o n 1 4 - C - I s o l e u c i n i n L o c u s t e n m i t o c h o n d r i e n . ( V e r  s u c h s b e d i n g u n g e n s i e h e 4. 3 . 1 . ) Ipm/mg Protein ι 1 r -30 60 90 120 1S0 160 210 2*0 Inkubationsxeit [min] Abb. 1 2 . Zeitabhängigkeit d e s E i n b a u s v o n 1 4 - C - L e u c i n i n R a t t e n l e b e r m i t o c h o n d r i e n . ( V e r s u c h s b e d i n g u n g e n s i e h e 4. 3 . 1 . ) ft. 1. 5 . Abhängigkeit d e s E i n b a u s von d e r Mg*"*" K o n z e n t r a t i o n Von d e n b e r e i t s g u t u n t e r s u c h t e n E i n z e l r e a k t i o n e n d e r P r o t e i n  b i o s y n t h e s e i n c y t o p l a s m a t i s c h e n S y s t e m e n i s t b e k a n n t , daß M g+ + z u r A k t i v i e r u n g d e r DNA abhängigen RNA-Polymerase, d e r A m i n o a c y l - R N A - S y n t h e t a s e n s o w i e für d i e I n t a k t h a l t u n g d e r R i b o s o m e n s t r u k t u r n o t w e n d i g i s t . W e i t e r h i n k a n n M g+ + i n d i r e k t

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über d i e E n e r g i e v e r s o r g u n g d e n E i n b a u b e e i n f l u s s e n , d a e s e i n e w i c h t i g e R o l l e b e i d e r o x i d a t i v e n P h o s p h o r y l i e r u n g s p i e l t . I n s b e s o n d e r e w i r d b e i h o h e n M g+ + K o n z e n t r a t i o n e n e i n e A T P a s e i n d u z i e r t ( s i e h e a u c h A b s c h n i t t 3 . 1 .7 . ) . Sowohl im F a l l e d e r L o c u s t e n m i t o c h o n d r i e n a l s a u c h b e i d e n R a t t e n l e b e r m i t o c h o n d r i e n e r g a b s i c h e i n e s t a r k e S t i m u l i e r u n g d e s E i n b a u s d u r c h Z u s a t z v o n M g+ + zum I n c u b a t i o n s m e d i u m (Abb. 13 und Abb. 1 4 ) .

I p m / m g P r o t e i n

Abb. 1 3 . Abhängigkeit des E i n b a u s von 1 4 - C - I s o l e u c i n i n i s o l i e r t e L o c u s t e n  m i t o c h o n d r i e n v o n d e r M g+ + K o n z e n  t r a t i o n im I n c u b a t i o n s m e d i u m . ( V e r  s u c h sbe d i n g u n g e n s i e h e 4. 3 - 1 « ) 10 15 20 mM M g C l2 Abb. 14. Abhängigkeit E i n b a u s von 1 4 - C - L e u c i i n i s o l i e r t e R a t t e n  l e b e r m i t o c h o n d r i e n v o n d e r Mg++ K o n z e n t r a t i o n im I n c u b a t i o n s m e d i u m . ( V e r s u c h s b e d i n g u n g e n s i e h e 4 .3.1.)

3 . 1 * 6 . Abhängigkeit d e s E i n b a u s von d e r Phosphationen-k o n z e n t r a t i o n

Auch P h o s p h a t i o n e n vermögen d e n E i n b a u z u s t i m u l i e r e n . D a b e i b e o b a c h t e t man e i n e w e s e n t l i c h stärkere Erhöhung d e s E i n b a u s b e i R a t t e n l e b e r m i t o c h o n d r i e n a l s b e i L o c u s t e n m i t o c h o n d r i e n (Abb. 1 5 und Abb. 1 6 ) . E i n e r s e i t s mag d i e Bedeutung d e r zuge gebenen P h o s p h a t i o n e n i n d e r Unterstützung d e r o x i d a t i v e n P h o s p h o r y l i e r u n g i n d e n M i t o c h o n d r i e n l i e g e n . A n d e r e r s e i t s d e u t e t d e r s t a r k e E f f e k t u n d d i e r e l a t i v hohe K o n z e n t r a t i o n für d a s Optimum b e i R a t t e n l e b e r m i t o c h o n d r i e n ( 1 3 mM) d a r a u f h i n , daß d i e P h o s p h a t i o n e n , d i e b e k a n n t l i c h S c h w e l l u n g von M i t o c h o n

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-d r i e n v e r u r s a c h e n [4-5] , über e i n e Än-derung -d e r Permeabilität d e r m i t o c h o n d r i a l e n Membranen Einfluß a u f d i e E i n b a u r a t e ausüben.

Ipm/mg Protein _{Ipm/mg Prettin}

12 16 20 28 40 fmM] PO,3- _{(mM] p o} t» -Abb. 1 5 - Abhängigkeit d e s E i n b a u s von 1 4 - C - I s o l e u c i n i n i s o l i e r t e L o c u s t e n m i t o  c h o n d r i e n v o n d e r P h o s p h a t  k o n z e n t r a t i o n im I n c u b a t i o n s  medium. ( V e r s u c h s b e d i n g u n g e n s i e h e 4. 3 . 1 . ) Abb. 16. Abhängigkeit d e s E i n b a u s von 1 4 - C - L e u c i n i n i s o l i e r t e R a t t e n l e b e r m i t o  c h o n d r i e n von d e r P h o s p h a t  k o n z e n t r a t i o n im I n c u b a t i o n s  medium. ( V e r s u c h s b e d i n g u n g e n s i e h e 4. 3 . 1 . ) 3*1»7» B e r e i t s t e l l u n g d e r E n e r g i e für den E i n b a u

I n w e l c h e r Form und a u f welchem .'/ege w i r d d i e E n e r g i e für d e n Einbauprozeß b e r e i t g e s t e l l t ?

Am übersichtlichsten e r s c h i e n e s zunächst, d i e s e E n e r g i e d u r c h Zugabe v o n ATP zum I n c u b a t i o n s m e d i u m von außen z u r Verfügung z u s t e l l e n . Abb. 17 und Abb. 18 z e i g e n das R e s u l t a t d i e s e s V e r s u c h e s für L o c u s t e n - und R a t t e n l e b e r m i t o c h o n d r i e n . I n b e i d e n Fällen h a b e n g e e i g n e t e K o n z e n t r a t i o n e n von ATP e i n e S t e i g e r u n g z u r F o l g e , d i e i n den g e z e i g t e n E x p e r i m e n t e n b e i L o c u s t e n m i t o c h o n d r i e n e i n e n F a k t o r v o n 5 und b e i R a t t e n l e b e r  m i t o c h o n d r i e n e i n e n F a k t o r v o n 3 · 5 ausmacht.

I s t nun d i e s e W i r k u n g d e s z u g e s e t z t e n ATP e i n e d i r e k t e ? Das heißt, w i r d d i e s e s zugegebene ATP für d i e v e r s c h i e d e n e n e n e r g i e v e r b r a u c h e n d e n R e a k t i o n e n , d i e d i e P r o t e i n s y n t h e s e einschließt, benützt?

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Ipm/mg Protein

fflM ATP

" Ί 1 Γ -6 7 β

mM ATP

ADD. 1 7 · Wirkung von AT? a u f den E i n b a u v o n 1 4 C I s o l e u -c i n i n L o -c u s t e n m i t o -c h o n d r i e n . ( V e r s u c h s b e d i n g u n g e n s i e h e

4. 3 . 1 . )

Abb. 18. -./irkung von A T I a u f den E i n b a u von 1 4 C P h e n y l -a l -a n i n i n R -a t t e n l e b e r m i t o  c h o n d r i e n . ( V e r s u c h s b e  d i n g u n g e n s i e h e 4 .3 . 1 . )

E i n e r s e i t s i s t b e k a n n t , daß exogenes ATP i n M i t o c h o n d r i e n e i n  d r i n g e n kann [ 4 6 ] , a n d e r e r s e i t s h a t man d a m i t z u r e c h n e n , daß e x o g e n e s ATP n i c h t a l s s o l c h e s i n d i e M i t o c h o n d r i e n g e l a n g t , s o n d e r n n a c h H y d r o l y s e , etwa d u r c h m i t o c h o n d r i a l e ATPase und d u r c h d i e m i t o c h o n d r i a l e A d e n y l a t k i n a s e a l s a D P i n d i e Mito c h o n d r i e n aufgenommen w i r d und e r s t d o r t w i e d e r p h o s p h o r y l i e r t w i r d . B e i Gültigkeit d i e s e r Annahme s o l l t e z u g e s e t z t e s ADP z u g e s e t z t e s ATP e r s e t z e n können. Abb. 19 und Abb. 2 0 z e i g e n nun für L o c u s t e n - und R a t t e n l e b e r m i t o c h o n d r i e n , daß ADP etwa d i e g l e i c h e s t i m u l i e r e n d e Wirkung a u f d e n E i n b a u h a t , w i e zugefügtes ATP.

D i e i n den Abb. 1 7 - 2 0 g e z e i g t e n Daten werfen d i e Frage a u f , ob n u r endogen e r z e u g t e s ATP d e n E i n b a u a n t r e i b e n k a n n , o d e r a u c h ATP e x o g e n e r N a t u r .

(26)

2 3

-ipm/mg Prettin

3 m M A D P

Abb. 1 9 . Wirkung von ADP a u f den E i n b a u v o n 1 4 - C - I s o l e u c i n

i n i s o l i e r t e L o c u s t e n m i t o  c h o n d r i e n . ( V e r s u c h s b e d i n g u n g  en s i e h e 4 .3 . 1 . )

Abb. 20. Wirkung von ADP a u f den E i n b a u von 1 4 - C - L e u c i n i n i s o l i e r t e R a t t e n l e b e r m i t o  c h o n d r i e n . ( V e r s u c h s b e  d i n g u n g e n s i e h e 4 .3 . 1 . )

E x p e r i m e n t e m i t Hemmern d e r Atmungskette und d e r o x i d a t i v e n P h o s p h o r y l i e r u n g e r l a u b e n e i n e D i f f e r e n z i e r u n g d i e s e s P r o b l e m s ( T a b . 6 ) . E i n e Gegenüberstellung d e s V e r h a l t e n s d e r d u r c h Atmung und d e r d u r c h e x o g e n e s ATP a n g e t r i e b e n e n Systeme e r  g i b t f o l g e n d e s B i l d :

1 ) I n Übereinstimmung m i t d e r Annahme, daß endogenes ATP i n d e r L a g e i s t , den E i n b a u a n z u t r e i b e n , b e o b a c h t e t man e i n e Hemmung d e s von ADP s t i m u l i e r t e n E i n b a u s d u r c h d i e B l o c k e r d e r A t m u n g s k e t t e KCN und A m y t a l , den E n t k o p p l e r DNP und den I n h i b i t o r d e r p h o s p h o r y l i e r e n d e n Atmung O l i g o m y c i n . D i e Wirkung d i e s e r S u b s t a n z e n i s t sowohl für R a t t e n l e b e r - a l s a u c h für L o c u s t e n m i t o c h o n d r i e n - wenn a u c h i n v e r s c h i e d e n e m Ausmaß - i n g l e i c h e r Weise f e s t z u s t e l l e n ( T a b . 6 / 2 ) .

(27)

2 ) B e t r a c h t e t man d e n Einfluß d i e s e r Hemmer a u f d e n ATP g e  t r i e b e n e n E i n b a u , s o e r g i b t s i c h e i n k o m p l i z i e r t e r e s B i l d , w o b e i s i c h a u c h n o c h R a t t e n l e b e r - und L o c u s t e n m i t o c h o n d r i e n u n t e r s c h e i d e n ( T a b . 6 / 3 ) .

a ) R a t t e n l e b e r m i t o c h o n d r i e n : Auch d e r ATP g e t r i e b e n e E i n b a u kann d u r c h KCN, A m y t a l und O l i g o m y c i n gehemmt werden, a l l e r d i n g s z u e i n e m g e r i n g e r e n Ausmaß a l s d e r ADP s t i m u  l i e r t e E i n b a u . D a r a u s laßt s i c h schließen, daß z u m i n d e s t e i n T e i l d e r A T P - S t i m u l i e r u n g n i c h t a u f e i n e r d i r e k t e n Verwendung d e s exogenen ATP b e r u h t , s o n d e r n daß d i e s e s d u r c h A T P a s e n und d u r c h d i e i n d e n R a t t e n l e b e r m i t o c h o n  d r i e n v o r h a n d e n e A d e n y l a t - K i n a s e z u ADP h y d r o l y s i e r t w i r d , d a s i n d i e M i t o c h o n d r i e n g e l a n g t , und d a s , w i e i n Abb. 19 g e z e i g t , b e i e i n e r w e s e n t l i c h n i e d r i g e r e n K o n z e n t r a t i o n a l s ATP o p t i m a l d e n E i n b a u s t i m u l i e r t . D i e "Wirkung v o n DNP i s t i n d i e s e m F a l l n i c h t e i n d e u t i g , d a e s n i c h t n u r e n t k o p p e l t , s o n d e r n a u c h d i e m i t o c h o n d r i a l e A T P a s e s t i m u  l i e r t . D i e w e n i g e r a l s h a l b so große W i r k s a m k e i t d e r d r e i übrigen Hemmer im ATP-unterstützten S y s t e m v e r g l i c h e n m i t dem ADP-unterstützten S y s t e m l e g t d i e Vermutung n a h e , daß e i n T e i l d e s exogenen ATP i n d i e M i t o c h o n d r i e n e i n d r i n g t und a l s s o l c h e s b e i d e n v e r s c h i e d e n e n ATP e r f o r d e r n d e n R e a k t i o n e n d e r P r o t e i n b i o s y n t h e s e Verwendung f i n d e t . b ) L o c u s t e n m i t o c h o n d r i e n : Auch i n d i e s e n M i t o c h o n d r i e n w i r d

d e r ATP-unterstützte E i n b a u v o n KON, Amytal und O l i g o  m y c i n gehemmt. Aber i n d i e s e m F a l l g e s c h i e h t d i e s zum i n n e r h a l b d e r Meßfehlergrenzen g l e i c h e n Ausmaß w i e b e i dem ADP-unterstützten E i n b a u . D a d u r c h w i r d d i e Vermutung nahe g e l e g t , d a ß d i e A T P - S t i m u l i e r u n g b e i d e n L o c u s t e n  m i t o c h o n d r i e n tatsächlich a u f e i n e r A D P - S t i m u l i e r u n g b e r u h t . D i e s e Vermutung w i r d d u r c h f o l g e n d e B e o b a c h t u n g e n s t a r k unterstützt: I n s e k t e n f l u g m u s k e l m i t o c h o n d r i e n b e  s i t z e n e i n e s e h r hohe ATPase Aktivität, d i e d u r c h M g+ + I o n e n d r a s t i s c h erhöht w i r d [ 4 7 ] . E s läßt s i c h a b  schätzen, daß d i e s e M g+ + s t i m u l i e r t e A T P a s e b e i w e i t e m a u s r e i c h t , um s o v i e l ADP z u e r z e u g e n , daß d i e s e s d e n E i n b a u i n s e i n e r o p t i m a l e n K o n z e n t r a t i o n a n t r e i b e n kann. Genügend M g+ + I o n e n s i n d z u d i e s e r S t i m u l i e r u n g d e r ATPase im I n c u b a t i o n s m e d i u m anwesend. D i e V e r g l e i c h s

(28)

2 5

-w e i s e v i e l höhere S t i m u l i e r u n g d e s E i n b a u s d u r c h

M g+ + I o n e n im F a l l e d e r L o c u s t e n m i t o c h o n d r i e n gegenüber den R a t t e n l e b e r m i t o c h o n d r i e n mag a u f dem g l e i c h e n E f f e k t b e r u h e n .

5 ) Von I n t e r e s s e s i n d w e i t e r h i n d i e Wirkungen e i n e r s e i t s e i n e s ATP r e g e n e r i e r e n d e n S y s t e m s und a n d e r e r s e i t s e i n e s ATP b e 

s e i t i g e n d e n S y s t e m s ( T a b . 6 / 4 ) . I n R a t t e n l e b e r m i t o c h o n d r i e n verändert d e r Z u s a t z von P h o s p h o e n o l p y r u v a t und P y r u v a t -k i n a s e zum ATP g e t r i e b e n e n S y s t e m d i e E i n b a u r a t e n i c h t , während b e i L o c u s t e n m i t o c h o n d r i e n e i n e e m p f i n d l i c h e Hemmung z u b e o b a c h t e n i s t . Nach den v o r a u s g e h e n d e n D a t e n wäre d i e s so z u i n t e r p r e t i e r e n , daß d a s ATP r e g e n e r i e r e n d e S y s t e m b e i den R a t t e n l e b e r m i t o c h o n d r i e n B e d i n g u n g e n s c h a f f t , b e i denen mehr ATP z u r Verfügung s t e h t und i n d i e M i t o c h o n d r i e n e i n  d r i n g t , um den E i n b a u d i r e k t a n z u t r e i b e n . B e i den L o c u s t e n  m i t o c h o n d r i e n , i n denen d e r E i n b a u n a c h den oben b e s c h r i e  benen E x p e r i m e n t e n a l l e i n über d i e A t m u n g s k e t t e g e t r i e b e n w i r d , b e s e i t i g t o f f e n s i c h t l i c h d a s ATP r e g e n e r i e r e n d e S y s t e m d a s d u r c h d i e ATPase e n t s t a n d e n e ADP und hemmt den E i n b a u beträchtlich.

D i e G l u c o s e / H e x o k i n a s e F a l l e hemmt, w i e man n a c h den v o r a u s  gegangenen B e f u n d e n e r w a r t e n s o l l t e , s e h r s t a r k den E i n b a u i n R a t t e n l e b e r m i t o c h o n d r i e n . D e r e b e n f a l l s s e h r s t a r k hemmende Einfluß a u f L o c u s t e n m i t o c h o n d r i e n i s t n i c h t e i n  f a c h z u d e u t e n . Nach Abb. 19 i s t z u vermuten, daß d i e e n t  s t e h e n d e n hohen ADP K o n z e n t r a t i o n e n e i n e n s t a r k hemmenden E f f e k t a u f den E i n b a u ausüben.

4 ) Wie a u s Tab. 6/4 e r s i c h t l i c h i s t , vermag a u c h AMP d e n E i n  bau z u s t i m u l i e r e n . D i e s e r E f f e k t i s t b e i den R a t t e n l e b e r  m i t o c h o n d r i e n stärker a l s b e i d e n L o c u s t e n m i t o c h o n d r i e n . D i e s läßt s i c h damit erklären, daß d i e R a t t e n l e b e r m i t o c h o n  d r i e n e i n e höhere Adenylatkinaseaktivität b e s i t z e n , a l s d i e L o c u s t e n m i t o c h o n d r i e n [ 4 8 ] .

5 ) W e i t e r h i n h a t d e r Z u s a t z d e r anderen d r e i N u c l e o s i d t r i -p h o s -p h a t e GTP, UTP und CTP a u f R a t t e n l e b e r - und L o c u s t e n  m i t o c h o n d r i e n e i n e n u n t e r s c h i e d l i c h e n Einfluß ( T a b . 6 / 4 ) . Während d i e e r s t e n b e i d e n N u c l e o s i d t r i p h o s p h a t e i n R a t t e n

(29)

-Zugabe R a t t e n l e b e r - L o c u s t e n  m i t o c h o n d r i e n m i t o c h o n d r i e n (Ipm/mg P r o t e i n ) (Ipm/mg P r o t e i n ) % Hemmung % Hemmung 7 5 6 389 +ADP (2mM) 1740 696 +KCN (4mM) 321 81.6 2 3 5 66.2 +DNP (0.2mM) 836 5 2 . 0 2 0 5 70.6 +Amytal (5mM) 417 76.0 510 26.8 + 0 1 i g o m y c i n (4μβ/ια1) 569 6 7. 3 441 36.6 +ATP (2mM) 1482 1 0 7 4 +KCN (4mM) 885 40.4 306 71.6 +DNP (0.2mM) _{6 1 5} 6 8. 5 111 8 9. 7 +Amytal (5mM) 1269 1 4. 5 _{7 6 5} 28.8 + 0 1 i g o m y c i n (4μδ/πι1) 1000 3 2. 5 629 4 1. 5 +ATP (2mM) +PEP (12.5mM) +PK (0.1mg/ml) 1472 278 +ATP (2mM) • G l u k o s e (20mM) +HK (0.2mg/ml) 340 133 +AMP (2mM) 1463 588 +GTP (1mM) 834 256 +CTP (1mM) 787 396 +UTP (1mM) 960 1 5 2 +ADP (2mM) •fOtGP (5mM) 1088 3 7 . 5 505 2 7 . 5 • P y r u v a t / M a l a t (5/2.5mM) 1 1 2 2 35-4 268 6 1. 5 -f-ocKG 1145 34.1 676 3.0 T a b . 6. Abhängigkeit d e s E i n b a u s v o n 1 4 - C - I s o l e u c i n i n L o c u s t e n m i t o c h o n d r i e n und 1 4 - C - L e u c i n i n R a t t e n l e b e r m i t o c h o n  d r i e n v o n e n d o g e n e r und e x o g e n e r E n e r g i e v e r s o r g u n g . ( V e r s u c h s b e d i n g u n g e n s i e h e 4. 3 . 1 . )

(30)

2 7

-l e b e r m i t o c h o n d r i e n den E i n b a u -l e i c h t s t i m u -l i e r e n , mög-licher w e i s e d u r c h d i e Wirkung d e r N u c l e o s i d d i p h o p h a t k i n a s e , üben s i e b e i den L o c u s t e n m i t o c h o n d r i e n e i n e Hemmung a u f den E i n  bau a u s . E i n e Erklärung d i e s e s E f f e k t e s e r s c h e i n t a u f d e r B a s i s d e r v o r l i e g e n d e n E x p e r i m e n t e n i c h t möglich.

6 ) Welche R o l l e s p i e l t d i e Versorgung mit S u b s t r a t e n d e r A t m u n g s k e t t e a u f den ADP s t i m u l i e r t e n E i n b a u ? Aus Tab. 6 / 5 k a n n man entnehmen, daß b e i den R a t t e n l e b e r m i t o c h o n d r i e n d e r Z u s a t z von α-Glycerophosphat, P y r u v a t / M a l a t und oc-Keto-g l u t a r a t den E i n b a u d u r c h s c h n i t t l i c h um 1 / 3 hemmt, b e i den L o c u s t e n m i t o c h o n d r i e n n u r d i e b e i d e n e r s t e n S u b s t r a t e . o c K e t o g l u t a r a t , d a s b e k a n n t l i c h n i c h t i n I n s e k t e n f l u g -m u s k e l -m i t o c h o n d r i e n e i n d r i n g e n kann, z e i g t k e i n e n E f f e k t . A n s c h e i n e n d b e s i t z e n d i e M i t o c h o n d r i e n n o c h genügend e n d o  g e n e s S u b s t r a t , um d i e E n e r g i e v e r s o r g u n g z u gewährleisten. Zu e i n e r I n t e r p r e t a t i o n d e s Hemmeffektes s i e h e [ 4 9 ] .

3 . 2 . Einfluß von Hemmsubstanzen d e r c y t o p l a s m a t i s c h -r i b o s o m a l e n P -r o t e i n s y n t h e s e a u f den E i n b a u

B e r e i t s w i e d e r h o l t wurde d e r E i n b a u von Aminosäuren i n i s o  l i e r t e M i t o c h o n d r i e n m i t dem c y t o p l a s m a t i s c h - r i b o s o m a l e n S y s t e m v e r g l i c h e n . E i n e w e i t e r e Möglichkeit, n a c h P a r a l l e l e n im Mechanismus b e i d e r S y s t e m e z u s u c h e n , i s t d i e Anwendung v o n Hemmsubstanzen d e r c y t o p l a s m a t i s c h e n P r o t e i n s y n t h e s e a u f d a s m i t o c h o n d r i a l e S y s t e m . DNA abhängige c y t o p l a s m a t i s c h e P r o t e i n S y n t h e s e w i r d d u r c h A c t i n o m y c i n gehemmt. D i e s b l o c k i e r t d i e T r a n s s c r i p t i o n d e r messenger-RNA und wegen d e r e n k u r z e n H a l b w e r t s z e i t s t o p p t d i e P r o t e i n s y n t h e s e . I n d i e s e n E x p e r i m e n t e n wurden z w e i v e r s c h i e  dene A c t i n o m y c i n e v e r w e n d e t : A c t i n o m y c i n C und A c t i n o m y c i n D. D a b e i z e i g t e s i c h , daß d a s z w e i t e u n w i r k s a m i s t , d a s e r s t e j e d o c h e i n e n w i r k s a m e n Hemmer d e s E i n b a u s d a r s t e l l t ( T a b .7 ) . A c t i n o m y c i n C b e s t e h t a u s m e h r e r e n S u b s t a n z e n [ 5 0 ] . D i e r e i n e Komponente A c t i n o m y c i n D k a n n o f f e n s i c h t l i c h n i c h t i n d i e M i t o c h o n d r i e n e i n d r i n g e n , d a e s , w i e von NEUBERT [ 5 1 ] g e z e i g t wurde, s e h r wohl den E i n b a u i n D i g i t o n i n s u b p a r t i k e l a u s R a t t e n l e b e r m i t o c h o n d r i e n hemmen k a n n .