der Tierärztlichen Hochschule Hannover und der
Abteilung für Klinische und Experimentelle Endokrinologie der Universitäts – Frauenklinik Göttingen
Phytoestrogene Wirkung von Belamcanda chinensis an Uterus und Knochen der ovarektomierten Ratte
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
Vorgelegt von Tamara Becker
Aus Göttingen
Hannover 2002
1. Gutachter: Prof. Dr. H.-O. Hoppen, Hannover 2. Gutachterin: PD Dr. C. Kirchhoff, Hamburg Tag der mündlichen Prüfung: 05.06.2002
1. Einleitung und Zielsetzung 9
2. Literaturübersicht 11
2.1. Phytoestrogene und Hormon-Ersatz-Therapie 12
2.2. Estrogenrezeptoren 12
2.3. Die Wirkung von Estrogenen am Uterus 13
2.3.1. Der „vascular endothelial growth factor“ (VEGF) 14 2.3.2. Der „insulin-like growth factor“ (IGF-1) 15
2.4. Estrogene und der Knochen 15
2.5. SERMs 17
2.6. Belamcanda chinensis 18
3. Material und Methoden 20
3.1. Tierexperimente 20
3.1.1. Versuchstiere und Haltungsbedingungen 20
3.1.2. Ovarektomie 20
3.1.3. Testsubstanzen 21
3.1.4. Applikation der Testsubstanzen 21
3.1.4.1. Akuter Versuchsansatz 21
3.1.4.1.1. Anfertigen eines Venenkatheters 21
3.1.4.1.2. Katheterisierung der Vena jugularis 22 3.1.4.1.3. Intravenöse Applikation der Substanzen 22
3.1.4.1.4. Versuchsende 23
3.1.4.2. Subakuter Versuchsansatz 23
3.1.4.2.1. Versuchsende 23
3.1.4.3. Chronischer Versuchsansatz 23
3.1.4.3.1. Versuchsende 24
3.2. Analytische Methoden 24
3.2.1. Präparation der Gewebeproben aus Knochen und Uterus 24
3.2.1.1. Isolierung von RNA 24
3.2.1.2. Isolierung von Gesamt-RNA 24
3.2.1.3. Reverse Trankription 25
3.2.1.5. TaqMan®-PCR-Assay 27 3.2.1.5.1. Auswahl der Sonden und Primer für die TaqMan®-PCR 29 3.2.1.5.2. Durchführung des TaqMan®-PCR Assays 30 3.2.1.5.3. Das ABI PRISM™ 7700 Sequence Detection System 31 3.3. Messung der Endometrium- und Wanddicke der Uteri 31
3.4. Statistische Auswertung 32
4. Ergebnisse 33
4.1. Uterus 33
4.1.1. Uterusgewicht 33
4.1.2. Wanddicke 36
4.1.3. Endometriumdicke 38
4.1.4. IGF-1 40
4.1.5. VEGF 42
4.2. Knochen 45
4.2.1. IGF1 45
4.2.2. Osteokalzin 47
4.2.3. TGF-β 49
4.2.4. OPG 49
4.2.5. TRAP 50
5. Diskussion 52
6. Zusammenfassung 60
7. Summary 61
8. Literaturverzeichnis 62
9. Anhang 79
9.1 Abbildungsverzeichnis 79
9.2 Tabellenverzeichnis 82
A Adenin
BGP bone Gla-protein BNO Bionorica
C Cytosin
Ca2+ Kalzium
cDNA komplementäre DNA DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxiribonukleosid-Triphosphat DTT Dithioerythrol
E2 Estradiol-17-beta ER Estrogen Rezeptor
ERγ Estrogen Rezeptor gamma ERα Estrogen Rezeptor alpha ERβ Estrogen Rezeptor beta FAM 6-Carboxy-Fluoreszein FET Fluoreszenz-Energietransfer
G Guanin
HE Hämatoxilin-Eosin
HRE hormone response element HRT hormone replacement therapy i.p. intraperitoneal
i.v. intravenös
IGF-1 insulin-like growth factor
IGFBP insulin-like growth factor binding protein KGW Körpergewicht
mRNA messenger- Ribonukleinsäure NaCl Natriumchlorid
OPG Osteoprotegerin ovx ovarektomiert
p.o. per os
PCR Polymerase chain reaction RNA Ribonukleinsäure
SERM selective estrogen receptor modulator ssp. Subspezies
T Thymin
TAMRA 6-Carboxy-Tetramethyl-Rhodamin Taq Thermophilus aquaticus
TE Tris-EDTA
TGF-β transforming growth factor beta TRAP tartrate-resistant acid phosphatase VEGF vascular endothelial growth factor VPF vascular permeability factor
1. Einleitung und Zielsetzung
In der Veterinärmedizin und der Landwirtschaft kennt man schon seit Jahrzehnten Pflanzen bzw. pflanzliche Produkte, denen eine estrogene Wirkung zugeschrieben wird. So treten z.B. in Gebieten mit intensiver Schafhaltung immer wieder Fruchtbarkeitsprobleme nach Aufnahme von Klee (Trifolium ssp.) auf (ADAMS 1981;
ADAMS 1983; LITTLE 1996), durch das Mykotoxin Zearalenon in fusarium- belastetem Futter kann es bei Schweinen zum sog. Hyperestrogenismus der Ferkel kommen (PLONAIT und BICKHARDT 1988), oder sojahaltige Labornagerdiäten führen zu veränderten Ergebnissen in reproduktionsbezogenen Versuchen (PAN et al. 2001; ROBERTS et al. 2000; THIGPEN et al.1999).
Die Humanmedizin richtet ihr Augenmerk weniger auf solche unerwünschten, als vielmehr auf eventuelle positive Wirkungen pflanzlicher Estrogene. Einige dieser sog.
Phytoestrogene werden vor allem in der Gynäkologie zur Linderung klimakterischer Beschwerden eingesetzt. Die Akzeptanz der Patientinnen scheint einem pflanzlichen Präparat gegenüber größer zu sein als gegenüber herkömmlichen tierischen oder synthetischen Estrogenen (GLAZIER und BOWMAN 2001). In der traditionellen Chinesischen Medizin, in der Naturheilkunde oder der Homöopathie sind ebenfalls Pflanzen bekannt, die schon seit Jahrhunderten bei gynäkologischen Beschwerden Verwendung finden.
Eine besondere Eigenschaft, die vielen Phytoestrogenen zugeschrieben wird, ist die eines selektiven Estrogenrezeptor-Modulators, eines sog. SERMs: Auf bestimmte Organe scheinen sie einen erwünschten, positiven estrogenen Einfluß auszuüben, andere Organe hingegen, bei denen herkömmliche Estrogene eher unerwünschte Wirkung zeigen, beeinflussen sie weniger oder überhaupt nicht.
Als seit Jahrzehnten etabliertes Versuchstier wird die Ratte (Rattus norvegicus) häufig auch bei Untersuchungen zu endokrinologischen Fragestellungen eingesetzt.
Trotz ihres nur vier bis fünf Tage dauernden Zyklus zeigen sich zahlreiche Parallelen zur Physiologie des Menschen. Nach Ovarektomie bilden sich innerhalb weniger Wochen Estrogenmangel bedingte Beschwerden heraus, die denen der Frau in der Peri- bzw. Postmenopause weitgehend entsprechen. So dient die ovarektomierte Ratte mittlerweile als Standardmodell für die klimakterische Patientin, wie die zahlreichen Versuche zu diesem Thema beweisen.
Ziel dieser Arbeit soll es sein, anhand von Ergebnissen aus drei unterschiedlichen Versuchen die eventuelle phytoestrogene Wirkung von Extrakten aus dem Wurzelstock des Irisgewächses Belamcanda chinensis an Knochen und Uterus der ovarektomierten Ratte darzustellen und daraus folgend mögliche SERM-artige Eigenschaften dieser Arzneipflanze zu beurteilen. Darüber hinaus soll möglichen Applikationsarten und -zeiträumen Beachtung geschenkt werden.
2. Literaturübersicht
2.1 Phytoestrogene und Hormon-Ersatz-Therapie
Die Phytoestrogene können verschiedenen chemischen Stoffklassen zugeordnet werden, so unterscheidet man beispielsweise die hauptsächlich aus Leguminosen wie z.B. Sojabohnen stammenden Isoflavone, die in Getreide, Früchten und Gemüse auftretenden Lignane, die Coumestane aus Sprossen und Futterpflanzen wie Luzerne sowie die Resorzylsäurelaktone, zu denen einige Mykotoxine der futterverderbenden Pilze zu zählen sind (MURKIES et al. 1998).
All diesen Stoffen gemeinsam ist eine chemische Struktur ähnlich der des Estradiols (s. Abb. 2.1), welche es ihnen ermöglicht, an dieselben Rezeptoren wie dieses zu binden (DIEL et al. 2000; FERRARA 2000; GEHM et al. 1997; KUIPER et al. 1998a;
NIKOV et al. 2000).
Abb. 2.1: Chemische Struktur von Estradiol, Daidzein aus Soja, Coumestrol aus Trifolium ssp. sowie von Tectoridin und Tectorigenin aus Belamcanda chinensis ( LINDNER 1976; KIM et al. 1999;)
In der Behandlung und Vorbeugung menopausaler Beschwerden der Frau spielen Phytoestrogene bereits eine wichtige Rolle. Wegen der Nachteile und Nebenwirkungen der klassischen Hormon-Ersatz-Therapie („hormone replacement
therapy“, HRT), bei welcher Estrogene synthetischer (Estradiol-Valerat) oder tierischer Herkunft (Equilin und Equilenin aus dem Harn trächtiger Stuten) verabreicht werden, stellen Gynäkologen und Patientinnen diese Behandlungsform immer mehr in Frage (AKHMEDKHANOV et al. 2001; MAHAVNI und SOOD 2001).
Einerseits gilt es als bewiesen, daß nach dem physiologischen Erlöschen der Ovarfunktion in der Menopause die künstliche Zufuhr von Estrogenen vor Hitzewallungen („hot flushes“) und Störungen des Allgemeinbefindens (SAHLIN et al.
1994) ebenso schützt wie vor Herz-Kreislauferkrankungen (BANG et al. 2001;
FISHER et al. 2000; KHURANA et al. 2001; TOLBERT und OPARIL 2001), Alzheimer (SIMPKINS et al. 1997; GREEN und SIMPKINS 2000) und Osteoporose (BANG et al. 2001; NASU et al. 2000; PICHERIT et al. 2001a; ROSEN et al. 1998).
Andererseits wird nach Stoffen gesucht, die das ebenfalls nachgewiesene erhöhte Risiko, unter oder nach HRT an malignen Tumoren von Mamma oder Uterus zu erkranken, minimieren helfen (DAVIS et al. 1999; MERRITT 2001a). Nachdem festgestellt worden war, daß asiatische Frauen weitaus seltener unter ihrem Klimakterium litten als europäische oder amerikanische, wurde im Zusammenhang mit der unterschiedlichen Ernährungsweise dieser Gruppen die positive phytoestrogene Potenz des Soja und seiner Inhaltsstoffen Genistein und Daidzein entdeckt (ANTHONY et al. 1998; SETCHELL et al. 2001). Besonders in den USA wird die Zufuhr von Soja und Sojaprodukten über die Nahrung für peri- und postmenopausale Frauen propagiert (CLARKSON et al. 1998; DAVIS 2001;
MERRITT 2001b).
2.2 Estrogenrezeptoren
Für Estrogene (E2) gibt es mindestens zwei, möglicherweise mehr Rezeptoren, die zur Familie der Zinkfinger-Steroidrezeptoren gehören. DÖCKE (1994) beschreibt den Mechanismus der Hormon-Rezeptor-Interaktion wie folgt:
Bindet ein Ligand an einen solchen spezifischen Rezeptor, kommt es zur Konformationsänderung im Rezeptormolekül, wodurch eine Dimerisierung zweier Ligand-Rezeptor-Komplexe möglich wird. Entscheidend für die Hormonwirkung ist die Bindung des Hormon-Rezeptor-Dimers an kurze Nukleotid-Sequenzen in der DNA, die als „hormone response element“ (HRE) bezeichnet werden. Diese punktsymmetrischen DNA-Segmente (Palindrome) beeinflussen als Verstärker- (Enhancer-) Elemente die Transkription und somit die Zellantwort (DÖCKE 1994).
Der schon lange bekannte Estrogenrezeptor α (ERα) ist weitgehend charakterisiert.
1997 allerdings beschreibt DAS einen zusätzlichen estrogenresponsiven Mechanismus in gentechnisch veränderten Mäusen ohne ERα, sog. ERα-„knock-out“
(ERKO) Mäusen (DAS, 1997). Diese Untersuchungen lassen auf einen weiteren Estrogenrezeptor neben ERα schließen. Diesem, ERβ genannten, Estrogenrezeptor (ENMARK et al. 1997; KUIPER et al. 1998b) werden ERα-„Gegenspielerfunktionen“
zugeschrieben. So erlaubt eine Erniedrigung der ERβ-Gen- und Proteinexpression eine höhere Expression des ERα und umgekehrt (PAECH et al. 1997;
PETTERSSON et al. 2000; TEMPLE et al. 2001). Im Jahr 2000 wird die Existenz eines dritten ER, möglicherweise ERγ, in Micropogonias undulatus, einem zur Familie der Sciaenidae gehörenden atlantischen Fisch, von LOOMIS und THOMAS beschrieben (LOOMIS und THOMAS 1999).
2.3 Die Wirkung von Estrogenen am Uterus
Der Uterus ist bei allen bisher untersuchten Säugetierspezies einschließlich des Menschen ein hoch empfindliches Zielorgan für E2. Während des Brunst- bzw.
Menstruationszyklus stimuliert E2 die Proliferation des Endometriums sowie des gesamten Uterus und löst ein präovulatorisches ödematöses Anschwellen des Gewebes aus, was bei der Ratte zu einer hochsignifikanten Gewichtszunahme des Uterus im Proestrus führt. Nach Ovarektomie kommt es zu massiver Regression von sowohl Endo- als auch Myometrium, während unter E2- Substitution bereits nach Stunden oder Tagen wieder eine Proliferation von Endo- und Myometrium sowie ödematöse Schwellung auftreten (DÖCKE 1994). Aufgrund dieser Eigenschaften war der Uterus schon immer im Blickpunkt von Studien für mögliche estrogene Wirkungen von Pharmaka. Diesen sog. uterotropen Effekt von E2 machen sich ebenfalls häufig pharmakologische und toxikologische Test zur Erforschung etwaiger estrogenaktiver Substanzen zunutze (ALTAVILLA et al. 2001; DIEL et al. 2000;
GEHM et al. 1997; LIND et al. 1999; ROSEN 2000a; SAHLIN und ERIKSSON 1996;
WHITTEN et al. 1992).
Vom Menschen ist bekannt, daß chronische Behandlung mit E2 über sowohl ERα als auch ERβ (WEIHUA et al. 2000 ) eine Hyperproliferation des Endometriums auslöst, und somit das Risiko der Entwicklung endometrialer Tumoren vergrößert (PICHERIT et al. 2001b). Allerdings kann diesem Risiko durch ergänzende Behandlung mit
progestagenen Stoffen, die eine Regression bzw. unter chronischen Bedingungen sogar eine Atrophie des Endometriums auslösen, wirksam begegnet werden (POSACI et al. 2001).
2.3.1 Der „vascular endothelial growth factor“ (VEGF)
Die erhöhte Gefäßpermeabilität uteriner Kapillaren wird u.a. durch den „vascular endothelial growth factor“ (VEGF) induziert (HYDER und STANCEL 1999). Dieser auch als „vascular permeability factor“ (VPF) oder Vaskulotropin bekannte Wachstumsfaktor wirkt über einen Mechanismus, welcher für die Angiogenese bei der Wundheilung, besonders aber auch bei der Tumorentstehung eine bedeutende Rolle spielt: Die Wand der Kapillare wird regelrecht fenestriert. Größere Plasmaproteinmoleküle erhalten so die Möglichkeit, das Gefäß zu verlassen. Das so entstehende extravaskuläre Fibringel dient als Substrat für Endothel- und Tumorzellwachstum (FANTI et al. 1998). Ursprünglich wurde VEGF als von Tumoren produziertes Protein angesehen (IGARASHI und YAMAGUCHI 2001).
Dieser Wachstumsfaktor gilt heute als starkes Mitogen speziell für Endothelzellen großer und kleiner Gefäße ohne wahrnehmbare Wirkung an anderen Zelltypen. In vitro regt er die Angiogenese aus mikrovesikalem Endothel in dreidimensionalen Gelen an, die bis zur Bildung kapillärer Strukturen führt (FANTI et al. 1998).
Schon in Blutinseln des Dottersackes, also auf einer sehr frühen Entwicklungsstufe des Individuums, finden sich VEGF-Rezeptoren bei Hämangioblasten (FANTI et al.
1998). Im adulten Organismus ist die Angiogenese jedoch ein eher seltenes Geschehen und bleibt größtenteils auf die schon erwähnte Wundheilung und das Tumorwachstum beschränkt. Eine Ausnahme bilden die weiblichen Fortpflanzungsorgane, wo bedingt durch die zyklischen Auf- und Abbauvorgänge der Neubildung von Gefäßen eine bedeutende Rolle zukommt (HYDER und STANCEL 2000) und VEGF eine verstärkte Kapillareinsprossung in das proliferierende endo- und myometriale Gewebe verursacht. HYDER et al. zeigten in diesem Zusammenhang mehrfach die Beeinflußbarkeit der VEGF-Expression durch Estrogene (HYDER et al. 1996; HYDER und STANCEL 2000; HYDER et al. 2000a) und wiesen schließlich sogar das HRE in dem für VEGF kodierenden Gen nach (HYDER et al. 2000b) .
2.3.2 Der „insulin-like growth factor“ (IGF-1)
Ein weiterer, u.a. die Kapillareinsprossung induzierender Faktor ist der „insulin-like growth factor“-1 (IGF-1), auch bekannt als Somatomedin, ein dem Insulin strukturell und funktionell ähnliches Polypeptid, welches sowohl für das prae- als auch für das postnatale Wachstum sowie für die Organentwicklung von Bedeutung ist (LE ROITH et al. 2001). Seine Expression ist am höchsten in Lebergewebe, inzwischen ist jedoch in so gut wie jedem Gewebe des Körpers IGF-1 nachgewiesen worden, wobei in der Ratte der Uterus nach der Leber das Organ mit der höchsten Expression dieses Wachstumsfaktors darstellt (MURPHY et al. 1987). Im Serum werden die
„insulin-like growth factors“ IGF-1 und IGF-2 werden an spezielle Proteine, die „IGF- binding proteins“ (IGFBP), gebunden transportiert (KNAUER et al. 1981) . Das gebundene IGF kann aufgrund der enormen Molekülgröße des Bindungsproteins die Blutgefäße nicht verlassen und kann somit nicht wirksam werden. IGFBP kann also modulierend auf IGF einwirken (GOMES et al. 2000). Auch im Gewebe liegt IGF an IGFBP gebunden vor (GIUDICE et al. 1993 ). Die ursprüngliche Ansicht, IGF-1 sei allein vom Wachstumshormon (GH) induziert und wirke rein auf endokrinem Wege auf Wachstum und Entwicklung („Somatomedin-Hypothese“), konnte inzwischen widerlegt werden (SJOGREN et al. 1999; YAKAR et al. 1999). Vielmehr wird heute neben der endokrinen auch eine para- und autokrine Wirkungsweise des IGF-1 postuliert (MURPHY et al. 1987) .
Außer von GH wird die Synthese von IGF-1 in hohem Maße von Estrogenen beeinflußt. Sowohl im Uterus (KLEINMAN et al. 1995) als auch im Knochen, auf den später eingegangen werden soll, induziert E2 die Bildung von IGF-1 (ROY et al. 2000;
SAHLIN et al. 1994).
Die Bestimmung dieses Wachstumsfaktors dient ebenso wie die des schon beschriebenen VEGF der Beurteilung estrogener Wirkung bei der Untersuchung uterinen Gewebes (RUTANEN 1998). Wie VEGF stellt auch IGF-1 außerdem ein bedeutendes Element für die Entwicklung von Tumoren dar (FIORE et al. 2001;
SACHDEV und YEE 2001). ZUMKELLER schlägt das IGF-System daher als neue Tumormarker vor (ZUMKELLER 2001).
2.4 Estrogene und der Knochen
E2 ist nicht nur wichtig für einen physiologischen Ablauf der Reproduktion, vielmehr erstrecken sich seine Wirkungen auch auf zahlreiche nicht reproduktionsbezogene
Organe. So erhöht sich, wie bereits erwähnt, durch eine reduzierte oder gar zum Erliegen gekommene E2-Produktion, sei sie nun chirurgisch induziert (Ovarektomie) oder spontan auftretend wie nach der Menopause, das Risiko von Osteoporose (NICHOLS et al. 1984; BANG et al. 2001).
Knochen, besonders solche mit trabekulären Strukturen, werden durch die An- oder Abwesenheit von Estrogenen in hohem Maße beeinflußt. Postmenopausale Frauen ebenso wie ovarektomierte Tiere entwickeln über Jahre (Frauen) bzw. über einige Wochen (Ratten) eine deutliche Reduktion trabekulärer Knochenstrukturen (FANTI et al. 1998; MERRITT 2001a). Zahlreiche Tierversuche belegen die Wirkungen von Estrogenen am Knochen (ARJMANDI et al. 2000; FITTS et al. 2001; PICHERIT et al.
2001b).
Knochengewebe besteht aus Osteoblasten und Osteoklasten, wobei Erstere am Aufbau, Letztere am Abbau der Knochensubstanz beteiligt sind. In einem „gesunden“
Knochen finden diese Vorgänge stets parallel und in einem Gleichgewicht (Homöostase) statt und tragen so zu einer gewissen Dynamik des Knochens bei . Durch Estrogenentzug wird das empfindliche Gleichgewicht zwischen Osteoblasten und Osteoklasten massiv gestört . Beide Zelltypen erhöhen ihre Aktivität, die Osteoklasten werden jedoch aktiver als die Osteoblasten, d.h., der Knochenumsatz ist insgesamt hoch, doch die Reparaturmechanismen stehen hinter dem Abbau zurück, was zur Ausbildung einer Osteoporose, genauer gesagt einer sog. Typ I oder
„high turnover“ Osteoporose, führt (ROSEN 2000b).
Das Osteokalzin oder „bone Gla protein“ (BGP) gilt neben IGF-1 als biochemischer Marker für eine erhöhte Aktivität der Osteoblasten (ROGERS et al. 2000; ROSEN et al. 1998). Osteokalzin ist das bedeutendste nicht-kollagene Protein der Knochenmatrix mit der Funktion, Kalzium (Ca2+) zu binden und so der Mineralisation der neu gebildeten Knochenmatrix zu dienen. Während des Knochenaufbaus wird es zum größten Teil in diese eingebaut und wird bei Knochenabbau durch Osteoklasten wieder frei (HAMWI et al. 2001; ROSEN et al. 1998). Sowohl während dieser katabolen als auch der anabolen Prozesse am Knochen gelangt ein Teil des Osteocalcins ins Blut (MORIYAMA et al. 2000).
Auch der „transforming growth factor beta“ (TGF-β) zeigt die Aktivität von Osteoblasten während eines osteoporotischen Geschehens (MARIE 1997; VAN DESSEL et al. 1999). Gemeinsam mit IGF-1 regt er die Knochenbildung bei ovarektomierten Ratten an (PRESTWOOD et al. 1995). Darüber hinaus soll TGF-β
über die Induktion von Osteoprotegerin (OPG) bei der negativen Regulation der Entwicklung von Osteoklasten mitwirken (GIUDICE et al. 1993; YAKAR et al. 1999).
Osteoprotegerin, auch „osteoclastogenesis inhibiting factor“ (ZANKER und SWAINE 2000) genannt, gehört zur „tumor necrosis factor“ (TNF)-Rezeptorfamilie und wird als ein löslicher, nicht membranassoziierter Rezeptor beschrieben. Wie bereits erwähnt, schützt OPG die Knochensubstanz vor dem Abbau, indem es die Entwicklung von Osteoklasten aus Vorläuferzellen im Knochenmark verhindert. YASUDA (1999) beschreibt den Mechanismus dieser Inhibition als Unterbrechung der Signalübertragung zwischen stromalen und Osteoklasten-Vorläuferzellen (YASUDA et al. 1999) .
Die saure Phosphatase, „tartrat-resistant acidic phosphatase“ (TRAP) wird, außer von Makrophagen und dendritischen Zellen, von Osteoklasten produziert und gilt als Marker für deren Aktivität während des Knochenabbaus (BUTLER et al. 1998;
GIMBEL et al. 2001; KHAMSI und ROBERGE 2001).
All diesen Faktoren wurde eine Abhängigkeit von Estrogenen nachgewiesen ( MARIE 1997; JAFFERALI et al. 2000; BUTLER und LEROITH 2001).
2.5 SERMs
Estrogen übt an zahlreichen Organe seine hormonale Wirkung aus. Durch das Fehlen des Steroides werden, wie bereits dargestellt, Ausfallserscheinungen bedingt.
Die subtile Regulation estrogenrezeptiver Organe scheint aber nicht durch „simple“
Hormonsubstitution mit Estrogen in estrogendefizienten Individuen wiederherstellbar zu sein. Dies zeigt sich am Beispiel des erhöhten Karzinomrisikos für Endometrium und Mamma unter HRT. Die Idealvorstellung für die HRT wäre somit, Stoffe oder Gemische zu entwickeln oder zu beschreiben, die unerwünschte Wirkungen in Uterus und Mamma vermeiden, aber den E2-Mangel in weiteren Organen beheben können (GUSTAFSSON 1998; HALBREICH und KAHN 2000).
In neuerer Zeit wurden solche Substanzen entwickelt. Eine dieser Substanzen ist das erst kürzlich klinisch eingeführten Raloxifen, welches aufgrund seiner
„organselektiven“ Eigenschaften als „selektiver Estrogenrezeptor-Modulator“ (SERM) bezeichnet wird (BRZOZOWSKI et al. 1997). Raloxifen wirkt über Interaktion mit den Estrogenrezeptoren (PIKE et al. 1999, 2000) teils als Agonist, teils als Antagonist von E2 (BARKHEM et al. 1998; BRZOZOWSKI et al. 1997).
Wie bereits beschrieben, wurden parallel zu der Entwicklung von SERMs durch die Pharmaindustrie gezeigt, daß Phytoestrogene, vornehmlich Isoflavone, einen deutlichen Einfluß auf den Verlust von Knochensubstanz sowohl bei klimakterischen Frauen (MEI et al. 2001) als auch bei ovarektomierten Ratten (FANTI et al. 1998;
ROSEN 2000c) haben können. Bei Letzteren konnte außerdem die pulsatile LH- Sekretion, die mit Hitzewallungen in Verbindung steht, von einigen dieser Isoflavone reduziert werden (MCGARVEY et al. 2001; PAN et al. 2001). Somit scheinen auch diese Substanzen ein SERM-artiges Potential zu besitzen. Andere Autoren hingegen verweisen auf Untersuchungen ohne Nachweis positiver Wirkungen von SERMs pflanzlicher Herkunft (DEN et al. 2001; HORN-ROSS et al. 2001).
2.6 Belamcanda chinensis
Die in China, Japan und Korea beheimatete, zu den Iridaceen gehörende Leopardenblume, Belamcanda sinensis (Abb. 2.2), wird als „She Gan“ in der Traditionellen Chinesischen Medizin u.a. zur Behandlung entzündlicher und gynäkologischer Erkrankungen eingesetzt.
Abb. 2.2: Belamcanda chinensis (Foto: BIONORICA, Neumarkt)
Die Droge stellt der geschnittene und getrocknete Wurzelstock dar. Als wirksame Hauptbestandteile sind neben vielen anderen die Isoflavonoide Belamcandinin, Iridin, Irigenin, Tectoridin und Tectorigenin sowie Flavonoide, Ketone, Triterpene, Xanthone und Stilbene bekannt. In vitro erwies sich die Droge u.a. als antifungal und antiviral, in vivo zusätzlich als uterusrelaxierend, schleimlösend und sogar wirksam gegen Leukämie-388-Tumorzellen. Allerdings scheint bei Extrakten aus Rhizoma Belamcandae sinensis, abgesehen von den Hauptbestandteilen Tectoridin und Iridin, die Zusammensetzungen der Inhaltsstoffe durchaus abhängig von der Herkunft der Pflanze zu sein (WAGNER et al. 1999).
3. Material und Methoden
3.1 Tierexperimente
In diesem Abschnitt sollen die Versuchstiere sowie die tierexperimentellen Methoden dargestellt werden.
Genehmigungen für die Tierversuche lagen vor: Az. 509.42502/01-02.98 3.1.1 Versuchstiere und Haltungsbedingungen:
Weibliche Sprague-Dawley Ratten (Fa. Winkelmann) mit einem Körpergewicht von 220-230 g wurden in der Tierexperimentellen Einrichtung des Universitätsklinikums Göttingen unter Standardbedingungen (20° C Lufttemperatur, relative Luftfeuchtigkeit 55 %, Licht von 6.00 Uhr bis 18.00 Uhr, Futter und Wasser ad libitum) in Gruppen zu je 5 bzw. 6 Tieren pro Käfig (Makrolon IV) gehalten.
3.1.2 Ovarektomie
Eine Woche nach Einstellung der Tiere wurden die Keimdrüsen operativ entfernt.
Dazu wurde jede Ratte bis zum Einsetzen der Bewußtlosigkeit einer Etheratmosphäre ausgesetzt und darauf folgend mit Ketamin (Hostaket, Hoechst) und Xylazin (Rompun, Bayer) in einer Dosierung von 11mg/Tier Ketamin (entspr.
45mg/kg KGW) und 2,5 mg/Tier Xylazin (entspr. 10 mg/kg KGW) durch intraperitoneale (i.p.) Injektion narkotisiert.
Beidseitig wurde im Bereich der Flanken das Fell geschoren und das Tier in Seitenlage verbracht. Nach Desinfektion des Operationsgebietes und Eröffnung der Bauchhöhle unter Durchtrennung von Haut und Muskulatur im Winkel zwischen Wirbelsäule und Rippenbogen wurde das nun unmittelbar zugängliche Ovar mittels einer Pinzette vorgelagert und von dem umgebenden Fettgewebe befreit. Das Ovidukt bzw. der distale Anteil der Uterushornspitze wurde mit einer Arterienklemme gequetscht, mit Catgut (3 metric, Ethicon) ligiert und das Ovar mit einem Skalpell abgesetzt. Nach Reposition des Uterushornes in die Bauchhöhle wurde diese durch einschichtigen Verschluß der Muskulatur mittels eines einfachen Knopfheftes unter Verwendung von Catgut (s.o.) geschlossen. Eine Adaptation der Wundräder der Hautwunde wurde durch Michel-Klammern (Martin) erreicht. Die Entfernung des zweiten Ovars erfolgte auf der anderen Körperseite in gleicher Weise.
Zur Vermeidung exsikkotischer Zustände erhielten die Ratten post operationem je 5ml isotone NaCl-Lösung (Braun) subkutan (s.c.). Die Aufwachphase wurde durch i.p. Injektion von 0,25 mg/Tier (entspr. 1mg/kg KGW) Atipamezolhydrochlorid (Antisedan, Pfizer) verkürzt.
3.1.3 Testsubstanzen
Estradiol (Sigma) und ein Extrakt aus dem Rhizom von Belamcanda chinensis mit der Bezeichnung BNO 1420 (Bionorica) bzw. Tectoridin und Tectorigenin (Bionorica) wurden jeweils in 2 %igem Cremophor (BASF) gelöst. Die Estradiollösung erhielt dabei eine Konzentration von 50 nMol/ml. Die Tectoridin- bzw. Tectorigeninlösung erhielten jeweils eine Konzentration von 3,5 mg/ml, der Belamcanda-chinensis- Extrakt wurde mit 62,5 mg/ml eingesetzt. Als Kontrollsubstanz diente eine reine 2%ige Cremophorlösung. Zur Herstellung und Konzentration des Testfutters siehe Abschnitt 3.1.4.3.
3.1.4 Applikation der Testsubstanzen
Die Substanzen wurden in drei gesonderten Versuchsansätzen über verschiedene Zeiträume hinweg verabreicht: akut als einmalige intravenöse Applikation, subakut über 7 Tage mittels subkutaner Injektion und chronisch oral über 3 Monate per Futterpellets. Da Tectoridin und Tectorigenin in ihrer Herstellung sehr aufwändig und schon wenige mg der Reinsubstanzen dementsprechend kostspielig waren, mußte auf ihren Einsatz im Futterversuch verzichtet werden.
3.1.4.1. Akuter Versuchsansatz
Der akute Versuch wurde mit 18 Tieren in drei Gruppen zu je 6 Tieren durchgeführt.
Um die Wirkung der Substanzen möglichst ohne Beeinflussung durch den Stress einer intravenösen Injektion untersuchen zu können, wurden den Tieren zentrale Venenkatheter implantiert, durch welche es möglich war, am nächsten Tag ohne direkte Manipulation dem wachen und frei beweglichen Tier die jeweilige Testsubstanz intravenös zu verabreichen.
3.1.4.1.1 Anfertigen eines Venenkatheters
In der Mitte eines ca. 20 cm langen Stückes Silikonschlauch (Medical Grade Silicone Tubing, Sedat) mit einem Innendurchmesser von 0,5 und einem Außendurchmesser
von 0,9 mm wurde ein ca. 0,5 x 1 cm großes Fähnchen aus Silikongewebe (Perthèse, LPI) befestigt und mittels Silikonkautschuk (Elastosil, Wacker-Chemie) mit dem Schlauch verklebt. Das eine Ende dieses Schlauches wurde auf eine abgesägte und leicht gebogene Spitze einer 22 G Luer Lock Einmal-Injektions- Kanüle (Sterican, Braun) aufgeschoben.
3.1.4.1.2 Katheterisierung der Vena jugularis
Zwei Wochen nach der Ovarektomie wurde den Ratten unter Ethernarkose ein zentraler Venenkatheter gelegt. Dazu wurde das jeweilige Tier in Rückenlage gebracht und an der ventralen Halsseite rechts paramedian im Winkel zwischen Clavicula und Trachea ein Hautschnitt angelegt. Nach behutsamer stumpfer Präparation der Unterhaut und der Faszie wurde in die nun freiliegende Vena jugularis externa auf Höhe der Insertionsstelle der Vena subclavia der Katheter eingeführt. Dazu wurde das Tier in die Hand genommen, durch leichtes Vorwölben des Brustkorbes die Vene gestaut und die mit dem Silikonschlauch verbundene Kanülenspitze von cranial nach caudal ein- und wieder ausgestochen. Der Schlauch wurde bis zum Fähnchen durchgezogen und ca. 1cm lang abgeschnitten. Nun wurde das abgeschnittene Ende bis ins Venenlumen zurückgeführt und im Gefäß nach caudal vorgeschoben. Die Durchgängigkeit des Katheters wurde mit verdünnter Heparinlösung (50 U/ml Liquemin, Roche) getestet. Das Silikonfähnchen diente der sicheren Fixation des Katheters und wurde unter der Subcutis eingenäht. Nach Verschluß der Hautwunde wurde eine Venenpunktionskanüle nach Strauss (Braun) subkutan vom Nacken bis zur Halswunde geführt, der Katheterschlauch durch diese Kanüle hindurch geschoben und anschließend die Kanüle wieder entfernt. Im Nackenbereich wurde nach 1 cm langem Hautschnitt eine subkutane Tasche angelegt und der Silikonschlauch dort bis zum nächsten Tag verstaut. Der Schnitt wurde mit einem einfachen Hautheft verschlossen. Die Tiere verbrachten die Nacht in Einzelkäfigen, um gegenseitiges Benagen und eventuelles Durchbeißen und Entfernen der Katheter zu vermeiden.
3.1.4.1.3 Intravenöse Applikation der Substanzen
Am nächsten Tag wurde das Hautheft geöffnet, der Katheterschlauch aus der Hauttasche hervorgezogen und mit dem Konus einer 20 G Kanüle verbunden. Nach
Prüfen der Durchgängigkeit der Katheter mit Heparinlösung wurden den Ratten die Testsubstanzen im Bolus verabreicht. Der Schlauch wurde anschließend tierkörpernah verknotet und abgesetzt, der Hautschnitt mit einer Michelklammer verschlossen. Jegliche Manipulation erfolgte möglichst kurz und für die Ratten stressarm.
3.1.4.1.4 Versuchsende
6 Stunden nach der Applikation wurden die Tiere unter Ethernarkose mit Hilfe einer Guillotine dekapitiert. Das Blut wurde aufgefangen, der Uterus und die distale Femur- Metaphyse wurden entnommen, der Uterus auf einer Analysenwaage gewogen und die Organe unverzüglich in flüssigem Stickstoff eingefroren.
3.1.4.2 Subakuter Versuchsansatz
Für den subakuten Versuch wurden 50 Ratten in 5 Gruppen zu je 10 Tieren eingesetzt.
Beginnend zwei Wochen nach der Ovarektomie wurde den Tieren über einen Zeitraum von 7 Tagen täglich in den frühen Morgenstunden je 1ml Estradiol-, Belamcanda-, Tectoridin-, Tectorigenin- bzw. Cremophorlösung s.c. injiziert. Dabei wurde darauf geachtet, die Kontrollgruppe jeweils zuerst, die Estradiolgruppe zuletzt zu behandeln und zwischen den einzelnen Gruppen die Schutzhandschuhe zu wechseln, um ein Verschleppen estrogener Substanzen in andere Gruppen zu verhüten.
3.1.4.2.1 Versuchsende
Am 7. Tag wurde 6 Stunden nach der letzten Injektion mit den Ratten entsprechend der unter Nr. 3.4.1.1.4 dargestellten Vorgehensweise verfahren.
3.1.4.3 Chronischer Versuchsansatz
An diesem Versuch nahmen insgesamt 60 Tiere teil. Die chronische Applikation der Testsubstanzen erfolgte über das Futter. Vom Tag ihres Eintreffens in der Tierexperimentellen Einrichtung an wurden die Ratten in Versuchsgruppen zu je 12 Tieren mit den verschiedenen Testfuttern gefüttert. Das Futter wurde von der Firma ssniff (Soest) als phytoestrogenarme Sondermischung ohne Soja auf der Basis von Getreide und Molke unter Zusatz der jeweiligen Testsubstanz (Estradiolbenzoat: 68
mg / kg Futter; Belamcanda-cinensis-Extrakt in Konzentrationen von 50, 200 und 1000 mg/100 g Futter) in einer Pelletgröße von 10 mm hergestellt. Die Kontrollgruppe erhielt das Grundfutter ohne Zusatz. Den Tieren stand ausschließlich das jeweilige Testfutter zur Verfügung. Um eine gleichmäßige Futteraufnahme aller Gruppen sicherzustellen, wurde die Futteraufnahme zweimal wöchentlich, das Körpergewicht der Tiere zweimal monatlich sowie zu Beginn und Ende des Versuches kontrolliert.
3.4.1.3.1 Versuchsende
Dekapitation und Organentnahme fanden entsprechend Nr. 3.1.4.1.4 und Nr. 3.1.4.2.1 3 Monate nach Ovarektomie statt.
3.2 Analytische Methoden
3.2.1 Präparation der Gewebeproben aus Knochen und Uterus 3.2.1.1 Isolierung von RNA
Um RNase- Aktivitäten möglichst gering zu halten, galten grundsätzlich folgende Vorsichtsmaßnahmen für das Arbeiten mit RNA:
Sämtliche Arbeitsschritte wurden mit Ethanol-desinfizierten Handschuhen, zügig und auf Eis durchgeführt. Alle Glasgefäße wurden bei 240°C für 12 Stunden sterilisiert, sämtliche anderen Materialien für 30 Minuten bei 120°C autoklaviert. Alle Lösungen wurden für ca. 3 Stunden mit 0,1% Velcorin (Dimethylpyrocarbonat, Bayer) behandelt, welches RNasen durch kovalente Modifikationen inaktiviert. Anschließend konnten die Lösungen wie oben angegeben autoklaviert werden. Reagenzien wie Tris und Dithioerythrol (DTT), die durch Autoklavieren zerstört worden wären, wurden als kommerziell erhältliche RNase-freie Stammlösungen verwendet.
3.2.1.2 Isolierung von Gesamt-RNA
Die Gewebefragmente wurden mit einem Mikro-Dismembrator (B. Braun Biotech International) mechanisch zerkleinert, mit 0,4 ml Lysispuffer versetzt und 15
Sekunden im Ultraschallbad homogenisiert.
Die Präparation von Gesamt-RNA eignet sich zur Bearbeitung zahlreicher
Parallelbestimmungen in Zellkulturen und Geweben. Die Präparation wurde mit Hilfe
des RNeasy® - Systems (Qiagen) durchgeführt und die RNA - Konzentration in einem BioPhotometer® (Eppendorf) gemessen.
Anschließend konnten die Proben direkt weiter verarbeitet oder bei – 70° C gelagert werden.
3.2.1.3 Reverse Transkription (RT)
Durch die RNA-abhängige DNA-Polymerase Reverse Transkriptase wird mRNA in cDNA umgeschrieben. Um eine kurzen, doppelsträngigen Startbereich für das Enzym zu erhalten, können sequenzspezifische Primer, „random“-Hexamere oder Oligo-Primer eingesetzt werden.
Die reverse Transkription wurde mit dem Ribomax® - Präamplifikationssystem (Qiagen) durchgeführt. Das in diesem System verwendete Enzym weist keine RNAse-Aktivität auf, so dass ein vorzeitiger Abbau der RNA während der Transkriptionsreaktion vermieden wird. Diese Eigenschaft ist besonders bei Arbeiten mit sehr geringen RNA-Mengen vorteilhaft (TSE und FORGET 1990).
Reaktionsansatz (Endvolumen 20 µl):
1-10 µl Gesamt- bzw. mRNA 1 µl Oligo-dT-Primer (0,5 mg/ml) 0-9 µl Velcorin-H2O
Dieser Reaktionsansatz wurde, um Sekundärstrukturen der RNA zu zerstören, 10 Minuten bei 70° C inkubiert, auf Eis abgekühlt, kurz zentrifugiert und mit folgenden Reagenzien versetzt:
4 µl 5fach Synthesepuffer 2 µl 0,1 M DTT
1 µl 10 mM dNTP-Mix
0,5 µl RNase-Inhibitor (40 U/µl)
1 µl Reverse Transkriptase (200 U/µl)
Der Reaktionsansatz durchlief im Thermocycler folgende Inkubationsschritte:
10 min Primer-Annealing bei 22° C 50 min Gegenstrangsynthese bei 42° C 10 min Denaturierung bei 95° C
Die Proben wurden auf Eis abgekühlt und nach kurzem Zentrifugieren sofort in die PCR eingesetzt oder bei –70° C eingefroren.
3.2.1.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Durch die PCR wird ein schnelle und hocheffektive Amplifikation selbst von kleinsten Mengen an DNA ermöglicht (MULLIS et al. 1992). Hierbei wird die Eigenschaft von DNA-Polymerasen genutzt, einen DNA-Einzelstrang zum Doppelstrang aufpolymerisieren zu können, sofern ihnen ein kurzer, doppelsträngiger DNA-Bereich zur Verfügung steht. Aus den Randbereichen der zu amplifizierenden DNA-Region (=Template) werden chemisch zwei Oligonukleotide (=Primer) synthetisiert, die strangspezifisch (=komplementär) zu diesen Randbereichen sind. Diese als Primer bezeichneten Oligonukleotide hybridisieren an die komplementären Sequenzen des Templates, und der entstehende doppelsträngige Bereich mit einem freien 3´-OH- Ende dient als Startpunkt für die DNA-Polymerase. Die entstandenen Doppelstränge werden durch Hitze in Einzelstränge zerlegt, welche wiederum als Matrize für die Polymerase dienen. Durch die Wiederholung der Reaktionsfolge DNA- Denaturierung, Hybridisierung der Primer und Polymerasereaktion kommt es bei jedem Schritt zu einer Verdopplung der Template-DNA. Für die Reaktion wird die thermostabile Taq-DNA-Polymerase (isoliert aus Thermus aquaticus) eingesetzt.
Dieses Enzym besitzt ein Temperaturoptimum von 70° C und ist kurzzeitig bis 95° C stabil und wird während der Hitzedenaturierung der Doppelstrang-DNA nicht denaturiert. Dadurch wird vermieden, dass nach jedem Reaktionszyklus neues Enzym hinzugefügt werden muß. Darüber hinaus zeichnet sich diese Polymerase durch eine hohe Prozessivität aus, so dass DNA-Fragmente von mehreren Kilobasen Länge amplifizierbar sind.
Aufgrund der extrem hohen Sensitivität dieser Amplifikationsreaktion war darauf zu achten, dass das Arbeiten mit PCR-Produkten streng räumlich getrennt vom sogenannten Prä-PCR-Bereich durchgeführt wurde, um Kontaminationen in den folgenden Reaktionen zu vermeiden. Aus demselben Grund war die Durchführung einer Kontroll-PCR ohne Template in jeder Versuchsreihe obligatorisch.
3.2.1.4.1 Wahl, Synthese und Aufreinigung der PCR-Primer
Bei der Wahl der Primer wurde darauf geachtet, dass die Länge möglichst zwischen 20 und 30 Basen lag, der GC-Gehalt für beide möglichst gleich war und nicht mehr als 60 % betrug. AT- und GC-reiche Regionen sowie Strecken mit Polypurinen und Polypyrimidinen sollten vermieden werden, und die Primerpaare sollten keine komplementären Strukturen besitzen. Diese Kriterien wurden mit Hilfe des Computerprogramms DNAsis (PHARMACIA, Freiburg) für jedes Primerpaar überprüft. An die 5´-Enden der Primer wurden Schnittstellen für geeignete Endonukleasen angefügt, um ein direktes Klonieren der PCR-Produkte zu ermöglichen. Es wurden unterschiedliche Schnittstellen ausgewählt, um die Orientierung des Fragmentes im Vektor festzulegen.
Die Synthese der Primer wurde kommerziell von der Firma BIOMETRA (Göttingen) durchgeführt.
Die Aufreinigung der Primer erfolgte über NAP-5-Säulen (Qiagen). Zunächst wurden die Oligonukleotide durch zweistündiges Spülen mit 1 ml 25 %iger Ammoniaklösung von der Säulenmatrix gelöst und anschließend zur Entfernung der Schutzgruppen das Eluat in einem Eppendorff-Reaktionsgefäß mit Gummidichtung über Nacht bei 56° C inkubiert. Die Lösung wurde in einer Vakuum-Zentrifuge getrocknet. Das Pellet wurde in 500 µl TE-Puffer (pH 7,5) resuspendiert, auf eine mit 10 ml TE-Puffer kalibrierte NAP-5-Säule aufgetragen und mit 1 ml TL-Puffer eluiert. Die Konzentration wurde photometrisch bestimmt. Die Lagerung der Primer erfolgte in geeigneten Aliquots bei –20° C.
3.2.1.5 TaqMan- PCR Assay
Der TaqMan-PCR Assay (Applied Biosystems GmbH, Weiterstadt) ermöglicht Amplifikation und Nachweis des PCR-Produktes simultan in einem Reaktionsgefäß.
Die Methode basiert auf der 5´-3´- Exonukleaseaktivität der AmpliTaq DNA Polymerase. Es wird eine spezielle fluorogene Sonde eingesetzt ,die aus einem Oligonukleotid besteht, dessen 5´-Ende mit einem fluoreszenten Reporter-Farbstoff (Fluoreszein-Derivat) markiert ist, während das 3´-Ende einen Quencher-Farbstoff (Rhodamin-Derivat) trägt und außerdem mit einem Phosphatrest blockiert ist. Wird die intakte Sonde bei einer spezifischen Wellenlänge (488 nm) zur Fluoreszenz angeregt, so wird die Fluoreszenz des Reporter-Farbstoffes aufgrund der räumlichen
Nähe zum Quencher durch einen Fluoreszenz-Energietransfer (FET) unterdrückt.
Während der PCR hybridisiert die Sonde mit den Primern zunächst an den Matrizenstrang. In der Extensionsphase trifft die Taq Polymerase nun auf diese Sonde und beginnt diese zu verdrängen. Es entsteht eine Y-förmige Sekundärstruktur, wodurch die 5´-3´-Exonukleaseaktivität der AmpliTaq DNA Polymerase aktiviert und die Sonde hydrolysiert, d.h. geschnitten wird. Freie, nicht- hybridisierte Sonde wird hingegen nicht hydrolysiert. Kommt es allerdings zur Sondenhydrolyse, so wird die räumliche Nähe und damit auch der FET zwischen Reporter und Quencher unterbrochen und die Fluoreszenz des Reporterfarbstoffes kann gemessen werden. Entsprechend der Akkumulation von PCR-Produkt steigt die Fluoreszenz des Reporters also mit jedem PCR-Zyklus an. Das dabei gebildete Signal ist strikt sequenzspezifisch, da alle nicht 100 %ig gebundenen Sondenmoleküle verdrängt werden, bevor die Exonukleaseaktivität der Taq Polymerase aktiviert wird. Der Anstieg der Fluoreszenz wird mit Hilfe des ABI PRISM™ 7700 Sequence Detektors im geschlossenen Reaktionsgefäß Zyklus für Zyklus erfaßt.
Die Quantifizierung der Fluoreszenzänderung erfolgt über die Berechnung einer Standardkurve.
Die Produktmenge wächst in der PCR exponentiell, erreicht jedoch irgendwann ein Plateau. Unter idealen Bedingungen ergäbe sich für die Anzahl der amplifizierten Moleküle (N) folgende Gleichung:
N=N0x2n,
wobei N0 die Anzahl der Ausgangsmoleküle und n die Anzahl der Amplifikationszyklen beschreibt.
Da die Reaktionseffizienz (E) durch Sequenz und Lage der Primer und der zu amplifizierenden Ziel-DNA sowie Verunreinigungen und die Prozessivität der Taq Polymerase beeinflußt wird, wird die Gleichung besser folgendermaßen formuliert:
N=N0(1+E)n.
Zur Erstellung einer Standardkurve wird diese Gleichung in ihre logarithmierte Form umgeschrieben:
logN=logN0+n log(1+E).
Eine Standardkurve muß über ≥5 Standardstufen verfügen. In dieser Arbeit wurden Standardkurven mit den Intervallen einer 1:10 Verdünnung verwendet.
3.2.1.5.1 Auswahl der Sonden und Primer für die TaqMan®-PCR Einige Punkte sollten bei der Auswahl der Sonde berücksichtigt werden:
1. Das 5´-Ende der Sonde sollte sich in relativer Nähe des 3´-Endes des PCR- Primers befinden.
2. Die Sondenlänge sollte 20-30 Basen umfassen.
3. Der GC-Gehalt sollte 40-60% betragen.
4. Am 5´-Ende der Sonde darf kein G liegen.
5. Es darf nie mehr als dreimal dieselbe Base hintereinander liegen.
6. Sonde und PCR-Primer dürfen nicht komplementär zueinander sein.
7. Auffällige Sekundärstrukturen (z.B. hairpin-loops) sollten vermieden werden.
Die eingesetzten Sonden sind an ihrem 5´-Ende mit dem Farbstoff FAM (6-Carboxy- Fluoreszein) und an ihrem 3´-Ende mit dem Farbstoff TAMRA (6-Carboxy- Tetramethyl-Rhodamin) markiert.
Für die Auswahl der Primer gelten die schon in Abschnitt 3.2.1.4.1 genannten Kriterien.
Folgende Sonden und Primer wurden in dieser Arbeit verwendet:
IGF-1:
sense-Primer: 5´-TGT CGT CTT CAC ATC TCT TCT ACC TG-3´
antisense-Primer: 5´-CCA CAC ACG AAC TGA AGA GCG T-3´
Sonde: 5´-FAM-TTA CCA GCT CGG CCA CAG CCG GAC-TAMRA3´
VEGF:
sense-Primer: 5´-GGG AGC AGA AAG CCC ATG A-3´
antisense-Primer: 5´-GCT TGA AGA TAT ACT CTA TCT CAT CGG G-3´
Sonde: 5´-FAM-TAC CAG CGC AGC TAT TGC CGT CCG ATT G-TAMRA3´
Osteokalzin:
sense-Primer: 5´-CCA AGC CCA GCG ACT CTG A-3´
antisense-Primer: 5´- AGG TAG CGC CGG AGT CTA TTC-3´
Sonde: 5´FAM-CCT TCA TGT CCA AGC AGG AGG GCA GT -TAMRA3´
TGF-β:
sense-Primer: 5´-GGG CTT TCG CTT CAG TGC T-3´
antisense-Primer: 5´-TCG GTT CAT GTC ATG GAT GGT-3´
Sonde: 5´FAM-TCA GTC CCA AAC GTC GAG GTG ACC TG-TAMRA3´
OPG:
sense-Primer: 5´-CCT CTT TCT TTC TGC CTC TGA TAG TC-3´
antisense-Primer: 5´-CCA AGT CTG CAA CTC GAA TCA AAT-3´
Sonde: 5´FAM-CGT ATC AGG TGC ACG AGC CTT ATC CCA-TAMRA3´
TRAP:
sense-Primer: 5´-GAT CAC CTT GGC AAT GTC TCG-3´
antisense-Primer: 5´-GGC TGA CAA AGT CGT CGG AAT-3´
Sonde: 5´FAM-TGC CTA CTC CAA GAT CTC CAA GCG CTG-TAMRA3´
3.2.1.5.2 Durchführung des TaqMan-PCR Assays:
Die Erstellung einer Standardkurve erfolgte mit 1:10-Verdünnungsschritten.
Für die TaqMan-PCR wurden bei einem Reaktionsvolumen von 25 µl folgende Reagenzien benötigt:
12,5 µl 2x Puffer
2,5 µl sense-Primer (300nM) 2,5 µl antisense-Primer (300nM) 2,5 µl Sonde (225nM)
3 µl Ampuwa 2 µl cDNA
Diese Reagenzien wurden in eine 96-well Microtiterplatte (MicroAmp Optical 96- well reaction plate, Fa. PE Applied Biosystems, Weiterstadt) pipettiert, und die Platte mit optischen Deckeln (MicroAmp Optical caps, Fa. Applied Biosystems, Weiterstadt) verschlossen.
Zur Analyse wurde die Microtiterplatte in das ABI PRISM 770 Detection System überführt.
3.2.1.5.3 Das ABI PRISM 7700 Sequence Detection System
Das ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (7700 SDS, Fa. PE Applied Biosystems, Weiterstadt) verfügt über einen eingebauten Thermocycler, in welchem die Proben 40mal den folgenden Zyklus durchlaufen:
Start:
2 Minuten 50°C 10 Minuten 95°C Zyklus:
15 Sekunden 95°C 1 Minute 60°C.
Über den Reaktionsgefäßen der Microtiterplatte befindet sich eine Linse, die den Strahl eines Argon-Lasers (488 nm) in die Gefäße weiterleitet, wodurch eine Fluoreszenzanregung erfolgen kann. Die Fluoreszenzemission wird über denselben optischen Leiter gemessen.
Die Steuerung des gesamten Systems leistet ein Power Macintosh 4400.
3.3 Messung der Endometrium- und Wanddicke der Uteri
Jeweils von einer Uterushälfte, d.h. je einem Uterushorn, wurde ein histologisches Präparat hergestellt. Die Fixierung der Organe erfolgte in einem Gewebeeinbettautomaten (TP 1020, Leica). Anschließend wurden die Präparate mit Hilfe einer modularen Paraffinausgießstation (EG 1160, Leica) in Paraffinblöcke gegossen und mit einem Microtom (RM 2135, Leica) quer in Schnitte von 2-4 µm Dicke geschnitten. Diese Schnitte wurden auf positiv geladene Objektträger (Superfrost plus, Hersteller) aufgebracht und mit Hämatoxilin/Eosin gefärbt. Mit einer Kamera (Color View 12, SIS) wurde von dem im Mikroskop (Axiophot, Zeiss) sichtbaren Präparat jeweils bei 50- bzw. 250facher Vergrößerung ein Bild aufgenommen und an einen Rechner mit Bildverarbeitungsprogramm (AnalySIS®, SIS) übertragen. Dort wurde die Dicke der gesamten Wand bzw. des Endometriums bestimmt.
3.4 Statistische Auswertung
Die Uterusgewichte, Wanddicke und Endometriumdicke sowie die PCR-Signale und TaqMan-Analysen wurden mit GraphPad Prism (GraphPad Software), Version 3.0 für Windows (Microsoft) statistisch ausgewertet. Bei den TaqMan-Ergebnissen wurde jeweils der Mittelwert der Kontrollgruppe gleich 100 Prozent gesetzt, d.h. die Ergebnisse wurden prozentrelativiert. Es wurden für jede Untersuchungsgruppe Mittelwert und Standardfehler ermittelt und im Ergebnisteil (Abschnitt 4 ff.) in Klammern wie folgt angegeben: „(Mittelwert ± Standardfehler)“. Außerdem wurde für jeden untersuchten Parameter eine Varianzanalyse mit Dunnett´s Post Test durchgeführt. Als Referenzgruppe diente jeweils die Kontrolle. Abweichungen von der Kontrolle mit einem p ≤ 0,05 wurden als signifikant gewertet und werden im Ergebnisteil mit dem Symbol „ * “ über der entsprechenden Säule im Graphen gekennzeichnet.
4. Ergebnisse
4.1 Uterus
Zunächst sollen die uterusbezogenen Ergebnisse dargestellt werden. Dabei werden zuerst die morphologischen Daten wie Uterusgewicht und Wand- bzw.
Endometriumdicke, danach die molekularbiologischen Daten beschrieben.
Zur Illustration der Ergebnisse in 4.1.1, 4.1.2 und 4.1.3 dienen die Abbildungen 4.4.und 4.5, 4.7 und 4.8 sowie 4.10 und 4.11.
4.1.1 Uterusgewicht
Nach einmaliger intravenöser Applikation der Testsubstanzen zeigt sich ein signifikanter, fast dreifacher Anstieg des Uterusgewichtes unter E2 (345,0 ± 11,8 mg) im Vergleich mit der Kontrollgruppe (122,6 ± 5,6 mg). Tectorigenin führt hingegen zu einer geringfügigen, nicht signifikanten Gewichtsverringerung (102,4 ± 4,7 mg) (Abb. 4.1).
Abb. 4.1: Einfluß von Estradiol und Tectorigenin auf das Uterusgewicht ovarektomierter Ratten 6 Stunden nach einmaliger intravenöser Applikation
Nach einwöchiger, täglicher subkutaner Applikation der Testsubstanzen ist unter E2
ein signifikanter, etwa 2,5facher Anstieg des Uterusgewichtes (317,0 ± 35,3 mg) gegenüber der Kontrolle (137,0 mg ± 13,7) zu bemerken. Weder Belamcanda chinensis (126,5 ± 6,2 mg), noch Tectoridin (124,8 ± 8,5 mg) oder Tectorigenin (128,7 ± 7,9 mg) zeigen hingegen einen Einfluß auf diesen Parameter.
Kontrolle ovx Estradiol
Tectorigenin 0
100 200 300
400
*
mg
Abb. 4.2: Einfluß von Tectoridin, Tectorigenin und Belamcanda chinensis auf das Uterusgewicht ovarektomierter Ratten nach täglicher subkutaner Applikation über eine Woche
Abb. 4.3: Einfluß von Belamcanda chinensis in drei verschiedenen Konzentrationen auf das Uterusgewicht ovarektomierter Ratten nach dreimonatiger Applikation über das Futter
Die dreimonatige Applikation von E2 über das Futter hat einen signifikanten, fast 4fachen Anstieg des Uterusgewichtes (408,1 ± 15,8) gegenüber der Kontrollgruppe (118,0 ± 13,6 mg) zur Folge (siehe auch Abb. 4.4 und 4.5). Belamcanda chinensis führt in allen drei verwendeten Konzentrationen zu einer nicht-signifikanten Verringerung des Uterusgewichtes (Belamcanda 50: 89,47 ± 2,3 mg; Belamcanda 200: 88,94 ± 2,6 mg; Belamcanda 1000: 91,25 ± 3,4 mg) (Abb. 4.3).
Kontrolle ovx Estradiol Tectoridin
Tectorigenin Belamcanda 0
100 200 300
400
*
mg
Kontrolle ovx
Estradiol
Belamcanda 50Belamcanda 200Belamcanda 1000 0
100 200 300 400
500
*
mg
Abb. 4.4: Präparierter Rattenuterus eines Kontrolltieres 3 Monate nach Ovarektomie. Das Tier erhielt seit der Entfernung der Keimdrüsen nur phytoestrogenarmes Futter.
Abb. 4.5: Präparierter Uterus einer ovarektomierten Ratte nach chronischer Applikation von Estradiol.
Im Vergleich mit Abbildung 4.4 ist ein deutlicher Größenunterschied der Organe zu bemerken.
4.1.2 Wanddicke
Die Wanddicke des Uterus wurde nach dem dreimonatigen Futterversuch bestimmt.
Abbildung 4.6 zeigt eine signifikante Verdickung der Uteruswand durch E2 (0,65 ± 0,06 mm) gegenüber der Kontrolle (0,49 ± 0,05 mm) (siehe auch Abb. 4.7 und 4.8).
Belamcanda chinensis hat in einer Konzentration von 50 mg/100g Futter keinen (0,51 ± 0,03 mm), in den beiden höheren Konzentrationen einen nicht-signifikant verringernden Einfluß auf die Wanddicke (Belamcanda 200: 0,44 ± 0,03 mm;
Belamcanda 1000: 0,46 ± 0,02 mm).
Abb.4.6: Einfluß von Estradiol und dreier unterschiedlicher Konzentrationen von Belamcanda chinensis auf die Wanddicke des Uterus ovarektomierter Ratten nach dreimonatiger Fütterung der Testsubstanzen
Kontrolle ovx
Estradiol
Belamcanda 50Belamcanda 200Belamcanda 1000 0.00
0.25 0.50
0.75
*
mm
Abb. 4.7: Histologisches Präparat des Uterus eines ovarektomierten Kontrolltieres (HE-Färbung, Vergrößerung 50x)
Abb. 4.8: Ausschnitt aus einem histologischen Präparat eines Rattenuterus 3 Monate nach
Ovarektomie und dauernder Applikation von Estradiol über das Futter (HE-Färbung, Vergrößerung 50x). Im Vergleich mit Abb. 4.7 zeigt sich die deutliche Verdickung der Uteruswand.
4.1.3 Endometriumdicke
Abb. 4.9: Einfluß von Estradiol und dreier verschiedener Konzentrationen von Belamcanda chinensis auf die Dicke des Endometriums ovarektomierter Ratten nach dreimonatiger Applikation der Testsubstanzen über das Futter
Nach chronischer Applikation der Testsubstanzen bewirkt E2 einen signifikanten, ca.
3,5fachen Anstieg der Endometriumdicke (0,0376 ± 0,0009 mm) gegenüber der Kontrollgruppe (0,0111 ± 0,0003 mm) (siehe auch Abb. 4.10 und 4.11). Die Dicke des Endometriums wird durch den Belamcanda chinensis Extrakt hingegen in allen drei Konzentrationen tendenziell , jedoch nicht-signifikant verringert (Belamcanda 50: 0,0088 ± 0,0001 mm; Belamcanda 200: 0,0097 ± 0,0002 mm; Belamcanda 1000: 0,0088 ± 0,0003 mm) (Abb. 4.9).
Kontrolle ovx
Estradiol
Belamcanda 50Belamcanda 200Belamcanda 1000 0.00
0.01 0.02 0.03
0.04
*
mm
Abb. 4.10: 250fache Vergrößerung des Präparates aus Abb. 4.8. In der unteren Mitte das Bildes erkennt man das Uteruslumen. Die das Lumen umgebende Zellschicht bildet das einschichtige Endometrium.
Abb. 4.11: 250fache Vergrößerung eines Ausschnittes des Präparates in Abb. 4.9. Die helle Fläche diagonal von unten links nach oben rechts stellt das Uteruslumen dar, zu beiden Seiten des Lumens ist das Endometrium zu sehen. Im Vergleich mit Abbildung 4.10 fällt eine deutliche Verdickung und
die Mehrschichtigkeit des Endometriums auf. Außerdem ist eine „Auflockerung“ des Gewebes im Sinne eines Ödems zu sehen (obere linke Ecke).
4.1.4 IGF-1
Nach einmaliger intravenöser Applikation der Testsubstanzen bewirkt E2 einen signifikanten Anstieg der Genexpression von IGF-1 im Uterus um den Faktor 2,7 (270,8 ± 21,6 %) gegenüber der Kontrollgruppe (100,0 ± 4,1%). Tectoridin hat keinen solchen Einfluß (118,7 ± 12,4 %) (Abb 4.12).
Abb. 4.12: Einfluß von E2 und Tectoridin auf die Genexperssion von IGF-1 im Uterus ovarektomierter Ratten nach einmaliger intravenöser Applikation
Nach einer Woche subkutaner Applikation führt E2zu einem signifikanten, mehr als 9fachen Anstieg der IGF-1 Expression im Uterus (939,4 ± 180,0 %; Kontrolle: 100,0
± 20,0 %). Tectoridin zeigt keinen (96,1 ± 29,1 %), Tectorigenin einen geringen, nicht-signifikanten Anstieg (156,3 ± 54,4 %), Belamcanda chinensis einen deutlichen, jedoch nicht signifikanten Abfall (49,81 ± 8,3 %) der Genexpression von IGF-1 in diesem Organ (Abb. 4.13).
Kontrolle ovx
Estradiol Tectoridin 0
100 200
300
*
% der Kontrolle
Abb. 4.13: Einfluß von Estradiol, Tectoridin, Tectorigenin und Belamcanda chinensis auf die Genexpression von IGF-1 im Uterus ovarektomierter Ratten nach einwöchiger subkutaner Applikation
Abbildung 4.14 zeigt, dass die chronische Applikation von E2 eine signifikante, 3fache Erhöhung (299,2 ± 33,0 %) der IGF-1-Genexpression im Uterus bewirkt (Kontrolle: 100,0 ± 7,5 %). Belamcanda hat hier in keiner der eingesetzten Konzentrationen einen Einfluß auf IGF-1 (Belamcanda 50: 108,3 ± 11,9 %;
Belamcanda 200:115,4 ± 11,0 %; Belamcanda 1000: 119,3 ± 10,3 %).
Abb. 4.14: Einfluß von Estradiol und verschiedenen Konzentrationen von Belamcanda chinensis auf die Genexpression von IGF-1 im Uterus der ovarektomierten Ratte nach dreimonatiger oraler Applikation über das Futter
Kontrolle ovx Estradiol Tectoridin
Tectorigenin Belamcanda 0
50 100 150 200 250
*
1000 1500
% der Kontrolle
Kontrolle ovx
Estradiol
Belamcanda 50Belamcanda 200Belamcanda 1000 0
100 200 300
400
*
% der Kontrolle
4.1.5 VEGF
In Abbildung 4.15 ist der Einfluß von Estradiol und Tectoridin auf die Genexpression von VEGF im Uterus nach einmaliger intravenöser Applikation dargestellt. Durch E2
wird VEGF signifikant erhöht (153,9 ± 8,3 %; Kontrolle 100,0 ± 9,4 %) ebenso, allerdings in geringerem Maße, durch Tectoridin (135,1 ± 11,8 %).
Abb. 4.15: Einfluß von E2 und Tectoridin auf die Genexpression von VEGF im Uterus der ovarektomierten Ratte nach einmaliger intravenöser Applikation der Testsubstanzen
Nach 7-tägiger subkutaner Applikation (Abb.4.16) führt E2 zu einer signifikanten Erhöhung der VEGF-Genexpression (230,9 ± 32,1 %) gegenüber der Kontrolle (100,0 ± 34,4 %). Belamcanda (105,9 ± 20,0 %) scheint keinen Einfluß auf VEGF zu haben, Tectoridin (82,9 ± 36,6 %) und Tectorigenin (82,4 ± 27,9 %) hingegen verringern eher dessen Expression, wenn auch nur in geringem Maße.
Kontrolle ovx
Estradiol Tectoridin 0
100
200
*
*
% der Kontrolle
Abb. 4.16: Einfluß von Estradiol, Tectoridin, Tectorigenin und Belamcanda chinensis auf die Genexpression von VEGF im Uterus der ovarektomierten Ratte nach
einwöchiger subkutaner Applikation
Abb. 4.17: Einfluß von Estradiol und Belamcanda chinensis in drei verschiedenen Kozentrationen auf die Genexpression von VEGF im Uterus der ovarektomierten Ratte nach dreimonatiger Applikation über das Futter
Kontrolle ovx Estradiol Tectoridin Tectorigenin Belamcanda 0
100 200
300
*
% der Kontrolle
Kontrolle ovx
Estradiol
Belamcanda 50Belamcanda 200Belamcanda 1000 0
50 100 150
% der Kontrolle
Die chronische Applikation führt bei E2 zu einer Verringerung der Expression von VEGF (74,8 ± 9,2 %; Kontrolle ovx: 100,0 ± 5,4 %) (Abb. 4.17). Belamcanda chinensis scheint hier VEGF nicht zu beeinflussen (Belamcanda 50: 98,0 ± 10,5 %), bzw. in geringem Umfang zu erhöhen (Belamcanda 200: 107,9 ± 11,4 %;
Belamcanda 1000: 112,6 ± 13,7 %).
Tabelle 4.1: Zusammenfassung Uterus
ovx ∅ E2 Tdn. Tgn. B. c. B 50 B 200 B 1000
Gewicht akut i.v. 122 mg ↑
*
→/↓subakut s.c. 137 mg ↑
*
→ → →chronisch p.o. 118 mg ↑
*
→/↓ →/↓ →/↓Wanddicke chronisch p.o. 0,49 mm ↑
*
→ →/↓ →/↓Endo-
metriumd. chronisch p.o. 11,1µm ↑
*
→/↓ →/↓ →/↓IGF-1 akut i.v. 100 % ↑
*
→subakut s.c. 100 % ↑
*
→ →/↑ ↓chronisch p.o. 100 % ↑
*
→ → →VEGF akut i.v. 100 % ↑
*
↑*
subakut s.c. 100 % ↑
*
→/↓ →/↓ →chronisch p.o. 100 % ↓ → →/↑ →/↑
↑: Anstieg, ↓: Abfall, →: keine Änderung,
*
: statistisch signifikant (p ≤ 0.05), /: TendenzTab. 4.1: Zusammenfassung der Ergebnisse der Untersuchungen an Uteri ovarektomierter Ratten.
Uterusgewicht, Wanddicke und Endometriumdicke sowie die Genexpressionen von IGF-1 und VEGF sind für die einzelnen Untersuchungsgruppen Estradiol (E2), Tectoridin (Tdn.), Tectorigenin (Tgn.) und Belamcanda chinensis (B. c.) sowie für die drei unterschiedlichen Konzentrationen des Belamcanda- extraktes (B 50, B 200, B 1000) dargestellt. Die Pfeile zeigen das Verhalten der Behandlungsgruppen jeweils im Vergleich mit dem Mittelwert der Kontrolle (ovx ∅).
4.2 Knochen
Bei den knochenbezogenen Ergebnissen wird zunächst die IGF-1-Genexpression in den drei gesonderten Versuchsansätzen, dann die Expression der unterschiedlichen Marker der Osteoblasten und Osteoklastenaktivität dargestellt.
4.2.1 IGF-1
Die einmalige intravenöse Applikation von E2 bewirkt einen 4fachen Anstieg der IGF- 1-Expression im Knochen (421,8 ± 29,4 %). Tectoridin (1240,0 ± 76,1 %) führt ebenfalls zu einem Anstieg, doch ist dieser mehr als 12mal so hoch wie bei der Kontrollgruppe (100,0 ± 67,5 %) (Abb. 4.18)
Abb. 4.18: Einfluß von Estradiol und Tectoridin auf die Genexpression von IGF-1 im Knochen der ovarektomierten Ratte nach einmaliger intravenöser Applikation der Substanzen
Im subakuten Versuchsansatz (Abb. 4.19) zeigt sich eine Erhöhung der IGF-1- Expression bei allen Testsubstanzen in ähnlicher Weise (E2: 127,3 ± 15,1 %;
Tectoridin: 128,2 ± 13,5 %; Tectorigenin: 138, 2 ± 10,2 %; Belamcanda: 118,8 ± 17,2
%), doch ist sie hier bei keiner Gruppe signifikant unterschiedlich zur Kontrolle (100,0
± 2,9 %).
Kontrolle ovx
Estradiol Tectoridin 0
500 1000
1500
*
% der Kontrolle
*
Abb. 4.19: Einfluß von E2 , Tectoridin, Tectorigenin und Belamcanda chinensis auf die Genexpression von IGF-1 im Knochen der ovarektomierten Ratte nach 7tägiger subkutaner Applikation
Abb. 4.20: Einfluß von Estradiol und dreier verschiedener Konzentrationen von Belamcanda chinensis auf die Genexpression von IGF-1 im Knochen ovarektomierter Ratten nach dreimonatiger Applikation über das Futter
Kontrolle ovx
Estradiol Tectoridin
Tectorigenin Belamcanda 0
50 100 150
% der Kontrolle
Kontrolle ovx
Estradiol
Belamcanda 50Belamcanda 200Belamcanda 1000 0
50 100 150
% der Kontrolle
Die chronische Applikation wirkt bei allen untersuchten Substanzen und unterschiedlichen Konzentrationen reduzierend auf die Expression von IGF-1 (E2: 86,2 ± 16,4 %; Belamcanda 50: 65,7 ± 11,9 %; Belamcanda 200: 81,3 ± 9,3 %;
Belamcanda 1000: 62,7 ± 8,6 %), jedoch ist diese Reduktion bei keiner der Gruppen statistisch signifikant gegenüber der Kontrolle (100,0 ± 21,7 %) (Abb. 4.20).
4.2.2 Osteokalzin
Sowohl E2 als auch Tectoridin bewirken nach einmaliger intravenöser Applikation einen signifikanten Anstieg der Osteokalzinexpression im Knochen. Diese ist bei E2
(391,0 ± 20,2 %) fast viermal, bei Tectoridin (503,9 ± 22,3 %) sogar fünfmal so hoch wie in der Kontrollgruppe (100,0 ± 28,5 %) (Abb. 4.21).
Abb. 4.21: Einfluß von Estradiol und Tectoridin auf die Genexpression von Osteokalzin im Knochen der ovarektomierten Ratte nach einmaliger intravenöser Applikation
Die Abbildung 4.22 zeigt die Auswirkungen 7tägiger subkutaner Applikation der Testsubstanzen auf die Osteokalzinexpression im Knochen. E2 führt hier zu einer Erhöhung von Osteokalzin (131,8 ± 22,2 %) gegenüber der Kontrolle (100,0 ± 16,5
%), Belamcanda hat keinen Einfluß (94,6 ± 20,9 %). Tectoridin (126,5 ±23,9 %) wirkt ähnlich wie Estradiol, durch Tectorigenin (80,4 ± 8,01 %) wird die Osteokalzinexpression verringert, jedoch nicht signifikant.
Kontrolle ovx
Estradiol Tectoridin 0
250 500 750
* *
% der Kontrolle
Abb. 4.22: Einfluß von Estradiol und Belamcanda chinensis auf die Genexpression von Osteokalzin im Knochen der overektomierten Ratte nach 7tägiger subkutaner Applikation.
Chronisch appliziert (Abb. 4.23) führt E2 zu einer signifikanten Erniedrigung der Osteokalzinexpression (28,0 ± 6,2 %) gegenüber der Kontrolle (100,0 ± 11,9 %).
Auch Belamcanda chinensis führt in jeder der untersuchten Konzentrationen zu einer solchen Erniedrigung, allerdings bleibt diese im Vergleich mit der Kontrolle nicht signifikant (Belamcanda 50: 75,8 ± 4,5 %; Belamcanda 200: 59,0 ± 8,3 %;
Belamcanda 1000: 79,0 ± 18,3 %).
Abb. 4.23: Einfluß von E2 und dreier verschiedener Konzentrationen von Belamcanda chinensis auf die Genexpression von Osteokalzin im Knochen ovarektomierter Ratten nach chronischer Applikation über das Futter
Kontrolle ovx
Estradiol
Belamcanda 50Belamcanda 200Belamcanda 1000 0
50 100 150
% der Kontrolle
*
Kontrolle ovx Estradiol Tectoridin Tectorigenin Belamcanda 0
100 200
% der Kontrolle
4.2.3 TGF-β
Abb. 4.24: Einfluß von Estradiol und dreier verschiedener Konzentrationen von Belamcanda chinensis auf die Genexpression von TGF-β nach chronischer Applikation über das Futter
Sowohl durch E2 (60,2 ± 13,2 %) als auch durch Belamcanda wird die Genexpression von TGF-β verringert. Dabei zeigen sich sowohl Belamcanda 50 (52,7 ± 7,9 %) als auch Belamcanda 200 (54,1 ± 7,8 %) signifikant unterschiedlich zur Kontrolle (100,0 ± 19,3 %).
Belamcanda 1000 erniedrigt die TGF-β-Expression nicht signifikant (76,7 ± 18,3 %) (Abb. 4.24).
4.2.4 OPG
Die Genexpression von Osteoprotegerin wird nach dreimonatiger Applikation durch E2 (39,5 ± 6,8 %) ebenso wie durch Belamcanda chinensis in allen drei untersuchten Konzentrationen signifikant erniedrigt (Belamcanda 50: 40,2 ± 7,3 %; Belamcanda 200: 46,7 ± 7,8 %; Belamcanda 1000: 42,0 ± 4,8 %; Kontrolle ovx: 100,0 ± 16,3 %) (Abb 4.25).
Kontrolle ovx
Estradiol
Belamcanda 50Belamcanda 200Belamcanda 1000 0
50 100 150
% der Kontrolle
* *
Abb. 4.25: Einfluß von E2 und Belamcanda chinensis auf die Genexpression von Osteoprotegerin im Knochen der ovarektomierten Ratte nach 3monatiger Applikation über das Futter
4.2.5 TRAP
Abb. 4.26: Einfluß von E2 und dreier verschiedener Konzentrationen von Belamcanda chinensis auf die Genexpression von tartratresistenter saurer Phosphatase (TRAP) nach dreimonatiger Applikation über das Futter
Kontrolle ovx
Estradiol
Belamcanda 50Belamcanda 200Belamcanda 1000 0
50 100 150
* * * *
% der Kontrolle
Kontrolle ovx
Estradiol
Belamcanda 50Belamcanda 200Belamcanda 1000 0
100 200
* *
% der Kontrolle
