Direktor: Prof. Dr. med. H. Scherer
Die Rolle von Hypoxie und Ischämie bei der Entstehung
von Hörstörungen
HABILITATIONSSCHRIFT
zur Erlangung der Lehrbefähigung
für das Fach
Hals-, Nasen-, Ohrenheilkunde
vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin
von
Frau Dr. med. Birgit Mazurek
geboren am 25.04.1970 in Schwerin
Dekan: Prof. Dr. med. Martin Paul
eingereicht am:
26.01.2006
Tag der Habilitation:
22.01.2007
Gutachter:
1. Prof. Dr. med. Th. Lenarz
2. Prof. Dr. A.W. Gummer
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung...5
1.1. Hörstörungen...5
1.2. Rolle der Haarzelle bei der Entstehung von Hörstörungen ...6
1.2.1. Störungen der Stereozilien und Tip-Links ...7
1.2.2. Störung der Kalium-Kanäle...8
1.2.3. Veränderung der Glutamat-Ausschüttung...9
1.2.4. Tinnitus...10
1.3. Hypoxie und Ischämie...12
1.3.1. Die Rolle von HIF-1...12
1.3.2. Die Wirkung von Hypoxie und Ischämie in der Cochlea...15
1.3.3. HIF-1-abhängige Gene ...19
1.4. Apoptose und Nekrose ...20
1.5. Prestin...22
1.6. Microarray...25
1.7. Problemstellung...27
2. Methoden ...30
2.1. Zellkultur ...30
2.2. Hypoxie und Ischämie...31
2.3. Apoptose und Nekrose ...32
2.4. Isolation und Quantifizierung von Gesamt-RNA...33
2.5. Quantifizierung der mRNA...35
2.6. Microarray-Untersuchung ...36
2.6.1. Versuchsaufbau ...36
2.6.2. RNA-Präparation für die Microarray-Untersuchungen...38
2.6.3. Microarray-Untersuchung ...38
2.6.4. Statistik der Microarray-Untersuchungen ...40
2.7. mRNA von HIF-1 alpha und Prestin...41
2.8. HIF-1-Aktivität...42
2.9. Statistik...43
3. Ergebnisse...45
3.1. Die organotypische Kultur der Cochlea...45
3.2. Vulnerabilität der Haarzellen gegenüber Hypoxie und Ischämie in der
organotypischen Kultur ...45
3.3. Einflussfaktoren auf den Haarzellverlust ...49
3.3.1. Einfluss der Kalium-Konzentration auf die Ischämievulnerabilität der
Haarzellen in der organotypischen Kultur ...49
3.3.2. Einfluss der Kalzium-Konzentration auf die Ischämievulnerabilität der
Haarzellen in der organotypischen Kultur ...52
3.3.3. Wirkung von Magnesium auf die Hypoxievulnerabilität von Haarzellen...55
3.3.4. Wirkung von MK 801 auf die Hypoxievulnerabilität von Haarzellen ...56
3.4. Art des Zelltodes unter Ischämie ...58
3.4.1. Apoptose und Nekrose der Haarzellen...58
3.4.2. Einfluss von Wachstumsfaktoren auf den Zelltod...61
3.5. HIF-1-Aktivität in der Cochlea...64
3.5.1. HIF-1-Aktivität in der organotypischen Kultur...65
3.5.2. HIF-1-Aktivierung unter Hypoxie und Ischämie in Einzelzellkultur...66
3.5.3. HIF-1 alpha Protein in der Einzelzellkultur ...69
3.6. Genexpression in der Cochlea (mRNA) ...72
3.6.1. Statistische Betrachtungen zu den angewandten Microarray-Untersuchungen .72
3.6.2. Charakterisierung der Genexpression in der frisch präparierten Cochlea (S1)..78
3.6.2.1. Analyse der Gene mit einer hohen Expression im Organ Corti im
Vergleich zu Modiolus und Stria vascularis...80
3.6.2.2. Analyse der Gene mit einer mehr als zweimal so hohen Expression im
Organ Corti gegenüber Modiolus und Stria vascularis ...83
3.6.2.3. Analyse der nur im Organ Corti vorkommenden Gene ...84
3.6.2.4. Analyse der Gene mit einer hohen Expression im Modiolus im
Vergleich zu Organ Corti und Stria vascularis...86
3.6.2.5. Analyse der Gene mit einer mehr als zweimal so hohen Expression im
Modiolus gegenüber Organ Corti und Stria vascularis ...88
3.6.2.6. Analyse der nur im Modiolus vorkommenden Gene...90
3.6.2.7. Analyse der Gene mit einer hohen Expression in der Stria vascularis im
Vergleich zu Organ Corti und Modiolus ...92
3.6.2.8. Analyse der Gene mit einer mehr als zweimal so hohen Expression in
der Stria vascularis gegenüber Organ Corti und Modiolus ...94
3.6.2.9. Analyse der nur in der Stria vascularis vorkommenden Gene...96
3.6.3. HIF-1 alpha mRNA ...99
3.6.4. Charakterisierung der Genexpression unter besonderer Berücksichtigung
HIF-1-abhängiger Gene ...100
3.6.5. Charakterisierung der Genexpression unter Kultivierung (S2) ...103
3.6.5.1. Analyse der Gene, die unter Kultivierung hochreguliert wurden...104
3.6.5.2. Analyse der Gene, die unter Kultivierung runterreguliert wurden ...128
3.6.6. Einfluss von Hypoxie auf die Genexpression (S3)...134
3.6.6.1. Gene, die unter Hypoxie hochreguliert wurden...136
3.6.6.2. Gene, die unter Hypoxie runterreguliert wurden ...140
3.6.7. Veränderung von „Prestin“ als Schlüsselgen der äußeren Haarzellen in der
organotypischen Kultur der Cochlea...144
3.6.7.1. Veränderung von „Prestin“ in der organotypischen Kultur unter
Hypoxie und Ischämie ...147
3.6.8. Veränderung der HIF-1-abhängigen Gene unter Kultivierung und Hypoxie...148
4. Diskussion ...151
4.1. Vor- und Nachteile des eingesetzten Modells ...151
4.2. Mechanismen der Schädigung von Haarzellen durch Hypoxie/Ischämie ...152
4.3. Einfluss von Elektrolyten auf die Ischämievulnerabilität von Haarzellen in
der organotypischen Kultur ...155
4.3.1. Einfluss von Kalium ...155
4.3.2. Einfluss von Kalzium ...159
4.3.3. Einfluss von Magnesium ...161
4.3.4. Protektiver Einfluss von MK 801...162
4.4. Art des Zelltodes unter Ischämie ...163
4.5. Rolle der HIF-1-Aktivität ...164
4.6. Analyse der Genexpression (mRNA)...167
4.6.1. Charakterisierung der Genexpression in der frisch präparierten Cochlea (S1) 167
4.6.2. Veränderung der Genexpression unter Kultivierung (S2)...171
4.6.2.1. Veränderung der HIF-1-abhängigen Gene unter Kultivierung...174
4.6.3. Einfluss von Hypoxie auf die Genexpression (S3)...175
4.6.4. Veränderung der HIF-1-abhängigen Gene unter Hypoxie ...177
4.7. Analyse der Prestinexpression ...177
5. Schlussfolgerungen für die Protektion von Haarzellen und Ausschau auf
zukünftige Untersuchungen ...179
7. Literatur ...186
8. Schema- und Abbildungsverzeichnis ...219
9. Tabellenverzeichnis ...224
10. Abkürzungsverzeichnis ...226
Erklärung ...231
6. Zusammenfassung
In dieser Arbeit wurde der Einfluss von Hypoxie/Ischämie auf die organotypische Kultur
sowie die daraus resultierenden Veränderungen der Genexpression der neugeborenen
Wistarratte (3.-5. postnataler Tag) untersucht. Die innere Haarzelle ist gegenüber
Hypoxie/Ischämie vulnerabler als die äußere Haarzelle. Für die unterschiedliche
Vulnerabilität der Haarzellen spielt besonders die Plasmamembran-Kalzium-ATPase
(PMCA) eine bedeutende Rolle. Die Aktivierung der Plasmamembran-Kalzium-ATPase
kann ein zukünftiger therapeutischer Ansatz zur Protektion von Haarzellen sein.
Elektrolyte haben einen entscheidenden Einfluss auf die
Hypoxie/Ischämie-Vulnerabilität von Haarzellen. So führte unter Normoxie als auch unter Ischämie eine
Kalium-Erhöhung nicht zu einer Zunahme der Haarzellschädigung. Unter Ischämie hatte
im Gegenteil eine Kalium-Konzentration von 70 mM einen stark protektiven Effekt auf die
Haarzellen. Magnesium und MK 801 (NMDA-Antagonist) zeigten in der organotypischen
Kultur ebenfalls eine Protektion der inneren und äußeren Haarzelle während
Hypoxieexposition.
Hypoxie und Ischämie führen zum Zelltod der Haarzellen über Apoptose und
Nekrose. Wachstumsfaktoren wie rhEPO, rhIGF-1 und rhEGF verringerten in der
organotypischen Kultur die apoptotische und nekrotische Todesrate. Da die Apoptose
partiell reversibel ist, kann die Aktivierung oder Blockade bestimmter Signalwege der
Apoptose zur Haarzellprotektion oder zum Haarzelltod führen.
Für die Charakterisierung des Profils der Genexpression und ihrer Veränderung durch
Kultivierung und Hypoxie wurden Microarray-Untersuchungen (RN U34-Genchip von
Affymetrix) verwandt. Die Gewebeproben von drei Regionen der Cochlea, Organ Corti,
Modiolus und Stria vascularis, wurden untersucht. Es wurden drei Gruppen gebildet:
Genexpressionsprofil der frisch präparierten Cochlea, Genveränderungen unter
Kultivierung und unter Hypoxie. Interessanterweise sind die typischen Eigenschaften der
Cochlea bereits am 3.-5. postnatalen Tag ausgeprägt. Im Organ Corti fanden sich
besonders Gene, die wesentlich für die Kalzium- und Kalium-Homeostase verantwortlich
sind. Im Modiolus waren besonders Gene nachweisbar, die für die Entwicklung, die
Reifung und die Regulation neuronaler Strukturen verantwortlich sind. In der Stria
vascularis wurden überwiegend Gene exprimiert, deren Genprodukte der Sicherung der
Ionenhomeostase und der Durchblutung sowie dem Schutz vor Radikalen dienen.
Betrachtet man die Veränderungen im Organ Corti unter Kultivierung, so zeigten
sich bei der Hochregulation starke Genveränderungen im Glukose-Stoffwechsel, bei
Cytokinen und einigen speziellen Genen, z. B. der „Heme oxygenase 1“ (Hmox) und
„Proteinkinase 9“ (Mapk9). Runterreguliert waren besonders Gene der Neurotransmission
und der Signaltransduktion. Die stärksten Veränderungen in der Genexpression unter
Kultivierung waren im Modiolus nachweisbar. Die Genveränderungen in der Stria
vascularis entsprachen im Wesentlichen der des Organ Corti. Die insgesamt sehr starken
Veränderungen in der Genexpression innerhalb von 24 Stunden während der Kultivierung
sind einerseits offensichtlich Ausdruck des traumatischen Stresses durch Präparation und
Kultivierung, andererseits der normalen Entwicklungsprozesse, die aber unter
Kulturbedingungen verändert ablaufen.
Im Gegensatz zu den durch die Kultivierung induzierten Veränderungen waren die
durch 5 h Hypoxie induzierten Veränderungen sehr gering. Die stärkste Veränderung der
Hochregulation in der Genexpression unter Hypoxie zeigte sich im Modiolus. Sowohl
Wachstumsfaktoren, eine Reihe von Ionenkanälen sowie Gene der Neurotransmission
wurden im Modiolus hochreguliert.
Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) ist ein Schlüsseltranskriptionsfaktor für die
Anpassung von Zellen und Geweben an Hypoxie und Ischämie. In der Cochlea führten
Hypoxie und Ischämie zu einer deutlichen und gewebespezifischen Aktivierung von
HIF-1, wobei im Modiolus und Organ Corti die höchsten Aktivitäten nachweisbar waren. Der
HIF-1 alpha mRNA-Gehalt veränderte sich unter Normoxie und Hypoxie nicht und war im
Modiolus wesentlich niedriger als im Organ Corti und in der Stria vascularis. Unsere
Untersuchungen zeigen, dass die HIF-1
alpha mRNA-Expression und die
Proteinexpression in der Cochlea nicht parallel verlaufen. Demzufolge ist die Regulation
von HIF-1 in der Cochlea in der Posttranslationsebene zu vermuten. Protektive
therapeutische Ansätze sind nicht über die HIF-1 alpha Aktivierung zu erwarten, sondern
eher über die Hoch- oder Runterregulation der Targetgene.
Bei den HIF-1-abhängigen Genen wies die Stria vascularis unter Normoxie die
höchste Expression der Gene „Solute carrier family 2 (facilitated glucose transporter,
member 1“ (Slc2a1) und „Insulin-like growth factor binding protein 2“
(Igfbp2) auf.
Unter Kultivierung wurden zahlreiche HIF-1-abhängige Gene in der Cochlea
hochreguliert. Hochreguliert (≥ 2fach) wurden die Gene, die im Zusammenhang mit dem
Umsatz der Glukose (Gapdh), dem Glukosetransport (Slc2a1), der Aktivität des
Wachstumshormons IGF, mit dem Eisentransport (Tf, Tfrc), der Durchblutung bzw. der
Elimination von Sauerstoffradikalen stehen. Eine 5 Stunden dauernde Hypoxie führte nur
zu einer geringen Veränderung der HIF-1-abhängigen Gene. Eine mehr als 2fache
Erhöhung war bei „Insulin-like growth factor 2“ (
Jgf2) im Modiolus nachzuweisen.
Da das Prestin-Gen auf dem neurobiologischen Chip nicht enthalten ist und aufgrund
der bedeutenden Rolle von Prestin für die Haarzellfunktion, wurden die Veränderungen der
Prestin mRNA-Expression durch schädigende Faktoren mittels RT-PCR untersucht. Der
Prestin mRNA-Gehalt im Organ Corti der neugeborenen Ratte stieg während der
Entwicklung in vitro ebenso wie in vivo um den Faktor zwei an. Diese Zunahme war mit
der Herausbildung eines apikal-basalen Gradienten verbunden, wobei apikal der höchste
mRNA-Gehalt vorlag. Ischämie und Hypoxie führen zu einer Abnahme des Prestin
mRNA-Gehaltes parallel zum Verlust der äußeren Haarzellen. Dies bestätigt, dass die
Abnahme des Prestin mRNA-Gehaltes als ein Indikator für den Schaden oder Verlust der
äußeren Haarzelle angesehen werden kann.
In der vorliegenden Arbeit wurde eine Reihe neuer Erkenntnisse über die Rolle von
Hypoxie/Ischämie in der Cochlea gewonnen, die neue Ansatzpunkte für
Therapiemöglichkeiten und Prävention der Hypoxie/Ischämie bedingten Hörstörungen
bieten.
8. Schema- und Abbildungsverzeichnis
Schema 1 Tinnitusklassifizierung
Abb. 1 Schematischer Versuchsaufbau der Microarray-Untersuchungen der Cochlea der Serien 1, 2 und 3.
Abb. 2 Darstellung der Microarray-Untersuchung. (Quelle:
www.dkfz.de/ibios_old/lectures/bioinf_ss05/rKoenig/FunktionalAnalyse1TB.pdf)
Abb. 3 Kontrollplasmid pGL3 und Reporterplasmid pHBE.
In das Reporterplasmid pHBE sind drei HBE-Bindungsstellen mit einer EcoRi-Kontrollschnittstelle in den Enhancer-Bereich des SV 40-Promotors hineinkloniert worden. Nach Bindung von HIF-1 an die HBEs erfolgt eine im Vergleich zum Kontrollplasmid verstärkte Expression der Luciferase.
Abb. 4 Repräsentative Darstellung der Rhodamine-Phalloidin gefärbten Cochlea-Kultur (apikaler Teil) unter Normoxie (oben) und nach 24 h Hypoxie (unten). Der Strich entspricht 10 µm.
Abb. 5 Prozentualer Verlust von inneren und äußeren Haarzellen (IHZ/ÄHZ) in den 3 cochleären Segmenten nach unterschiedlicher Hypoxiedauer im Vergleich zu den Kontrollgruppen. Die Hypoxieexposition erfolgte unmittelbar (oben; 13 h n = 21, 36 h n = 41, Kontrollen n = 36) oder 12 h (unten; 24 h n = 20, 48 h n =12, Kontrollen n = 17) nach der Präparation. Angegeben sind die Mittelwerte ± Standardfehler.
Abb. 6 Haarzellverlust (%) in der gesamten Cochlea nach 6 bzw. 8 h dauerndem Glukosemangel (n =18), Hypoxie (n = 21) oder Ischämie (Glukosemangel + Hypoxie; n =51) im Vergleich zu den Kontrollgruppen (n = 19). Angegeben sind die Mittelwerte ± Standardfehler.
Abb. 7 Einfluss der Kalium (K+)-Konzentration im Medium unter Normoxie auf die Anzahl der inneren (IHZ) und äußeren (ÄHZ) Haarzellen, die in den 3 cochleären Segmenten/100 µm gezählt wurden. Angegeben sind die Mittelwerte ± Standardfehler (5 mM K+, n = 36; 30 mM K+, n = 19; 50 mM K+, n = 17; 70 mM K+, n =19).
Abb. 8/9 Einfluss der Kalium (K+)-Konzentration im Medium auf die Anzahl der inneren und äußeren Haarzellen (IHZ/ÄHZ), die in den 3 cochleären Segmenten nach 3 h (Abb. 8, oben) und 4 h (Abb. 9, unten) Ischämie pro 100 µm gezählt wurden (% zu Kontrollen). Angegeben sind die Mittelwerte ± Standardfehler. (Abb. 8: n = 9-11, * p <0,05; Abb. 9: n = 8-15; */**/*** p < 0,01/0,001/0,001 vs. Ischämie bei 5 mM K+ im Medium).
Abb. 10 Wirkung von unterschiedlichen Eosinkonzentrationen (1,5 µM, n = 15; 5 und 10 µM, je n = 9) auf die Anzahl der inneren und äußeren Haarzellen (IHZ/ÄHZ) unter normoxischen Bedingungen im Vergleich zur Kontrollgruppe (n = 19). Dargestellt sind die Mittelwerte ± Standardfehler (*/** p < 0,05/0,01 vs. Kontrolle).
Abb. 11 Verlust von inneren und äußeren Haarzellen (IHZ/ÄHZ) in den 3 cochleären Segmenten nach 36 h Hypoxie ohne (n = 12) und mit Zusatz von 3 mM Magnesium (Mg, n = 6) im Vergleich zu den Kontrollgruppen (n = 15). Angegeben sind die Mittelwerte ± Standardfehler. P < 0,01/0,001 kennzeichnet die Signifikanzen zwischen den beiden Hypoxiegruppen.
Abb. 12 Verlust von inneren und äußeren Haarzellen (IHZ/ÄHZ) in den 3 cochleären Segmenten nach 36 h Hypoxie ohne (n = 12) und mit Zusatz von 1 µM (n = 6) bzw. 10 µM MK 801 (n = 8) im Vergleich zu den Kontrollgruppen (n = 15). Angegeben sind die Mittelwerte ± Standardfehler. P < 0,05/0,001 kennzeichnet die Signifikanzen zwischen der unbehandelten und den mit MK 801 behandelten Hypoxiegruppen.
Abb. 13 Anzahl der inneren (IHZ) und äußeren (ÄHZ) Haarzellen/100 µm in den 3 cochleären Bereichen nach 3 h (n = 5-19) und 4 h Ischämie (n = 6-22) im Vergleich zu den Kontrollen (n = 18-28). Die Proben wurden entweder unmittelbar oder 24 h nach der Ischämie fixiert (*/** p < 0,05/0,01 vs. unmittelbar). Angegeben sind die Mittelwerte ± Standardfehler.
Abb. 14 Anzahl der nekrotischen und apoptotischen Zellkerne/100 µm in den 3 cochleären Segmenten nach 3 h (n = 5-21) und 4 h Ischämie (n = 4-22) im Vergleich zu den Kontrollen (n = 18-28). Die Proben wurden entweder unmittelbar oder 24 h nach der Ischämie untersucht (*/** p < 0,05/0,01 vs. unmittelbar). Angegeben sind die Mittelwerte ± Standardfehler.
Abb. 15 Anzahl der im apikalen, medialen und basalen Segment der Cochlea gezählten inneren und äußeren Haarzellen/100 µm der Kontrollgruppe (n = 22-23) sowie nach 3,5 h Ischämie ohne Wachstumsfaktoren (WF) (n = 30-33), mit rhEPO (n = 8-9), rhIGF-1 (n = 11-12) und rhEGF (n = 9-11). (Mittelwerte ± Standardfehler; */** p < 0,05/0,001 vs. Ischämie ohne WF).
Abb. 16 Einfluss der Wachstumsfaktoren (WF) auf die Anzahl der nekrotischen (PI-gefärbten) und apoptotischen (ApopTagR-gefärbten) Kerne, die in den 3 cochleären Segmenten der Kontrollgruppen (n = 18-23) und nach 3,5 h Ischämie ohne WF (n = 26-33) sowie mit rhEPO (n = 8-10), rhIGF-1 (n = 11-12) und rhEGF (n = 4-11) pro 100 µm gezählt wurden (Mittelwerte ± Standardfehler; */** p < 0,05/0,01 vs. Ischämie ohne WF).
Abb. 17 Korrelation zwischen der Anzahl der Haarzellen und den PI- and ApopTag®-gefärbten Kernen, die im apikalen, medialen und basalen Segment der Cochlea/100 µm gezählt wurden. Es wurden die Mittelwerte der einzelnen Gruppen verwendet. (Kontrolle und Ischämie mit und ohne Wachstumsfaktoren).
Abb.18 Erythropoetin-Rezeptor-Bande in Organ Corti (OC), Stria vascularis (SV), Modiolus (MOD) im Vergleich zur Leber.
Abb. 19 Expression der Vektoren pGL3 (weiß) und pHRE (schwarz) in der Explant-Kultur von Stria vascularis (SV), Organ Corti (OC) und Modiolus (MOD) in Normoxie und Hypoxie (gemessen in RLE = relativen Lumineszenzeinheiten, Mittelwert ± Standardfehler, n = 11-15). Die Kulturen wurden direkt nach der Hypoxie (24 h) transfiziert (* p < 0,001 vs. SV).
Abb. 20 Kinetik der HIF-1-Aktivität in den Einzelzellkulturen der drei Cochleagewebe Stria vascularis (SV), Organ Corti (OC) und Modiolus (MOD) nach 6 h, 13 h, 24 h und 36 h Hypoxie. Angegeben ist der Quotient aus pHRE/pGL3 unter Normoxie und Hypoxie (Mittelwerte ± Standardfehler; n = 4-6 für jede Hypoxiezeit; * p < 0,05 vs. 6 h; # p < 0,05 im Vergleich zu SV).
Abb. 21 Einfluss von Hypoxie und Ischämie auf die HIF-1-Aktivierung in der Einzellzellkultur von Organ Corti (OC), Modiolus (MOD) und Stria vascularis (SV). Die Untersuchung erfolgte im kompletten Medium (Hypoxie), in Elektrolytlösung mit Glukose (Hypoxie) und Elektrolytlösung ohne Glukose (Ischämie). Dargestellt sind die Mittelwerte ± Standardfehler (n = 4-6).
Abb. 22 Zytochemische Identifikation von HIF-1 alpha in Einzelzellkulturen von Stria vascularis (SV), Cortischem Organ (OC) und Modiolus (MOD) in Kulturen nach 24-stündiger Normoxie oder Hypoxie. (a) SV, Normoxie; (b) SV, Hypoxie; (c) SV, 60 Minuten nach Hypoxie; (d) OC, Normoxie; (e) OC, Hypoxie; (f) OC, 60 Minuten nach Hypoxie; (g) MO, Normoxie; (h) MO, Hypoxie; (i) MO, 60 Minuten nach Hypoxie. Dabei wurden normoxische Kulturen mit Kulturen, die einer Hypoxie von 24 h ausgesetzt waren und direkt nach Hypoxieende fixiert wurden, sowie mit Kulturen, die einer 24 h Hypoxie ausgesetzt waren aber 60 min nach Hypoxieende fixiert wurden, verglichen.
Abb. 23 Korrelation der normierten Signale von zwei Aliquotes des Organ Corti.
Abb. 24 Korrelation der normierten Signale des Organ Corti der Proben P2 und P4.
Abb. 25 Korrelation der normierten Signale der „housekeeping“ Gene in den Proben P1 und P2-P4 von Organ Corti.
Abb. 27 Analyse der Signifikanzschwelle der normierten Signale des Organ Corti (P2).
Abb. 28 Histogramm der Absolutwerte (oben) und der log 2-Werte (unten) der normierten Signale des Organ Corti (P2).
Abb. 29 Ergebnis der Berechnung von hierarchischen Clustern der neugeborenen Ratte in den Regionen Organ Corti, Stria vascularis und Modiolus. Rot = hohe Expression, blau = niedrige Expression, gelb = mittlere Expression.
Abb. 30 Gene, die über der 90. Perzentile im Organ Corti exprimiert wurden. Ionenkänale und Ionenhomeostase regulierende Gene = schwarz, Wachstums- und Überlebensgene = dunkelgrau, andere Gene = weiß.
Abb. 31 Gene im Organ Corti (OC), deren normierte Signale mehr als doppelt so hoch exprimiert wurden wie in Modiolus (MOD) und Stria vascularis (SV).
Ionenkanäle und Ionenhomeostase regulierende Gene (1): Atp2b2, S100a1, Wachstums- und Überlebensgene (2): Igfbp3,
Interzelluläre und synaptische Signaltransduktion (3): Rab3a, Slc1a3.
Abb. 32 Gene, die nur im Organ Corti als „present“ bewertet wurden. Ionenkanäle und Ionenhomeostase regulierende Gene = schwarz, Wachstums- und Überlebensgene = dunkelgrau, interzelluläre und synaptische Signaltransduktion = hellblau.
Abb. 33 Gene, die über der 90. Perzentile im Modiolus exprimiert wurden. Wachstums- und Überlebensgene = dunkelgrau.
Abb. 34 Gene, die im Modiolus mindestens doppelt so hoch exprimiert wurden wie im Organ Corti und der Stria vascularis.
Wachstums- und Überlebensgene (2): Cnp1, Egr1, Igf2, Mag, Nr4a1, Plp, Ednrb,
Mapk9, Prnp, Vcam1, Ctsk,
Interzelluläre und synaptische Signaltransduktion (3): Snca.
Abb. 35 Gene, die nur im Modiolus exprimiert wurden. Wachstums- und Überlebensgene = dunkelgrau, interzelluläre und synaptische Signaltransduktion = hellgrau, andere Gene = weiß.
Abb. 36 Gene, die in der Stria vascularis hoch exprimiert wurden. Ionenkanäle und Ionenhomeostase regulierende Gene (1) = schwarz, Wachstums- und Überlebensgene (2) = dunkelgrau, interzelluläre und synaptische Signaltransduktion (3) = hellblau.
Abb. 37 Gene, die in der Stria vascularis signifikant höher exprimiert wurden als im Organ Corti und im Modiolus.
Wachstums- und Überlebensgene (2): Apoe, Fgfr1,Fgfr4, Igf1, Igfbp2, Nnat, Pou3f4,
Serpine2, Sod3, Tf,
Interzelluläre und synaptische Signaltransduktion (3): Glul.
Abb. 38 Gene, die nur in der Stria vascularis exprimiert wurden. Ionenkanäle und Ionenhomeostase regulierende Gene = schwarz, Wachstums- und Überlebenssgene = dunkelgrau, interzelluläre und synaptische Signaltransduktion = hellblau.
Abb. 39 Expression von HIF-1-abhängigen Genen in der organotypischen Kultur von Cortischem Organ (OC), Modiolus (MOD) und Stria vascularis (SV) unter Normoxie. Die Analyse erfolgte mittels Microarray (Affymetrix). Dargestellt sind die normierten Signale in logarithmischer Form. Folgende Gene erreichen im OC und MOD nicht die statistische Signifikanz von p < 0,04: Pdgfa, Vegfb, Hmox1, Nos2, Trfc. In der SV ist
Trfc „marginal“ (p = 0,054).
Abb. 40 Cochleogramm für die inneren (grau) und äußeren (weiß) Haarzellen (IHZ/ÄHZ) nach 5 h Hypoxie (% zur Normoxie). Angegeben sind die Mittelwerte ± Standardfehler (n = 9-13).
Abb. 41 Totale RNA (oben) und Prestin mRNA (unten) in den 3 cochleären Segmenten während der Kultivierung in vitro. Angegeben sind die Mittelwerte ± Standardfehler (n = 6). * p < 0,001 vs. sofort; # p < 0,01 vs. apikal bzw. medial.
Abb. 42 Totale RNA (oben) und Prestin mRNA (unten) in den 3 cochleären Segmenten während der Entwicklung in vivo am 3. (weiß), 5. (grau) und 7. (schwarz) postnatalen Tag. Angegeben sind die Mittelwerte ± Standardfehler (n = 3). * p < 0,05 vs. 3. Tag; # p < 0,01 vs. apikal.
Abb. 43 Veränderung der HIF-abhängigen Gene in der organotypischen Kultur von Organ
Corti (OC), Stria vascularis (SV) und Modiolus (MOD) unter Kultivierung.
Abb. 44 Veränderung der HIF-abhängigen Gene in der organotypischen Kultur von Organ
Corti (OC), Stria vascularis (SV) und Modiolus (MOD) unter Hypoxie.
Abb. 45 Mögliche Ursachen der unterschiedlichen Vulnerabilität von äußeren (ÄHZ) und inneren (IHZ) Haarzellen und bei Hypoxie und Ischämie.
Abb. 46 Zusammenfassung der spezifischen Genexpression in der frisch präparierten Cochlea (S1) im Organ Corti (OC), Modiolus (MOD) und in der Stria vascularis (SV). (Quelle Cochlea: anatomy.iupiui.edu/Earf04/cochlea.jpg)
9. Tabellenverzeichnis
Tabelle 1 Rolle von Hypoxie/Ischämie für den neurosensorischen Tinnitus.
Tabelle 2 Verlust von inneren und äußeren Haarzellen (IHZ/ÄHZ) unter ischämischen
Bedingungen und einer K+-Konzentration von 70 mM im Medium ohne Blocker oder mit Linopiridin, KB-R7943 bzw. Eosin. Angegeben sind die Mittelwerte ± Standardfehler (% gegenüber Werten ohne Blocker bei 70 mM K+ unter Normoxie).
Tabelle 3 Anzahl der gezählten inneren und äußeren Haarzellen (IHZ/ÄHZ) pro 100 µm unter
Normoxie und Ischämie ohne (Kontrollen) und mit unterschiedlichen Thapsigargin-Konzentrationen [Mittelwert ± Standardfehler (n)].
Tabelle 4 Anzahl der gezählten inneren und äußeren Haarzellen (IHZ/ÄHZ) pro 100 µm unter
Ischämie ohne (Kontrollen) und mit unterschiedlichen Eosin-Konzentrationen [Mittelwert ± Standardfehler (n)].
Tabelle 5 Korrelationsanalyse der normierten Signale von Organ Corti (OC), Modiolus (MOD)
und Stria vascularis (SV) unter den Bedingungen Normoxie, Kultivierung und Hypoxie.
Tabelle 6 Korrelationsanalyse der normierten Signale der „housekeeping“ Gene von Organ Corti
(OC), Modiolus (MOD) und Stria vascularis (SV) zwischen Normoxie (P1) und Kultivierung (P2/P4).
Tabelle 7 Differentielle Genexpression in den Regionen Organ Corti (OC), Modiolus (MOD)
und Stria vascularis (SV).
Tabelle 8 HIF-1 alpha mRNA-Expression in Organ Corti (OC), Modiolus (MOD) und Stria
vascularis (SV) in Normoxie. Gegenübergestellt sind die Microarray-Daten (normierte Signale) und die Werte der quantitativen RT-PCR.
Tabelle 9 HIF-1-abhängige Zielgene, die auf dem RN U34-Chip enthalten sind. Tabelle 10 Anzahl der hoch- und runterregulierten Gene unter Kultivierung.
Tabelle 11 Unter Kultivierung hochregulierte Gene der Gruppe Kohlenhydratstoffwechsel. Tabelle 12 Unter Kultivierung hochregulierte Gene der Gruppe Wachstumsfaktoren. Tabelle 13 Unter Kultivierung hochregulierte Gene der Gruppe Cytokine.
Tabelle 14 Unter Kultivierung hochregulierte Gene der Gruppe der Kinasen. Tabelle 15 Unter Kultivierung hochregulierte Gene der Gruppe Redoxstoffwechsel. Tabelle 16 Unter Kultivierung hochregulierte Gene der Gruppe Apoptose.
Tabelle 18 Unter Kultivierung hochregulierte Gene der Gruppe Stress-Proteine und Peptide. Tabelle 19 Unter Kultivierung hochregulierte Gene der Gruppe der Phosphodiesterasen. Tabelle 20 Unter Kultivierung hochregulierte Gene der Gruppe der „anderen“ Gene.
Tabelle 21 Unter Kultivierung runterregulierte Gene der Gruppe Wachstum und Zytoskelett. Tabelle 22 Unter Kultivierung runterregulierte Gene der Gruppe Ionenkanäle.
Tabelle 23 Unter Kultivierung runterregulierte Gene der Gruppe Neurotransmission. Tabelle 24 Unter Kultivierung runterregulierte Gene der Gruppe Signaltransduktion. Tabelle 25 Unter Kultivierung runterregulierte Gene der Gruppe Apoptose.
Tabelle 26 Unter Kultivierung runterregulierte Gene der Gruppe Transportproteine. Tabelle 27 Unter Kultivierung runterregulierte Gene der Gruppe Proteinsynthese. Tabelle 28 Anzahl der hoch- und runterregulierten Gene unter Hypoxie (5 h). Tabelle 29 Unter Hypoxie hochregulierte Gene der Gruppe Wachstumsfaktoren. Tabelle 30 Unter Hypoxie hochregulierte Gene der Gruppe Transkriptionsfaktoren. Tabelle 31 Unter Hypoxie hochregulierte Gene der Gruppe Ionenkanäle.
Tabelle 32 Unter Hypoxie hochregulierte Gene der Gruppe Neurotransmission. Tabelle 33 Unter Hypoxie hochregulierte Gene der Gruppe Apoptose.
Tabelle 34 Unter Hypoxie runterregulierte Gene der Gruppe Wachstum/Zytoskelett. Tabelle 35 Unter Hypoxie runterregulierte Gene der Gruppe Apoptose.
Tabelle 36 Unter Hypoxie runterregulierte Gene der Gruppe Cytokine.
Tabelle 37 Unter Hypoxie runterregulierte Gene der Gruppe Redoxstoffwechsel. Tabelle 38 Unter Hypoxie runterregulierte Gene der Gruppe Signaltransduktion. Tabelle 39 Unter Hypoxie runterregulierte Gene der Gruppe Transkriptionsfaktoren. Tabelle 40 Effekt der Hypoxie (38 h) auf den Prestin mRNA Gehalt des Organ Corti.
10. Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung ACH Acetylcholin ADP Adenosindiphosphat ÄHZ Äußere Haarzelle AMPA Alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure ApopTag® Insitu DNA End labeling AssayARNT Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator ATP Adenosintriphosphat
bHLH-PAS- Basische Helix-Loop-Helix- und PER-ARNT-SIM-Homologie-Domäne bzw. Beziehungsweise ca. Zirka Ca2+ Kalzium cGMP 3,5-Guanylmonophosphat CO2 Kohlendioxid DA Dopamin DLU Digital light unit DNA Desoxyribonukleinsäure ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay EST Expressed sequence tag
ET1 Endothelin 1
EZK Einzelzellkultur F-Aktin Filamentäres Aktin GABA Gammaaminobuttersäure G-Aktin Globuläre Aktin-Monumere GLUT1 Glukosetransporter 1 GLUT5 Glukosetransporter 5 h Stunde HIF-1 Hypoxia-inducible factor 1 HRE Hypoxie response element
IHZ Innere Haarzelle
iNOS Induzierte Stickstoffmonoxid-Synthase
K+ Kalium
MOD Modiolus
mRNA Messenger ribonucleic acid N2 Stickstoff
Na+ Natrium
NGF Nerve growth factor
NMDA N-Methyl-D-Aspartat
nNOS Neuronale Stickstoffmonoxid-Synthasen NO Stickstoffmonoxid
NOS Stickstoffmonoxid-Synthase
n.s. Nicht signifikant
OC Organ Corti
PCR Polymerase chain reaction PI Propidiumiodid
PMCA Plasmamembran-Kalzium-ATPase pO2 Sauerstoffpartialdruck
rhEGF Recombinant human epithelial growth factor rhEpo Recombinant human erythropoetin
rhIGF-1 Recombinant human insulin-like growth factor RLE Relative Lumineszenzeinheit
ROS Reactive oxygen species
RT-PCR Real-time polymerase chain reaction
SERCA Smooth endoplasmatic reticulum calcium ATPase SLC 26 Sulfat-Anionen-Austauscher ähnliche Proteine SV Stria vascularis
TNF Tumor necrosis factor u. a. Unter anderem VK Variationskoeffizient WF Wachstumsfaktoren z. B. Zum Beispiel ZNS Zentralnervensystem GENE
Adora2b Adenosine A2B receptor Apoe Apolipoprotein E Arrb2 Arrestin, beta 2
ATF2 Activating transcription factor
Atp1a1 ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide Atp1a2 ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 2 polypeptide Atp1b1 ATPase, Na+/K+transporting, beta 1 polypeptide Atp1b3 ATPase, Na+/K+ transporting, beta 3 polypeptide Atp2a3 ATPase, Ca2+ transporting
Atp2b2 ATPase, Ca2+ transporting, plasma membrane 2, auch als Pmca2 bekannt Bax Bcl2-associated X protein
Bcl2 B-cell cll/lymphoma 2
Bdnf Brain derived neurotrophic factor Birc2 Baculoviral IAP repeat containing 2
Bmyc Brain expressed myelocytomatosis oncogene C3 Komplementfaktor 3
C4a Komplementfaktor 4a
C9 Complement component 9
Cacna1e Calcium channel, voltage-dependent, L type, alpha 1E subunit Cacnb2 Calcium channel, voltage-dependent, beta 2 subunit
Calm1 Calmodulin 1 Casp2 Caspase 2 Casp3 Caspase 3 Capn3 Calpain 3
Ccl2 Chemokine (C-C motif) ligand 2 Ccl3 Chemokine (C-C motif) ligand 3 Cebpb CCAAT-enhancer binding protein beta Chrm2 Cholinergic receptor, muscarinic 2
Chrna9 Cholinergic receptor, nicotinic, alpha polypeptide 9 Chrna7 Cholinergic receptor, nicotinic, alpha polypeptide 7 Cited2 Cbp/p300-interacting transactivator
Ckb Creatine kinase, brain Clcn3 Chloride channel 3
Cnp1 Cyclic nucleotide phosphodiesterase 1 Crem cAMP response element modulator Ctsk Cathepsin K
Drd1a Dopamine receptor 1A Et-1 Endothelin-1 Ednrb Endothelin receptor type B
Eef2 Eukaryotic translation elongation factor 2 Egr1 Early growth response 1
Eno2 Enolase 2, gamma
Enpp2 Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 2 Fas ligand TNF superfamily, member 6
Fez1 Fasciculation and elongation protein zeta 1 Fez2 Fasciculation and elongation protein zeta 2 Fgf2 Fibroblast growth factor
Fgf5 Fibroblast growth factor 5
Fgfr1 Fibroblast growth factor receptor 1 Fgfr4 Fibroblast growth factor receptor 4 Fosl1 Fos-like antigen 1
Gabbr1 GABA B receptor 1 Gabt1 GABA Transporter protein
Gapdh Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Gfap Glia fibrillary acidic protein
Glul Glutamine synthetase 1 Gmfb Glia maturation factor, beta
Gnao Guanine nucleotide binding protein, alpha o Gpr51 G protein-coupled receptor 51
Gria4 Glutamate receptor, ionotropic, 4 Grm6 Glutamate receptor, metabotropic 6 Gsta5 Glutathion-S-transferase A5 Hk1 Hexokinase 1
Hmox1 Heme oxygenase 1 Hspa1a/b Heat shock protein 1a/b Hspa1a Heat shock protein1a Hsp70 Heat shock protein 70
Icam1 Intercellular adhesion molecule 1 Igf1 Insulin-like growth factor 1 Igf2 Insulin-like growth factor 2
Igfbp1 Insulin-like-growth factor binding protein 1 Igfbp2 Insulin-like growth factor binding protein 2 Igfbp3 Insulin-like growth factor binding protein 3 Il15 Interleukin 15
Il1b Interleukin 1 beta
Il6 Interleukin 6
Il8 Interleukin 8
Irf-1 Interferon regulatory factor 1 Jak2 Januskinase 2
Jgf1r Insulin-like growth factor 1 receptor
Junb Jun-B oncogen
Kcne1 Potassium voltage-gated channel, Isk-related subfamily, member 1 Kcnj1 Potassium inwardly-rectifying channel, subfamily J, member 1 Kcnj11 Potassium inwardly rectifying channel, subfamily J, member 11 Kcnj16 Potassium inwardly-rectifying channel, subfamily J, member 16 Mag Myelin-associated glycoprotein
Maob Monoamine oxidase B
Mapk9 Mitogen-activated protein kinase 9 Mapt Microtubule associated protein tau Mbp Myelin basic protein
Mbz Myelin protein zero
Mcl-1 Myeloid cell leukaemia sequence 1 Mif Macrophage migration inhibitory factor Mtap2 Microtubule associated protein 2 Mt1a Metallothionein Nefh Neurofilament heavy polypeptide Neud4 Neuronal d4 domain family member Nf1 Neurofibromatosis 1
Nip3 BCL2/adenovirus E1B 19-kDa protein-interacting protein 3 Nnat Neuronatin
Nos2 Nitric oxide synthase 2, inducible
Npy Neuropeptide y
Nr4a1 Nuclear receptor subfamily 4, group A, member 1 Nrxn2 Neurexin 2
Ntf3 Neurotrophin-3
Ntrk2 Neurotrophic tyrosine kinase receptor, type 2 Nxph4 Neurexophilin 4
Oprk1 Opoid receptor kappa 1 P53 Tumor protein 53
Pbp Phosphatidylethanolamine binding protein Pcp4 Purkinje cell protein 4
Pdap1 PDGFA associated protein 1 Pde4b Phosphodiesterase 4b Pdgfa Platelet-derived growth factor, alpha
Pdgfb Platelet-derived growth factor, B polypeptide
Pdgfra Platelet-derived growth factor receptor, alpha polypeptide Penk-rs Preproenkephalin, related sequence
Plp Proteolipid protein
Pmca2 ATPase, Ca2+ transporting, plasma membrane 2, auch als Atp2b2 bekannt Pou3f4 POU domain, class 3, transcription factor 4
Prkcz Protein kinase C, zeta
Prnp Prion protein
Rab3a RAB3A, member RAS oncogene family RG:621458 Neurofilament light polypeptide
RGD:61922 Sodium channel, voltage-gated, type 6, alpha polypeptide RGD:628710 Voltage-gated channel like 1
Rhoip3 Rho interacting protein 3
S100a1 S100 calcium binding protein A1 S100b S 100 protein, beta polypeptide
Selp Selectin, platelet Ser2 Serpine 2
Serpin2 Serine proteinase inhibitor, clade E, member 2
Slc1a2 Solute carrier family 1 (glial high affinity glutamate transporter), member2 Slc1a3 Solute carrier family 1 (glial high affinity glutamate transporter), member 3 Slc2a1 Solute carrier family 2 (facilitated glucose transporter), member 1
Slc2a3 Solute carrier family 2 (facilitated glucose transporter), member 3
Slc6a3 Solute carrier family 6 (neurotransmitter transporter, dopamine), member 3 Slco1a4 Solute carrier organic anion transporter family, member 1a4
Smad1 SMAD, mothers against DPP homolog 1 Snca Synuclein alpha
Sncg Synuclein gamma Sod3 Superoxide dismutase 3
Stx12 Syntaxin 12
Stxbp1 Syntaxin binding protein 1
Sult2A2 Sulfotransferase family 2, member 2 (predicted) Syt3 Synaptotagmin 3
Tac1 Tachykinin1 Tf Transferrin Tfrc Transferrin receptor
Tgfb1 Transforming growth factor, beta 1 Tgfb2 Transformin growth factor, beta 2 Thra Thyroid hormone receptor alpha Vcam1 Vascular cell adhesion molecule 1 Vdac1 Voltage-dependent anion channel 1 Vegfb Vascular endothelial growth factor B Vgf VGF nerve growth factor inducible
