PCR-Analytik zur Bestimmung von GVOs in Heimtierfuttermitteln

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Informationsveranstaltung „Heimtierfuttermittel“

PCR-Analytik zur Bestimmung von GVOs in Heimtierfuttermitteln

C. Haldemann, ALP

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Die Bestimmung genveränderter Organismen (GVO) basiert auf dem Nachweis von

ampilifzierter Deoxyribonukleinsäure (DNA), die zielgerichtet in das Genom eines Organismus eingebracht wurde, um dem Organismus eine neue Eigenschaft zu verleihen (z.B. Toleranz gegen Schädlinge, Herbizide etc).

Grundidee des Nachweises von GVOs mittels PCR

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Struktur der DNA

Wasserstoff-Verbindungen Base

Zucker - Phosphat Gerüst

Helix Umdrehung = 3.4nm

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Schematisch dargestelltes Gen Konstrukt eines GVO:

Promotor

Enhancer

(Expressionsregulator)

Gen

Terminator Ziel: Einfügen in Wirt-DNA

Erfolgreiche Transformation

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Doppel-Strang DNA

Erhitzen

Einzel-Strang DNA

Doppel-Strang DNA

DNA Denaturierung und Hybridisierung

Abkühlen

Re-Naturierung Hybridisierung Denaturierung

DNA-Eigenschaft als Voraussetzung der PCR:

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54 72

1 1 2

Temperatur (ºC)

Zeit (min.) 94

20-40 Zyklen

Denaturierung primer Anbindung

Extension

Reaktions Mix:

- DNA Vorlage - dNTPs

- MgCl

₂

- primer

- DNA polymerase

Polymerase Chain Reaction PCR

Polymerase-Kettenreaktion

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Exponentielle DNA-Amplifikation

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Quantitative real-time PCR – TaqMan System

3’ 5’

reporter quencher

3’ 5’

Taq

5’ 3’

FLUORESCENCE

3’ 5’

Taq

5’ 3’

Reporter = FAM, VIC Quencher = TAMRA

TaqMan Sonde

5’ 3’

Primer

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Arbeitsschritte zur Bestimmung von GVOs mittels PCR

2. DNA Extraktion

3. Zubereitung des PCR Mastermix

1. Probenaufbereitung

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qualitative end-punkt PCR

quantitative real-time PCR

4. Amplifikation

Resultat: (nicht) nachweisbar Resultat: z.B. in % GVO

5. Daten Analyse

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• Positiv Kontrolle (Probe mit der zu untersuchenden Ziel-Substanz )

• Negativ Kontrolle (Probe ohne die zu untersuchende Ziel-Substanz)

• Extraktions Kontrolle (Kontrolle der Reinheit des DNA Isolierungs Proesses)

• PCR Kontrolle oder No Template Control (NTC) (Kontrolle für Reinheit der Reaktionskomponenten

• Quantitative Kontrolle (Probe mit bekannter Konzentration der zu untersuchenden Ziel-Substanz)

PCR Kontrollen

• Zieltaxonspezifisches Gen Kontrolle – eine zweite Ziel-Substanz,

vorhanden in allen zu untersuchenden Proben (z.B. Lektin für Soja)

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Sicherheitsvorkehrungen um Kontaminationen zu verhindern

• Räumlich getrennte GVO Laboratorien

• Mastermix versehen mit Uracil-DNA

Glycosylase (UNG) and dUTP anstelle von dTTP

• Tragen von Handschuhen

• Probenzerkleinerungsgeräte mit Sodiumhypochlorid (Javel-Wasser) dekontaminieren

• UV-Bestrahlung während der Nacht

• Benutzen von Einweg-Plastikwaren von Einweg-

Plastikwaren und Pipettenspitze mit Aerosol-Barriere

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Qualitäts Kontrolle in der GVO Analytik

Aktive Teilnahme an verschiedenen Proficiency Tests (PT), wie:

• ISTA PT on GMO testing

• GeMMA PT (Genetically Modified Material Analysis Scheme)

• Bipea (Bureau Interprofessionnel d’Etudes Analytiques)

• etc.

Unsere GVO-Laboratorien sind akkrediert nach:

ISO 9001:2000 / ISO 17025

Alle Methoden müssen eine hausinterne Validierung

bestehen bevor sie zum routinemässigen Einsatz gelangen

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Vielen Dank um Ihre Aufmerksamkeit