Immunreaktionen in der Histochemie
HANS LUPPA · HERWART AMBROSIUS · WULF STORCH
Mit 157 Abbildungen und 62 Tabellen
Gustav Fischer Verlag· Stuttgart · New York · 1986
Inhaltsverzeichnis
I. Immunologische Grundlagen der Immunhistochemie
H. AMBROSIUS
A. Das Immunsystem . . . 1
B. Antigene und Haptene . . . . 4
1. Immunogen und Tolerogen 4
2. Antigendeterminanten und Haptene . 6
C. Die humorale Immunantwort . . . 1
1. Der Verlauf der humoralen Immunantwort 8
2. Das immunologische Gedächtnis . . . 8
3. Die Sequenz der Immunglobulinklassen im Verlaufe der Immunantwort 10
· 4. Die Regulation der Immunantwort 11
a) Die Rolle der Makrophagen 11
b) DieHelfer-T-Zellen . . . . 13
c) Die Suppressor-T-Zellen . . 15
d) Antikörper als Regulatoren . 16
5. Antikörperbildung und Antikörperaffinität 16
D. Struktur und Funktion der Antikörper . . 19
1. Die Grundstruktur der Immunglobuline 19
a) Leichte Ketten . . . 19
b) Schwere Ketten . . . 20
c) Immunglobulinfragmente . . . 21
d) ~äumliche Struktur der Immunglobuline . 23
2. Die Heterogenität der Antikörper . . . . 24
3. Die Immunglobulinklassen des Menschen 25
a) Immunglobulin G . 27
b) Immunglobulin M . 27
c) Immunglobulin A . 28
d) Immunglobulin D . 29
e) ImmunglobulinE; . . 29
4. Die Immunglobulinklassen der Versuchstiere 30
5. Die Phylogenese der Immunglobuline . . . . 31
E. Die Spezifität der Antigen-Antikörper-Reaktion 32
1. Die Bindungskräfte in der Antigen-Antikörper-Reaktion 32
a) Elektrostatische Wechselwirkungen 32
b) Wasserstoffbrücken . . . 33
c) Hydrophobe Wechselwirkungen . . . '· 33
d) V an der Waalssche Kräfte . . . 33
2. Die Struktur der Antigenbindungsstelle von Antikörpern und die Multispezifität der Antikörper . . . 33 3. Die Spezifität der Reaktion von Antikörpern mit Haptenen . . . . 39 4. Die Spezifität der Reaktion von Antikörpern mit Proteinantigenen 43 a) Die Antigenstruktur von Proteinen . . . 43 b) Kreuzreaktivität von Proteinantigenen mit Antikörpern . . . . 46 5. Ursachen für die unspezifische Bindung von Antiseren und Antikörpern 46 a) Denaturierung von Proteinantigenen . . . 46 b) Unspezifität infolge «Nebenantikörpern>> . . . 48 c) Unspezifitäten durch nichtimmunologische Affinitätsreaktionen . 49
d) Unspezifitäten als Folge der Markierung der Antikörper 49
F.
Die Herstellung von Antiseren und monoklonalen Antikörpern 491. Antiserum oder monoklonale Antikörper? 49
2. Die Herstellung von Antiseren . . . 50 a) Die Wahl der Versuchstierart . . . 50
b) Immunisierungsschemata für verschiedene Spezies . 52
VI Inhaltsverzeichnis
a) Immunisierung von Kaninchen . . . 53 ß) Immunisierung von Kaninchen mit sehr geringer Antigenmenge 53
y) ImmunisierungvonZiegen . . . 54
ö) Immunis!erung von Schweinen . . . 54
E) Immunisierung von Hühnern oder Enten 54
l;) Immunisierung von Karpfen . . . 54
c) Die Induktion monospezifischer Antiseren bei Fehlen vollständig gereinigten Anti- gens . . . 55 a) Immunisierung mit Fraktionen aus Polyakrylamidgel . . . 55 ß) Immunisierung mit Präzipitatlinien der Immunelektrophorese 55 d) Herstellung von Antiseren gegen niedermolekulare Substanzen 56
3. Die Herstellung monoklonaler Antikörper . . . . 57
a) Material und Geräte . . . 57
b) Immunisierung und Präparation der Milzzellen . 58
c) Zellfusion und HAT -Selektion der Hybridzellen 59
d) Nachweis von Hybridomen . . 60
e) Klonierung . . . 62
f) In-vitro-Kultur der Hybridome 62
g) In-vivo-Kultur der Hybridome 63
h) Tieftemperaturkonservierung von Myeloma- und Hybridornzellen . 63
i) Immunchemische Analyse der monoklonalen Antikörper 64
G. Der Nachweis von Antikörpern . . . 65
1. Doppelte radiale Immundiffusion 66
2. Einfache radiale Immundiffusion 68
3. Passive Hämagglutination . . . . 70
a) Kopplungstechnik mit Bisdiazobenzidin 71
b) Adsorption von Antigen an tannierte Erythrozyten . 72
4. Unterscheidung von IgM- und IgG-Antikörpem . . . . 72
H. Spezifitätsprüfung, Reinigung und Autbewahrung von Antiseren und Antikörpern 73 1. Spezifitätsprüfung von Antiseren mittels Immunelektrophorese . . . 73 2. Hämagglutinationshemmtest zur Spezifitätsprüfung . . . 75 3. Reinigung von Antiseren, Antikörpern und Antigenen mittels Immunchromatographie 76 a) Herstellung eines Immunadsorbens mit CNBr-aktivierter Sepharose . 76 b) Verfahrep zur Vernetzung von Proteinen mittels Glutardialdehyd 77
c) Säulenchromatographie mit Immunadsorbentien . 78
d) "Batch"-Verfahren mit Immunadsorbentien 79
4. Reinigung von Antiseren . . . 79
· 5. Aufbewahrung von Antiseren und Antikörpern 80
IT. Prinzipien immunhistochentischer Methoden
H.
LUPPAA. Gewebevorbehandlung . . . . 1. Gewebevorbehandlung für die Lichtmikroskopie
a) Fixation . . . . a) Aldehyde . . . .
ß)
Osmiumtetroxid . . . y) Pikrinsäuregemische . ö) Ethanol und Aceton . E) Carbodiirnide und Dümidoesterl;) Chinone, Pyrocarbonate und andere Fixantien b) Kryostattechnik . . . .
c) Gefriertrocknungstechnik d) Gefrieraustauschverfahren e) Vibratomtechnik . . f) Paraffinschnittechnik . . .
83 83 83
84
86 86 88 88 90 9496
9798
100
Inhaltsverzeichnis 2. Gewebevorbehandlung für die Elektronenmikroskopie
a) Einbettung in Kunstharzen . . . . b) Einbettung in wasserlöslichen Medien c) Gefrierultrarnikrotomie .
3. Membranpermeabilität . . . 4. Methodenanhang . . . . B. lmmuncytochemische Methoden
1. Immunenzymtechniken . . . a) Einführung in die Grundlagen
a) Antikörpermarkerenzyme . 13) Enzymkonjugationstechniken
b) Antigennachweis mit lmmunperoxidase-Techniken a) Direkte und indirekte Immunperoxidase-Technik . 13) Immunglobulin-Enzymbrückentechnik . . . .
y) Unmarkierte Antikörper-Peroxidase-Antiperoxidase-(P AP-)Methode ö) Pre-embedding staining . . . .
e) Post-embeddingstaining . . . . c) Modifikationen der Immunperoxidase-Techniken d) Weitere Immunenzymtechniken
e) Spezifität, Kontrollreaktionen . . . . f) Methodenanhang . . . .
2. Antikörpermarkierung durch Schwermetallverbindungen und Immunkolloide a) Immunferritintechnik . . . .
b) Immun-Goldkolloid-Methoden . a) Antikörper-Gold-Technik . . 13) Protein-A-Gold-Technik . .
y) Gold-markierte Antigennachweis-(gold-labelled antigen detection, GLAD-)- Technik . . . .
ö) Immun-Gold-Silber-Technik c) Methodenanhang . . . . 3. Hybridantikörper-Methode . . . . 4. Avidin-Biotin-Methoden . . . .
5. Gemischte Aggregations-immuncytochemische Methode (MAGIC-Technik) 6. Doppel-un~ Mehrfachfärbungen . . . . .
a) Eluierung der Antikörper . . . . b) Multiple Immunperoxidase-Färbungen . c) Doppel-Immunenzym-Markierung . . . d) Multiple Markierung mit Immunkolloiden e) Methodenanhang .
c.
Radioimmuncytochemie .1.
Markierung mit Na125I . 2. Chloramin-T-Methode . 3. Lactoperoxidase-lodierung4 . .Marki~;:rung mit dem Bolton-Hunter-Reagens J), Quantttative lmmunhistochemie . . . .
nr. hnmunftuoreszenz
YIJQtiW11.pg.in
Grundlagen der Methodik der Immunfluoreszenz;), ~hl~~l~:I!Ü$:che Grundbegriffe . . . . . ~)l<l.;;l)ltlit:ll::SZ<i:Jl:Z1 Fluoreszenz, Phosphoreszenz . . . .
;i\1~} l:luiOreszemrverm<J>geJil,Fluoreszenzausbeute, Fluoreszenzintensität
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191
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194
VIII Inhaltsverzeichnis
2. Nomenklatur der Immunfluoreszenzerscheinungen und Kriterien der Zuverlässigkeit einer immunhistologischen Reaktion . . . 196 3. Kurzdarstellung der wichtigsten Arbeitsgänge der direkten Immunfluoreszenz . . . 199 C. Markierung und Reinigung von Antiseren für die Immunfluoreszenz 199
1. Fluoreszenzfarbstoffe . . . 199
a) Anforderungen an Fluoreszenzfarbstoffe . 199
b) Fluoreszenzfarbstoffe . . . 200
2. Isolierung der Immunglobuline aus Vollseren 202
a) Fällung mit Ammoniumsulfat . . . 202
b) Isolierung von IgG durch Fällung mit Caprylsäure 204
g) Isolierung von Immunglobulinen mittels Affinitätschromatographie an Protein A 204
d) Immunadsorption zur Isolierung reiner Antikörper . 204
3. Proteinbestimmung . . . 204 4. Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen . . . 206
a) Markierung von Fluoreszeinisothiozyanat (FITC) . 206
b) Markierung mit Tetramethylrhodaminisothiozyanat (TRITC) 207
c) Markierung mit Texasrot . . . 207
d) Markierung mit Methoxydiphenylfuranon (MDPF) 208
e) Markierung mit Azetamidoisothiozyanatstilbensulfonsäure (SITS) . 208 f) Markierung mit Dichlortriazinylaminofluorescein (DT AF) . . . 208 g) Markierung mit Monobrombiman . . . 208 h) Markierung mit Dimethylamino-methylcumarinyl-maleimid (DACM) 209 i) Markierung mit Phycobiliproteinen . . . 209 5. Reinigung der Konjugate . . . 210
a) Beseitigung des ungebundenen Farbstoffes durch Gelfiltration an quervernetzten Dextranen . . . 210 b) Selektion der sogenannten optimal markierten Antikörper mittels Ionenaustausch-
chromatographie an DEAE-Zellulose, DEAE-Sephadex oder Trägerelektropho- rese . . . 212 a) Fraktionierung mit DEAE-Zellulose . . . 212
~) Fraktionierung mit DEAE-Sephadex . . . 212 y) Fraktionierung mittels präparativer Trägerelektrophorese 213 c) Adsorption und Immunadsorption zur Beseitigung unerwünschter Antikörper . 213 6. Konzentration verdünnter Antikörperlösungen . . . 214 7. Stabilisierung und Aufbewahrung markierter Antiseren . . . 214 D. Charakterisierung und QualitätskontroUe der Antiseren und Konjugate 214
1. Kenndaten der Konjugate . . . 214
2. Methoden zur Charakterisierung der Antiseren . . . 214
a) Prüfung auf freien Farbstoff . . . , . . . . 216
b) Bestimmung des Farbstoff/Protein-Verhältnisses . 216
a) Bestimmung des F/P-Verhältnisses für RITC-Konjugate 216
~) Bestimmung des F/P-Verhältnisses für Rhodamin-Konjugate 218 y) Bestimmung des F/P-Verhältnisses für Konjugate mit anderen Fluoreszenzfarb-
stoffen . . . 218 c) Bestimmung der Proteinverteilung mittels Zelluloseazetat-Folienelektrophorese 218 d) Bestimmung der Antikörperaktivität, -spezifität und -konzentration 219 a) Spezifitätskontrolle mit künstlichen Substraten . . . 219
~) Spezifitätskontrolle mit biologischen Substraten . . . 220 3. Eignungsprüfung im speziellen Testsystem mit Bestimmung der optimalen Gebrauchs-
verdünnung des Konjugates . . . 221
E. Immunfluoreszenzmikroskopische Verfahren . 227
1. Übersicht über verschiedene Methoden 227
a) Direktes Verfahren . . . 228
b) Indirekte Technik . . . 229
c) Doppelimmunfluoreszenz und Mehrfachfluorochromierung 230
d) Sequentielle Technik . . . 233
Inhaltsverzeichnis IX
e) Hapten-Sandwich-Technik 233
f) Hybrid-Antigen-Technik 233
g) Avidin-Biotin-Technik . . 234
h) Komplement-Methoden . 234
i) Markiertes Protein A von Staphylococcus aureus . 236
j) Markierte Lektine . 238
k) Markierte Bakterien . . . 238 I) Künstliche Substrate . . . 239 a) Immunfluoreszenz an spärischen künstlichen Substraten 240 ß) Immunfluoreszenz an ebenen (festen) künstlichen Substraten . 242 2. Immunfluoreszenz in Kombination mit anderen Mikroskopierverfahren und anderen
Techniken . . . 244 a) Immunfluoreszenz kombiniert mit Kontrastverfahren . . . 245 b) Immunfluoreszenz kombiniert mit Sekundärfluoreszenz . . . 245 c) Immunfluoreszenz kombiniert mit konventioneller Lichtmikroskopie 246 d) Immunfluoreszenz in Kombination mit histochemischen Reaktionen und der lmmun-
enzymtechnik . . . 247 e) Immunfluoreszenz in Kombination mit der Elektronenmikroskopie 248 f) Immunfluoreszenz in Kombination mit der Autoradiographie . 248 g) Immunfluoreszenz in Kombination mit der Zellelektrophorese . 248 3. Immunfluoreszenz an Schnittpräparaten . . . 248 a) Immunfluoreszenz an Kryostatschnitten . . . 250
b) Standardtechniken der immunhistologischen Färbung 251
a) Durchführung der direkten Methode . . . 251
ß)
Durchführung der einfachen indirekten Methode . 252y) Durchführung einer "doppelt" indirekten Methode zum Nachweis komplement- bindender Antikörper . . . 252 ö) Durchführung einer Doppel- oder Mehrfachmarkierung als direkter oder indirek-
ter Test . . . 252 c) Variationen der Standardtechnik . . . 253 d) Immunfluoreszenz an paraffin- und kunststoffeingebettetem Material . . . 256 4. Immunfluoreszenz an Zellsuspensionen (Membranimmunfluoreszenz und Fluoreszenz
intrazellulärer Antigene) . 258
a) direkte Meth9de . 259
b) Doppelmarkierung . . 259
g) Indirekte Methode . . 259
d) Nachweis zytoplasmatischer Antigene in Zellsuspensionen . 259 e) Nachweis von Membran- und zytoplasmatischen Antigenen an derselben Zelle 260 5. Immunfluoreszenz an künstlichen Substraten . . . 260
a) Nachweis von Zelloberflächenantigenen mit Hilfe monoclonaler Antikörper, die an fluoreszierende Mikrokugeln gekoppelt sihd . . . 260 b) Nachweis von Anti-Hapten-Antikörpern mit Hilfe haptengekoppelter Sephadexkü-
gelchen . . . 261 6. Eindecken und Aufbewahrung immunfluoreszenzoptischer Präparate . . . 262 7. Ursachen, Erkennen und Vermeiden falsch-negativer und falsch-positiver Befunde . 263
a) Falsch-negative Befunde . . . 263
a) Ursachen . . . 263
ß) Erkennen und Vermeidung 264
b) Falsch-positive Befunde 266
a) Ursachen . . . 266
ß)
Erkennen und Vermeidung 270F. Mikroskop . . . . 283
1. Lichtquellen . . . 285
a) Gasentladungslampen 285
b) Niedervoltglühlampen 285
c) Laser 285
2. Filter . . . 285
X Inhaltsverzeichnis 3. Durchlichtkondensoren . .
a) Fluoreszenzkondensoren b) Kontrastkondensoren . . 4. Objektive, Okulare . . . . 5. Mikrophotographie . . . .
6. Quantifizierung der Immunfluoreszenz . . a) Visuelle Bewertung . . . . b) Mikrofluorametrie . . . . c) Densitometrie photographischer Negative 7. Automatisierung . . . .
IV. Ausgewählte Anwendungsgebiete immunhistochemischer Methoden
H.
LUPPAund W.
STORCHA. Lokalisation von Zeßstrukturen, Hormonen und Enzymen (H. Luppa) B. Anwendung in der klinischen Immunologie und Pathologie (W. Storch)
1. Nachweis von im Serum zirkulierenden Antikörpern 2. Nierenkrankheiten .
3. Hautkrankheiten . . . . 4. Leberkrankheiten . . . .
5. Erkrankungen der Skelettmuskulatur . . . . . 6. Tumormarker und Immunhistochemie maligner Lymphome (H. Luppa) C. Anwendung in der Mikrobiologie (W. Storch)
1. Bakteriologie . . . . 2. Parasitologie . . . . D. Lektine in der Histuehernie (H. Luppa)
