Aus der Klinik und Poliklinik für Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie Direktor: Professor Dr. Dr. N.- C. Gellrich
Zentrum Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde der Medizinischen Hochschule Hannover
Auswirkungen einer vorangegangenen
Weichgewebeexpansion auf die Osseointegration isogener Knochenaugmentate und die Vaskularisierung des
Augmentatlagers
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Zahnheilkunde
in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Ulrike Jachmann
aus Gifhorn
2010
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 04.04.2011
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann
Betreuer: Prof. Dr. Dr. M. Rücker
Referent: Prof. Dr. Dr. med. Oskar Bauß
Koreferent: Prof. Dr. med. Michael Jagodzinski
Tag der mündlichen Prüfung: 04.04.2011
Prüfungsausschussmitglieder: Prof. Dr. Dr. André Eckardt
PD Dr. Michael Eisenburger
INHALTSVERZEICHNIS
1 Einleitung 1
1.1 Knochen 4
1.1.1 Knochenaugmentation 6
1.2 Periost 7
1.3 Defektdeckung 8
1.4 Angiogenese 9
1.5 Entwicklung der Expander 9
1.6 Physiologie der Gewebeexpansion 11
1.7 Weichgewebeexpansion 11
1.7.1 Vaskularisation von expandiertem Weichgewebe 13 1.7.2 Histologische ossäre Veränderungen beim Einsatz von Expandern 13
1.8 Intravitalmikroskopie 14
1.9 Fragestellung und Zielsetzung 14
2 Material und Methoden 15
2.1 Versuchstiere 15
2.1.1 Ethische Erklärung 15
2.1.2 Nahrung und Haltung 15
2.2 Expander 16
2.2.1 Cupolaexpander 16
2.4 Operatives Vorgehen 17
2.5 Intravitalmikroskopie 22
2.5.1 Beschreibung der Intravitalmikroskopie 22
2.5.2 Auswertung der Intravitalmikroskopie 24
2.6 Histologische Aufarbeitung 26
2.6.1 Histologische Auswertung 27
2.7 Statistische Auswertung 28
3 Ergebnisse 29
3.1 Versuchstiere 29
3.2 Expander 29
3.3 Beobachtungsfenster 30
3.4 Intravitalmikroskopie 31
3.4.1 Funktionelle Gefäßdichte 32
3.4.2 Durchmesser der Gefäße 35
3.4.3 Blutflussgeschwindigkeit 37
3.4.4 Adhärente Leukozyten 40
3.4.5 Rollende Leukozyten 42
3.4.6 Makromolekulare Extravasation 44
3.5 Histologie der Knochenpräparate 47
3.6 Knochenarchitektur 48
4 Diskussion 51
4.1 Verwendung selbstquellender Expander 51
4.2 Intravitalmikroskopie am chronischen Kopffenster der Ratte 55 4.3 Reaktive ossäre Effekte durch präaugmentative Weichgewebeexpansion 56
5 Zusammenfassung 58
6 Abkürzungsverzeichnis 59
7 Literaturverzeichnis 60
8 Danksagung 65
Lebenslauf 66
Erklärung nach § 2 Abs. Nr. 5 und 6 PromO 68
1 Einleitung
In der Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie stellt die Knochenaugmentation ein standardisiertes Verfahren dar. Knochenverlust bei Tumorresektion nach operativen Eingriffen sowie die Atrophie des Alveolarkamms beschreiben zwei mögliche Formen des Knochenverlustes, wodurch oftmals eine Knochenaugmentation vor der späteren endgültigen Versorgung indiziert ist. Hierfür ist ein suffizientes knöchernes Augmentatlager von entscheidender Bedeutung. Ein wichtiger Aspekt ist dabei auch die Verfügbarkeit sowie die Biokompatibilität des betreffenden Augmentationsmaterials. Weitere wichtige Betrachtungspunkte sollten die Funktionalität des autogenen Knochens, die Morbidität an der Entnahmestelle sowie die Frage bleibender Schäden im Entnahmegebiet sein [1]. Vor allem die herausragende Verträglichkeit sowie fehlende immunologische Reaktionen sind ein entscheidender Vorteil des autogenen Knochens gegenüber Knochenersatzmaterialien.
Die knöcherne Rekonstruktion ist grundsätzlich mit verschiedenen Materialen unterschiedlichen Ursprungs möglich. Bei der Rekonstruktion des Knochens stellt die autogene Knochenaugmentation noch immer den "Goldstandard" dar [1, 2], da es zu den niedrigsten Komplikationsraten kommt.
Nach erfolgtem Wachstumsabschluss unterliegt der Knochen einer kontinuierlichen Erneuerung, dem so genannten "Remodelling" [3]. Die wechselseitig wirkende Aktivierung von Osteoblasten und Osteoklasten bewirkt eine permanente Erneuerung sowie den Umbau des mineralisierten Knochens [4].
Um das Augmentat in bestehende Remodellingprozesse zu integrieren ist die Augmentation auf einer knöchernen Unterlage zwingend notwendig. Nach der Augmentation sind dabei die Augmentate von den versorgenden Gefäßen getrennt. Bis zur Neovaskularisation erfolgt die Nähr- und Sauerstoffversorgung über die umliegenden Gefäße [5]. Da gerade im Zentrum des eingebrachten Augmentates die Vermeidung von Nekrosen essentiell ist [5-7], ist innerhalb der initialen Phase nach der Augmentation eine hohe funktionelle Gefäßdichte um das Augmentat von entscheidendem Interesse. Die Neovaskularisation erfolgt dabei zum Einen von der knöchernen Unterlage zum Anderen aus den umliegenden Weichgeweben [8].
Anforderungen an ein optimales Knochenaufbaumaterial stellen hierbei:
- ausreichende Verfügbarkeit, - hohe Erfolgsrate,
- fehlendes Infektionsrisiko,
- Ausschluss einer Übertragung von Bakterien, Viren, Prionen oder anderen pathogenen Krankheitserregern,
- kein Risiko einer Allergisierung oder Abstoßung, - Osteokonduktivität, Osteoinduktivität sowie
Zur Prüfung dieser sind drei verschiedene Qualitäten des Knochens zu begutachten. Dazu gehören: 1. die Spongiosa, 2. die Kortikalis und 3. das vaskularisierte Knochenaugmentat.
Die reine Spongiosa zeichnet sich durch eine schwammartige Textur mit interkonnektierender Porosität aus und weist dadurch eine hohe osteokonduktive Eigenschaft auf. Des Weiteren fördert die Spongiosa das appositionelle Knochenwachstum und bietet dem Transplantatlager ein aufnahmefähiges Gerüst. Dies ermöglicht eine verstärkte Knochenbildung [1]. Auch enthält die Spongiosa Knochenmarksanteile mit noch wenig ausdifferenzierten Progenitorzellen. Diese werden mit der Spongiosa transplantiert.
Bei entsprechender Stimulation differenzieren sie zu knochenbildenden Zellen. Ein Teil der transplantierten Zellen stirbt oder geht durch Apoptose zu Grunde wodurch die Angiogenese im Knochen zusätzlich unterstützt wird. Anschließend erfolgt die Ausreifung zu knochenbildenden Vorläuferzellen. Nach Muschler und Lane hat die Spongiosa somit eine hohe osteogene Potenz [9]. Zu berücksichtigen ist, dass diese mit zunehmendem Patientenalter schwindet [10].
Innerhalb des Defektes ist somit eine Überlebenschance nur für die direkt dem ernährenden Lagerknochen anliegenden Zellen zu sehen [1]. Die Revaskularisation zentral gelegener Spongiosaanteile erfolgt verspätet. Daher ist die osteogene Potenz lokal begrenzt [11].
Reine Spongiosatransplantate sind daher hinsichtlich der funktionellen Qualität eher kritisch zu bewerten, da sie eine geringe Festigkeit zeigen sowie starken Resorptionsvorgängen unterliegen [1], in deren Folge das Augmentationsvolumen reiner Spongiosatransplantate limitiert ist.
Im Gegensatz zur Spongiosa zeigt das reine Kortikalistransplantat auf Grund fehlender interkonnektierender Porosität nur an der Oberfläche Osteokonduktivität. Einzig die Havers- und Volkmannkanäle bieten Leitschienen für den sonst porenfreien Knochen. Das Verhältnis osteogener Zellen ist mit 1:4 im Vergleich zur Spongiosa sehr gering [11]. Da nur wenige Osteozyten eine Transplantation überleben [7], wird der Knochen überwiegend nekrotisch [12]. Dadurch ergibt sich nur eine geringe osteogene Potenz für das reine kortikale Knochenaugmentat. Eine Revaskularisation erfolgt besonders langsam, wodurch sich eine höhere Anfälligkeit gegenüber Infektionen im Vergleich zum vaskularisierten Knochenaugmentat ergeben kann. Im Gegensatz zur Spongiosa verliert die Kortikalis im Laufe des Resorptionsvorganges an Stabilität [13]. Daher finden reine Kortikalistransplantate ebenso wie die reinen Spongiosatransplantate selten Anwendung für die Knochenrekonstruktion. Als Folge kommen meist kortikospongiose Knochenaugmentate zum Einsatz, weshalb auch in dieser Arbeit diese Form des Knochenaugmentates gewählt wurde.
und Muschler [12] sollen nach adäquater Anastomose und Transplantatstabilität mehr als 90% der Osteozyten im Transplantat überleben. In Abhängigkeit vom Remodelling erfolgt der Umbau des Transplantates, welcher vor allem durch die mechanische Stabilität des Empfängerortes bestimmt wird [12]. Ist diese nicht in ausreichendem Maße gegeben, kommt es häufig zur Bildung von Granulationsgewebe. Besteht zwischen Transplantat und Empfängergewebe eine Fibrose kann dies die Integration des Transplantates beeinträchtigen oder verhindern [12]. Entscheidend dabei sind auch die Gefäßversorgung des Empfängerortes sowie die verfügbare Anzahl und Kompetenz der endothelialen beziehungsweise bindegewebsbildenden Progenitorzellen.
Bei der freien mikrovaskulären Transplantation erfolgt die Entnahme des Knochens sowie der darüber liegenden Haut mit den ernährenden Gefäßen. Diese werden im Empfängergebiet wieder an die dort vorhandenen Blutgefäße angeschlossen. Diese Methode hat sich vor allem in der rekonstruktiven Chirurgie bei Verlust oder Entfernung großer Knochenanteile etabliert. Vorteilhaft dabei ist, dass der transplantierte Knochen unmittelbar nach der Augmentation wieder mit Blut versorgt und so die Heilung beschleunigt wird [12, 14]. Da es nur wenige Entnahmeorte und Anschlussmöglichkeiten im Empfängergebiet gibt, sind gefäßgestielte Transplantate nicht überall einsetzbar. Weiterhin treten hohe Komplikationen im Entnahmegebiet auf.
Im Gegensatz dazu muss bei einer nicht gefäßgestielten Transplantation von Knochen das Empfängergewebe das Transplantat per Diffusion ernähren.
Die subperiostale Insertion des Augmentates auf dem Empfängerknochen hat sich dabei als Methode der Wahl etabliert, um eine vollständige knöcherne Durchbauung zu ermöglichen.
Sie stellt das allgemein akzeptierte klinische Routineverfahren zur Knochenaugmentation dar [12]. Dadurch lassen sich bestehende Remodellingvorgänge des Wirtsknochens für den Erfolg der Augmentation nutzen.
1.1 Knochen
Die Knochen zählen anatomisch zu den Stützgeweben des Körpers und entstehen durch desmale oder chondrale Ossifikation. Bei der desmalen Ossifikation erfolgt die Entwicklung direkt aus mesenchymalen Zellen. Nach der kausalen Histiogenese Pauwels` hängt die Entstehung der Stützgewebe von mechanischen Kräften ab [15]. Für die desmale Knochenentstehung ist Bewegungsruhe in dehnungsbelastetem Gewebe notwendig. So entstehen zum Beispiel platte Knochen sowie die perichondrale Knochenmanschette von Röhrenknochen. Während des Ossifikationsvorganges differenzieren Mesenchymalzellen in Ossifikationszentren zunächst zu Vorläuferzellen und anschließend zu Osteoblasten.
Diese sondern Kollagen und Osteoid ab und mauern sich mit zunehmender Mineralisation des Osteoids ein. Gleichzeitig werden Ab- und Umbauvorgänge durch Osteoklasten aktiviert.
Der entstandene Knochen besteht aus Knochenbälkchen und ist durch ein schwammartiges (spongioses) Aussehen charakterisiert. Außen und innen ist die Spongiosa von einer kompakten Knochenschicht umgeben, bei der die Osteoblastenaktivität die der Osteoklasten überwiegt. Innerhalb der Spongiosa differenzieren Mesenchymalzellen zu Stammzellen des blutbildenden Systems. Wachstumsvorgänge finden vor allem im Bereich der Suturen statt.
Im Gegensatz dazu erfolgt die chondrale Ossifikation indirekt über ein hyalines Knorpelvorläufermodell, welches nach und nach durch Knochengewebe ersetzt wird. Die chondrale Ossifikation lässt sich nochmals in die perichondrale und die enchondrale Ossifikation unterteilen, welche vor allem in kurzen Knochen stattfindet und Folge von Bewegungsruhe in kompressionsbelastetem Gewebe ist [15].
Bei der perichondralen Entwicklung entsteht zunächst Geflechtknochen. Dieser wird abgebaut und durch Lamellenknochen ersetzt.
Makroskopisch lassen sich am ausgereiften Knochen eine äußere dichte Kompakta sowie eine innere, aus Knochenbälkchen aufgebaute Spongiosa unterscheiden.
Knochengewebe setzt sich aus Interzellularsubstanz, die sich in Grundsubstanz, Kollagenfasern und Mineralien einteilen lässt und verschiedenen Zellen wie Osteoblasten, Osteozyten oder Osteoklasten zusammen.
Osteoblasten gehen aus Präosteoblasten hervor und sind für die Knochenbildung verantwortlich. Diese stammen von pluripotenten Mesenchymzellen ab. Osteoblasten bilden die unverkalkte Grundsubstanz des Knochens, das weiche Osteoid. Innerhalb der Zellen kommt es zur Anreicherung von Hydroxylapatit. Erst durch die erfolgte
Osteoblasten werden als Osteozyten bezeichnet. Sie unterliegen einer zunehmenden Mineralisation und Kalziumauffüllung. Aktive und inaktive Osteoblasten liegen dem mineralisierten Knochen sowie dem frisch sezernierten Osteoid gleichermaßen an. Inaktive Osteoblasten sind stark abgeflachte Zellen mit wenigen Organellen. Sie werden auch als so genannte Knochendeckzellen bezeichnet [16].
Vorläuferzellen des reifen Knochens, der nur eine geringe Erneuerungsrate aufweist, sind durch ihr spindelförmiges und abgeplattetes Aussehen charakterisiert, welche im Endost sowie Periost lokalisiert sind.
In Folge von Remodellingvorgängen nehmen Osteozyten an Größe zu, verändern ihre Form und differenzieren sich zu aktiven Osteoblasten aus. Dabei werden die Zellen kubisch oder sogar prismatisch und es sind große, ovale, helle Kerne und reichlich spindelförmiges Zytoplasma erkennbar. Sie stellen sich basophil dar, was sich in dem hohen Gehalt an rauem Endoplasmatischem Retikulum (ER) widerspiegelt. Dies wiederum ist ein Hinweis für die proteinsynthetisierende und -sezernierende Aktivität.
Sind Osteoblasten vollständig von Knochenmatrix umgeben, so gehen sie in den inaktiven Zustand von Osteozyten über und zeigen eine abgeplattete und spindelförmige Gestalt.
Diese liegen in kleinen Knochenlakunen. Jeder Osteozyt erhält sich einen schmalen Osteoidsaum aufrecht und weist einen gut entwickelten Golgi-Apparat und wenig raues ER auf.
Hingegen bauen Osteoklasten mineralisierten Knochen wieder ab. Dabei handelt es sich um kernreiche Riesenzellen, die sich im Knochenmark aus Vorläuferzellen differenzieren.
Riesenzellen sind auch zur Bildung von Monozyten und Makrophagen fähig. Sie sind somit polyploid. In direkter Nähe zum Knochen liegen Osteoklasten bei resorptiven knöchernen Umbauvorgängen in so genannten Howshipshen Lakunen dem Knochen an [16].
Die Interzellularsubstanz des Knochens besteht etwa zur Hälfte aus anorganischen Substanzen [17]. Die andere Hälfte wird von organischen Verbindungen und Hydratationswasser gebildet. Den Hauptteil unter den anorganischen Bestandteilen nehmen anorganisches Phosphat (ca. 50%) und Kalzium (ca. 35%) ein. Sie liegen im Knochen in Form hexagonaler, gitterartig angeordneter Kristalle, als Apatitkristalle, vor. Dabei macht das Hydroxylapatit (Ca10(PO4)6(OH)2) den größten Anteil aus. Die organischen Bestandteile des Knochens verteilen sich auf Kollagen (90-95%), Proteoglycane und Glycoproteine.
Histologisch werden Geflecht- oder Faserknochen und Lamellenknochen unterschieden.
Während Geflechtknochen sich eher zellreich darstellt und von einem unregelmäßigen Geflecht aus fein- und grobfibrillären Kollagenfasern durchzogen wird, weist der Lamellenknochen eine hohe Ordnung der Knochenlamellen auf.
Strukturelle Grundlage des Lamellenknochens ist das Osteon. Es hat einen Durchmesser von 20-100µm [18], das ein bis drei Gefäße und vegetative Nerven führt und mit mesenchymalem Bindegewebe gefüllt ist. Jedes Osteon ist von etwa 5-20 konzentrischen
Knochenlamellen umgeben, die auch Havers-Lamellen oder Speziallamellen genannt werden. Die einzelnen Lamellen weisen hierbei eine Breite von 4-10µm auf.
Untereinander sind Havers-Kanäle durch Volkmann-Gefäße, welche am Fehlen sie umgebender Knochenlamellen erkennbar sind, verbunden. Volkmann-Gefäße sind Bestandteil des Gefäß- und Versorgungsnetzes des Knochens und stellen die Verbindung zur inneren und äußeren Knochenhaut dar.
1.1.1 Knochenaugmentation
Für die Knochenaugmentation kommen verschiedene Materialien in Frage. Dabei wird vor allem nach der Herkunft unterschieden. Dementsprechend lassen sich xenogene, allogene, autogene und isogene Knochenaugmentate unterteilen.
Jedes der oben genannten Transplantate zeichnet sich durch verschiedene biologische und physikalische Eigenschaften aus.
Xenogene Knochenersatzmaterialien bezeichnen Materialien einer anderen Spezies.
Bei der Transplantation von xenogenen sowie allogenen Materialien besteht die Gefahr der Abstoßung. Während der Transplantation ist eine bakterielle oder virale Kontamination des einzubringenden Transplantates auszuschließen. Daher müssen xenogene Materialien biokompatibel sein [19].
Allogene oder alloplastische Materialien ähneln dem körpereigenen Gewebe. Sie werden jedoch synthetisch hergestellt [19]. Ihr Stellenwert in der Chirurgie ist durch die begrenzte Verfügbarkeit und einen eventuell erforderlichen Zweiteingriff zu sehen. Unabhängig von der Art des einzubringenden Materials wirken alloplastische Materialien im Gegensatz zu den autogenen Knochenersatzmaterialien nur osteokonduktiv. Sie bilden die Leitschiene für den einwachsenden Knochen. Ein Teil der verwendeten Materialien wird resorbiert, weisen aber dennoch keine osteogene Potenz auf. Eine Kombination mit autogenen Materialien, welche osteogene Eigenschaften aufzeigen, ist möglich.
Unter autogenen Knochenmaterialien werden körpereigene Knochenmaterialien verstanden [19]. Diese zeichnen sich vor allem durch ihre gute Verträglichkeit und geringe bis fehlende Abstoßungsreaktion aus. Daher werden sie nach wie vor als "golden standard" [1] innerhalb der Transplantationschirurgie angesehen. Autogene Materialien wirken gegenüber den alloplastischen Materialien osteoinduktiv. Durch einwachsende Gefäße aus dem
Transplantates spielt dabei eine wichtige Rolle. Ebenso die Wertigkeit des Transplantatlagers ist für den Erfolg von Bedeutung [1].
Isogene Materialien stammen von Tieren genetisch gleichen Erbgutes, jedoch handelt es sich nicht um ein identisches Tier. Abstoßungsrektionen lassen sich so auf ein Minimum reduzieren.
1.2 Periost
Definitionsgemäß wird eine dünne bindegewebige den Knochen bedeckende Hülle als Periost bezeichnet. Mit Ausnahme von Gelenkflächen umgibt dieses den Knochen.
Es erfüllt nutritive und regenerative Funktionen [20-23]. Das desmale Periost als funktionelle anatomische Einheit setzt sich aus einem typischen dreischichtigen Aufbau zusammen [24].
Die derbe und faserige Bindegewebsschicht, welche dem Knochen fest anliegt, beinhaltet Osteoblasten. Diese sind durch ihre rundliche und kompakte Zellform gekennzeichnet. Die Bindegewebsschicht wird als Kambium bezeichnet. Eine feste Adaption mit dem Knochen wird über Hemidesmosomen erreicht, die aus dem Knochen in das Kambium einstrahlen. In der mittleren Schicht sind zahlreiche Mikrogefäße und lockeres Bindegewebe zu finden. Ihr ist eine Schicht aus straffem Bindegewebe aufgelagert.
Auf Grund seiner straff elastischen Konsistenz sichert das Kambium die Form des Knochens. Insbesondere im Wachstum des desmalen Knochens wird dies sichtbar, da es dort in Folge von Störungen der periostalen Durchblutung zur Wachstumshemmung kommen kann [25]. Über die Gefäß- und Nährstoffversorgung ist der Knochen eng an das Periost gebunden [22]. Trotz der geringen Dicke des Periostes kommt diesem daher eine immense Bedeutung für den Knochenmetabolismus zu. So ermöglichen die enthaltenen Osteoblasten eine natürliche Wundheilung [15].
Hauptaufgabe des Periostes ist die Gefäßversorgung des Knochens, die Unterstützung des appositionellen Knochenwachstums sowie die Versorgung der äußeren Knochenanteile und Wachstumszonen mit Nährstoffen. Des Weiteren hat das Periost Schutzfunktion gegenüber dem Knochen und stellt eine Anheftungsstelle für Sehnen oder Bänder dar. Zudem ist das Periost an Wachstums- und Regenerationsvorgängen beteiligt.
Neben der nutritiven Funktion hat das Periost auch mechanische und reparative Aufgaben [26, 27]. Zwischen dem Periost und dem darüber befindlichen Weichgewebe als auch zwischen Periost und darunter liegendem Knochen besteht eine dauerhafte Interaktion.
Daher ist gerade im Bereich der chirurgischen Versorgung knöcherner Defekte die Rolle des Periostes für die Heilung von herausragendem Interesse [28, 29]. Treten pathologische Veränderungen am Periost auf, in deren Folge es zu Durchblutungsstörungen des Knochens kommt, können Knochennekrosen oder Knochendeformitäten die Folge sein [30, 31].
1.3 Defektdeckung
Die primäre Defektdeckung erfolgt in der rekonstruktiven und plastischen Chirurgie häufig unter Zuhilfenahme eines Transplantates. Hierzu wird grundsätzlich zwischen gestielten und ungestielten Transplantaten unterschieden. So kann ein freies mikroanastomosiertes Transplantat genutzt werden, aber auch ein Fernlappen oder ein Schwenklappen können zur Defektdeckung eingesetzt werden.
Allen drei Möglichkeiten gemeinsam ist, dass gesundes Gewebe vom Ort der Entnahme zum Defekt transferiert wird. Daraus können sich jedoch Komplikationen und Probleme an der Entnahmestelle sowie auch im Defektbereich ergeben. Eine mögliche Komplikation stellt die eingeschränkte Vaskularisation dar. Der primäre Wundverschluss muss daher sowohl im Entnahme- wie auch im Empfängerbereich spannungsfrei erfolgen, um so Vaskularisationseinschränkungen möglichst gering zu halten [32].
Eine weitere Möglichkeit der Defektdeckung bietet die lokale Wundrandadaptation. Bei dieser Defektdeckung ist jedoch eine genügende Mobilisation des umgebenden Gewebes notwendig.
Im Rahmen der Augmentation kommt es zu einem Mehrvolumen durch das augmentierte Gewebe. Vor allem ausgedehnte Defekte stellen dabei den Chirurgen immer wieder vor ein Problem, da eine spannungsfreie Deckung durch den Volumenzuwachs ausgehend vom Augmentat mit dem ortsständigem Gewebe nur sehr schwer zu erzielen ist. Neben den funktionellen Anforderungen ist auch unter ästhetischen Aspekten eine suffiziente Defektdeckung entstandener Weichgewebsdefekte erforderlich [33]. Hierfür stehen verschiedene chirurgische Verfahren zur Auswahl.
Ein erheblicher Vorteil der lokalen Defektdeckung ist vor allem in der Erzielung optimaler ästhetischer Ergebnisse zu sehen, da sich Farbe und Struktur des umliegenden Gewebes nicht vom transferierten Gewebe unterscheiden.
Der Einsatz von Fernlappen hat für die intraorale Anwendung den gravierenden Nachteil, dass oftmals der Haarwuchs im transplantierten Gebiet erhalten bleibt und sich beeinträchtigend auf das Ergebnis auswirkt.
Um eine ausreichende Mobilität des Gewebes zu erzielen, wurde daher die Methode der Weichgewebeexpansion in der rekonstruktiven Therapie entwickelt. Durch diese lässt sich eine ausreichende Dehnung sowie ein Gewebezuwachs vor der Augmentation des Weichgewebes erzielen und somit anschließend für die Defektdeckung nutzen [34, 35].
Dabei hat sich die defektnahe Weichgewebeexpansion in den vergangenen Jahren in der
1.4 Angiogenese
Für die erfolgreiche Einheilung des eingebrachten Knochenmaterials spielt die Angiogenese eine entscheidende Rolle. Sie ist durch das Aussprossen neuer Kapillaren aus bereits vorhandenen Gefäßen definiert [36].
Hierbei handelt es sich um einen sehr komplexen Vorgang [37], der bisher noch nicht abschließend untersucht ist. Bekannt ist, dass die Angiogenese mit der gezielten und streng lokalisierten Auflösung der Gefäßwand beginnt und mit der Bildung von ausgereiften neuen Gefäßstrukturen endet.
Die kontrollierte Freisetzung angiogener Faktoren und das präzise regulierte Erscheinen der entsprechenden Rezeptoren für diese auf den Endothelzellen löst den Vorgang aus [38].
Die Stimulation zur Angiogenese erfolgt unter anderem durch den Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), der eine Endothelproliferation und -migration bewirkt. Zur Bildung von Gefäßwänden erforderliche Endothelzellen, Perizyten und glatte Muskelzellen werden durch den VEGF zur Proliferation angeregt. Das die Kapillare umgebende Bindegewebe wird hierbei abgebaut und es erfolgt eine Migration kleiner Zellausläufer in das Gewebe. Die Bildung neuer Kapillaren erfolgt ausschließlich durch Migration vorbestehender Endothelzellen. Dabei sind die Mitglieder der Notch-Protein-Familie für die Arteriogenese zuständig. Sie umfasst eine Reihe von Proteinen, die einerseits als Zelloberflächenrezeptoren agieren und andererseits als direkte Regulatormoleküle die Gentranskription beeinflussen [39-41]. Im Trans-Golgi-Apparat werden diese gespalten und im Anschluss als Heterodimere auf der Zelloberfläche exprimiert [42]. Des Weiteren stellen sie Transmembranproteine dar. Dagegen wird die Bildung der Venen durch den Coup-TFII- Rezeptor bestimmt. Die abschließende Wandausbildung wird für Arterien und Venen gleichermaßen durch den Plated Derived Growth Factor (PDGF) und Angiopoietin-1 reguliert.
Die Angiogenese des Transplantatlagers sowie des Transplantates selbst spielt sowohl in biologischer als auch medizinischer Sicht eine entscheidende Rolle bei der Rekonstruktion des verloren gegangenen Knochens. Eine adäquate Perfusion ist unverzichtbar für das Wachstum und die Remodellation des Knochens.
Nur so kann eine dauerhafte Nutrition und Infektabwehr im Knochen gewährleistet werden.
1.5 Entwicklung der Expander
1957 wurde erstmals ein Gewebeexpander in einer Operation verwendet. Dabei blies Neumann [43] einen Gummiballon subkutan mit Luft auf. Die so gewonnenen Hautareale verwendete er für eine Ohrmuschelrekonstruktion. Die Auffüllung von Hohlkörpern und die damit verbundene Weichgewebeexpansion wurden mit Hilfe eines Verbindungsschlauches
sowie einem außen am Hals fixierten Ventil durchgeführt. Die gewonnene Haut, die in Qualität und Farbe dem Ohr ähnelte, wurde anschließend für die Rekonstruktion des Ohres benutzt.
Erst 1976 wurde die Methode der so genannten Ballonexpander akzeptiert, nachdem Radovan [44, 45] einen Silikonballon entwickelte, den er mit Kochsalzlösung füllte. Er nutzte diese Technik im Bereich der Brustrekonstruktionen. Hierbei wurde der aus Ballon, Verbindungsschlauch und Ventil bestehende Ballonexpander komplett subkutan inseriert.
Nach anschließender erfolgreicher Weichgewebeexpansion wurde der Expander entfernt und eine Prothese eingesetzt.
Austad und Rose [46] entwickelten 1982 die selbstquellenden Expander, indem sie die Ballonexpander mit einer permeablen Membran und einer hypertonen Flüssigkeit füllten.
Folglich kam es zu einem osmotisch bedingten Flüssigkeitseinstrom und somit zur Expansion. Die Volumenzunahme lies sich dabei nicht exakt steuern und es kam anschließend zu Leckagen des Expanders, so dass die hyperosmolare Flüssigkeit zu Gewebenekrosen führte. Daraus resultierte, dass selbstquellende Expander auf Grund der technischen Mängel zunächst keine praktische Anwendung fanden.
1993 führte Wiese [47] einen neuen selbstquellenden Expander ein, welcher auch heute noch Verwendung findet. Ziel dieser hochhydrophilen Hydrogelexpander war die Gewährleistung einer kontinuierlichen Druck- und Volumenzunahme. Jedoch wollte Wiese die aufwendigen chirurgischen Zugangswege, wie sie bei Ballonexpandern erforderlich waren, sowie auch die potentiell gewebeschädigende Wirkung hypertoner Osmoseexpander vermeiden. Das entwickelte physiologisch gewebeverträgliche Hydrogel besteht aus einem Co-Polymer auf der Basis von Methylmethacrylat und N-Vinylpyrrolidon [48]. Versuche von Wiese [47] zeigen, dass dabei eine gute Gewebeverträglichkeit zwischen Gewebe und verwendetem Hydrogelexpander vorliegt.
Dieser wird im dehydrierten Zustand unter den zu dehnenden Bereich implantiert und quillt durch Aufnahme interstitieller Flüssigkeit selbständig auf. Die Befüllung des Expanders ist somit nicht mehr notwendig. Jedoch traten zunächst Komplikationen, wie Gewebenekrosen, durch eine zu schnelle Expansion auf [49].
Um dieses Problem zu lösen werden die selbstquellenden Expander der ersten Generation seit 2001 zusätzlich mit einer perforierten Silikonhülle versehen. Dadurch wird eine bessere zeitliche Steuerung des Quellverhaltens der Expander der zweiten Generation erreicht.
1.6 Physiologie der Gewebeexpansion
Das Dehnungsverhalten der Haut, zum Beispiel während der initialen Schwangerschaft aber auch pathologische Vorgänge wie Abszesse oder Tumoren, zeigen, dass es sich dabei um einen physiologischen Prozess handelt [50]. Hierbei ist die natürliche Rückstellkraft der Haut zu beachten.
1967 beschrieben Gibson und Kenedi [51] die biomechanischen Eigenschaften der Haut als
„Creep“ und „Stress-Relation“. „Creep“ beschreibt dabei die Tatsache, dass eine konstante Kraft zu einer zunehmenden Hautdehnung über die Zeit führt und „Stress-Relation“ erklärt, dass die dabei benötigte Kraft für die Aufrechterhaltung der ausgeübten Hautdehnung mit der Zeit abnimmt. Histologisch nachweisbare Folgen des unter Druck expandierten Gewebes sind neben der Gewebeneoplasie auch reaktive Umbauprozesse.
Es lassen sich drei Phasen der Hautdehnung unterscheiden.
Während der ersten Phase findet eine stetige Abnahme des Flächenzuwachses statt. Sie wird als viskoelastische Dehnung angesehen. Die Dehnung erfolgt hierbei ohne großen Kraftaufwand. Die scherenförmig angeordneten Kollagenfasern sowie die dünnen elastischen Fasern werden mit einem geringem Kraftaufwand bis zu einem Grenzwert gestreckt [52, 53].
Bei einer vergleichbar hohen Kraft gegenüber der ersten Phase kommt es in der zweiten Phase nur zu einem geringen Flächenzuwachs. Anschließend kommt es gewebeabhängig zeitlich variabel innerhalb dieser Phase zu einer Verschiebung der interstitiellen Flüssigkeit des Gewebes und anschließender Dehnung der kollagenen Fasern [51, 54].
In der dritten Phase wird davon ausgegangen, dass das echte Hautwachstum durch Zellproliferation beginnt. Dies bestätigen gesteigerte Mitoseraten bei expandierter Haut [55].
Durch zunehmende Expansion verliert die Haut vorübergehend ihre viskoelastischen Eigenschaften.
Bei in vivo Verwendung ist die Größe der Expander ausschlaggebend für die Dauer der vollständigen Füllung der Expander. Hierbei lassen sich verschiedene Verhalten in unterschiedlichen Körperregionen beschreiben. In seiner Arbeit erzielte Wiese [56] über einen Zeitraum von 40 Tagen am Rücken einen Zuwachs von 63%, an der Stirn (subperiostal) hingegen nur von 52%. Daraus ist ersichtlich, dass die Lage des Expanders ein entscheidendes Kriterium für die Füllung darstellt.
1.7 Weichgewebeexpansion
Die Weichgewebeexpansion basiert auf der Stimulierung neuen Hautwachstums in der Nähe des Hautdefektes. Dabei wird die natürliche Fähigkeit der Haut, sich zu dehnen, genutzt [44].
Bereits Ende der 70er Jahre setzte Radovan [44] den von ihm entwickelten Expander (Radovan®-Gewebe-Expander) zur Gewebedehnung erfolgreich ein. In seinen Untersuchungen implantierte Radovan den Expander epiperiostal unter die gesunde Haut und füllte ihn über einen Zeitraum von mehreren Wochen allmählich mit isotonischer Kochsalzlösung. Er war der Erste der gesundes Gewebe zur Behebung unerwünschter Hautdefekte verwenden konnte [44].
Auch der Einsatz selbstquellender Hydrogelexpander setzt Gewebe gegen ein Widerlager unter Spannung, wodurch im vorliegenden Bereich eine Expansion der Haut erzielt wird, die im Ergebnis zu einem Gewebezuwachs führt. Ist schließlich ein ausreichender Zuwachs erreicht, findet eine Entnahme des eingebrachten Expanders statt und der expandierte Bereich kann zur plastischen Deckung eingesetzt werden [46, 57-59]. Meist dient hierbei eine knöcherne Unterlage als Widerlager. Je nach vorliegender Indikation kommen unterschiedliche Expander zum Einsatz.
Für die Weichgewebeexpansion finden bisher überwiegend Hohlkörper Anwendung. Hierzu werden diese in das zu dehnende Gewebe implantiert und anschließend mit Luft oder Flüssigkeit gefüllt [47, 48, 60, 61].
Je nach Art der Befüllung lassen sich verschiedene Systeme unterscheiden:
- die perkutane Befüllung des Expanders,
- die endoskopische Befüllung des Expanders und - die selbst aufquellenden Expander.
Selbstquellende Expander, wie sie hier verwendet werden, stellen eine neue Möglichkeit der Weichgewebeexpansion dar. Hierbei wird Hydrogel im dehydrierten Zustand unter den zu expandierenden Bereich eingesetzt. Unter Flüssigkeitsaufnahme erfolgt anschließend eine selbstständige Quellung. Daraus ergibt sich, dass eine Befüllung des Expanders von extern nicht mehr notwendig ist. Dadurch ist die Operationsdauer im Vergleich zu herkömmlichen Expandern deutlich minimiert. Im Gegensatz zur externen Befüllung kommt es zum Aufbau einer nahezu kontinuierlichen Zugspannung [47].
Untersuchungen von Wiese [56] zeigen, dass geringe aber dauerhafte Drücke (10-20mmHg) in Bezug auf die Oberflächenvergrößerung der Haut eine höhere Effektivität zeigen, als vergleichbar hohe intermittierende Drücke.
Die Quellung des Expanders basiert auf der Aufnahme interstitieller Flüssigkeit. Sie ist durch die Materialzusammensetzung und die exponierte Oberfläche des Expanders determiniert [60]. Hierbei ist zu beachten, dass der Dehnung des Expanders physikalische Grenzen
Auch wenn Hydrogelexpander bereits erfolgreich klinisch genutzt werden [44, 60], sind die reaktiven Veränderungen zum jetzigen Zeitpunkt noch wenig untersucht.
1.7.1 Vaskularisation von expandiertem Weichgewebe
Durch den einwirkenden Druck des Ballonexpanders kommt es zunächst zu einer verminderten Durchblutung des Weichgewebes, welche nach drei Tagen wieder physiologische Werte annimmt [62]. Eine Dehnung der Gefäße des Periostes und der Haut hat zunächst eine Verringerung ihres Querschnittes zur Folge. Daraus resultiert eine geringere Blutflussrate und somit ein Perfusionsdefizit innerhalb der bestehenden Gefäße.
Die vorübergehende Hypoxie induziert ihrerseits eine reaktiv gesteigerte Vaskularisation [63], welche die Überlebensrate der expandierten Hautbereiche sowie auch die Angiogeneseaktivitäten in diesen erhöht. Die Verlängerung bestehender Gefäße [64] sowie die Gefäßneubildung [65] führen zu einem gesteigerten Blutfluss in den expandierten Hautarealen mit temporärer Hypervaskularisation. Bei dauerhafter Gefäßdehnung und erhöhter Blutflussrate tritt zusätzlich eine Gefäßdilatation ein.
1.7.2 Histologische ossäre Veränderungen beim Einsatz von Expandern
Die Verwendung von Ballonexpandern kann in den darunter liegenden Hartgeweben zu reaktiven morphologischen Änderungen führen.
Sowohl Resorptionen als auch Perforationen der Schädeldecke wurden bei Kindern und Erwachsenen nach Verwendung von Silikonexpandern mehrfach nachgewiesen [25, 61, 66- 69]. Dabei entstehende Deformitäten bilden sich auch nach Entfernung des Expanders nicht immer vollständig zurück. Daher sollten insbesondere beim wachsenden Knochen keine Expander verwendet werden [61]. Unterhalb der Expanderbasis kommt es zum Knochenabbau, wogegen es in der Peripherie zum periostalen Knochenanbau kommt [25, 61, 68]. Remodellingvorgänge können einerseits durch mechanische Reize aber auch durch zellulär vermittelte Mechanismen induziert werden [61]. Diese Knochenveränderungen treten auch dann auf, wenn der Expander auf der bedeckenden Muskelschicht platziert wird [61].
Eine direkte Platzierung des Expanders auf dem Knochen ist hierbei für das Remodelling des Knochens nicht zwingend erforderlich.
Jedoch ist dieser osteoklasteninduzierte Metabolismus erst bei Überschreiten eines Schwellenwertes zu beobachten [70]. So haben Sato et al. [70] im Tierversuch gezeigt, dass sich unter einem Schwellenwert von 1,96kPa eine Knochenresorption nicht mehr nachweisen lässt.
Eine Verteilung des Druckes mit Hilfe einer Titanplatte zwischen Expander und Knochen kann solche Resorptionen vermeiden [71].
1.8 Intravitalmikroskopie (IVM)
Mit Hilfe der IVM ist es möglich, die Mikrozirkulation von Gefäßen direkt in vivo repetitiv zu beobachten und aufzuzeichnen. Hierzu werden Fluoreszenzfarbstoffe intravenös appliziert und der Blutfluss so sichtbar gemacht. Die so entstehenden Bilder werden anschließend aufgezeichnet und eine spätere offline Analyse ist jeder Zeit möglich.
1.9 Fragestellung und Zielsetzung
In der vorliegenden tierexperimentellen Untersuchung soll die Beeinflussung der Mikrozirkulation des Periostes von expandiertem und nicht expandiertem Weichgewebe beim Einsatz von selbstquellenden Hydrogelexpandern verglichen werden. Zudem sollen die Auswirkungen auf die Osseointegration sowie reaktive Veränderungen zwischen dem isogenen Knochenaugmentat und der Calvaria der Ratte unter dem Aspekt der vorherigen Weichgewebeexpansion dargestellt werden.
Ziel dieser Studie ist die Untersuchung der Angiogenese des Periostes nach der Augmentation von isogenem Knochen bei direkter Defektdeckung von expandiertem und nicht expandiertem Weichgewebe. Dabei soll das Modell des chronischen Untersuchungsfensters verwendet werden. Dieses ermöglicht es mit Hilfe der Intravitalmikroskopie in vivo repetitiv die vaskuläre Mikrozirkulation im Periost zu untersuchen. Außerdem soll der Einfluss der Weichgewebeexpansion auf die Bluttflussbedingungen sowie auf die Osseointegration untersucht werden. Des Weiteren erfolgt die histomorphologische Analyse der daraus resultierenden Osseointegration im Vergleich zwischen präaugmentativ expandiertem und nicht expandiertem Weichgewebe.
Da zum jetzigen Zeitpunkt noch keine Untersuchungen zur Angiogenese nach autogener Knochenaugmentation über dem expandierten Gewebe und dem Periost vorliegen, sind die Untersuchungen zur Minimierung der Komplikationsrate der Knochenaugmentation sowie die Erweiterung des möglichen Einsatzbereiches der Weichgewebeexpander von grundlegender Bedeutung.
2 Material und Methoden 2.1 Versuchstiere
Die Versuche wurden an Lewis-Ratten (männlich, 280-320g, n= 24, isogener Stamm) zu drei Gruppen à acht Tieren durchgeführt. Alle Versuchstiere ließen keine allergischen Reaktionen auf Dextran erkennen. Auf Grund der anatomischen Gegebenheiten der Calvaria eigneten sich Ratten besonders für die Versuche mit miniaturisierten Hydrogelexpandern.
Dabei dienten acht isogene Versuchstiere als Spendertiere für die 16 verwendeten Knochenaugmentate. Hierbei handelt es sich um Tiere gleicher Spezies, aber nicht um ein identisches Tier. Abstoßungsreaktionen lassen sich dadurch weitgehend vermeiden. In Gruppe 1 wurde ein Knochenaugmentat eines Spendertieres direkt über dem Defekt gedeckt, wohingegen bei Gruppe 2 der Defekt erst nach vorheriger Weichgewebeexpansion auf dem Augmentat gedeckt wurde. Eine dritte nicht operierte Gruppe diente als Kontrolle.
2.1.1 Ethische Erklärung
Die Haltung der Tiere und die Durchführung der Versuche entsprachen dem deutschen Tierschutzgesetz (§ 8 Absatz 1 Tierschutzgesetz in der Fassung der Bekanntmachung vom 25. Mai 1998) (BGBl. I Seite 1105) geändert durch Artikel 2 des Gesetzes vom 12.April 2001 (BGBI I Seite 530). Das Tierversuchsvorhaben vom 01.01.2007 war vom Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, Dezernat 33/Tierschutz Oldenburg genehmigt worden. Die Gesamtheit der Versuche wurde im zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführt.
2.1.2 Nahrung und Haltung
Nachdem die Tiere vom Züchter (Charles River) in der Medizinischen Hochschule Hannover (Deutschland) eintrafen, wurde ihnen die Möglichkeit gegeben, sich in den folgenden zwei Tagen vom Transport zu erholen und sich an die neue Umgebung zu gewöhnen.
Dabei hatten alle Ratten identische Haltungsbedingungen:
- Nahrung [Pellet (Standard Diät Haltungsfutter Nummer 1324 Altromin GmbH, Lage/ Westphalen, Deutschland), Wasser ad libitum],
- klimatische Gegebenheiten (20-22°C bei relativer Luftfeuchte von ~ 60%), - Lichtverhältnisse,
- Einzelkäfighaltung und
- Streu (Altromin, Lage/ Westphalen, Deutschland).
Die Tiere hatten einen zwölf Stunden Tag/ Nachtrhythmus.
2.2 Expander
2.2.1 Cupolaexpander
Im Versuch wurden selbst aufquellende Hydrogelexpander der Firma Osmed (Cupola 0,7ml, Firma Osmed, Ilmenau, Deutschland), welche zusätzlich mit einer Silikonhülle umgeben waren, verwendet. Dabei handelt es sich um chemische Stoffe, welche nach der Implantation in der Lage sind, durch Aufnahme interzellulärer Flüssigkeit zu quellen. Die Höhe des Hydrogelexpanders betrug im dehydrierten Zustand 5,0mm und die Grundfläche war kreisförmig mit einem Radius von 3,0mm. Der Expander hatte eine 2,0mm hohe Zylinderform auf der Grundfläche und eine Halbkugelform mit 3,0mm Radius im Aufbau. Das Ausgangsvolumen des Expanders betrug 0,113cm³ (Zylinder: πr²h=56,55mm³; Halbkreis:
4/3Пr³=56,55mm³). Er war mit einer Silikonhülle von 6,0mm Durchmesser ummantelt, welche beidseits verklebt war. Die Silikonhülle war mit zwei Löchern mit einem Durchmesser von jeweils 0,5mm versehen. Der Quellfaktor in vitro war mit sechs angegeben. In 0,9%iger Natriumchlorid-Lösung (NaCl-Lösung) betrug das Volumen nach Expansion 0,7ml (Abbildung 1).
Der verwendete Expander wurde vor der Implantation auf einer Titanplatte (Länge: 13,0mm, Breite: 17,0mm, Dicke: 0,6mm, Synthes, Oberdorf, Schweiz), welche als Druckverteiler fungierte, befestigt. So wurden druckinduzierte Knochenresorptionsvorgänge bei der Quellung vermieden [71].
Direkt nach Einbringen des Expanders begann die Expansion. In in vitro Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, dass durch verschieden große Perforationen der Silikonhülle die Expansionsgeschwindigkeit gezielt beeinflusst werden kann. Das beste Quellverhalten zeigt sich bei zwei 0,5mm großen Perforationen der den Expander umgebenen Silikonhülle wie sie auch in den Versuchen zum Einsatz kamen.
Cupola 0,7ml 2 Löcher in-vitro
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 Zeit in Tagen
Volumen in ml
Cupola 0,7ml 2 Löcher in-vitro
Abbildung 1: Quellkurve in vitro bei Standardbedingungen (Temperatur, Druck) 2.4 Operatives Vorgehen
Der ersten Gruppe (n= 8) wurde präaugmentativ ein Hydrogelexpander für 21 Tage auf die Calvaria inseriert. Für die Implantation wurde in Ketamin/ Xylazin- Narkose (Ketavet, 100mg/kg Körpergewicht, Parke-Davis, Berlin, Deutschland und Rompun 5mg/kg Körpergewicht, Bayer, Leverkusen, Deutschland) der Expander subperiostal am Ort der späteren Knochenaugmentation platziert. Hierfür wurde nach Rasur (PilcaMed®, Schwarzkopf, Deutschland) und Desinfektion (Softasept, Fa. Braun, Melsungen, Deutschland) nuchal der späteren Expanderposition die Cutis und die Subcutis inzidiert. Im Anschluss an die subkutane Präparation erfolgte am kaudalen Rand des Os occipitale eine transversale Inzision des Periostes. Unter zu Hilfenahme eines Rasparatoriums wurde das Periost anterior der Inzision auf einer Fläche von 20,0mm im Durchmesser von der Calvaria abpräpariert. Anschließend erfolgte die spannungsfreie Insertion des auf einer Titanplatte fixierten Expanders im Bereich des Os frontale anterior der Coronarnaht. Der Wundverschluss erfolgte zweischichtig mit je vier atraumatischen Einzelknopfnähten und mit resorbierbaren Ethicon-Vicrylfäden® (Polyglactin 910, sterile, Größe 4,0, Johnson &
Johnson, St.-Stevens-Woluwe, Belgien). Nach 21-tägiger Quellzeit wurde der Expander über den zu Beginn präparierten Zugangsweg entfernt. Bei Gruppe 2 (n= 8) wurde keine Manipulation vor der Augmentation durchgeführt. Im Anschluß daran wurde beiden Gruppen ein 10,0x8,0x0,4mm messendes Knochenaugmentat (Abbildung 2) eines Spendertieres
(Lewis-Ratte, männlich, 280-300g) direkt auf der Calvaria inseriert und anschließend ortständig mit Hilfe von zwei Mikroschrauben (1.0mm, art. no. 400.504, Synthes GmbH, Solothurn, Schweiz) fixiert.
Abbildung 2: Isogenes Augmentat (A) nach Entnahme aus dem Spendertier mit zwei Mikroschrauben sowie nach Augmentation in situ (B)
Nach operativem Wundverschluss wurde fünf Tage post augmentationem bei den Tieren eine Kopfkammer ebenfalls operativ inseriert. Hierfür wurde die Oberhaut oberhalb der Calvaria kreisförmig im Durchmesser von acht Millimetern eröffnet und mit dem subkutanen Bindegewebe vorsichtig entfernt. Anschließend wurde das Periost auf dem Augmentat
A
B
gefäßführende Schicht war unter dem Mikroskop sicher möglich. Die Kammer wurde hierbei so platziert, dass sowohl im Periost auf dem Augmentat, im Übergang Augmentat/ Calvaria sowie direkt auf der Calvaria Untersuchungen möglich waren (Abbildung 3 A). Der Kammerrahmen wurde an den umliegenden Hauträndern (Schnittflächen) austrocknungssicher vernäht (Polyglactin 910, sterile, Größe 5,0, Johnson & Johnson, St.- Stevens-Woluwe, Belgien). Abschließend wurde das Beobachtungsfenster mit Hilfe eines Sprengrings auf der Kammer befestigt. (Abbildung 3 B)
Abbildung 3: Darstellung der Untersuchungspunkte vor Kammerinsertion (A) sowie nach Kammerinsertion (B)
Dabei ist das Periost bis auf die gefäßführende Schicht für die intravitalmikroskopische Untersuchung präpariert (Pfeil).
A: Periost im Bereich auf dem Augmentat B: Periost im Übergang Augmentat/ Calvaria C: Periost direkt auf der Calvaria
A B C A
B
Abbildung 4: Schematische Darstellung der Kopfkammer in der Aufsicht (A) sowie im Querschnitt (B) a: Calvaria unter dem Periost
b: Periost
c: Sprengring zur Befestigung des Beobachtungsglases d: Kopfkammer mit Befestigungsösen
a b
c
d
a b
c
d
B
A
2.5 Intravitalmikroskopie
2.5.1 Beschreibung der Intravitalmikroskopie
Bereits 1839 beschrieb R. Wagner erste intravitalmikroskopische Untersuchungen [72], bei denen Fluoreszenzfarbstoffe zur Kontrastverstärkung eingesetzt wurden [73, 74]. Seitdem wurden die Versuchsmodelle weiter modifiziert und spezifiziert und verschiedene Versuchstiere, je nach Art und Ziel der Versuche, eingesetzt.
Die Fluoreszenzmikroskopie der eigenen Untersuchungen wurde mittels eines modifizierten Zeiss-Mikroskops (Pieper FK 6990 IQ-S, Zeiss Fluoartic, Deutschland) mit einer 100 Watt HBO- Quecksilberlampe (HBO, 100W, OFR, Osram, Augsburg; Gehäuse 100Z, Fa. Leitz GmbH, Wetzlar, Deutschland) bei 20-facher Vergrößerung durchgeführt, das über ein Blau- Filter-Set 09 (BP 450-490, FT 510, LP 515, Leukozyten) sowie ein Grün-Filter-Set 02 (G365, FT 395, LP 420, Erythrozyten) verfügte. Über eine charge- couple device (ccd) Videokamera (FK 6990 IQ-S, Zeiss Fluoartic, Deutschland) war dieses an einen DVD-Rekorder (Panasonic LQ-MS 800, Osaka; Japan) angeschlossen, so dass die auf dem Monitor sichtbare Mikroskopie online aufgezeichnet und zu einem späteren Zeitpunkt offline ausgewertet werden konnte. Dadurch wurde die Untersuchungszeit pro Tier erheblich verkürzt.
Vor jeder Untersuchung wurden zwei zuvor im Verhältnis 1:1 gemischte Fluoreszenzfarbstoffe intravenös in die Schwanzvene der Versuchstiere injiziert, wodurch eine Kontrastverstärkung erzielt wurde. Dabei handelte es sich zum einen um Fluorescein- Isothiocyanat markiertes Dextran (FITC-Dextran für Ratten 15%: 150mg/ml, 0,25ml, MG 150000, Sigma Chemicals # FD-150S, St. Louis, MO, USA), welches Aufnahmen von hoher Auflösung durch Kontrastierung des Blutplasmas erlaubte.
Zum Anderen wurde Rhodamin-6G (0,1% in 0,9% NaCl: 1mg/ml, 2 mol/kg KG, MG 476, Sigma # 83697, Merck, Darmstadt, Deutschland) verwendet, um so Leukozyten [75] und Thrombozyten sichtbar zu machen. Die erreichte Kontrastverstärkung stellte eine hochauflösende Bildgebung der Mikrozirkulation sicher.
Zur Mikroskopie erfolgte die Ruhigstellung des Versuchstieres in Bauchlage auf einem speziell konzipierten Versuchstisch aus Plexiglas. Dadurch war bei gleichzeitiger Minimierung der atmungsabhängigen Kopfbewegungen eine Darstellung des zu mikroskopierenden Bereichs möglich.
Die Intravitalmikroskopischen Untersuchungen wurden in Ketamin-Xylazin Narkose am 5., 8., 10., 14. und 19. Tag post augmentationem vorgenommen.
Abbildung 5: Intravitalmikroskopische Standbildaufnahme der Arteriolen (Pfeil) und Venolen (Pfeilspitze) des Periostes nach Kontrastierung mit FITC- Dextran 150.000 (10-fach) am 5. Tag post-op bei präaugmentativ nicht expandiertem Weichgewebe (A) und expandiertem Weichgewebe (B)
Unter Verwendung der oben beschriebenen Technik wurden in vivo Analysen der Mikrozirkulation bei allen Tieren der drei Versuchsgruppen (Gruppe 1: ohne Expansion, Gruppe 2: mit Expansion, Gruppe 3: Kontrollgruppe) im Bereich des das Augmentat bedeckenden Weichgewebes sowie in unmittelbarer Nachbarschaft im Periost der Calvaria durchgeführt. Die repetitive Aufzeichnung erfolgte für jeweils 30 Sekunden an drei verschiedenen Interessenbereichen (0,18mm²): 1. im Periost auf dem Augmentat (A), 2. im Periost im Übergangsbereich Augmentat/ Calvaria (B) sowie 3. im Periost der Calvaria (C).
Die Körpertemperatur der Tiere wurde mit Hilfe einer Wärmematte während der Mikroskopie konstant bei +36°C gehalten.
A
B
2.5.2 Auswertung der Intravitalmikroskopie
Für die praktische Durchführung wurden drei Messpunkte im Periost (A, B, C) festgelegt.
Zum einen wurden die Aufnahmen im Periostes auf dem Augmentat (A), im Übergangsbereich Augmentat/ Calvaria (B) und zum anderen neben dem Augmentat (C) vorgenommen. Bei 20-facher Vergrößerung erfolgte die Aufnahme alle zwei Minuten/ Tier/
Untersuchungspunkt.
Die Auswertung der aufgezeichneten Daten erfolgte computergestützt (CapImage, Dr. Zeintl, Heidelberg, Deutschland).
Folgende Parameter wurden dabei analysiert:
- funktionelle Gefäßdichte [cm/cm2], - Durchmesser des Gefäßes [ m], - Blutflussgeschwindigkeit [mm/s], - Makromolekulare Extravasation [Ee/Ei],
- Leukozytenanzahl/ 100 m/ min [adhärente und rollende Leukozyten].
Um mikrozirkulatorische Veränderungen des Periostes in vivo untersuchen zu können, wurden intravitalmikroskopische Untersuchungen (siehe 2.5) an Ratten durchgeführt. Die reaktiven Knochenreaktionen wurden mit Hilfe histologischer Verfahren ermittelt.
Abbildung 6: Intravitalmikroskopische Darstellung (Standbildaufnahme) der Kapillaren des Periostes der Calvaria der Ratte im Blaufiltersystem nach Injektion von FITC-Dextran (450-490nm Wellenlänge), (A) und Venolen des Periostes im Grünfiltersystem (420nm Wellenlänge), (B) nach Injektion von Rhodamin-6G zur Anfärbung der Leukozyten:
adhärente Leukozyten (Pfeile) und rollende Leukozyten (Pfeilspitzen)
A
B
2.6 Histologische Aufarbeitung
Für die histologische Auswertung wurden die Versuchstiere 19 Tage nach Knochenaugmentation mittels CO2 betäubt und entsprechend den Bestimmungen für Tierschutz getötet. Anschließend erfolgte die Entnahme der Calvaria für die histologischen Untersuchungen. Hierfür wurde mit Hilfe einer Trennscheibe ein rechteckiges Stück der Calvaria, auf dem das Knochenaugmentat verschraubt war, mit der gesamten darüber liegenden Haut vom Schädel der Tiere entnommen.
Die so erhaltenen Präparate wurden dann zunächst für 24 Stunden in 3,5%igem Formaldehyd (pH 7,4) fixiert und danach gewässert. Im Anschluss daran wurden sie dann für 14 Tage in 10%iger Ethylen-Diamin-Tetraessigsäure (EDTA) (0,3 M Tris-HCl pH 7,4) entkalkt. Schließlich erfolgten eine gründliche Auswaschung und die Vorbereitung der Präparate im Technicon. Danach wurden die Präparate in Parafin eingebettet und geschnitten.
Um mit dem Mikrotom 5µm dicke Schnitte herstellen zu können, war die Kühlung der fertigen Paraffinblöcke obligat. Bevor die Schnitte blasenfrei auf Objektträger aufgezogen wurden, diente 49°C warmes destilliertes Wasser zur Strecku ng der angefertigten Schnitte.
Abschließend wurden die Schnitte nach Standardprotokoll mit Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbt und qualitativ ausgewertet.
Die HE-Färbung erfolgte nach folgendem Schema:
- 2 x 10 min Xylol - 1 min 100 % Alkohol I - 1 min 100 % Alkohol II - 1 min 90 % Alkohol - 1 min 80 % Alkohol - 1 min 70 % Alkohol - 1 min 50 % Alkohol
- abspülen in destilliertem Wasser
- 1,5 min Hämalaun nach Böhmer (Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland), vor Gebrauch frisch filtriert
- 10 min abspülen unter fließendem Leitungswasser - 1 min Eosin (Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland) - kurz in Leitungswasser abspülen
Mittels dieser Färbung konnten basophile Strukturen, wie z.B. Nukleinsäuren, im Zellkern blau dargestellt werden. Im Gegensatz dazu wurden kollagenes Bindegewebe und azidophile Strukturen rötlich angefärbt.
Abbildung 7: Darstellung des kollagenen Bindegewebes (Pfeil) und der Nuklei (Pfeilspitze) in HE-Färbung bei 5-facher Vergrößerung in der Durchbauungszone zwischen Augmentat und Calvaria 19 Tage nach Implantation und 21-tägiger vorangegangener Weichgewebeexpansion, coronal oberer Bildrand
2.6.1 Histologische Auswertung
Analog zur IVM erfolgte die Unterscheidung in Augmentatauflagen- und Randbereich.
Dabei wurden die Knochenveränderungen zunächst qualitativ bewertet. Anschließend erfolgte noch die mikroskopische Beurteilung.
Die Auswertung erfolgte mit Hilfe des Programms ANAlysis (Soft Imaging System GmbH, Münster, Deutschland) und dem Lichtmikroskop Leica DM_4000 B (Leica Camera AG, Solms, Deutschland).
Eine deskriptive Beschreibung der unterschiedlichen Ausprägung der knöchernen Durchbauung zwischen Augmentat und Schädelkalotte ergänzte die qualitative Auswertung.
Dazu wurden die vorhandene und die neu gebildete Knochenarchitektur qualitativ mit der Kontrollgruppe verglichen.
2.7 Statistische Auswertung
Die Datenerfassung erfolgte offline während der Auswertung der DVD- Aufzeichnungen. Die statistische Auswertung und graphische Darstellung wurden mit Hilfe der Programme SigmaStat und SigmaPlot (Jandel Corporation, San Rafael, Californien, USA) durchgeführt.
Die Normalverteilung und die Varianz der Daten aller Gruppen wurde berechnet. Die Ergebnisse wurden als Durchschnittswerte ± SEM ausgedrückt. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mittels one- way ANOVA bewertet und mit anschließenden post hoc Tests verglichen. Unterschiede innerhalb der einzelnen Gruppen wurden mit Hilfe von ANOVA on ranks analysiert. Um die allgemeinen Unterschiede zu erfassen, wurde die Auswertung entsprechend der Student-Newman-Keuls oder der Dunn post-hoc Tests durchgeführt.
Unterschiede wurden als signifikant betrachtet, wenn p < 0,05 war.
3.1 Versuchstiere
Das Körpergewicht der Tiere betrug zwischen 280-320g, ohne dass signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen festzustellen waren. Die Operationszeit zur Expanderimplantation dauerte zwischen 11-18min (Durchschnitt 13,4min). Die Präparationszeit für die Kopfkammer betrug zusätzlich 14-21min (Durchschnitt 18,2min). Da bezüglich der Dauer der Expanderimplantation nach der Kammerpräparation keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen bestanden, kann von einem vergleichbaren Gewebetrauma in den entsprechenden Gruppen ausgegangen werden. Bei allen untersuchten Tieren wurden postoperativ keine Änderungen im Verhalten oder der Nahrungsaufnahme beobachtet. Alle Versuchstiere (n= 24) zeigten postoperativ ein normales Schlaf- und Nahrungsverhalten.
Somit konnten alle Versuchstiere in die Auswertung einbezogen werden.
Für die histologische Auswertung dienten außerdem acht Präparate der Calvaria gesunder unbehandelter Ratten als Kontrollgruppe.
Somit ergab sich folgende Verteilung:
Gruppe Versuchstieranzahl (n)
1. Augmentation ohne Expansion mit Kammerimplantation
8
2. Augmentation mit Expansion mit Kammerimplantation
8
3. Kontrollgruppe mit Kammerimplantation 8
Tabelle 1: Verteilung der Versuchstiere auf die Untersuchungsgruppen 3.2 Expander
Die Verwendung der selbstquellenden Expander ergab über den gesamten Zeitraum der Untersuchungen keine technischen Probleme. Alle eingebrachten Expander führten zur klinisch sichtbaren Expansion der Haut. Die Expander waren bei der Explantation von einer derben Bindegewebshülle ummantelt. Durch die gleich groß gewählten Expander, welche subperiostal inseriert wurden, war die Expansionsgeschwindigkeit bei allen Versuchsgruppen identisch. Somit war ein direkter Vergleich der Ergebnisse zwischen den verschiedenen Gruppen möglich und zulässig.
Abbildung 8: Selbstquellender Hydrogelexpander (Cupola 0,7ml, Firma Osmed, Ilmenau, Deutschland) auf Titanplatte fixiert, prä-op (A) sowie post-op 21 Tage nach Implantation und Entfernung der bindegewebigen Kapsel (B)
Nach 21-tägiger Tragedauer in vivo betrug das Gewicht der Expander 0,56±0,02g. Innerhalb der Gruppen konnte ein homogenes Quellverhalten der Expander festgestellt werden.
3.3 Beobachtungsfenster
Die Kopfkammer ermöglichte über den gesamten Untersuchungszeitraum die sichere Darstellung des den Knochen bedeckenden sowie umliegenden Periostes der Calvaria. Bei
A
B
Die intravitalmikroskopische Untersuchungstechnik ermöglichte die mikrohämodynamischen Parameter für alle Untersuchungsgruppen sowohl im Periost auf dem Augmentat, im Periost im Übergangsbereich Augmentat/ Calvaria als auch in unmittelbarer Umgebung auf dem Periost zuverlässig zu erheben.
Abbildung 9: Intravitalmikroskopische Darstellung der Venolen des Periostes der Calvaria der Ratte im Grünfiltersystem (420nm Wellenlänge) nach Injektion von Rhodamin-6G zur Anfärbung der Leukozyten (10-fach), adhärente Leukozyten (Pfeile) und rollende Leukozyten (Pfeilspitzen) bei: nicht expandiertem Weichgewebe (A) und expandiertem Weichgewebe (B) am 14. Tag post-op
A
B
Die funktionelle Kapillardichte auf dem Augmentat war in der Kontrollgruppe im Vergleich zur Gruppe ohne sowie auch zur Gruppe mit Expansion über den gesamten Untersuchungszeitraum signifikant größer. Ebenso zeigte die Gruppe mit Expansion im Vergleich zur Gruppe ohne Expansion über den gesamten Untersuchungszeitraum eine signifikant höhere Gefäßdichte auf dem Augmentat. Nicht durchblutete Gefäße wurden in der Gruppe ohne Expansion bis zum 8. Tag post augmentationem festgestellt. Eine leichte Erhöhung der Kapillardichte auf dem Augmentat und somit auch der Revaskularisation war nicht vor dem 10. Tag post-op zu beobachten. Vom 5. Tag post-op gab es zwischen dem Periost der Calvaria und dem bedeckenden Weichgewebe in der Gruppe mit vorangegangener Expansion keine signifikanten Unterschiede (Abbildung 10 A).
Im Bereich um den augmentierten Knochen gab es am 8. und 10. Untersuchungstag signifikante Unterschiede innerhalb der Gruppe mit und ohne Expansion. Über den gesamten Versuchszeitraum konnte eine nahezu konstante Gefäßdichte in beiden Gruppen beobachtet werden. Im Gegensatz dazu traten zwischen der Kontrollgruppe und der Gruppe mit und ohne Expansion signifikante Unterschiede über den gesamten Untersuchungszeitraum auf (Abbildung 10 B).
Neben dem Augmentat zeigte die funktionelle Gefäßdichte der Kontrollgruppe über den gesamten Untersuchungszeitraum signifikant größere Werte gegenüber der Gruppe ohne Expansion. Verglichen mit der nicht expandierten Gruppe zeigten sich bei der Kontrollgruppe bis zum 14. Tag post augmentationem eine signifikant größere Gefäßdichte (Abbildung 10 C).
Die Kontrollgruppe zeigte über den gesamten Versuchszeitraum an den drei Untersuchungspunkten eine signifikant höhere Gefäßdichte gegenüber der Gruppe mit und ohne Expansion.
Abbildung 10: Veränderung der funktionellen Gefäßdichte des Periostes auf dem Augmentat (A), im Übergangsbereich Augmentat/ Calvaria (B) sowie neben dem Augmentat (C)
Signifikanzen auf dem Augmentat:
- Kontrollgruppe gegenüber der Gruppe mit sowie ohne Expansion an allen Untersuchungstagen
- Gruppe mit Expansion im Vergleich zur Gruppe ohne Expansion im gesamten Untersuchungszeitraum.
Gefäßdichte [cm/cm2]
0 50 100 150 200
Kontrollgruppe Mit Vordehnung Ohne Vordehnung
Gefäßdichte [cm/cm2]
0 50 100 150 200
Kontrollgruppe Mit Vordehnung Ohne Vordehnung
Tag
5 8 10 14 19
Gefäßdichte [cm/cm2]
0 50 100 150 200
Kontrollgruppe Mit Vordehnung Ohne Vordehnung
# ^
*
#
^
#
^
#
^ #
^
#
^
* * * *
#
^
#
^ #
^
#
^
* *
#
^
#
^ #
^
#
^ A
B
C
#
^
- Kontrollgruppe im Vergleich zur Gruppe mit und ohne Expansion im gesamten Untersuchungszeitraum
- Gruppe mit Expansion gegenüber der Gruppe ohne Expansion am 8. und 10. Tag post augmentationem.
Signifikanzen neben dem Augmentat:
- Kontrollgruppe im Vergleich zur Gruppe ohne Expansion über den gesamten Untersuchungszeitraum
- Kontrollgruppe im Vergleich zur Gruppe mit Expansion bis zum 14. Tag post augmentationem
- innerhalb der Gruppe ohne Expansion vom 5. zum 8. Untersuchungstag.
Die Kontrollgruppe zeigte über den gesamten Versuchszeitraum an den drei Untersuchungspunkten eine signifikant höhere Gefäßdichte gegenüber der Gruppe mit und ohne Expansion.
Werte sind als Mittelwerte +/- SEM angegeben
* p < 0,05 zwischen der Gruppe mit und der Gruppe ohne Expansion,
^ p < 0,05 zwischen der Kontrollgruppe und der Gruppe mit Expansion,
# p < 0,05 zwischen der Kontrollgruppe und der Gruppe ohne Expansion.
Nach vorangegangener Weichgewebeexpansion mit Hilfe des Hydrogelexpanders zeigten sich zwischen dem Periost der Calvaria und dem das Augmentat bedeckenden Gewebe vergleichbare Gefäßdurchmesser mit signifikanten Unterschieden zwischen der Gruppe mit und der Gruppe ohne Expansion auf dem Augmentat über den gesamten Untersuchungszeitraum. Ebenso zeigten die Gefäßdurchmesser der Gruppe mit Expansion im Vergleich zur Kontrollgruppe am 5., 8. und 19. Tag signifikant größere Werte der Gefäßdurchmesser. Die Kontrollgruppe zeigte über den gesamten Untersuchungszeitraum signifikant größere Gefäßdurchmesser gegenüber der Gruppe ohne Expansion. Erst ab dem 10. Tag post augmentationem konnten auf dem Augmentat durchmesserreduzierte Gefäße gegenüber der nicht expandierten Gruppe beobachtet werden, die dann bis zum 19. Tag wieder an Durchmesser zunahmen (Abbildung 11 A).
Im Bereich um das Augmentat wiesen die Kontrollgruppe sowie die Gruppe mit Expansion im gesamten Untersuchungszeitraum signifikant höhere Werte gegenüber der Gruppe ohne Expansion auf. Verglichen mit der Kontrollgruppe zeigte die Gruppe mit Expansion am 5., 8., 10. und 19. Tag signifikant größere Gefäßdurchmesser. Wie auch im Periost im Bereich auf dem Augmentat traten um das Augmentat im Vergleich zur Kontrollgruppe und zur nicht expandierten Gruppe erst ab dem 10. Tag post-op durchmesserreduzierte Gefäße auf (Abbildung 11 B).
Im Vergleich zur Gruppe mit Expansion wurden in unmittelbarer Nachbarschaft zum Augmentat signifikant größere Wert gegenüber der Gruppe ohne Expansion und der Kontrollgruppe auf dem Periost ermittelt.
Im Bereich neben dem Augmentat war der Gefäßdurchmesser am 5. Tag post-op im Vergleich zur Kontrollgruppe sowie zur Gruppe mit Expansion signifikant größer (Abbildung 11 C). Im weiteren Verlauf konnten für beide Versuchsgruppen signifikant größere Werte gegenüber der Kontrollgruppe festgestellt werden.
Abbildung 11: Veränderung des Durchmessers der Gefäße des Periostes auf dem Augmentat (A), im Übergangsbereich Augmentat/ Calvaria (B) sowie neben dem Augmentat (C).
Signifikanzen auf dem Augmentat:
Durchmesser in µm
0 10 20 30 40
Kontrollgruppe Mit Vordehnung Ohne Vordehnung
A
Tag
5 8 10 14 19
Durchmesser in µm
0 20 40 60
80 Kontrollgruppe
Mit Vordehnung Ohne Vordehnung
Durchmesser in µm
0 10 20 30
40 Kontrollgruppe
Mit Vordehnung Ohne Vordehnung
B
^
* A
^
*
^
^
*
C
^
* ^
*
* *
# # # # #
# # # # #
^
* ^
* ^
* *
^
# # ^
#
#
