Analyse der zellulären Immunantwort gegen SV40 T-Antigen-induzierte Mammakarzinome im
transgenen Mausmodell
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Jara Wanger
aus Bremen
Hannover 2011
Wissenschaftliche Betreuung: 1. Prof. Dr. Andreas Beineke Institut für Pathologie
Tierärztliche Hochschule Hannover
2. Prof. Dr. Wolfgang Deppert Abteilung Tumorvirologie Heinrich-Pette-Institut,
Leibniz-Institut für Experimentelle Virologie, Hamburg
1. Gutachter: Prof. Dr. Andreas Beineke und Prof. Dr. Wolfgang Deppert 2. Gutachterin: Apl. Prof. Dr. Beatrice Grummer
Tag der mündlichen Prüfung: 16.12.2011
Für meine Familie
Inhaltsverzeichnis
I. Einleitung ... 1
I.1.Das humane Mammakarzinom ... 1
I.2.Aufbau und Histologie der weiblichen Brust ... 1
I.3.Karzinogenese ... 3
I.3.1. Entwicklung von Mammakarzinomen ... 5
I.4.Mausmodelle ... 6
I.5.Aufbau und Entwicklung der murinen Brustdrüse ... 7
I.6.Das WAP-T Mausmodell ... 9
I.6.1. Tumorgenese in WAP-T-Mäusen ... 11
I.6.2. WAP-T-NP8-Mäuse ... 11
I.6.2.1. Immunologische Kompetenz transgener WAP-T-NP8-Mäuse ... 12
I.7.Tumorimmunologie ... 13
I.7.1. Physiologische Bedeutung des PD-L1/PD-1-Signalweges ... 15
I.7.2. PD-L1-Expression auf chronisch-infizierten Zellen und Tumorzellen ... 16
II. Problemstellung ... 18
III. Material ... 20
III.1. Biologisches Material ... 20
III.1.1. Mauslinien ... 20
III.1.1.1. BALB/c-Mäuse ... 20
III.1.1.2. WAP-T-NP8-Mäuse ... 20
III.1.2. Zelllinien ... 20
III.2. Molekularbiologisches Material ... 21
III.2.1. Oligonukleotide ... 21
III.2.1.1. Oligonukleotide für die Standard-PCR ... 21
III.2.1.2. Oligonukleotide für die qRT-PCR ... 21
III.2.2. Normalseren ... 22
III.2.3. Antikörper ... 22
III.2.3.1. Primäre Antikörper... 22
III.2.3.2. Konjugierte Antikörper (FACS) ... 22
III.2.3.3. Sekundäre Antikörper (IHC) ... 23
III.2.3.4. Sekundäre Antikörper (IF) ... 23
Inhaltsverzeichnis
III.2.4. Fluoreszenzfarbstoffe für DNA ... 23
III.2.5. Enzyme ... 23
III.2.6. Größenstandards ... 23
III.3. Chemikalien und Materialien ... 24
III.3.1. Chemikalien ... 24
III.3.2. Kits ... 25
III.3.3. Puffer und Lösungen ... 25
III.3.4. Verbrauchsmaterialien ... 27
III.4. Geräte ... 27
IV. Methoden ... 30
IV.1. Experimentelle Methoden mit Tieren ... 30
IV.1.1. Tierhaltung und -zucht ... 30
IV.1.2. Induktion von Mammakarzinomen in WAP-T-NP8-Mäusen ... 30
IV.1.3. Präparation der Tiere ... 30
IV.1.4. Stadienbestimmung („Staging“) der Tumore ... 31
IV.1.5. Histologische Einteilung der Mammakarzinome („Grading“) ... 32
IV.1.6. Subkutane Tumorzelltransplantation ... 33
IV.1.7. Depletion CD8-positiver T-Zellen von BALB/c-Mäusen ... 33
IV.2. Histologische Methoden ... 33
IV.2.1. Gewebefixierung und Paraffineinbettung ... 33
IV.2.2. Herstellung von Gewebeschnitten am Mikrotom ... 34
IV.2.3. Entparaffinierung von Gewebeschnitten ... 34
IV.2.4. Hämalaun-Eosin Färbung ... 34
IV.3. Immunhistochemische Färbemethoden ... 35
IV.3.1. Prinzip der Immunhistochemie (IHC) ... 35
IV.3.1.1. Antigen-Demaskierung ... 35
IV.3.1.2. Waschen ... 35
IV.3.1.3. Blocken ... 36
IV.3.1.4. Primär-Antikörper ... 36
IV.3.1.5. Sekundär-Antikörper und Detektion ... 36
IV.3.1.6. Gegenfärbung mit Hämalaun ... 36
IV.3.2. Alkalische Phosphatase-Färbung für SV40 T-Ag ... 37
IV.3.3. Etablierung des Färbeprotokolls für PD-L1 ... 38
IV.3.4. Peroxidase-Färbung für PD-L1 ... 38
IV.3.5. Dokumentation von HE- und immunhistochemischen Färbungen ... 39
IV.3.6. Immunhistologische Methoden an Kryoschnitten ... 39
IV.3.6.1. Gewebefixierung in Kryomatrix ... 39
IV.3.6.2. Herstellung von Kryogewebeschnitten ... 40
IV.3.6.3. Indirekte Immunfluoreszenz-Färbung (IF) ... 40
IV.3.7. Fluoreszenzmikroskopie ... 41
IV.3.8. Auswertung der Immunhistochemie für PD-L1 ... 42
IV.4. Versuche mit eukaryotischen Zellen ... 43
IV.4.1. Zellkulturtechniken ... 43
IV.4.1.1. Kultivierung und Passagieren der Tumorzellen ... 43
IV.4.1.2. Einfrieren und Auftauen von Zellen ... 43
IV.4.1.3. PFA-Fixierung von Zellen ... 44
IV.4.2. Bestimmung der Zellzahl ... 45
IV.4.3. Färben von Zellen für die Durchflusszytometrie (FACS) ... 45
IV.4.4. Vorbereiten der Zellen für die Transplantation in Mäuse ... 45
IV.5. Molekularbiologische Methoden ... 46
IV.5.1. RNA-Extraktion aus gefrorenem Gewebe ... 46
IV.5.1.1. Bestimmung der RNA Konzentration ... 46
IV.5.1.2. Überprüfen der RNA Reinheit ... 47
IV.5.2. cDNA-Synthese ... 47
IV.5.3. Quantitative real-time-PCR ... 48
IV.6. Statistische Auswertungen ... 49
V. Ergebnisse ... 50
V.1. Untersuchung der immunologischen Kompetenz von WAP-T-NP8-Nullipara und BALB/c-Mäusen mit unterschiedlichem immunologischen Status ... 50
V.1.1. Mammakarzinomzellen ... 51
V.1.2. Transplantation von H8N8-Zellen ... 52
V.1.2.1. Unbehandelte BALB/c-Mäuse ... 53
V.1.2.2. CD8 T-Zell-depletierte BALB/c-Mäuse ... 53
V.1.2.3. WAP-T-NP8-Nullipara ... 53
V.1.2.4. Transplantation von G-2-Zellen in unbehandelte BALB/c-Mäuse (NP-Epitop-Negativkontrolle)... 54
V.1.3. Statistische Auswertung der Transplantationen ... 54
Inhaltsverzeichnis
V.2. Vergleichende Analyse von BALB/c- und WAP-T-NP8-Mäusen 4, 7 und 21
Tage nach Transplantation von H8N8-Zellen ... 55
V.2.1. Tumorgenese der transplantierten H8N8-Zellen in BALB/c- und WAP-T-NP8-Mäusen ... 55
V.2.2. Immunhistochemische Analyse von Tumor-infiltrierenden T-Lymphozyten... 58
V.2.3. Vergleich der Immunreaktion im regionären Lymphknoten und in der Milz ... 59
V.3. Tumor-assoziierte PD-L1-Expression ... 61
V.3.1. Validierung des PD-L1-Antikörpers ... 61
V.3.2. Analyse der PD-L1-Expression an Mammakarzinomzellen in vitro ... 63
V.3.2.1. PD-L1-Status der G-2- und H8N8-Zellen ... 63
V.3.2.2. Stimulation von G-2- und H8N8-Zellen mit Interferon-gamma ... 63
V.3.2.3. Dauer der Interferon-gamma-induzierten PD-L1-Expression ... 64
V.3.3. PD-L1-Expression in endogenen und durch Transplantation erzeugten Tumoren ... 66
V.3.4. Immunhistochemische Analyse von endogenen WAP-T-NP8-Tumoren unterschiedlichen Differenzierungsgrades ... 69
V.3.4.1. Auswertung der PD-L1-Immunhistochemie ... 71
V.3.4.2. Verteilung der PD-L1-positiven Zellen innerhalb der WAP-T-NP8-Tumore ... 73
V.3.4.3. Zelluläre Lokalisation von PD-L1 ... 73
V.3.5. PD-L1-Genexpressionsanalyse von endogenen, undifferenzierten WAP-T-NP8-Tumoren ... 74
V.4. Charakterisierung der PD-L1-exprimierenden Tumore ... 77
V.4.1. Nachweis PD-L1- und T-Ag-doppelt positiver Tumorzellen in endogenen WAP-T-NP8-Tumoren ... 78
V.4.2. Identifizierung PD-L1-positiver T-Zellen und Makrophagen in WAP-T-NP8-Tumoren ... 79
V.5. Zytokeratine ... 82
V.5.1. Zytokeratin-Profil und PD-L1-Expression von WAP-T-NP8- Mammakarzinomen ... 83
V.5.1.1. CK 8/18 und PD-L1 ... 83
V.5.1.2.CK 14 und PD-L1 ... 84
V.6. Sca-1 ... 88
V.6.1. Sca-1-Expression von Mammakarzinomzellen in vitro ... 88
V.6.2. Sca-1-Genexpressionsanalyse endogener WAP-T-NP8-Tumore ... 89
V.6.3. Proteinexpression von Sca-1 ... 90
VI. Diskussion ... 93
VI.1. Immunstatus von BALB/c- und transgenen WAP-T-NP8-Mäusen gegenüber SV40 T-Ag und LCMV/NP-Epitop ... 94
VI.2. Sca-1 ... 98
VI.3. Einfluss von Interferon-gamma auf die Expression von PD-L1 und Sca-1 sowie auf die Tumorentwicklung in vivo ... 100
VI.4. Bedeutung der Tumor-assoziierten PD-L1-Expression ... 103
VI.5. Prognostische Relevanz von Tumor-infiltrierenden T-Zellen ... 105
VII. Literaturverzeichnis ... 109
VIII. Abbildungsverzeichnis ... 119
IX. Tabellenverzeichnis ... 122
X. Abkürzungen ... 123
XI. Zusammenfassung ... 125
XII. Summary ... 128
XIII. Danksagung ... 131
I. Einleitung
I.1. Das humane Mammakarzinom
Brustkrebs ist mit Abstand die häufigste Krebserkrankung der Frau. Im Jahr 2008 lag die Neuerkrankungsrate (Inzidenz) mit 1,38 Mio Fällen bei 23 %. Damit steht Brustkrebs weltweit an zweiter Stelle aller Krebsneuerkrankungen. Trotz der diagnostischen Fortschritte bei der Früherkennung sterben in Deutschland pro Jahr noch immer etwa 17.500 Betroffene an den Folgen der Erkrankung. Die Anzahl der jährlichen Neuerkrankungen liegt hierzulande bei ca. 57.000 Frauen. Somit muss etwa jede zehnte Frau damit rechnen, im Laufe ihres Lebens an Brustkrebs zu erkranken. Das mittlere Erkrankungsalter liegt bei 63 Jahren.
(www.bcaction.de, Bundesministerium für Gesundheit, http://globocan.iarc.fr)
In den westlichen Industrienationen konnte durch Früherkennung und den Einsatz von individuellen Therapiekonzepten bereits eine deutliche Verbesserung der Heilungschancen und somit eine Reduktion der Sterblichkeit erreicht werden. Das Hauptproblem dieser Krebserkrankung ist in den meisten Fällen nicht der Primärtumor, sondern die Absiedlung von disseminierten Tumorzellen, die zur Ausbildung von Metastasen führen. Häufig betroffene Organe sind Knochen, Lunge, Leber und Gehirn.
Eine genaue Ursache für die Entstehung von Brustkrebs ist nicht bekannt. Allerdings gibt es eine Reihe von Risikofaktoren, die die Wahrscheinlichkeit an Brustkrebs zu erkranken deutlich erhöhen. Dazu zählen das Alter, an Brustkrebs erkrankte Verwandte 1. Grades (Mutter, Schwester), Mutationen im BRCA-1/BRCA-2-Gen (etwa 5 % aller Mammakarzinome), frühe Menarche, spätes Klimakterium sowie Kinderlosigkeit (Nullipara) und späte Schwangerschaft (> 30. Lebensjahr). Des Weiteren hat - wie bei vielen anderen Krebserkrankungen auch – der Lebensstil (Ernährung, Umweltfaktoren, Übergewicht, Bewegung, Nikotin- und Alkoholkonsum) einen Einfluss auf die Entstehung von Brustkrebs (www.dkfz.de).
I.2. Aufbau und Histologie der weiblichen Brust
Die weibliche Brust setzt sich aus drei Geweben zusammen: dem Drüsengewebe mit den Milchgängen sowie dem Binde- und Fettgewebe. Das Brustdrüsenparenchym besteht aus 15- 25 Einzeldrüsen (Lobi), die jedoch teilweise untereinander in Verbindung stehen. Wie in Abbildung 1 schematisch dargestellt, besteht jede Einzeldrüse (Lobus) aus einem komplexen baumartig verzweigten Milchgangsystem (Ductus lactiferi) und den traubenartig darum angeordneten sekretorischen Drüsenläppchen (Lobuli). Die Drüsenendstücke (Acini)
Einleitung 2
produzieren die Milch, welche über die terminalen und segmentalen Milchgänge in die spindelförmig erweiterten Milchsäckchen (Sinus lactiferi) und dann weiter zum Ausführungsgang (Ductus excretorius) gelangt. Der terminale Milchgang mit dem sich anschließenden Drüsenläppchen wird als terminale duktulo-lobuläre Einheit (TDLE) zusammengefasst. Umgeben wird das Drüsengewebe von stützendem Binde- (Stroma) und Fettgewebe (Bocker et al., 2009)
Abbildung 1: Schematische Darstellung und Terminologie der humanen, weiblichen Brustdrüse.
Im Querschnitt sind 4 Einzeldrüsen (Lobi) und eine Ausschnittvergrößerung eines Milchgangs mit terminaler duktulo-lobulärer Einheit (TDLE) dargestellt. (modifiziert nach Mary K. Bryson)
Ähnlich wie bei der Reifung von Zellen des hämatopoetischen Systems, existiert auch in der Brustdrüse, einem Gewebe das ständig hormonbedingten, morphologischen Änderungen unterworfen ist, eine Differenzierungshierarchie. An der Spitze stehen die Brustdrüsen- Stammzellen, aus denen über intermediäre Vorläuferzellen (Progenitorzellen) die Epithelzellen der luminalen und myoepithelialen Reihe hervorgehen (Abbildung 2).
Histologisch besteht das Drüsengewebe aus einer luminalen Schicht von Epithelzellen und einer dieser anliegenden, äußeren myoepithelialen Zellschicht. Die sich daran anschließende Basalmembran trennt das Drüsenepithel vom umgebenden Stroma (Visvader, 2009).
Abbildung 2: Modell der Differenzierungshierarchie im Drüsenparenchym der weiblichen Brust.
Aus einer Brustdrüsen-Stammzelle gehen durch asymmetrische Zellteilung erneut eine identische Stammzelle (dargestellt durch den kreisförmigen Pfeil) sowie eine gemeinsame Vorläuferzelle (Progenitorzelle) hervor, aus der sich die unterschiedlichen Epithelzelltypen entwickeln. (modifiziert nach Visvader, 2009)
I.3. Karzinogenese
In der Literatur wird die Tumorgenese als mehrstufiger Prozess beschrieben, der sich häufig über einen Zeitraum von mehreren Jahren oder Jahrzehnten erstreckt und schließlich in der malignen Entartung einer ursprünglich normalen Körperzelle resultiert (Weinberg, 1989). Den Ursprung (Initiation) bilden durch Mutationen verursachte genetische Alterationen, die der Zelle einen entscheidenden Wachstumsvorteil verschaffen.
Die am häufigsten betroffenen Gene sind (Proto-) Onkogene und Tumorsuppressorgene. Sie kodieren für Proteine, die im Zellzyklus wichtige Kontrollfunktionen, wie beispielsweise Apoptose, Zellteilung und Zelldifferenzierung übernehmen. Proto-Onkogene können durch genetische Veränderungen in Form von Mutationen, Translokationen oder viralen Infektionen zu Onkogenen (z.B. c-muc, c-ras, c-erb) werden (van Dam et al., 1994). Tumorsuppessorgene kodieren für Proteine, die den Zellzyklus überwachen (Levine, 1990). Die wichtigsten Vertreter sind das p53 (Levine, 1989) und das RB-Protein (Weinberg, 1992). P53 schützt vor einer fehlerhaften DNA-Replikation und damit vor einer möglichen malignen Entartung, indem es bei Schäden in der DNA den Zellzyklus stoppt und so die Reparatur der defekten Stelle ermöglicht (Zellzyklus-Arrest). Bei zu starker Schädigung initiiert p53 den programmierten Zelltod (Apoptose). Bei über der Hälfte aller menschlichen Tumoren können Mutationen des p53 nachgewiesen werden (Soussi et al., 2006). Das RB-Protein steuert über den Transkriptionsfaktor E2F den Zellzyklus am G1/S-Übergang. Erst wenn beide Allele
Einleitung 4
mutiert sind kommt es bei Betroffenen zur Entstehung eines Retinoblastoms (Knudson and Strong, 1972).
Die starke Variabilitat von Tumoren und die damit verbundene zelluläre Heterogenität wird anhand zweier unterschiedlicher Modelle erklärt (Abbildung 3). Die von Nowell als „Klonale Evolution“ bezeichnete Theorie geht davon aus, dass es durch weitere genetische Veränderungen, wie beispielsweise durch das Einwirken wachstumsstimulierender, krebsfördernder Noxen (Promotoren), oder infolge der genetischen Instabilität bereits mutierter Zellen zur Entgleisung der zellulären Wachstumskontroll-Mechanismen und somit zu ungehemmtem, invasivem Zellwachstum (Progression) kommt (Nowell, 1976). Dabei kommt es durch Akkumulation und Selektion bestimmter Mutationsvarianten mit unterschiedlichen Eigenschaften zur Entstehung eines sehr heterogenen Tumorphänotyps.
Mittlerweile gewinnt jedoch die Tumor-Stammzell-Theorie immer mehr an Bedeutung (Cariati and Purushotham, 2008; Kakarala and Wicha, 2008). Sie geht davon aus, dass sich eine geringe Anzahl maligne transformierter, Tumor-initiierender Zellen mit Stammzelleigenschaften wie Selbsterneuerung sowie unbegrenztem Proliferations- und Differenzierungspotential aus normalen adulten Stammzellen entwickelt. Im Gegensatz zur Klonalen Evulotion besitzen nur die sogenannten Tumor-Stammzellen tumorigenes Potential, während die von ihnen hervorgebrachten differenzierteren Tumorzellen zwar die Masse des Tumors bilden, aber keine Selbsterneuerungseigenschaften mehr aufweisen. Dadurch entsteht eine aus unterschiedlichen Zelltypen aufgebaute hierarchische Struktur, die ebenfalls zur zellulären Heterogenität des Tumors führt. Die Entstehungsgeschichte der Tumor- Stammzellen ist noch nicht genau geklärt. Erste Hinweise liefern Untersuchungen, die gezeigt haben, dass durch Mutationen deregulierte Signalwege der Stammzell-Selbsterneuerung zu einer Reihe verschiedener Krebsarten führen (Al-Hajj et al., 2004; Lobo et al., 2007). Auch die Tatsache, dass leukämische Stammzellen die gleichen Oberflächenmarker wie hämatopoetische Stammzellen exprimieren, unterstützt die Theorie, dass sie von somatischen Stammzellen abstammen (Bonnet and Dick, 1997; Hope et al., 2004; Lapidot et al., 1994;
Miyamoto et al., 2000). Ein weiterer, überaus entscheidender Punkt ist die nachgewiesene Resistenz der Tumor-Stammzellen gegenüber vielen der gängigen Chemotherapeutika (Li et al., 2008; Soltysova et al., 2005). Dies erklärt das Auftreten von Rezidiven und Metastasen auch nach einem vermeintlichen Therapieerfolg und langen, krankheitsfreien Intervallen (Gupta et al., 2009).
Abbildung 3: Schematische Darstellung der beiden Karzinogenese-Modelle.
A: Der Tumor-Stammzell-Theorie nach werden adulte Stammzellen, die die Fähigkeit zur Selbsterneuerung (kreisförmiger Pfeil) besitzen oder auch Progenitorzellen (Vorläuferzellen) von Tumor-initiierenden Mutationen betroffen. Aus transformierten Stamm- oder Progenitorzellen gehen die Tumor-Stammzellen hervor, deren Zellpool infolge ihrer Fähigkeit zur Selbsterneuerung konstant bleibt, und die alle weiteren differenzierten Tumorzellen generieren. Dabei sind die differenzierten Tumorzellen und die Tumor-Stammzellen genetisch identisch (schwarzer Stern). Die Tumor- Stammzellen können auch weiter mutieren (hier nicht dargestellt). B: Im Modell der klonalen Evolution kann jede normale Körperzelle durch eine Mutation transformiert werden. Diese Tumorzelle kann zusätzliche Mutationen (schwarze Sterne) erwerben, wodurch neue Tumorzelllinien entstehen, aber auch noch Zellen ohne zusätzliche Mutation bestehen bleiben. Dieser Prozess kann sich im Laufe der Zeit mehrfach wiederholen. Dabei können die Tumorzellen auch neue Eigenschaften wie Dedifferenzierung oder die Fähigkeit zur Selbsterneuerung erwerben (kreisförmiger Pfeil). Die dominierende Tumorzellpopulation weist gegenüber anderen einen deutlichen Wachstumsvorteil auf.
(modifiziert nach Campbell and Polyak, 2007)
I.3.1. Entwicklung von Mammakarzinomen
Da sich Brustkrebs oft erst Jahrzehnte nach vorausgegangener onkogener Initiation manifestiert, ist davon auszugehen, dass durch den hormonell bedingten starken, zellulären Umbau in der Brustdrüse nur die langlebige Population der Stammzellen ausreichend Zeit hatte, die genetischen Veränderungen zu akkumulieren, die schließlich eine Krebsentstehung hervorrufen (Cobaleda et al., 2008) Der Tumor-Stammzell-Theorie nach ist die Proliferation im Tumor - ähnlich wie in dem sich ständig erneuernden Gewebe der Brustdrüse – hierarchisch organisiert (Charafe-Jauffret et al., 2009). Es gibt nur wenige, sich langsam teilende, Tumor-initiierende Tumor-Stammzellen (cancer stem cells, CSCs), jedoch viele, transient amplifizierende Zellen ohne tumorigenes Potential.
Der Ursprung des Mammakarzinoms wird durch eine Anhäufung genetischer Alterationen in den TDLEs erklärt, die histologisch zu atypischen duktalen Hyperplasien (ADHs) führen.
Einleitung 6
ADHs gelten als Vorläuferläsionen, die im Vergleich zur normalen Brustdrüse eine 4- bis 5- fach erhöhte Inzidenz für ein invasives Mammakarzinom aufweisen (Ryan and Coady, 1962;
Tavassoli and Norris, 1990). Durch Progression dieser atypischen Hyperplasien können in situ-Karzinome entstehen, die als Risikofaktoren für die Entwicklung eines invasiven Mammakarzinoms gelten (Fonseca et al., 1997; Simpson et al., 2005a; Simpson et al., 2005b).
Bei den nicht-invasiven Karzinomen bleibt die Entartung aufgrund der intakten Basalmembran innerhalb der Brustdrüsengänge (ductal carcinoma in situ, DCIS) oder der Drüsenläppchen (lobular carcinoma in situ, LCIS). In situ-Karzinome machen etwa 15-20 % aller Mammakarzinome aus. Bei den invasiven Formen wird die Basalmembran durchbrochen und der Tumor breitet sich auch im umgebenden Binde- und Fettgewebe aus. Diese Tumore treten mit 80-85 % am Häufigsten auf. Histogenetisch können duktale (70 %) und lobuläre Formen (10 %) unterschieden werden. Sonderformen, wie tubuläre, mucinöse oder medulläre Karzinomtypen stellen nur einen geringen Anteil (< 5 %) dar (Regierer and Possinger, 2005).
I.4. Mausmodelle
Zur Beantwortung grundlegender Fragen auf dem Gebiet der Mamma-Karzinogenese ist eine in vivo Analyse unumgänglich, da angenommen wird, dass Tumorprogression und Metastasierung im Wesentlichen durch Interaktion von Tumorzellen mit Komponenten der extrazellulären Matrix und Faktoren aus der Mikroumgebung des Tumors vorangetrieben werden (Sneddon and Werb, 2007). Reine Zellkulturversuche liefern zunächst nur Aussagen oder Anhaltspunkte über bestimmte mechanistische Zusammenhänge hinsichtlich bestimmter Parameter, wie z.B. der Zellproliferation, die jedoch im komplexen Umfeld eines Organismus überprüft werden müssen. Dies ist am Menschen aus experimentell-methodischen, vor allem aber aus ethischen Gründen nicht möglich. Aus diesem Grund wurden verschiedene (transgene) Mausmodelle entwickelt, an denen die unterschiedlichen Stadien der Tumorentstehung sowie die Mechanismen der Metastasierung studiert werden können.
Mäuse bieten den Vorteil, dass sie eine große genetische Ähnlichkeit zum Menschen aufweisen, was eine Übertragung der an der Maus gewonnenen Erkenntnisse auf den Menschen in vielen Fällen möglich macht. Des Weiteren können Mäuse aufgrund ihrer hohen Reproduktivität und ihrer geringen Körpergröße in großer Anzahl gezüchtet werden und liefern so in relativ kurzer Zeit aussagekräftige Daten. Ein weiterer Vorteil ist, dass Inzuchtmäuse - im Gegensatz zum Menschen - genetisch nahezu identisch sind. Daraus ergibt sich eine weitestgehend kontrollierbare Tumorprogression.
Um ein transgenes Mausmodell zu generieren, wird ein Transgen – meist ein bekanntes (Proto)-Onkogen – in das murine Genom eingefügt und unter die Kontrolle eines gewebsspezifischen Promotors gestellt. Es stehen sowohl verschiedene Promotoren als auch verschiedene Transgene zur Verfügung, um die Karzinogenese in der murinen Mamma zu initiieren (Tabelle 1).
Tabelle 1: Mamma-spezifische Promotoren
Promoter Herkunft Expression Aktivierung Referenz
MMTV- LTR
Mouse mammary tumor virus
Breast epithelial cells, several other tissues
Steroid hormones (Muller et al., 1988)
WAP Whey acidic protein Secretory mammary
epithelium
Lactogenic hormones (Hennighausen, 1990; Lipnik et al., 2005)
C3(1) Rat prostate steroid-binding protein (PSBP)
Epithelial cells of prostate and mammary gland
Estrogen (ductal and alveolar mammary epithelium)
(Green et al., 2000)
B-LG Bovine β-lactoglobulin Mammary gland Pregnancy and
lactation
(Ali and Clark, 1988;
Bortner and
Rosenberg, 1997)
MT Metallothionein Most mammary cells Zn2+ (Palmiter et al.,
1993)
(Fantozzi and Christofori, 2006)
I.5. Aufbau und Entwicklung der murinen Brustdrüse
Wie aus Abbildung 4 hervorgeht, besteht die Brustdrüse der Maus aus 10 paarig angelegten Brustdrüseneinheiten (Mammakomplexen). In der Nähe der Ohrspeicheldrüsen (Glandula parotis) liegen die zervikalen Brustdrüsenkomplexe (Nr. 1 und Nr. 10). Weiter kaudal befinden sich die thorakalen Brustdrüsen, welche durch den M. pectoralis nochmal unterteilt werden (Nr. 2/3 und Nr. 8/9). In der Abdomenregion befinden sich auf Höhe der Kniefalte die abdominalen Mammakomplexe (Nr. 4 und Nr. 7), welche die größten der fünf Brustdrüsenpaare darstellen. Die letzten beiden Paare liegen in der Leistenregion und werden als inguinale Brustdrüsen bezeichnet (Nr. 5 und Nr. 6).
Einleitung 8
Abbildung 4: Topographie der murinen Brustdrüsen in ventraler (A) und lateraler Ansicht (B).
Ventrale Ansicht (A): cervikale Mammae (1,10), durch den M.pectoralis unterteilte thorakale Mammae (2/3, 8/9), sowie abdominale (4,7) und inguinale Mammae (5,6)
Laterale Ansicht (B): Verlauf der linken cervikalen (1), thorakalen (2/3) und abdominalen (4) Brustrüse
Die Entwicklung der murinen Brustdrüse beginnt mit Einsetzen der Gonadotropinsekretion im Alter von drei Wochen. Wie in Abbildung 5 schematisch dargestellt ist, befindet sich zu diesem Zeitpunkt im Bereich der Mamma nur ein Fettkörper, in den rudimentäre Epithelzellen eingebettet sind. Undifferenzierte pluripotente Stammzellen („Cap-Zellen“) initiieren unter dem Einfluss von Östrogen die Bildung von kollateralen und terminalen Endknospen (terminal end buds, TEBs) und damit die Entwicklung des Milchgangsystems innerhalb des Brustdrüsenstromas (Welm et al., 2002). Das Ende der Wachstumsphase wird mit Erreichen der Grenze des Fettgewebes ausgelöst, wobei es zur Regression der terminalen Endknospen kommt. Im Alter von 10-12 Wochen wird der Brustdrüsenfettkörper vom Milchgangsystem baumartig durchzogen (Hennighausen and Robinson, 2005). Während der Trächtigkeit kommt es durch die Ausschüttung von Progesteron und Prolaktin zur gesteigerten Zellproliferation und zur Ausbildung von alveolären Knospen. Diese milchsezernierenden Einheiten verdrängen nun vermehrt das Brustdrüsenfettgewebe. Nach der Geburt der Jungen folgt eine etwa dreiwöchige Laktation. Mit Absetzen der Jungtiere kommt es durch eine verminderte Entleerung der Alveolen zur physiologischen Involution der Mamma. Durch verstärkte Apoptose-Inzidenz und einen lipomatösen Umbau durch Proteasen wird mit Abschluss der Rückbildung wieder ein postpubertärer Aufbau der Brustdrüse erreicht.
Histologisch ist der Aufbau von muriner und humaner Brustdrüse vergleichbar. Allerdings ist das Drüsengewebe der Maus nicht in einzelne Lobi unterteilt. Dadurch liegen die Milchgänge ungeordnet im Fettgewebe verteilt, während sie sich bei der humanen Mamma als Einheiten formieren und durch das umgebende Bindegewebe vom Fettgewebe separiert werden.
Abbildung 5: Schematische Darstellung der Entwicklung der murinen Brustdrüse.
In der Pubertät kommt es hormonbedingt zur Proliferation der terminalen Endknospen (terminal end buds, TEBs) und damit zum Auswachsen des Milchgangsystems. Der Fettkörper der Nullipara ist vollständig von verzweigten Milchgängen durchzogen. In der Trächtigkeit kommt es unter dem Progesteronanstieg zur Ausbildung alveolärer Knospen, die bis zur Geburt weiter differenzieren und schließlich in der Laktation die Milch sezernierenden Einheiten bilden. Mit der Involution nach dem Absetzen erlangt die Brustdrüse wieder einen postpubertären Nullipara-Status. (modifiziert nach Hennighausen und Robinson, 2005)
I.6. Das WAP-T Mausmodell
In der Abteilung Tumorvirologie des Heinrich-Pette-Instituts (HPI) wurden im Jahr 1997 transgene WAP-T- und WAP-T-NP-Mäuse mit C57BL/6xBALB/c F2 (CB6F2) Hintergrund entwickelt. Sie wurden anschließend in den BALB/c Hintergrund zurück gekreuzt, da der BALB/c-Inzuchtstamm genetisch eine Prädisposition für die Entwicklung von Mammakarzinomen trägt (Kuperwasser et al., 2000). Das induzierbare Mammakarzinom- Mausmodell trägt als Transgen die frühe Genregion des Simian Virus 40 (SV40) unter der Kontrolle des gewebsspezifischen, murinen WAP (whey acidic protein) –Promotors (Schulze- Garg et al., 2000). Dieser wird gegen Ende der Trächtigkeit und während der Laktation durch laktogene Hormone aktiviert (Abbildung 6) (Bayna and Rosen, 1990; Hennighausen et al., 1991).
Einleitung 10
Beim SV40 handelt es sich um ein nicht behülltes Polyomavirus mit doppelsträngiger DNA, dessen Genom in 2 Bereiche unterteilt werden kann. Die frühe Genregion kodiert für Proteine, die für die virale Replikation benötigt werden: das große Tumor-Antigen (T-Ag), das kleine T-Antigen (st oder t-Ag) und das 17 kDa (17 kT) Protein. Die späte Region kodiert für die viralen Strukturproteine (Modrow et al., 2010).
Durch die Onkoproteine der frühen Region werden nicht-permissive Zellen (Nagerzellen), in denen das Virus nicht replizieren kann, transformiert. In permissiven Zellen (z.B.
Affennierenzellen) kommt es hingegen zur Virusreplikation mit anschließender Freisetzung infektiöser Partikel durch die Lyse infizierter Zellen. Der transformierende Effekt von SV40 beruht auf der Bindung von T-Ag an die zellulären Proteine pRB, p53, p107, p130, CBP/p300 und RASSF1A (Ahuja et al., 2005; Zerrahn and Deppert, 1993). Durch die Komplexbildung mit T-Ag werden die Tumorsuppressoren pRB und p53 funktionell inaktiviert, was zu einem p53/pRB-Null-Status der Zelle führt (Sheng et al., 2000). Die Folge ist eine Blockade der Apoptose bzw. des Zellzyklus-Arrests und ein Eintritt in die S-Phase des Zellzyklus, was letztlich zu einer gesteigerten Zellproliferation führt. Die zwei weiteren Proteine der frühen Region (st und 17 kT) besitzen ebenfalls transformationsfördernden Eigenschaften (Rundell and Parakati, 2001).
Die Inaktivierung von Tumorsuppressorproteinen kann auch bei vielen humanen Mammakarzinomen in Form von Mutationen in den entsprechenden Genen nachgewiesen werden (Silva et al., 2003).
Abbildung 6: Schematische Darstellung der Induktion des WAP-T-Mausmodells.
Durch laktogene Hormone kommt es gegen Ende der Trächtigkeit und in der Laktation zur Aktivierung des gewebsspezifischen WAP-Promotors und damit zur Transkription der „frühen“
Region von SV40, was schließlich zur Expression des Transgens (T-Ag) in den Epithelzellen der Mammae führt.
I.6.1. Tumorgenese in WAP-T-Mäusen
Im WAP-T-Mausmodell wird die Tumorgenese durch die Verpaarung mit Einsetzen der Trächtigkeit induziert. Der WAP-Promotor wird gegen Ende der Trächtigkeit (Tag 12-13) und während der Laktation durch laktogene Hormone wie Östrogen und Prolaktin aktiviert.
Allerdings können auch Hydrocortison und Insulin den WAP-Promotor aktivieren (Bayna and Rosen, 1990; Hennighausen et al., 1991). In den Milch-sezernierenden Epithelzellen der Mamma kommt es während der gesamten Laktation zu einer starken Expression des Transgens (Pittius et al., 1988), welche jedoch mit der physiologischen Involution der Brustdrüse bis auf einige wenige Zellen wieder komplett zurückgeht. Nach dem Ende der Säugeperiode kommt es histologisch zu ersten Dysplasien und Hyperplasien, die in der Immunhistochemie deutlich T-Ag-positiv sind. Diese entwickeln sich weiter zu intraepithelialen Neoplasien der Mamma (mammary intraepithelial neoplasia, MINs), die den humanen duktalen in situ-Karzinomen (duktal carcinoma in situ, DCIS) entsprechen (Jannasch et al., 2009). Die MINs ähneln mit ihren unterschiedlichen morphologischen Subtypen denen humaner DCIS, weshalb die WAP-T Mäuse ein ausgezeichnetes Modell zur Erforschung des humanen Brustkrebs darstellen (Schulze-Garg et al., 2000). Mit einer durchschnittlichen Latenz von 5-9 Monaten nach Induktion entwickeln sich aus diesen MINs multifokal Tumore.
Da es erst mit der Trächtigkeit zu einer massiven Expression des Transgens kommt, durchlaufen WAP-T-Mäuse bis zu diesem Zeitpunkt eine normale Entwicklung, die mit der einer wt (Wildtyp) BALB/c-Maus vergleichbar ist.
I.6.2. WAP-T-NP8-Mäuse
Die Immunogenität von SV40 wurde bereits ausgiebig an unterschiedlichen Mausstämmen untersucht. Im Gegensatz zu C57BL/6-Mäusen zeigen BALB/c-Mäuse gegenüber SV40 induzierten Tumoren keine bzw. nur eine schwache spezifische Immunantwort durch zytotoxische T-Zellen (cytotoxic T lymphocytes, CTLs) (Pfizenmaier et al., 1980;
Schirmbeck et al., 1993; Zerrahn et al., 1996). Da in vielen humanen Tumorarten ebenfalls keine oder nur eine sehr schwache CTL-Antwort nachweisbar ist, stellt die Immunantwort gegenüber SV40 T-Ag in BALB/c-Mäusen ein ausgezeichnetes Modell-System dar, das die humane Situation äußerst gut reflektiert.
Um jedoch den Einfluss einer Immunantwort auf die Entstehung von Mammakarzinomen besser analysieren zu können, wurde zusätzlich zu den schwach immunologisch reagierenden WAP-T-Mäusen noch eine weitere transgene Mauslinie etabliert, die WAP-T-NP8-Mauslinie.
Einleitung 12
Wie in Abbildung 7 dargestellt ist, wurde ein 33 bp umfassendes Oligomer, welches für das MHC-1-restringierte T-Zell-Epitop des Lymphozytären Choriomeningitis Virus (LCMV) kodiert, in den C-Terminus der frühen Region von SV40 eingefügt. Dieses Epitop (NP- Epitop) stammt aus dem Nukleoprotein (NP) des LCM Virus (Schulze-Garg et al., 2000) und induziert in BALB/c-Mäusen eine starke, CTL-dominierte Immunantwort (Frelinger et al., 1983; Orn et al., 1982; Schulz et al., 1989). Durch die Insertion des NP-Epitops sollte mit Expression des Transgens im Gegensatz zu den ausschließlich T-Ag-exprimierenden WAP-T- Mäusen, eine Immunantwort induziert werden. Ein Vergleich von induzierten WAP-T- und WAP-T-NP-Mäusen sollte so die Analyse der Immunantwort gegenüber schwach (SV40 T- Ag) und stark immunogenen (LCMV NP-Epitop) T-Zell-Epitopen von BALB/c-Mäusen ermöglichen.
Abbildung 7: Schematische Darstellung der Insertion des MHC-1 (H-2d)-restringierten NP- Epitops von LCMV.
Das aus 33 bp bestehende Oligomer wurde in die für den C-Terminus des SV40 T-Ag kodierende Region des Transgens eingefügt. Das NP-Epitop stellt ein dominantes T-Zell-Epitop für Mäuse mit BALB/c-Hintergrund dar.
I.6.2.1. Immunologische Kompetenz transgener WAP-T-NP8-Mäuse
Wie bereits erwähnt, stellt T-Ag für Mäuse mit BALB/c-Hintergrund hinsichtlich der zellulären Immunantwort nur ein sehr schwaches Tumorantigen (Immunogen) dar. Durch eine Immunisierung mit T-Ag oder einer T-Ag-exprimierenden Vacciniavirus-Rekombinante sind BALB/c-Mäuse allerdings in der Lage, eine schützende Immunantwort gegen SV40- transformierte mKSA-Tumorzellen auszubilden (Lowe et al., 2010a; Lowe et al., 2010b;
Utermohlen et al., 2001). Im Gegensatz dazu erzeugt eine SV40 T-Ag-Immunisierung transgener, nicht induzierter (unverpaarter) WAP-T-NP8-Mäuse keinen protektiven Schutz vor T-Ag-exprimierenden mKSA-Tumorzellen (Daten: Dr. Michael Bruns und Dr. Olaf Utermöhlen, unveröffentlicht). In diesen Tieren wird T-Ag offensichtlich als körpereigen („selbst“) toleriert.
Um zu überprüfen, ob das NP-Epitop ebenfalls vom Immunsystem als „selbst“ toleriert wird, wurden die CTLs von zuvor LCMV-infizierten, unverpaarten WAP-T-NP8-, WAP-T-, wt BALB/c-Mäusen sowie von einmal induzierten WAP-T-NP8-Mäusen (4 Monate nach Laktation) hinsichtlich ihrer Lysefähigkeit LCMV-infizierter Zielzellen untersucht.
Erstaunlicherweise gab es keinen signifikanten Unterschied der T-Zell-Aktivität zwischen nicht induzierten transgenen Mäusen und BALB/c-Mäusen. Die CTL-Effizienz von bereits induzierten WAP-T-NP8-Mäusen war allerdings etwa um ein Drittel reduziert (Daten: Dr.
Olaf Utermöhlen, unveröffentlicht). Diese Ergebnisse machen deutlich, dass das ins Transgen integrierte NP-Epitop im Gegensatz zu SV40 T-Ag offensichtlich kein Tolerogen für die transgenen Mäuse darstellt.
I.7. Tumorimmunologie
Für den Erhalt eines Organismus ist ein dynamisches Gleichgewicht zwischen Zelltod und Zellerneuerung von existentieller Bedeutung. Während die Zellzykluskontrolle durch p53 und pRB ein Entstehen von Tumorzellen verhindern kann, übt das Immunsystem eine Wächterfunktion aus, indem es - unter bestimmten Voraussetzungen - bereits entstandene Tumorzellen eliminieren kann.
Zu Beginn des letzten Jahrhunderts wurde von Ehrlich die Theorie der „Immune Surveillance“ (Immunüberwachung) aufgestellt. Er behauptete, dass im Körper regelmäßig
entartete Zellen entstehen, die jedoch vom Immunsystem erkannt und eliminiert werden, noch bevor sie klinisch in Erscheinung treten (Ehrlich, 1909). Etwa fünf Jahrzehnte später wurde durch Burnet und Thomas die Existenz von Tumor-assoziierten Antigenen (TAAs) postuliert (Burnet, 1957; Lawrence, 1959). Begründet wurde diese Annahme durch Transplantationsversuche, bei denen es zur immunvermittelten Abstoßung der transplantierten Tumore kam (Dunn et al., 2004). Dabei sind vor allem T-Zellen die entscheidende Zellpopulation für die Vermittlung einer anti-Tumor-Immunantwort (Melief, 1992). Als klinischer Beweis der Immune Surveillance-Theorie werden Tumor-infiltrierende Lymphozyten (TILs) in Tumoren von Krebspatienten angesehen. Mehrere Studien belegen, dass eine hochgradige Infiltration von CD 8-positiven T-Zellen innerhalb von Tumorzellarealen mit einer günstigeren Prognose und einer besseren Überlebensrate korrelieren, als andere unabhängige Prognosefaktoren (Naito et al., 1998; Sato et al., 2005;
Yasunaga et al., 2000; Yoshimoto et al., 1993).
Durch die maligne Transformation einer Körperzelle in eine Krebszelle, kommt es auch zur Präsentation veränderter Genprodukte über das MHC-1 Molekül auf der Zelloberfläche aller
Einleitung 14
kernhaltigen Körperzellen. Handelt es sich bei diesen Tumorantigenen um körperfremde Proteine, werden sie als Tumor-spezifische Antigene (TSAs) bezeichnet. Andere von Tumorzellen exprimierte Antigene kommen physiologisch nur während der Embryonalentwicklung vor (Alpha-1 Fetoprotein, AFP; Carcino-Embryonales Antigen, CEA) oder es kommt zu einer Überexpression körpereigener Proteine (human epidermal growth factor receptor, HER2/neu). Die beiden letztgenannten Beispiele werden unter dem Begriff Tumor-assoziierten Antigene (TAAs) zusammengefasst. Während TSAs, sofern sie in ausreichender Zahl präsentiert werden, vom Immunsystem als fremd erkannt und eliminiert werden können, bleibt bei den TAAs eine Immunantwort häufig aus, da es sich um körpereigene Proteine handelt. Es konnte allerdings gezeigt werden, dass eine sehr hohe Antigendichte das Erkennen der TAAs durch spezifische T-Zellen bewirken kann (Guckel et al., 2006; Rosenberg, 1999).
Die Erkennung von Tumorzellen durch das Immunsystem ist demnach eine entscheidende Voraussetzung für deren Elimination. Die hohe Proliferations- und Mutationsrate verschafft entarteten Zellen jedoch einen evolutionären Vorteil. Durch den Selektionsdruck des Immunsystems werden immer neue Tumorzell-Varianten hervorgebracht, die von Immunzellen unerkannt bleiben und dadurch weiter proliferieren können. Aus diesem Grund wurde zu Beginn des 21. Jahrhunderts die Theorie der „Immune Surveillance“ um den Begriff
„Immunoediting“ erweitert (Dunn et al., 2002; Shankaran et al., 2001). Es wird von einem 3- stufigen Prozess, bestehend aus Elimination, Equilibrum und Escape ausgegangen. Am Anfang der Tumorentstehung kann es durch die Immunüberwachung noch zu einer Elimination entarteter Zellen kommen. Durch die Entfernung potentiell schädlicher Zellen setzt das Immunsystem jedoch gleichzeitig einen Selektionsprozess in Gang, der das Überleben nicht immunogener Krebszellen sichert. Dadurch kann es vorübergehend zu einem Gleichgewicht zwischen neu entstandenen und bereits beseitigten Tumorzell-Varianten kommen. In der letzten Phase gewinnen die vom Immunsystem unerkannten Escape- Varianten die Oberhand und manifestieren sich zu einem Tumor.
Es gibt eine Reihe von Strategien seitens der Tumorzellen, um einem Angriff durch das Immunsystem zu entkommen:
- Unzureichende Expression oder Verlust von MHC-1 Molekülen (Algarra et al., 2004;
Cohen and Kim, 1994)
- Verlust von Tumorantigenen („Antigen-Shedding“) (Black, 1980)
- Sekretion löslicher, immunsuppressiver Faktoren durch Tumorzellen (TGF-beta, IL- 10, Prostaglandin E2) (Beck et al., 2001; Urosevic and Dummer, 2003)
- Defekte in der Signaltransduktion von Effektorzellen (Verlust des CD 3-Moleküls von TILs, Veränderung des TZR) (von Bernstorff et al., 2001)
- Hemmung der T-Zell-Aktivierung durch CD4+/CD25+/FOXP3+ regulatorische T- Zellen (Treg) (Ghiringhelli et al., 2005; Ichihara et al., 2003)
- Anergie/Apoptose von T-Zellen durch Expression inhibitorischer Kostimulationsmoleküle auf Tumorzellen (CTLA-4 und PD-L1) (Blank and Mackensen, 2007; Kwon et al., 1997; Schoop et al., 2004)
Diese sogenannten Tumor- oder Immune Escape-Mechanismen sind für die Krebsforschung von besonderem Interesse, da sie mögliche Ansätze für neue Therapieformen bieten. Die Tumor-assoziierte PD-L1-Expression konnte bereits bei einigen humanen Tumoren nachgewiesen (Ghebeh et al., 2006; Inman et al., 2007; Nakanishi et al., 2007; Nomi et al., 2007; Ohigashi et al., 2005) und teilweise auch mit einer schlechteren Prognose assoziiert werden (Gao et al., 2009; Ohigashi et al., 2005; Thompson et al., 2005; Thompson et al., 2004).
I.7.1. Physiologische Bedeutung des PD-L1/PD-1-Signalweges
Die physiologische Bedeutung des PD-L1/PD-1-Signalweges ist die Induktion und Aufrechterhaltung der peripheren T-Zell-Toleranz zum Schutz des Gewebes vor autoreaktiven T-Zellen bzw. zu starker immunvermittelter Gewebeschädigung. Sie resultiert aus einer Hemmung der T-Zell-Aktivierung infolge negativer Kostimulation. Anhand von PD-1-knock out-Mäusen konnte von unterschiedlichen Gruppen gezeigt werden, dass ein Fehlen des PD- 1-Rezeptors zu schweren Autoimmunerkrankungen, wie Glomerulonephritis, Arthritis oder dilatativer Kardiomyopathie führte (Nishimura et al., 1999; Okazaki et al., 2003). Somit stellt die Expression von PD-1 auf potentiell selbst-reaktiven T-Zellen nach der negativen Selektion im Thymus einen weiteren Schutzmechanismus vor Autoimmunität dar. In NOD (non-obese diabetic)-Mäusen, die zur Erforschung des immunvermittelten Typ1 Diabetes dienen, kam es nach Behandlung mit PD-L1-blockierenden Antikörpern zu einer deutlich beschleunigten Manifestation der Erkrankung (Ansari et al., 2003). Eine wichtige Rolle spielt die Expression von PD-L1 für die feto-maternale Toleranz. Da ein Fetus auch immer fremde, paternale Antigene exprimiert, kann die Schwangerschaft als eine Art physiologisches Modell für die Tolerierung einer Transplantation angesehen werden. Im knockout-Mausmodell äußerte sich das Fehlen von PD-L1 in einem beträchtlichen Anstieg spontaner fetaler Resorptionen und verminderten Überlebensraten der Feten sowie einer erhöhten T-Zell-Infiltration der Plazenta (Guleria et al., 2005). Auch bei der Entstehung humaner Autoimmunerkrankungen, wie dem
Einleitung 16
Systemischen Lupus Erythematosus (SLE) und der Multiplen Sklerose (MS) spielt der PD- L1/PD-1-Signalweg eine entscheidende Rolle (Mozaffarian et al., 2008; Trabattoni et al., 2009)
I.7.2. PD-L1-Expression auf chronisch-infizierten Zellen und Tumorzellen Am Modell der chronischen LCMV-Infektion wurde die PD-L1/PD-1-Interaktion erstmalig als immunmodulatorischer Signalweg beschrieben. Barber und Kollegen konnten zeigen, dass sich virusspezifische T-Zellen durch die Expression hoher Mengen an PD-1 in einem Zustand der Erschöpfung („exhaustion“) befanden. Eine Blockade der PD-L1/PD-1-Interaktion durch monoklonale Antikörper konnte die Funktion der T-Zellen wieder herstellen und zu einer signifikanten Virusreduktion führen (Abbildung 8) (Barber et al., 2006). Dieser Mechanismus konnte inzwischen auch für andere humane, chronische Viruserkrankungen (HIV, HBV, HCV) nachgewiesen werden (Blackburn et al., 2010; Martinic and von Herrath, 2008).
Abbildung 8: Therapheutischer Effekt der Behandlung einer chronischen LCMV-Infektion mit PD-L1-spezifischen Antikörpern.
Bei einer chronischen Infektion exprimieren LCMV-spezifische CD8+ T-Zellen neben dem T-Zell- Rezeptor den negativen Kostimulator PD-1. Eine Bindung mit seinem Liganden PD-L1, der auf chronisch LCMV-infizierten Zellen exprimiert wird, führt zu einer Hemmung der CD8+ T-Zellen.
Durch die Behandlung mit einem blockierenden Antikörper gegen PD-L1 zeigen die CD8+ T-Zellen eine gesteigerte Proliferation sowie eine vermehrte Sekretion von Interferon-γ und Tumornekrosefaktor-α. Dies führt zu einer gesteigerten Zytotoxizität und zu einer Reduktion der LCMV-Virustiter. (modifiziert nach Shin and Rehermann, 2006)
In der Onkologie wurde die Expression von PD-L1 für eine ganze Reihe humaner Tumore beschrieben. So konnte in Melanomen sowie in Karzinomen von Lunge, Eierstöcken und Dickdarm das PD-L1-Protein immunhistochemisch nachgewiesen werden, während die
parallel analysierten Normalgewebe PD-L1-negativ waren (Dong et al., 2002). Bei verschiedenen Krebsarten (Speiseröhren- (Ohigashi et al., 2005), Nieren- (Thompson et al., 2004), Blasen- (Inman et al., 2007; Nakanishi et al., 2007), Bauchspeicheldrüsen- (Nomi et al., 2007), und Brustkrebs (Ghebeh et al., 2006)) korrelierte die Tumor-assoziierte PD-L1- Expression mit einer schlechteren Prognose. Auch auf diversen humanen Tumorzelllinien von Lungen-, Darm-, Plazenta-, Haut-, und Gehirntumoren konnte eine Oberflächenexpression von PD-L1 festgestellt werden (Blank et al., 2004; Dong et al., 2002; Latchman et al., 2001;
Wintterle et al., 2003). Bei vielen murinen und humanen Tumorzelllinien, die PD-L1 nicht konstitutiv exprimieren, kommt es, ähnlich wie bei Endothelzellen, durch Stimulation mit Interferon-gamma zu einer verstärkten Expression von PD-L1 (Blank et al., 2004; Dong et al., 2002). In der Zellkultur, wie auch im Mausmodell konnte gezeigt werden, dass PD-L1- exprimierende Tumorzellen weniger effektiv von Antigen-spezifischen CTLs lysiert wurden als Tumorzellen, die PDL1-negativ waren (Iwai et al., 2002). Durch die Blockade mit anti- PD-L1-Antikörpern konnte in unterschiedlichen Experimenten eine deutliche Leistungssteigerung der CTLs hinsichtlich der Lyse von Tumorzellen beobachtet werden (Blank et al., 2006; Dong et al., 2002).
Problemstellung 18
II. Problemstellung
Brustkrebs stellt mit ca. 57.000 Neuerkrankungen pro Jahr allein in Deutschland die häufigste Krebserkrankung der Frau dar. Trotz Früherkennung und Therapie starben im Jahr 2003 noch immer 17.173 Betroffene an dieser Krebserkrankung. Das entspricht 17 % der durch Krebs verursachten Todesfälle bei Frauen (Huber et al., 2008; Robert-Koch-Instiut, 2010). Diese Zahlen machen deutlich, wie wichtig neben Prävention und Früherkennung eine Verbesserung der Therapiemöglichkeiten ist. Ein besseres Verständnis der molekularbiologischen Vielfältigkeit von Tumoren sowie der Komplexität des Immunsystems sind daher neben der Identifizierung neuer, Tumor-assoziierter Zielstrukturen für die Entwicklung gezielterer, immuntherapeutischer Behandlungsverfahren äußerst wichtig.
Die Mammakarzinome des WAP-T-Mausmodells werden durch die transformierenden Eigenschaften des Transgens (SV40 T-Ag) induziert. Bei der WAP-T-NP8-Mauslinie wurde zusätzlich im C-Terminus des SV40 T-Ag das NP-Epitop des Lymphozytären Choriomeningitis Virus (LCMV) inseriert. Die Mammatumoren der transgenen Mäuse besitzen histologisch große Ähnlichkeit zu humanen Brustkrebs-Läsionen und stellen somit ein geeignetes Modell zur Analysen von Tumorprogression und Immunantwort zu verschiedenen Zeitpunkten der Tumorgenese dar (Heinlein et al., 2008; Schulze-Garg et al., 2000).
Obwohl die WAP-T-NP8-Mäuse tolerant gegenüber T-Ag sind, scheinen sie jedoch gegenüber dem NP-Epitop nicht tolerant zu sein, da sie nach einer akuten LCMV-Infektion ebenso wie wt BALB/c-Mäuse eine Virus-eliminierenden CTL-Antwort ausbilden können.
Nach Induktion (Verpaarung) entwickeln diese Mäuse mit einer Latenz von 4-6 Monaten allerdings genauso wie die WAP-T-Mäuse (kein NP-Epitop) multifokal Mammakarzinome.
Warum es bei der WAP-T-NP8-Mauslinie nicht zu einer CTL-vermittelten Lyse der T-Ag- und NP-exprimierenden Tumorzellen und damit zu einer deutlich verminderten Tumorinzidenz kommt, ist unklar.
In der vorliegenden Arbeit sollte daher durch Transplantationsexperimente die Immunogenität von H8N8-Mammakarzinomzellen (Expression von T-Ag- und NP-Epitop) vergleichend in WAP-T-NP8-, wt BALB/c- und CD8-depletierten BALB/c-Mäusen untersucht und so die T- Zell-Antwort und die damit verbundene Immunkompetenz der verschiedenen Versuchsgruppen analysiert werden.
Ein weiterer Schwerpunkt lag in der Analyse der Expression des T-Zell-inhibitorischen Oberflächenmoleküls PD-L1. Da der PD-L1/PD-1-Signalweg erstmals bei der chronischen LCMV-Infektion als sogenannter Immune Escape-Mechanismus nachgewiesen (Barber et al., 2006), und seitdem sowohl für viele humane, chronische Viruserkrankungen (HIV, HBV, HCV) (Blackburn et al., 2010; Martinic and von Herrath, 2008) als auch für humane Krebsarten beschrieben wurde (Ghebeh et al., 2006; Inman et al., 2007; Nakanishi et al., 2007; Nomi et al., 2007; Ohigashi et al., 2005), bestand der Verdacht, dass die antitumorale CTL-Antwort möglicherweise durch eine Tumorzell-assoziierte PD-L1-Expression inhibiert wird. Daher sollten sowohl die aus WAP-T-NP8- bzw. WAP-T-Tumoren etablierten Mammakarzinomzellen (H8N8- und G-2-Zellen) in vitro, als auch durch Transplantation induzierte sowie endogen entstandene WAP-T-NP8-Mammakarzinome auf die Expression von PD-L1 analysiert werden.
Zusätzlich sollte der Einfluss des Differenzierungsgrades endogener WAP-T-NP8- Mammakarzinome auf die Expression von PD-L1 näher untersucht und die PD-L1-positiven Zellen innerhalb des Tumors durch den Einsatz unterschiedlicher Marker genauer charakterisiert werden.
Material 20
III. Material
III.1. Biologisches Material
III.1.1. Mauslinien III.1.1.1. BALB/c-Mäuse
Die in dieser Arbeit verwendeten BALB/c-Tiere stammen aus der Zucht des HPI-Mausstalls.
Der BALB/c-Inzucht-Stamm trägt eine genetische Disposition zur spontanen Entwicklung von Mammakarzinomen.
III.1.1.2. WAP-T-NP8-Mäuse
Die transgenen WAP-T- und WAP-T-NP8-Mäuse wurden im Jahr 1997 in der Abteilung Tumorvirologie des HPI entwickelt (Schulze-Garg et al., 2000). Beide Mauslinien wurden in den BALB/c-Hintergrund gekreuzt und tragen als Transgen im Anschluss an den murinen WAP-Promotor die frühe Genregion von SV40. Während induzierte WAP-T-Mäuse ausschließlich das T-Ag exprimieren, kommt es bei den WAP-T-NP8-Tieren zusätzlich zur Expression des NP-Epitops des Lymphozytären Choriomeningitis Virus, welches in den C- Terminus der frühen SV40-Genregion inseriert wurde. Des Weiteren unterscheiden sich die beiden Mauslinien aufgrund ihrer Anzahl an Kopien des Transgens, die an unterschiedlichen Stellen im Genom der Tiere integriert sind. Dies äußert sich vor allem in einer unterschiedlichen Anzahl T-Ag-exprimierender Epithelzellen nach Induktion der Mäuse.
Dabei ist die T-Ag-Expression in den WAP-T-Mäusen gegenüber den WAP-T-NP8-Tieren etwa doppelt so stark/häufig.
III.1.2. Zelllinien
G-2-Zellen: Mammakarzinom-Zelllinie, die aus einem undifferenzierten G3-Tumor einer WAP-H22 x WAP-T1 bi-transgenen BALB/c-Maus etabliert wurde. Diese Mauslinie trägt zusätzlich zur frühen Region von SV40 (T-Ag) ein mutiertes p53-Gen (mutp53R270H), das ebenfalls unter der Kontrolle des WAP-Promotors steht (Heinlein et al., 2008).
H8N8-Zellen: Mammakarzinom-Zelllinie, die aus einem undifferenzierten G3-Tumor einer WAP-H8 x WAP-T-NP8 bi-transgenen BALB/c-Maus etabliert wurde. Auch diese Mauslinie trägt zusätzlich zur frühen Genregion von SV40 und dem im C-Terminus inserierten NP- Epitop ein mutiertes p53-Gen (mutp53R270H) unter der Kontrolle des WAP-Promotors.
III.2. Molekularbiologisches Material
III.2.1. Oligonukleotide
III.2.1.1. Oligonukleotide für die Standard-PCR
Name Sequenz Richtung Bindestelle Tm Amplikon Anwendung
Aktin-N CGAGCAGGAGATGGCCACTGC sense Aktin 68,4°C
507 bp Positivkontrolle Standard-PCR Aktin-H GTGAGCTCTCTGGGTGCTGGG antisense Aktin 65,4°C
NP-Epitop CAGAAGCTTGAGGCCTAGGAT sense SV 40 T-Ag
(Pos. 1419) 58,6°C 323 bp
Nachweis des inserierten NP- Epitops NP-Epitop-
STOP GTACAGACCTGTGGCTGAGTT antisense NP-Epitop
(Pos. 1741) 55,3°C
III.2.1.2. Oligonukleotide für die qRT-PCR
Name Spezies Sequenz Richtung Bindestelle Tm Amplikon
NH-GAPDH-1 Maus GGTGAAGGTCGGTGTGAAC sense Exon 2 (Pos. 53) 57,3°C 238 bp NH-GAPDH-2 Maus GGGGTCTCGCTCCTGGAA antisense Exon 3 (Pos. 290) 61,7°C PD-L1-Q1for Maus CCACGGTCCTCCTCTTCTTGA sense Exon 6 (Pos. 827) 62,4°C 158 bp PD-L1-Q1rev Maus ACAGACCACAAGCTGCCAATC antisense Exon 7 (Pos. 984) 61,1°C Rplp1-Q1 Maus CTCGCTTGCATCTACTCCGC sense Pos. 19-38 63.0°C 109 bp Rplp1-Q2 Maus AGAAAGGTTCGACGCTGACAC antisense Pos. 127-107 62.6°C SV40LTag-Q1 Maus TCCTGGCTGTCTTCATCATC sense Pos. 1598 57,1°C 179 bp SV40LTag -Q2 Maus AGAAAGGTTCGACGCTGACAC antisense Pos. 1420 54,2°C Sca1-Q1 Maus AGGAGGCAGCAGTTATTGTGG sense Pos. 167-187 62.1°C 114 bp Sca1-Q2 Maus CGTTGACCTTAGTACCCAGGA antisense Pos. 280-260 60.6°C
Material 22
III.2.2. Normalseren
Esel-Normalserum: Dianova, Hamburg Ziegen-Normalserum: Dianova, Hamburg
Kaninchen-Normalserum: Jackson Immuno Research, USA
III.2.3. Antikörper
III.2.3.1. Primäre Antikörper
Name Klon Spezies Hersteller
Cytokeratin 14 polyklonal Kaninchen Covance, München, DE
Cytokeratin 8/18 polyklonal Meerschweinchen Acris, Herford, DE
R15 (anti SDS-T) polyklonal Kaninchen (Deppert and Pates
1979)
Sca1 (Ly6A/E) Klon D7 Ratte BioLegend / Biozol,
Eching, DE
MAC-3 (CD107b) M3/84 Ratte Ab D Serotec,
Düsseldorf, DE
CD 3 polyklonal Kaninchen Abcam, Cambridge, GB
CD 3 polyklonal Kaninchen Dako, Hamburg, DE
PD-L1 (B7-H1) polyklonal Ziege R&D, Wiesbaden-
Nordenstadt, DE
CD 8 (YTS169.4) monoklonal Ratte (Moskophidis et al.,
1990)
III.2.3.2. Konjugierte Antikörper (FACS)
Name Klon Spezies Konjugat Hersteller
PD-L1 (B7-H1) polyklonal Ziege Allophycocyanin (APC)
R&D Systems,Wiesbaden- Nordenstadt, DE
Sca-1 (Ly-6A/E) D7 Ratte Alexa647 BioLegend / Biozol,
Eching, DE
EpCAM (CD326) IgG2a,k Ratte FITC BioLegend / Biozol,
Eching, DE
III.2.3.3. Sekundäre Antikörper (IHC)
Name Reaktivität Konjugat Hersteller
Histofine Simple Stain anti-Kaninchen Alkalische Phosphatase Nichirei, Amsterdam, NL Histofine Simple Stain anti-Ziege Peroxidase Nichirei, Amsterdam, NL Histofine Simple Stain anti-Kaninchen Peroxidase Nichirei, Amsterdam, NL Vectastain Elite ABC Kit Biotin Avidin-Biotin-Complex
(ABC)
Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA
III.2.3.4. Sekundäre Antikörper (IF)
Spezies Reaktivität Konjugat Pre-Adsorption Hersteller
Esel IgG (H+L) anti-Ratte Alexa 488 Bo,Ck,Go,Gp,Hs,Ho,Hu,Rb,Rt,Sh Invitrogen, Karlsruhe, DE Esel IgG (H+L) anti-Ratte DyLight 549 Hu,Rb,Bo,Go,Sh,Ho,Gp,Ck,Hs Invitrogen, Karlsruhe, DE Ziege IgG (H+L) anti-Kaninchen Alexa 488 Bo,Go,Hu,Ms,Rt Invitrogen, Karlsruhe, DE Ziege IgG (H+L) anti-Kaninchen Alexa 555 Bo,Go,Hu,Ms,Rt Invitrogen, Karlsruhe, DE Esel IgG (H+L) anti-Kaninchen Alexa 488 Hu,Ms,Rt,Bo,Go,Sh,Ho,Gp,Ck,Hs Invitrogen, Karlsruhe, DE Esel IgG (H+L) anti-Ziege Alexa 488 Rb, Rt, Ms, Hu Invitrogen, Karlsruhe, DE Esel IgG (H+L) anti-Ziege Alexa 555 Rb, Rt, Ms, Hu Invitrogen, Karlsruhe, DE
III.2.4. Fluoreszenzfarbstoffe für DNA
Name Hersteller
DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindol) Sigma Aldrich, Taufenkirchen, DE
DRAQ5™ Biostatus, Shepshed, GB
III.2.5. Enzyme
Enzyme Hersteller
Taq DNA-Polymerase 5 Prime, Hamburg, DE
Trypsin (1:250) 2,5 % (w/v) Biochrom AG, Berlin, DE
III.2.6. Größenstandards
Name Hersteller
Gene Ruler™ 1 kbp DNA-Leiter Fermentas, St. Leon-Rot, DE
Material 24
III.3. Chemikalien und Materialien
III.3.1. Chemikalien
Alle Chemikalien, die nicht in der folgenden Liste aufgeführt sind, wurden von den handelsüblichen Firmen Roche (Mannheim, DE), Fluka (Neu-Ulm, DE), Merck (Darmstadt, DE), Serva (Heidelberg, DE) und Sigma-Aldrich (München, DE) bezogen.
Chemikalie Hersteller
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich, München, DE
2-Propanol Merck, Darmstadt, DE
Agarose RNase-frei (RNA-Gele) Sigma-Aldrich, München, DE Agarose SeaKem® LE (DNA-Gele) Lonza, Köln, DE
Bromphenolblau Serva, Heidelberg, DE
BSA Sigma-Aldrich, München, DE
Chlorophorm Merck, Darmstadt, DE
Citrat Plus Puffer DCS, Hamburg, DE
DMSO Sigma-Aldrich, München, DE
EDTA Sigma-Aldrich, München, DE
EGTA Sigma-Aldrich, München, DE
Eosin Y Solution Sigma-Aldrich, München, DE
Ethanol Merck, Darmstadt, DE
Ethidiumbromid Roche, Mannheim, DE
Eukitt Kindler, Freiburg, DE
FCS PAA, Pasching,Österreich
Formaldehydlösung min. 37% säurefrei Merck, Darmstadt, DE
Glycerol Serva, Heidelberg, DE
Glycin Serva, Heidelberg, DE
Levamisol DakoCytomation, Glostrup, DK
Matrigel BD Biosciences, Heidelberg, DE
Mayers Hämalaunlösung Merck, Darmstadt, DE
Mowiol® 4-88 Reagent Merck, Darmstadt, DE
Ottix Plus DiaPath, Hannover, DE
Ottix Shaper DiaPath, Hannover, DE
Paraffin Typ 3 (Automat) Richard-Allan Scientific, Kalamazoo MI, USA Paraffin Typ 6 (Gießstation) Richard-Allan Scientific, Kalamazoo MI, USA
peqGOLD Trifast™ Peqlab, Erlangen, DE
Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1) Biomol, Hamburg, DE
Quantum-Medium Invitrogen, Frankfurt, DE
Salzsäure 37% Merck, Darmstadt, DE
SDS Serva, Heidelberg, DE
Shandon Cryomatrix™ Thermo Scientific, Langenselbold, DE
Triton X-100 Sigma-Aldrich, München, DE
Trizma Base (Tris) Sigma-Aldrich, München, DE
Trypanblau Sigma-Aldrich, München, DE
Tween 20 Sigma-Aldrich, München, DE
Wasserstoffperoxid 30 % (H2O2) Merck, Darmstadt, DE
Xylol Merck, Darmstadt, DE
III.3.2. Kits
Kit Hersteller
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystem, Darmstadt, DE peqGOLD RNA PURE solution Peqlab, Erlangen, DE
Power SYBR® Green PCR Master Mix Applied Biosystem, Darmstadt, DE RNA 6000 Nano Chip Kit Agilent, Waldbronn, DE
Rneasy® Micro Kit Qiagen, Hilden, DE
Rneasy® Mini Kit Qiagen, Hilden, DE
Turbo DNA-free™ Kit Ambion/Applied Biosystem, Darmstadt, DE
III.3.3. Puffer und Lösungen
4% Formalin / 0,1 M Phosphatepuffer Objektivputzlösung
10 % (v/v) Formaldehydlösung (37%), 50 % (v/v) 2-Propanol, 10 % (v/v) 1 M Phosphatpuffer (pH 7,3), 50 % (v/v) MilliQ-H2O,
in MilliQ-H2O 0,04 % (v/v) Tween 20
10x PBS Ladepuffer (10x DNA-Ladepuffer)
137 M NaCl, 0,1 % Xylencyanol (v/v),
27 mM KCl, 50 % Glycerol (w/v),
100 mM Na2HPO4, 0,1 M EDTA,
18 mM KH2PO4, 0,1 % SDS,
pH 7,4 (HCl) in 10x TAE
Material 26
DEPC-Wasser PBS
0,01 % (w/v) DEPC (Diethylpyrocarbonat), 10 % 10x PBS (v/v), in MilliQ-H2O, in MilliQ-H2O, pH 7,4 (HCl),
ÜN bei RT rühren; autoklavieren autoklavieren
Phosphatpuffer (0,2 M, für 1l Puffer) DMEM
28,42 g Na2HPO4 x 2H2O, 13,38 g DMEM Pulver,
7,76 g Na2HPO4 x 2H2O, 3,7 g NaHCO3,
in MilliQ-H2O, in 1 L Zellkulturwasser, pH 7,3 (HCl), pH 7,3 (HCl) steril filtrieren; bei 4 °C lagern.
Mowiol-Eindeckmedium (für 20 ml) 4 % PFA-Lösung
6 g Glycerol, 20 g Paraforaldehyd-Pulver
2,4 g Mowiol 4-88, in 450 ml warmes Wasser gegeben, über Nacht bei RT rühren, unter Rühren bei 60°C lösen
6 ml MilliQ-H2O, 5 Tropfen 2N NaOH
12 ml 0,2 M Tris-HCl (pH 8,5), mit 10x PBS auf 500 ml auffüllen ÜN bei RT rühren; zentrif. für 15 min bei 5000 g, mit 37 %iger HCL-Lösung ph 7,2 einstellen
Aliquots bei -20 °C lagern filtrieren und aliquotieren; Lagerung bei -20°C
50x TAE Einfriermedium
2 M Tris Base 10 % DMSO,
0,5 M Essigsäure 90 % FCS
0,05 M EDTA
