Natürliche und chemisch modifizierte Polyphenole als Inhibitoren von Signalproteinen des Wnt/ß-catenin-Signaltransduktionsweges

Medizinisch Fakultät

Abschlussarbeit

Postgradualstudium Toxikologie und Umweltschutz

Natürliche und chemisch modifizierte Poly- phenole als Inhibitoren von Signalproteinen des Wnt/β-catenin Signaltransduktionsweges

Strukturelle Einblicke in die selektive Hemmung der Caseinkinase-2 als potentiellem Target beim Hepatozellulären Karzinom

Vorgelegt von:

Dipl. pharm. Katja Steffi Lerche geboren am 02. August 1979 in Plauen

Betreuung:

Prof. Dr. Rolf Gebhardt Universität Leipzig Medizinische Fakultät

Institut für Biochemie/ Abteilung Organbiochemie der Leber

Kooperation:

Prof. Dr. Hans-Jörg Hofmann Universität Leipzig

Fakultät für Biowissenschaften, Pharmazie und Psychologie Institut für Biochemie/ Abteilung Biophysikalische Chemie

Leipzig, den 27. Februar 2009

Danksagung

Mein besonderer Dank gilt meinem Betreuer Herrn Prof. Dr. Rolf Gebhardt für die Überlassung dieses interessanten pharmakologischen und toxikologischen Themas, für seine ständige Unterstützung in theoretischen und praktischen Fragen und für die vielen Jahre in denen ich als Praktikantin, Diplomandin und nun auch Doktorandin, wissenschaftliches Denken und Arbeiten erlernte und mein Interesse für Wissenschaft und Forschung vertiefen konnte.

Des Weiteren gilt mein Dank Herrn Prof. Dr. Hans-Jürgen Hofmann und seiner Arbeitsgruppe für die geduldige Einführung in die Computer- berechnungen und Molekülmodellierungen und die Bereitstellung eines Arbeitsplatzes zur Durchführung dieser Aufgaben.

Für die Synthese der untersuchten Hydroxyanthracenderivate möchte ich mich bei der ehemaligen Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. Kurt Eger vom Institut für Pharmazie für die kooperative Zusammenarbeit bedanken.

Für die technische Unterstützung geht mein Dank an alle Mitarbeiter des Arbeitskreises von Herrn Prof. Dr. Rolf Gebhardt, vor allem an den Strahlenschutzbeauftragten Herrn Dr. Frank Gaunitz und an die Mitarbeiter Frau Doris Mahn und Herrn Frank Struck für die praktische Unterstützung und Mitdurchführung der MTT- und Phosphorylierungsassays.

Dank gebührt meiner Familie und meinen Freunden, deren Liebe und moralische Unterstützung mich durch mein Studium begleiteten und mir mit Rat und Tat stets zur Seite standen.

Abstract

Natural and chemical modified Polyphenoles as Guides for Prevention and Therapy of Hepatocellular Carcinomas

Selective Inhibition of Casein Kinase-2 in Comparison to other dedicated Wnt/β- Catenin Pathway-associated Kinases

Lerche, K. S.¹, Günther, R.², Hofmann, H.², Gebhardt, R.¹

1Institute of Biochemistry, Medical Faculty, University of Leipzig, Johannisallee 30, 04103 Leipzig, Germany

2Institute of Biochemistry, Faculty of Biosciences, Pharmacy and Psychology, University of Leipzig, Brüderstr. 34, 04103 Leipzig, Germany

Introduction: In former times, Rheum palmatum and Rheum officinale, commonly known as Chinese rhubarbs, were used as an anti-inflammatory and anticancer drug in the Orient. Main ingredients were anthraquinones with the basic moiety of emodin (1,3,8-trihydroxy-6-methyl-anthraquinone) and several ubiquitous flavonoids. In the last few years, the therapeutic potential of the chemical lead compound emodin was well studied, and recently the first cytostatics (e.g. daunorubicin and mitoxanthron) were registered. Herein, we investigated several modifications of the emodinic core interference with cell signalling pathways as targets for tumor therapy and looked for the potency of natural flavonoids that may act in a preventive manner. The intention for investigating natural flavonoids was the structural similarity of the chemical core with hydroxyl residues attached in a similar distance to the chemically modified anthranoids.

Background: The Wnt/β-catenin signal transduction pathway is a complex network of proteins, which is involved in normal physiological processes as well as in the pathophysiology of the hepatocellular carcinoma.

In this work, we have investigated casein kinase-1, glycogensynthase kinase-3β, cyclin dependent kinase-2/cyclinA and the prominent kinase casein kinase-2, which are quantitatively elevated in most proliferating tissues such as tumor cells. Therefore, the development of selective cell- permeable inhibitors may represent an important advance for therapeutic intervention in, for instance liver cancer.

Methods: With the intention to find inhibitors of casein kinase-2 with high potency in association with high selectivity, we were virtually docking^[1]

various polyphenoles into their already published X-ray crystallographic structures^[2] and analyzed their binding affinities and possible reasons of them. Secondly, we collected in-vitro data of selected hit-compounds, measured by an in-vitro kinase phosphorylation assay. Further on, we tested some of the compounds on primary hepatocytes in comparison to the hepatoma cell line HepG2 with a cytotoxic assay.

Results: The virtual screening of several flavonoids and chemical modified anthranoid structures^[3] showed, in the majority of cases, a selective inhibition of casein kinase-2 in the upper nano molar range. Some of the tested compounds had interesting biological properties. Acetylated compounds, for example, seemed to act as prodrugs and ethylester variants showed a higher cytotoxic potential to HepG2 tumor cells than to normal hepatocytes.

Conclusion: The elucidation of molecular details of protein-inhibitor interactions discloses further possibilities for compound modifications and target-orientated signalling pathway interference. Thereby, undesirable side- effects can be minimized and new therapeutically possibilities may arise.

Inhaltsverzeichnis

Danksagung II

Abstract III

Inhaltsverzeichnis V

Abkürzungsverzeichnis X

1. Einleitung und Zielsetzung 1

1.1. Physiologie und Pathophysiologie der Leber 1 1.1.1. Bau und Funktion der Leber als zentrales

Stoffwechselorgan 1

1.1.2. Epidemiologie und Entstehung des Hepatozellulären

Karzinoms 3

1.1.3. Ätiologie akuter und chronischer Leberschädigungen 3

1.2. Zelluläre Signalwege 6

1.2.1. Der Wnt/β-catenin Signaltransduktionsweg 6

1.2.2. Zellzykluskontrolle 7

1.3. Proteinkinasen 8

1.3.1. Die Funktion der Caseinkinase-1 im

Wnt/β-catenin Signaltransduktionsweg 10 1.3.2. Die Funktion der Caseinkinase-2 im

Wnt/β-catenin Signaltransduktionsweg 11 1.3.3. Die Funktion der Glykogensynthasekinase-3β im

Wnt/β-catenin Signaltransduktionsweg 13 1.3.4. Aktivierte Cyclinabhängige Kinase-2

(im Komplex mit CyclinA) 14

1.3.5. Zusammenfassung 15 1.4. Niedermolekulare Verbindungen als potentielle

Proteinkinaseinhibitoren 15

1.4.1. Anthranoide als potentielle Therapeutika 16 1.4.2. Flavonoide als potentielle Präventiva 19

1.5. Zielsetzung 20

2. Materialien 22

2.1. Enzyme, Inhibitoren, Substrate 22

2.2. Synthetisierte Anthranoide 23

2.2.1. Einfache Substituierungen am Anthrachinon-

Grundgerüst 23

2.2.2. 2,4,6,8-Tetranitroanthranoide 24 2.2.3. Vom Emodin abgeleitete C4-aminosubstituierte

Anthranoide 25

2.2.4. Vom Emodin abgeleitete C3/C4-ringsubstituierte

Anthranoide 26

2.3. Natürliche Flavonoide 27

2.4. Chemikalien 28

2.5. Puffer, Lösungen 29

2.6. Technische Geräte und Arbeitsmaterialien 30

3. Methoden 31

3.1. Virtuelles Screening mit molekularen

Modellierungsstudien 31

3.1.1. Molekulare Modellierung der Proteinstrukturen 31

3.1.2. Molekulare Modellierung der Inhibitoren 32 3.1.3. Automatische Protein-Ligand-Docking-Studien 32 3.2. Inhibitionsstudien mittels Phosphorylierungsassay 33 3.2.1. Protokoll des radiochemischen

Phosphorylierungsassays der CK-1 34 3.2.2. Protokoll des radiochemischen

Phosphorylierungsassays der CK-2 35 3.2.3. Protokoll des radiochemischen

Phosphorylierungsassays der GSK-3β 35 3.2.4. Die Auswertung des In-vitro-Kinase-Assays 35 3.3. Zytotoxizitätsbestimmungen mittels MTT-Assay 36

4. Ergebnisüberblick 38

4.1. Überblick über die virtuell berechneten

Docking-KD-Werte 38

4.2. Überblick über die gemessenen halbmaximalen

inhibitorischen Konzentrationen 39 4.3. Überblick über die gemessenen halbmaximalen

zytotoxischen Dosen 40

5. Ergebnisdiskussion 41

5.1. Strukturelle Einblicke 41

5.1.1. Vergleich der hoch konservierten ATP-Bindungs-

taschen 42

5.1.2. Synthetisierte Anthranoide 46

5.1.2.1. Einfache Substituierungen am Anthrachinon- 46 grundgerüst

5.1.2.2. 2,4,6,8-Tetranitroanthranoide 50 5.1.2.3. Vom Emodin abgeleitete C4-aminosubstituierte

Anthranoide 51

5.1.2.4. Vom Emodin abgeleitete C3/C4-ringsubstituierte

Anthranoide 54

5.1.3. Natürliche Flavonoide 57

5.1.3.1. Flavone 58

5.1.3.2. Flavanone 66

5.1.3.3. Flavanonole 67

5.1.3.4. Flavonole 68

5.1.3.5. Zusammenfassung 70

6. Zusammenfassung 71

6.1. Strukturelle Einblicke 71

6.1.1. Die Hemmung der Caseinkinase-1 72 6.1.2. Die Hemmung der Caseinkinase-2 74 6.1.3. Die Hemmung der Glykogensynthasekinase-3β 77 6.1.4. Die Hemmung der CyclinA-aktivierten cyclinabhängigen

Kinase-2 78

6.2. Zusammenfassung 79

7. Ausblick 80

Literaturverzeichnis XII

Selbständigkeitserklärung XXI

Abkürzungsverzeichnis

APC adenomatöse polyposis coli

AS Aminosäure

ATP Adenosintriphosphat

BSA Bovine Serum Albumin

CD50 halbmaximale zytotoxische Konzentration

CK-1 Caseinkinase-1

CK-2 Caseinkinase-2

cpm counts per minute

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

Dsh Dishevelled Protein

DTT Dithiothreitol

EDTA Ethylendiamintetraacetat

Fzd Frizzled Protein

GSK-3β Glycogensynthasekinase-3β

°C Grad Celsius

HBV Hepatitis-B-Virus

HCC hepatozelluläres Karzinom

HCl Salzsäure

HCV Hepatitis-C-Virus

HepG2 humane Hepatomzelllinie

H3PO4 Phosphorsäure

IC50 halbmaximale inhibitorische Konzentration

KCl Kaliumchlorid

M Molarität

MBq Megabequerel

mM Milimolar

MgCl2 x 6H2O Magnesiumchlorid Hexahydrat

Min Minute

MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl- tetrazoliumbromid

MW Molekulargewicht

NaCl Natriumchlorid

NaF Natriumfluorid

Na3VO4 Natriumorthovanadat

PC Phosphocellulosemembran

PK Proteinkinase

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

Ser Serin

SP Substratpeptid

TCF T-cell factor

TFA Trifluoressigsäure

Thr Threonin

Tris 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol

Tyr Tyrosin

U Unit

Wnt Wingless Int

µCi Mikrocurie

µl Mikroliter

µM Mikromolar

Außerdem wurden allgemein gebräuchliche Abkürzungen verwendet.

Einleitung und Zielsetzung

1.1. Physiologie und Pathophysiologie der Leber

1.1.1. Bau und Funktion der Leber als zentrales Stoffwechselorgan

Als größte Drüse des menschlichen Organismus (1500-2000g schwer) spielt die Leber eine herausragende Rolle bei der Synthese, Speicherung, Metabolisierung, Giftung, Entgiftung und bei der Ausscheidung körpereigener und körperfremder Substanzen. Sie nimmt bei Erwachsenen 2-3% des Körpergewichts ein und wird von 25-30% des Herzzeitvolumens mit Blut durchströmt.

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[1-1] Übersicht über Bau und Funktion der Leber (Abbildung links aus: http://hepatitis- c.de/leber2.htm)

Die Leber (Hepar) unterteilt sich in den linken (Lobus sinister) und den rechten (Lobus dexter) Leberlappen, getrennt durch ein Band (Ligamentum falciforme). Dabei werden der quadratische (Lobus quadratus) und der geschwänzte (Lobus caudatus) Leberlappen, dem linken Leberlappen zugeordnet.

Zwischen dem L. quadratus und dem L. caudatus befindet sich die Ein- und Austrittsstelle (Porta hepatis) der Blut- (A. hepatica, V. portae), Lymph- und Gallengefäße (Ductus hepaticus communis)^[4].

Zentrale Aufgaben übernimmt die Leber im Intermediärstoffwechsel Übersicht [1-1] rechts. So ist sie zum Beispiel im Kohlenhydratstoffwechsel für die Konstanthaltung des Blutzuckers, der Glykogensynthese, Glykogenolyse, Gluconeogenese, Glykolyse und der Verwertung von Fructose und Galactose verantwortlich. Weiterhin übernimmt sie im Proteinstoffwechsel die Synthese von Blutplasmaeiweißen, wie zum Beispiel Serumalbumin, welches den Wasseraustausch zwischen Blut und Gewebe reguliert und die Synthese wichtiger Blutgerinnungsfaktoren, wie II, VII, IX, X.

Nicht nur bei der Synthese, auch bei Um- und Abbauprozessen von Aminosäuren und auch Proteinen besitzt sie eine lebenswichtige Funktion, wie zum Beispiel bei der Ammoniakentgiftung über die Harnstoffsynthese. Im Fettstoffwechsel ist sie maßgeblich an der Synthese von Gallensäuren, Triglyceriden, Lipoproteinen, der Neubildung von Fettsäuren aus Glucose, dem Fettabbau und dem Fettsäureabbau beteiligt und übernimmt im Porphyrinstoffwechsel die Synthese von Globin, der Eiweißkomponente des sauerstofftragenden Pigments Hämoglobin und die Glucuronidierung von Bilirubin^[5,6,9].

Entscheidenden Einfluss hat die Leber auch auf die orale Bioverfügbarkeit von Medikamenten. So ist das Ausmaß eines Pharmakons aktiv den systemischen Kreislauf zu erreichen, abhängig von dem Vorhandensein eines First-Pass-Effektes. Viele Arzneistoffe/ Fremdstoffe unterliegen dieser ersten Leberpassage, bei der sie in den meisten Fällen metabolisch abgebaut werden und somit einen Teil ihrer Wirksamkeit verlieren. In einigen Fällen kann es aber bei solch einer Biotransformation auch zu aktiveren, entweder therapeutisch wirksameren oder auf der anderen Seite auch toxikologisch bedenklicheren Folgeprodukten und damit einer Giftung führen.

Beispiele hierfür sind die metabolische Aktivierung von Nitrosoverbindungen zu kanzerogenen Diazonium- oder Carbeniumintermediaten oder aromatische Amino- und Nitroverbindungen zu Phenylhydroxylaminen oder Nitrosobenzolen, welche als Methämoglobinbildner eine entscheidende Bedeutung besitzen^[7].

1.1.2. Epidemiologie und Entstehung des Hepatozellulären Karzinoms

Maligne Hepatome stellen weltweit eine der am häufigsten vorkommenden Krebsarten dar. Dabei zeigt sich das hepatozelluläre Karzinom als hochmaligner Tumor, welcher sich durch eine hohe Progredienz mit stark limitierten therapeutischen Möglichkeiten auszeichnet. In der Verbreitung der Neuerkrankungen zeigt sich ein deutliches geographisches Gefälle. So steigt die Neuerkrankungsrate von Europa/ Nordamerika von max. 3 Fällen auf 100.000 Einwohner pro Jahr auf ca. 100 Fälle in Afrika und Südostasien an.

Assoziationen zu viralen Hepatitiden (HBV, HCV) spielen hier eine marginale Rolle für den Inzidenzshift. Auch verantwortlich für die Zunahme der Erkrankungen in den südlichen Regionen, spielen Lebensmittel- verunreinigungen mit AflatoxinB1. In Europa und Nordamerika spielen vor allem die Risikofaktoren chronischer Leberschädigungen eine große Rolle, wie zum Beispiel Alkoholmissbrauch, alpha-1-Antitrypsinmangel, aber auch Krankheiten wie Hämochromatose und Morbus Wilson.

1.1.3. Ätiologie akuter und chronischer Leberschädigungen

Akut toxische Leberzellschädigungen führen in den meisten Fällen zur direkten Zellapoptose, Zellnekrose oder auch zu einer vermehrten Fettspeicherung. Bekannte Verbindungen,

welche einen akuten Leberschaden auslösen können, sind zum Beispiel Tetrachlormethan, Paracetamol, α-Amanitin, Isoniazid, Halothan, α- Methyldopa, Methotrexat, Ethanol, I-Asparaginase, Valproat, Tetracycline, weißer Phosphor, Chlorpromazin, Sulfonamide, anabole Steroide, Quecksilberdämpfe und viele weitere Verbindungen aus Industrie und Pharmazie, welche über eine Lipidperoxidation, die Bindung an zelluläre Makromoleküle oder durch den Eingriff und die Hemmung der Proteinbiosynthese wirken können.

Chronisch virale Hepatitis wird vorwiegend ausgelöst durch Infektionen mit dem Hepatitis B und C Virus, welches die Inzidenzraten für das Hepatozelluläre Karzinom in bestimmten Gegenden der Welt stark erhöht.

Autoimmune Erkrankungen, wie zum Beispiel die Autoimmunhepatitis, die primär biliäre Zirrhose, die primär sklerosierende Cholangitis und das Overlap-Syndrom führen langfristig gesehen zu einer Schädigung bestimmter Bereiche der Leber.

Biliäre und cholestatische Erkrankungen, ausgelöst durch Störungen des Gallesystems entstehen sekundär durch biliäre Zirrhose bei Gallensteinen, Infekten und Strikturen, als auch bei der Gallenwegsatresie, dem Alagille- Syndrom und als Folge einer Mukoviszidose in diesem Bereich. Es können aber auch akute cholestatische Schädigungen hervorgerufen werden, vor allem durch unphysiologische Androgene und Gestagene oder auch unphysiologische Konzentrationen von Östrogenen (Beispiele: früher höher dosierte Antikontrazeptiva, Schwangerschaftsgelbsucht oder Anabolika).

Metabolisch-hereditäre Ursachen gehen auf bestimmte Stoffwechsel- erkrankungen, wie der Hämochromatose, dem Morbus Wilson, einem Mangel an α-Antitrypsin, erythropoetische Protoporphyrie,

Glykogenose Typ IV, Galaktosämie, Tyrosinämie oder auf eine nichtalko- holische Fettleberhepatitis zurück.

Vaskuläre Leberschäden kommen bei Erkrankungen, wie der chronischen Rechtsherzinsuffizienz, der Pericarditis constrictiva, dem Budd-Chiari- Syndrom oder der Veno-occlusive-disease Erkrankung, vor. Ferner kann portaler Hochdruck auch durch das Monomer des PVC-Kunststoffes verursacht oder durch überhöhte dauerhafte Gaben des A-Vitamins ausgelöst, werden. Weiterhin zu den vaskulären Leberschäden zählt man die Peliosis hepatitis (Untergang des Sinusoidgitterfasernetzes durch zum Beispiel Vinylchlorid) oder die Endophlebitis obliterans (metabolische Aktivierung von Pyrrolizidinalkaloiden zu Alkylanzien).

Lebertumore unterscheiden sich in von Hepatozyten abstammenden Leberadenome und primäre hepatozelluläre Karzinome, von den Gefäßen abstammenden Hämangiosarkome (Beispiel: Vinylchlorid) und vom Gallengang abstammenden Cholangiokarzinome. Das hepatozelluläre Kar- zinom findet seine Ursache in verunreinigten Nahrungsmitteln mit Aflatoxin B1 (z.B. Pistazien) und bei industriellen und privat-chemischen Unfällen mit Arsenverbindungen (z.B. die Verwendung arsenhaltiger Pflanzenschutz- mittel von Winzern) oder mit polychlorierten Biphenylen und polychlorierten Benzofuranen (Yousho-Affaire 1968).

Chronisch-toxische Leberschäden können im unsachgemäßen Gebrauch von Alkohol und Alkoholderivaten, beim Medikamentenmissbrauch oder dem falschen Umgang mit Chemikalien begründet liegen^[8,9].

Im ungünstigsten Fall, kommt es über die Leberschädigung zur Fibrose, Zirrhose und als Folge der gestörten Signalabläufe in den Leberzellen zum erhöhten Risiko für die Ausbildung eines hepatozellulären Karzinoms.

1.2. Zelluläre Signalwege

1.2.1. Der Wnt/ β-catenin Signaltransduktionsweg

Signaltransduktionswege und Signalübertragungskaskaden spielen eine große Rolle bei der Übertragung von Signalen und deren Umsetzung in Informationen in der Zelle. Der Name Wnt setzt sich zusammen aus W für Wingless und steht für die flügellosen Varianten von Drosphilia melanogaster, welche eine Mutation im wingless-Gen zur Ursache hatten und dem Int-Gen (heute Wnt-1), welches Brustkrebs in Mäusen fördern kann.

Einleitung und Zielsetzung 7

[1-2] Schematisierte Darstellung der Signalübetragung im Wnt-Signalweg (PKCK1 = CK-1;

PKCK2 = CK-2; CDK2 = CDK2/cyclinA)

Dabei stellen die Wnt-Proteine sezernierende Glykoproteine dar, welche als ankommende Signale auf der Zelloberfläche an den Frizzled-Rezeptor (Fz) und seiner membranständigen Domäne binden.

Durch diesen Prozess wird das Protein Dishevelled (Dsh) phosphoryliert und damit aktiviert. Moduliert wird dieser Prozess zusätzlich durch die Proteinkinasen Caseinkinase- 1 und -2 (CK-1 und CK-2). Es kommt zur Ausbildung eines Multi-Enzym-Komplexes mit der Glykogensynthasekinase- 3β (GSK3-β), welches zur Stabilisierung des zytoplasmatischen β-catenins führt. Dieser Schutz vor dem proteasomalen Abbau durch Ubiquitinylierung führt zu einer Akkumulation des β-catenins im Zytoplasma und schließlich zur Anreicherung im Zellkern. Hier interagiert es mit den Proteinen der TCF- Familie, was zur Transkriptionsaktivierung und letztendlich zur Ziel- genexpression führt.

Durch Mutationen und Veränderungen, wie zum Beispiel einer Mutation im APC-Gen^[10] oder im β-catenin-Gen, kann die Menge an freiem β-catenin nicht mehr ausreichend reguliert werden, es kommt auch ohne Wnt-Signal zur Signalübertragung oder zum ungenügenden Abbau über das Proteasom und damit zu einer ständigen Aktivierung der Transkription. Folge ist eine unkontrollierte Zellteilung und damit eine mögliche Ursache für die Tumorentstehung^[11].

Der Wnt/β-catenin-Signalweg spielt eine große Rolle in der Embryogenese und bei bestimmten Krebsarten und stellt das komplexe Zusammenspiel verschiedener Proteinkomponenten dar, deren endgültige Aufklärung, ihre gezielte Hemmung oder Aktivierung einen wichtigen Schritt im Hinblick auf gezielt wirkende Tumortherapeutika oder dem Verständnis toxischer oder kanzerogener Prozesse aufzeigt.

1.2.2. Zellzykluskontrolle

Definitionsgemäß lässt sich die Zellzykluskontrolle nach Van den Heuvel et.al^[12] als die Kontrolle makromolekularer Vorgänge durch eine begrenzte Anzahl „heterodimerer Proteinkinasen“ beschreiben.

Dabei setzen sich diese Kinasen aus zwei Untereinheiten, den Cyclinen und der dazugehörigen und damit cyclin-abhängigen Kinase zusammen. Hinter der Zellzykluskontrolle stehen in der Regel drei einfache Prinzipien. Als erstes der Start des Zellzyklus durch ein Signal mit Hilfe des aktivierten cyclin-cdk-Komplexes, zweitens die Ausdifferenzierung des Kontroll- mechanismus durch abschnittsspezifische Cycline kurzer Lebensdauer und drittens die Aktivierung weiterer Proteinstrukturen. Dabei stellen cyclinabhängige Kinasen hoch konservierte Proteine dar, welche wiederum Proteine phosphorylieren und selber durch Cycline dephosphoryliert und damit aktiviert werden, und andererseits durch Phosphorylierung über CDK- Inhibitoren deaktiviert werden. Am Beginn des Zellzyklus spielen zunächst die CDK4 und 6 im Komplex mit dem cyclinE eine große Rolle, welche zum Ende der G1-Phase in die CDK2/cyclinE-Kontrolle übergeht. Die Synthesephase als wichtigste Phase des Zellzyklus wird geprägt durch die CDK2/cyclinA, welche damit auch Gegenstand unserer Arbeiten war.

Abschließend in die G2-Phase übergehend kommt die CDK1 im Komplex mit cyclin A und B vor^[13].

1.3. Proteinkinasen

Proteinkinasen regulieren als Phosphoryltransferasen den Phosphat- gruppentransfer von einem energiereichen Donor (meist γ-Phosphatgruppe des ATP) auf einen Akzeptor (meist Hydroxylgruppe einer Aminosäure, wie Serin, Threonin, Tyrosin).

Phosphorylierungen und Dephosphorylierungen von Proteinen sind ein wichtiges Regulations- und Signalübertragungsprinzip vieler Zellen. So stellt die Proteinphosphorylierung eines der wichtigsten posttranslationalen Regulationsmechnismen der Signalübertragung dar.

Zelluläre Ereignisse bei denen die reversible Phosphorylierung eine Rolle spielt, sind der Membrantransport^[14], die Regulation der Membranpermeabilität^[15], der Ionenfluss durch Kanäle^[16], die Kontraktilität^[17], die Beeinflussung des Metabolismus^[18], und besonders wichtig bei der Krebsentstehung, die Transkription und Translation von Genen ^[19].

[1-3] Übersicht über die Struktur und Funktionen der in dieser Arbeit untersuchten Protein- kinasen

Eine Proteinphosphorylierung bewirkt meist eine strukturelle Veränderung des Substratproteins und damit eine Änderung seiner funktionellen Aktivität.

Dadurch stellen die Proteinkinasen eine bedeutende Klasse zellulärer Regulatorproteine dar.

Die Proteinkinasen sind in ihrer Struktur, Verbreitung, Regulation und Substratspezifität heterogen, ähneln sich aber in ihrer katalytischen Domäne und Nukleotid-Bindungsstelle. So können sie ähnliche Aufgaben, wie zum Beispiel die Regulation der Signalübertragung, im Organismus wahrnehmen.

1.3.1. Die Funktion der Caseinkinase-1 im Wnt/β-catenin Signaltrans- duktionsweg

Die Caseinkinase-1 ist eine ubiquitär vorkommende, hoch konservierte monomere Serin/ Threoninproteinkinase. Sie ist in fast allen eukaryontischen Zellen zu finden und als multifunktionelle Proteinkinase an einer Vielzahl zellulärer Funktionen und Prozesse beteiligt^[20]. So spielt sie zum Beispiel eine Rolle bei der DNA-Reparatur^[21], bei der Zellzykluskontrolle und beim Vesikeltransport^[22].

Bei Wirbeltieren existieren 7 Untergruppen der CK-1 (Isoformen: α, β, γ1, γ2, γ3, δ, ε), welche im Zellkern, im Zytoplasma, in der Plasmamembran und in den Mikrosomen zu finden sind. Die CK-1 Isoformen besitzen unterschiedliche Funktionen, so ist die CK-1ε in die Regulation des circadianen Rhythmus, die CK-1α in die Aktivierung der T-Zellen und die CK- 1δ in die Entstehung neurodegenerativer Erkrankungen involviert^[20]. Alle CK- 1 Isoformen besitzen eine ca. 300 Aminosäurenreste lange, N-terminale katalytische Domäne^[23] und eine variable C-terminale Domäne, welche an der subzellulären Zielsteuerung^[24] und der Aktivitätsregulierung beteiligt sind^[6]. Im Wnt-Signaltransduktionsweg bindet das Wnt-Signal am Frizzled- Rezeptor und aktiviert so das Dsh-Protein, dieses kann aber auch durch die CK-1 phosphoryliert und damit aktiviert werden. So ist die CK-1 in die initiale Phosphorylierung des β-catenins als Protoonkogen eingebunden^[20].

Die Caseinkinase-1 zeigt ihre vielfältigen Funktionen vor allem im Membrantransport^[25], Mikrotubulibewegungen^[26,27], mRNA-Bindungen^[28], circadianem Rhythmus^[29], Transkription, Genexpression^[30], Apoptose^[31] und auch den Signaltransduktionsprozessen^[32,33]. Fehlregulationen der CK1 sind hauptsächlich bei neurodegenerativen Prozessen^[34,35] und einen breiten Spektrum von Krebserkrankungen^[36] zu finden.

1.3.2. Die Funktion der Caseinkinase-2 im Wnt/β-catenin Signaltrans- duktionsweg

Die Proteinkinase CK-2 repräsentiert eine pleiotrope, ubiquitär vorkom- mende, konstitutiv aktive und hoch konservierte Serin/ Threoninkinase, welche in vielen Organismen, Geweben und nahezu jedem subzellulärem Kompartiment^[37] exprimiert wird.

α β β α

Positive und negative Regulation Substratspezifität

Stabilität

Seitenspezifität Katalytische Aktivität

Hemmung durch Polyanionen

[1-4] Das heterotetramere Holoenzym der Caseinkinase-2

Das heterotetramere Holoenzym besteht aus zwei katalytischen Unter- einheiten (α oder α’), verantwortlich für die Katalyse und Autophospho- rylierung, und aus zwei regulatorischen Untereinheiten (β und β’) mit der Fähigkeit, die katalytische Aktivität und das Ansprechen auf die Substratrekognition^[38] zu beeinflussen.

Heutzutage sind mehr als 300 Substrate für die Proteinkinase CK-2 identifiziert^[39,40,41], zum Beispiel Wnt-Signalwegskomponenten und Wnt- Faktoren, wie APC (Tumorsuppressor Adenomes Polyposis Coli Protein)^[42,43], β-catenin^[43,44] und das dishevelled-Protein und weiterhin das calciumabhängige Zelladhäsionsprotein E-cadherin, das metabolisierende Enzym Glykogensynthase und das Tumorsuppressorphosphoprotein p53^[45,46,47] ein wichtiger transkriptioneller Regulator.

Die außerordentliche Vielfalt an möglichen Substraten für die CK-2 verdeutlich die außergewöhnliche Rolle in vielen inter- und intrazellulären Prozessen, mit speziellen Referenzen zu Signaltransduktionsprozessen, DNA-, RNA- und Proteinsynthetisierungen^[48], Genexpressionen und Zell- Zellinteraktionen^[49]. Dieses verdeutlicht einmal mehr die wichtige Rolle dieser Proteinkinase in nahezu allen Bereichen biologischer Prozesse, wie Wachstum, Proliferation, Differenzierung^[50], Metabolismus, Apoptosis^[51] und Zellüberlebensstrategien^[52] als Antwort auf verschiedene externe und interne Stimuli. Quantitativ hoch reguliert liegt die CK-2 in Tumorzellen^[53] und proliferierenden Geweben vor. Dabei kann die Hochregulierung der CK2 unabhängig von einer Stimulation oder dem Einfluss spezieller Kofaktoren^[54]

sein. Gezeigt wurde dies zum Beispiel an fetalen und adulten Rattenhepatozyten^[55]. Dabei scheint es aber keinen direkten Zusammenhang zwischen den CK-2 Spiegeln und der Proliferationsrate bestimmter Zellen zu geben. Weiterhin besitzt die CK-2 einen antiapoptotischen Effekt durch protektive Eigenschaften auf Caspase inhibierende Proteine^[56], führt zudem zu Zellzyklussignalen durch persistierende nukleäre Akkumulation dieser in der G1-Phase^[57], der Phosphorylierung des S- und G2-Phase regulierenden Proteins Geminin^[58]

und der Progression von der S-Phase in die S-Phase und durch die S-Phase, reguliert über die Proteinkinase CDK2/cyclinA. Diese mannigfaltigen Eigenschaften verdeutlichen die ausgesprochen wichtige Rolle dieser Proteinkinase.

1.3.3. Die Funktion der Glykogensynthasekinase-3β im Wnt/β-catenin Signaltransduktionsweg

Die Proteinkinase GSK-3β (Isoformen: GSK-3α, GSK-3β und GSK-3β2) ist ebenfalls ein wichtiger Mitspieler in verschiedenen Signaltransduktionswegen und wird durch die verschiedenen Phosphorylierungen des Tyrosins (Tyr279 bei Isoform alpha und Tyr216 bei Isoform beta) charakterisiert, welche durch sich selber katalysiert sind^[59]. Die Fähigkeit zur Autophosphorylierung verstärkt die Möglichkeit zur eigenen Proteinstabilisierung, weil dadurch der phosphorylierte N-Terminus in einer kompetitiven Art und Weise an sich selber binden kann^[60].

[1-5] Schematisierte Darstellung der Autophosphorylierungsfähigkeit der GSK-3β (Bild aus:

http://www.the-elso-gazette.org/magazines/issue9/mreview1.html)

Die GSK-3β wurde zuerst im Hinblick auf ihre Regulation (Inaktivierung durch Phosphorylierung) der Glykogensynthase und ihre Insulin induzierte Kontrolle hin untersucht.

Eine potentielle Rolle spielt sie auch in der Regulation der Zelladhäsion durch β-cateninphosphorylierung der cadherinbasierten Adhäsionsjunctions, Phosphorylierung von Cyclin D1 (verantwortlich für die Aktivität der CDK4 und CDK6) im Zellteilungszyklus, Phosphorylierung der Transkriptions- faktoren c-Jun, c-Myc, NFATc, HSF-1, CREB und MITF^[61] sowieso anderer zellulärer und physiologischer Ereignisse, inklusive Wnt-Signali- sierungen^[62,63,64], Hedgehog- und Insulintransduktionswege^[64,65], direkte Interaktionen mit p53 nach DNA-Schädigungen^[66] und Induzierung der caspaseabhängigen Tauaggregation in Alzheimererkrankungen^[67,68].

1.3.4. Aktivierte Cyclinabhängige Kinase 2 (im Komplex mit CyclinA)

Die Serin/ Threoninkinase, CDK2/cyclinA, ist ein Mitglied der vorwiegend heterodimer vorliegenden Zellzyklus regulierenden cyclinabhängigen Kinasefamilie, bestehend aus der katalytischen CDK-Untereinheit und seinem aktivierenden Cyclin. Sie ist verantwortlich für die Progression des Zellzyklusses von der G1-Phase in die und durch die S-Phase.

Sie besitzt strukturelle Ähnlichkeiten zu der aktiven Form der GSK3-β und zeigt Übereinstimmungen in der Aminosäuresequenz zur CK-1 und CK-2.

Fehlfunktionen in der Kontrolle der Zellzykluscheckpointproteine führen direkt zur Pathophysiologie des Krebses. Letztendlich wird sogar noch ein interagierendes Potential der CDK2 zum ß-catenin und Axin im Wnt- Signaltransduktionsweges^[69] diskutiert, dass auch eine potentielle Rolle beim Leberkrebs spielen könnte.

1.3.5. Zusammenfassung

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die Proteinkinase CK-2 über die Phosphorylierung anderer Kinasen eine entscheidende Rolle im Wnt- Signalweg spielt. Weiterhin hat diese Kinase einen entscheidenden Einfluss auf das wichtige Tumorsuppressorgen p53 und eine Fähigkeit zur Inaktivierung wichtiger cyclinabhängiger Kinasen, welche zum Zellzyklus- arrest führen kann. Die Progression von entartenden Zellen ist abhängig von der Zellzykluskontrolle dieser Zellen, daher ist die Entwicklung zellgängiger interagierender Moleküle ein wichtiges Ziel.

1.4. Niedermolekulare Verbindungen als potentielle Proteinkinase- inhibitoren

Entsprechend der Vielfalt möglicher Ursachen unkontrollierten Zellwachstums gibt es auch eine Vielzahl an Möglichkeiten, nicht nur von außen regulierend einzugreifen. So werden sie zum Beispiel über Kofaktoren oder sekundäre Botenstoffe, Aktivatorproteine, Inhibitorproteine, Pseudosubstrate (Autoinhibition oder Ligandenbindung an regulatorische Untereinheiten) oder der Phosphorylierung im aktiven Zentrum durch andere Proteinkinasen oder sich selbst (Autophsophorylierung) reguliert.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Hemmung des entsprechenden Enzyms durch niedermolekulare Verbindungen untersucht. Es handelt sich hierbei um die in-silico Suche nach größtenteils ATP-kompetitiven Naturstoffen und ihren Abwandlungen, welche durch gezielte Modifikationen möglichst selektiv das entsprechende Enzym hemmen.

Aufgrund der hohen Ähnlichkeit der ATP-Bindungstelle vieler Kinasen muss die Bindungsaffinität noch durch unterschiedliche Bindungsmöglichkeiten in der Umgebung der ATP-Tasche erhöht werden^[70]. So können Inhibitoren sehr selektiv mit bestimmten Teilstrukturen der Bindungsstelle in Wechsel- wirkung treten. Zur Untersuchung von Struktur-Wirkungs-Beziehungen spielen Eigenschaften, wie die Fähigkeit Wasserstoffbrückenbindungen aufzubauen, hydrophobe Wechselwirkungen, aber auch Elektronen- verschiebungen im Molekül, eine entscheidende Rolle für die Fähigkeit eines Inhibitors ATP aus seiner Bindungsstelle zu verdrängen. In der vorliegenden Arbeit untersuchten wir polyhydroxylierte aromatische Verbindungen, wie natürliche und chemisch synthetisierte Derivate mit einem anthrachinonen Grundgerüst^[3] und der natürlich vorkommenden Aglykone bekannter Flavonoide.

1.4.1. Anthranoide als potentielle Therapeutika

Die traditionelle orientalische und chinesische Medizin hat sich schon in anderen Bereichen als reichhaltige Quelle für neue, pharmazeutisch wirksame Substanzen erwiesen. Hydroxyanthracen-Derivate, bekannt auch als Emodine oder Anthrachinone sind phenolische Verbindungen mit meist laxierenden Eigenschaften.

Pflanzliche Vertreter aus dem Deutschen und Europäischen Arzneibuch (DAB/EAB) sind der Chinesische Rhabarber (Rheum officinale, Rheum palmatum), die Aloe (Aloe barbadensis, Aloe ferox), der Sennes (Cassia senna, Cassia angustifolia) und der Faulbaum (Rhamnus frangula, Rhamnus purshianus). Grundlage bildeten die Grundstrukturen Emodin, Physcion und Rhein, welche vor allem im Rhabarber und in der Aloe vorkommen.

[1-6] Charakterisierung der traditionell und offizinell verwendeten Rhabarberpflanze (Bild links aus Koehler’s Medicinal Plants 1887)

Hauptinhaltsstoffe dieser Pflanzenart sind vorwiegend Anthrachinone mit der Basisstruktur des Emodins (1,3,8-Trihydroxy-6-methylanthrachinon), traditionell verwendet als antiaggregierende, antimutagene, antiseptische, antiulcerative, antivirale, zytotoxische, gonatropine, immunsuppressive, pestizide, spasmolytische, vasorelaxierende und virizide Naturheilmedizin. In den letzten Jahren wurde das therapeutische Potential der chemischen Leitstruktur Emodin intensiv untersucht und die ersten chemisch abgewandelten Verbindungen anthranoider Grundstruktur als Arzneimittel zur Chemotherapie verschiedener Tumore, wie zum Beispiel die Verbindungen Daunorubicin und Mitoxanthron zugelassen. Sie stellen so, im Gegensatz zur traditionellen Verwendung in der Chinesischen Medizin, moderne Zytostatika dar. Im Screening neuer Hemmstoffe für die ATP- Bindungsstelle erschließen sich so neue pharmazeutische Anwendungsgebiete^[71].

[1-7] Anthrachinone zwischen traditionell chinesischer Medizin und allopathischer Tumor- therapie (Bild links aus: http://caliban.mpiz-koeln.mpg.de/~stueber/mavica/high/1000 /00934.html)

Die Hauptwirkungen des Hauptinhaltsstoffes Emodin wurden in der Literatur schon vielfach beschrieben, wie zum Beispiel die Induktion von Apoptose, beschrieben an humanen Lungenadenokarzinomazellen^[72], die Hemmung der Tumorzellmigration durch Suppression des Phosphatidylinositol-3- Kinase- Signaltransduktionsweges^[73] und für Aloeemodin (1,8-Dihydroxy-3- hydroxy-methylanthrachinon), einem Derivat des Emodins, eine Inhibition der N-Acetyltransferaseaktivität und -expression in humanen malignen Melanom- zellen^[74]. Zusätzlich zur antibakteriellen Aktivität^[75] induziert Emodin auch DNA-Strangbrüche durch die Generation reaktiver Sauerstoffspezies, beschrieben an humanen Lungenkarzinomzellen^[76], es hat weiterhin Effekte auf die mitochondriale ATP-Bildungskapazität^[77], bindet an Serumalbumine^[78] und besitzt letztendlich die hervorragende Fähigkeit Krebszellen für die Chemotherapie über die Inhibition von Transkriptionsfaktoren zu sensibilisieren^[79].

Weitere Eigenschaften sind die Induzierung der Angiogenese durch Inhibition von VEGF-A^[80,81], eine Neuroprotektion nach Schädigungen mit Effekten auf die synaptische Transmission^[82] und das Wiederauflösen von Alzheimergepaarten helikalen Filamenten durch abortive Tauaggregation^[83].

1.4.2. Flavonoide als potentielle Präventiva

Flavonoide sind die meist verwendeten medizinischen Polyphenole mit äußerst interessanten Fähigkeiten vor allem in präventiven Maßnahmen bei kardiovaskulären, neurodegenerativen und verschiedenen chronischen Entzündungserkrankungen. Flavonoide werden in nahezu allen Pflanzen synthetisiert und akkumulieren als Glykoside natürlichen Ursprungs.

Wir untersuchten die Aglykone, welche sich in verschiedene Unterklassen einteilen. Diverse Pflanzenpolyphenole sind bekannt wegen ihrer hervorragenden antioxidativen Aktivität durch Chelatisierung katalysierender Metallionen, welche wiederum freie Radikale generieren. Die Fähigkeit zur Tumorprävention basiert auf Modulierungen der verschiedenen Signalwege der Zelle, Schutz bei den normalen Abläufen der Zellzyklusregulation, Abschwächung von Entzündungsreaktionen, Hemmung proliferativer Prozesse und der Induzierung von Apoptosis in bereits degenerierten Zellen.

Hintergrund unserer Untersuchungen zu den inhibitorischen Effekten von den ubiquitär pflanzlich vorkommenden Polyphenolen im Gegensatz zu den gezielt chemisch modifizierten, aber auch von pflanzlichen Polyphenolen abgeleiteten Anthranoiden, war die hohe strukturelle Ähnlichkeit des chemischen Grundgerüstes und der Hydroxylgruppen in einer ähnlichen Distanz zueinander.

[1-8] Strukturvergleich zwischen Anthranoiden (links: Emodinsäure) und Flavonoiden (rechts:

Myricetin)

O

OH OH

O O

H

OH

O O

O

OH OH OH OH

OH O

H

Chemisch-modifizierte Anthranoide als potentielle

Therapeutika: Präventiva

Ubiquitär-vorkommende Flavonoide als potentielle

:

In dieser Hinsicht könnten Pflanzenpolyphenole auch in dieser Kategorie von Untersuchungen einen wichtigen Beitrag zur Prävention bieten.

1.5. Zielsetzung

In den letzten Jahren wurden nicht nur neue ATP-kompetitive Inhibitoren für verschiedene Proteinkinasen entdeckt, sondern auch zelltodinduzierende Nebenwirkungen von Arzneistoffen auf neue Einsatzgebiete hin untersucht und bekannte Wirkstoffe durch rationales Design verbessert.

In dieser Arbeit möchte ich die Verbindungsklasse der Hydroxyanthracene auf ihr möglichst selektiv hemmendes Potential gegenüber den Enzymen CK-1, CK-2, GSK-3β und der CDK2/cyclinA untersuchen, und damit einen Beitrag zur Leitstruktur-Optimierung des Emodins leisten. Ziel ist es, über das virtuelle Screening einer Vielzahl synthetisierter Derivate einer Leitstruktur, Struktur-Wirkungsbeziehungen für ein isoliertes Enzym, im Zusammenhang zur Komplexität der lebenden Zelle, aufzudecken.

Für die Auswertung wurden deshalb die Ergebnisse eines MTT-Tests mit herangezogen, welcher zytotoxische Wirkungen, erfasst. Nur selektiv auf ein bestimmtes Enzym und eine bestimmte Zellart wirkende Verbindungen können ihren Einsatz als Therapeutikum mit gesichertem Nebenwirkungsprofil finden.

Material

2.1. Enzyme, Inhibitoren, Substrate

CK-1δ, rat, recombinant Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen

CK-1, Substrat Calbiochem-Novabiochem,

Darmstadt

CK-1, IC261 Inhibitor Calbiochem-Novabiochem, Darmstadt

CK-2, human, recombinant (E-coli) Calbiochem-Novabiochem, Darmstadt

CK-2, Substrat aus Assay Kit Upstate Biotechnology, Biomol Hamburg

GSK-3β, rabbit, recombinant (E-coli) New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main

GSK-3β, Substrat IZKF, Dr. Rothemund Leipzig

GSK-3β, Inhibitor I (TDZD) Calbiochem-Novabiochem, Darmstadt

GSK-3β, Inhibitor (SB-216763) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen

2.2. Synthetisierte Anthranoide

Leitstruktur der Untersuchungen:

Emodin (1,3,8-Trihydroxy-6-methylanthrachinon)

2.2.1. Einfache Substituierungen am Anthrachinongrundgerüst O

O

R1 R4

R2 R3

Position: R1 R2 R3 R4

A-5 OAc - COOH OAc

A-6 OAc OAc COOH OAc

A-7 OH - COOEt OH

A-8 OH OH COOEt OH

[2-1] Überblick über die einfachen Substituierungen direkt am Grundgerüst

Überlegungen: Acetylierungen und Esterifizierungen zur hydrophilen Löslichkeitserhöhung mit eventueller Pro-Drug-Funktion durch Abspaltung zellulärer Esterasen.

2.2.2. 2,4,6,8-Tetranitroanthranoide

R1 O R4

R2 R3

O

O₂N NO₂

NO₂ NO₂

Position: R1 R2 R3 R4

B-1 OH - - OH

B-2 OH OH CH3 OH

B-3 OAc OH CH3 OAc

B-4 OH CH3O CH3 OH

[2-2] Überblick über die 2,4,6,8-Tetranitroanthranoide

Überlegungen: Verbindungen mit Nitrogruppen sind reaktive Verbindungen, vorwiegend sauren Charakters, welche bei aromatischen Verbindungen aufgrund eines –M Effektes den Benzolring für chemische Reaktionen desaktivieren können. Toxikologisch bedeutsames Strukturelement.

2.2.3. Vom Emodin abgeleitete C4-aminosubstituierte Anthranoide

OH O OH

R1 O O

H CH₃

Position: R1

C-5 NH NH₂

C-6

NH N

H CH₃ O

C-7

NH N

H O

C-8

NH N

H

O COOH

[2-3] Überblick über die C4-substituierten Anthranoide

Überlegungen: Primäre und sekundäre Amine können leicht protoniert werden und reagieren daher im Gegensatz zu den Nitro-Derivaten basisch durch das freie Elektronenpaar am Stickstoff. Pharmakologisch und toxikologisch bedeutsame funktionelle Gruppe.

2.2.4. Vom Emodin abgeleitete C3/C4-ringsubstituierte Anthranoide

OH O OH

R1

R2 O

CH₃

Position: R1 R2

D-4 ^NH

N H

D-5

NH N

H

D-6

O N

[2-4] Überblick über die C3/C4-ringsubstituierten Anthranoide

Überlegungen: Sekundäre und tertiäre Amine, als funktionelle Gruppen direkt am Aromaten zeigen eine reduzierte Basizität gegenüber nichtaromatischen Aminogruppen, weil das freie Elektronenpaar mit dem pi-System des Aromaten in Wechselwirkung treten kann.

2.3. Natürliche Flavonoide

O

O A

B

7 6

5

3' 4' 5' 2

3

R1

O

O OH

OH

OMe

R2

O

O OH

OH

OMe R3 ^OMe

Positions: 3 5 6 7 3’ 4’ 5’

Flavanes: Naringenin - OH - OH - OH -

Flavones: Flavone - - -

5-Hydroxyflavone - OH - - - 7-Hydroxyflavone - - - OH - - - 3’,4’-Dihydroxyflavone - - - - OH OH - Chrysin - OH - OH - - - Apigenin - OH - OH - OH - Luteolin - OH - OH - OH OH Diosmetin - OH - OH - OCH3 OH

Hydnocarpin - OH - OH - ……R1….

Flavanonols: Silibinin OH OH - OH - …….R2….

Flavonols: Kaempferol OH OH - OH - OH - Quercetin OH OH - OH OH OH - Myricetin OH OH - OH OH OH OH Isoflavones: Biochanin-A R3 OH - OH - - - [2-5] Untergruppen und Strukturen der untersuchten Flavonoide

Überlegungen: Strukturelle Ähnlichkeiten zu den Anthrachinonen im Hydroxylierungsmuster und in den Abständen der Hydroxylgruppen zueinander. Untersuchungen zu den Einflüssen unterschiedlicher Positionen für die Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen.

2.4. Chemikalien

ATP Roche Diagnostics GmbH,

Mannheim

ATP, [γ-³²P] Amersham Bioscience GmbH, Braunschweig

BSA Serva Electrophoresis GmbH,

Heidelberg

DMSO Carl, Roth GmbH & Co. KG,

Karlsruhe

HCl Carl, Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

H3PO4 Merck Bioscience GmbH,

Darmstadt

KCl Carl, Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

MgCl2 * 6 H2O Carl, Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

MTT Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Taufkirchen

NaCl Carl, Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

NaF Merck Bioscience GmbH,

Darmstadt

Na3VO4 Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Taufkirchen

P81-Blott-und Chromatographiepapier Whatman International Ltd., Maidstone

PMSF Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Taufkirchen

TFA Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen

Tris Carl, Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Ultima Gold/ Luma Safe⁺ Perkin Elmer GmbH, Rodgau-Jügesheim

2.5. Puffer, Lösungen

CK-1 Versuchspuffer 25mM Tris HCl pH 7.4 10mM MgCl2 * 6 H2O

CK-2 Versuchspuffer 100mM Tris HCl pH 7.4 20mM MgCl2 * 6 H2O 100mM NaCl

50mM KCl 0,1mM Na3VO4

GSK-3β Versuchspuffer 50mM Tris HCl pH 7.4 5mM MgCl2 * 6 H2O 1mM NaF

1mM PMSF 1mM Na3VO4

Waschlösung 1%ige H3PO4

2.6. Technische Geräte und Arbeitsmaterialien

Analysenwaage, BP 61 S Sartorius AG, Göttingen

Kühl-/Gefrierkombination, Premium Liebherr-Hausgeräte GmbH, Ochsenhausen

Magnetrührer, Variomag, Monotherm H+P Labortechnik AG, Oberschleißheim

pH-Elektrode mit Messkette, inoLab WTW GmbH & Co. KG, Level 1/ Sen Tix 41 Weilheim

Scintillationsmeßgerät, Tri-carb 2500TR Perkin Elmer GmbH, Rodgau-Jügesheim Thermomixer , 5436 Eppendorf AG,

Hamburg

Tiefkühlschrank (-70°C), Hera freeze Heraeus Instruments, Hanau

Vortex, Agitateur Top-Mix 11118 Biobloc Scientific GmbH, Schwerte

Waage, BL 1500 S Sartorius AG, Göttingen Wasseraufbereitungsanlage für Seral,

Bidestilliertes Wasser, Seralpur Ransbach-Baumbach Wasseraufbereitungsanlage für Seral,

Deionisiertes Wasser, Seradest Ransbach-Baumbach Zentrifuge, Rothilabo®-Mini Carl, Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Sonstige laborübliche Arbeitsmaterialien werden nicht gesondert aufgeführt.

Methoden

3.1. Virtuelles Screening mit molekularen Modellierungsstudien

[3-1] Stark vereinfachtes Schema der Dockingmethode nach Modellierung der Liganden (links) und der Proteine (mitte)

3.1.1. Molekulare Modellierung der Proteinstrukturen

Die Protein-Ligand-Docking-Studien wurden auf der Basis folgender publizierter Röntgenkristallstrukturen durchgeführt: für die CK-1 im Komplex mit dem ATP-kompetitiven Inhibitor IC261 (pdb-Eintrag: 1eh4^[84]), für die alpha-Untereinheit der CK-2 im Komplex mit Emodin (pdb-Eintrag: 1f0q^[85]), für die GSK-3β im Komplex mit AR-A014418 (pdb-Eintrag: 1q5k^[86]) und einem CDK2/cyclinA-ATP-Komplex (pdb-Eintrag: 1fin^[87]). In Anbetracht dessen, dass die Proteinkinase CK-2 Konformationsänderungen unterliegen kann und wir uns hier für eine Methode entschieden haben, in der das Protein während der Dockingprozedur rigid vorliegt. Haben wir uns für die Kristallstruktur mit Emodin, der Grundstruktur auch unserer Verbindungen, entschieden. Die Proteinstrukturen wurden von der Proteindatenbank herunter geladen und mittels spezieller Programme optimiert.

Zunächst wurden aus dieser Struktur die kokristallierten Inhibitoren, Ionen und löslichen Moleküle aus dem Protein, extrahiert. Danach wurden alle fehlenden polaren Wasserstoffatome mit dem Programm

Molecular Operating Environment^[88] wieder angefügt, um dann zum Schluss die entsprechenden Ladungen wieder zuzuweisen. Alle Proteinmoleküle wurden abschließend einem Verfahren der Energieminimierung mit Hilfe des Amber89-Kraftfeldes, welches im MOE inbegriffen ist, unterzogen.

Um die Kontakte zwischen den Wasserstoffen zu minimieren, wurden zunächst die Schweratome in ihrer kristallographischen Position fixiert und nur den Protonen erlaubt ihre Lage zu optimieren. Danach wurden dann Atome des Proteinrückrates fixiert und den Schweratomen erlaubt, ihre Lage zu optimieren und im vorletzten Schritt konnten dann noch die Atome des Proteinrückrates ihre Lage optimieren. Um dann zum Schluss noch die elektrostatischen Bedingungen in die Optimierungsberechnungen mit einzubeziehen.

3.1.2. Molekulare Modellierung der Inhibitoren

Die untersuchten anthranoiden und flavonoiden Molekülstrukturen wurden mit Hilfe des molekularen Modellierungsprogramms Spartan 5.0^[89] modelliert und für alle quantenmechanischen Berechnungen verwendet. Die Ligandenladungen, abgeleitet von ihrem elektrostatischen Potential, wurden auf dem AM1-Level minimiert und danach alle relevanten Torsionswinkel freigelassen.

3.1.3. Automatische Protein-Ligand-Docking-Studien

Die Dockingberechnungen mit Autodock 3.0^[90,91] wurden in einem benutzerdefinierten dreidimensionalen Gitter von 100 x 100 x 100Å für die Proteinkinase CK-1 und die CDK2/cyclinA, und 90 x 90 x 90Å für die CK-2 und GSK-3β, zentriert um unsere Leitstruktur Emodin, welches im

vorhergehenden Schritt in einem Gitter mit dem kompletten Protein gedockt wurde, durchgeführt (Programm: Autogrid implementiert in Autodock). Mit der Vorgabe eines 0,375 Å großen Gitterrasters offenbaren sich mögliche Protein-Ligand-Bindungsstellen und über das Programm Autotors werden mögliche freie Torsionen der Ligandensubstituenten definiert. Absicht war die Suche nach der bevorzugten Bindungssituation zwischen einem rigid gelassenen makromolekularen Targetproteins mit bekannter Struktur und verschiedenen niedrigmolekularen flexibel gelassenen Liganden oder Inhibitoren. Ausgewertet wurden, aus 50 unabhängigen Dockingläufen für jeden einzelnen Liganden, die Cluster mit den besten Bindungsenergien.

3.2. Inhibitionsstudien mittels Phosphorylierungsassay^[6]

Der radiochemische Phosphorylierungsassay basiert auf der durch [γ-³²P]ATP markierten Phosphorylierung eines für das jeweilige Enzym

spezifischen Substratpeptids, katalysiert durch Magnesium und das entsprechende Enzym. Das phosphorylierte Substratpeptid wird vom restlichen markierten ATP über Phosphorcellulosefilterpapier abgetrennt und die Cerenkow-Strahlung im Scintillationsmeßgerät gemessen. Durch Zusatz des Inhibitors wird das Enzym gehemmt, das Substratpeptid kann nicht mehr phosphoryliert werden. Folge ist die Abnahme der Strahlungsintensität gegenüber dem Leerwert ohne Substrat oder Enzym.

30°C/ 10min

X-Substratpeptid + [γ-³²P]ATP [³²P]-X-Substratpeptid + ADP

X-Enzym, Mg²⁺

[3-2] Stark vereinfachtes Reaktionsschema

3.2.1. Protokoll des radiochemischen Phosphorylierungsassays der CK-1^[6]

Der Reaktionsansatz für die Caseinkinase-1 setzt sich zusammen aus 2mg/ml BSA, 3,75µM unmarkiertem ATP, 0,2µCi [γ-³²P]ATP, 6,8U CK1- Enzym ad 20µl CK-1 Versuchspuffer. Der Reaktionsansatz wird 10min bei 30°C mit der zu untersuchenden Inhibitorkonzentration vorinkubiert.

Gestartet wird nun die Reaktion durch Zugabe des CK-1 Substratpeptides in der Konzentration 20µM nach einem festen Zeitschema, um für alle Proben eine 10minütige Reaktionszeit zu gewährleisten. Die eingestellte Reaktionstemperatur liegt bei 30°C. Die Reaktion wird beendet, indem man 90µl einer 10mM ATP-Lösung nach dem festgesetzten Zeitschema zupipettiert. Danach werden 40µl auf ein Phosphocellulose- filterpapierfähnchen der Größe 2x1cm aufgetragen und 20min getrocknet.

Das nicht gebundene radioaktive ATP wird in 5 Waschschritten mit jeweils 100ml 1%ige Phosphorsäurelösung für 5min unter ständigem Schütteln vom Filter gespült. Nach einer Trocknungszeit von ca. 15min werden die Fähnchen in die Scinitllationsmessröhrchen gegeben und mit 5ml der Scintillationsflüssigkeit Ultima Gold vollständig bedeckt. Die Cerenkow- Strahlung wird im Scintillationsmessgerät gemessen und in cpm (counts per minute) angegeben. Der absolute Nullwert enthält Puffer und kein Substrat und wird von allen nachfolgenden Werten abgezogen. Er berücksichtigt durch den Puffer, der Scintillationsflüssigkeit, und vor allem auf dem Fähnchen gebundener freier Radioaktivität, ausgelöste Effekte. Der Nullwert als Basislinie enthält DMSO und keinen Inhibitor, da die untersuchten Hydroxyanthracenderivate in DMSO gelöst sind, und wird als Kontrollwert ohne Inhibition zur 100% Enzym-Substrat-Reaktion gesetzt.

3.2.2. Protokoll des radiochemischen Phosphorylierungsassays der CK-2^[6]

Der Reaktionsansatz für Caseinkinase-2 setzt sich zusammen aus 3,75µM unmarkiertem ATP, 0,2µCi [γ-³²P]ATP, 20µM CK-2 Substratpeptid ad 20µl CK-2 Versuchspuffer als Reaktionsmedium. Der Reaktionsansatz wird auch hier 10min bei 30°C mit der zu untersuchenden Inhibitorkonzentration vor- inkubiert. Im Gegensatz zur CK-1 und GSK-3β wird die Reaktion nicht mit dem Substrat, sondern mit 10U CK-2 Enzym gestartet (Temperaturempfindlicher als CK-1 und GSK-3β). Der Test wird wie im Protokoll der CK-1 beendet.

3.2.3. Protokoll des radiochemischen Phosphorylierungsassays der GSK-3β^[6]

Der Reaktionsansatz für Glykogensynthasekinase-3β setzt sich zusammen aus 2mg/ml BSA, 3,75µM unmarkiertem ATP, 0,2µCi [γ-³²P]ATP, 5U GSK3- β-Enzym ad 20µl GSK-3β Versuchspuffer. Der Reaktionsansatz wird wieder 10min bei 30°C mit der zu untersuchenden Inhibitorkonzentration vorinkubiert. Gestartet wird die Reaktion durch Zugabe des GSK-3β Substratpeptides in der Konzentration 20µM. Der Versuch endet wie in den vorangestellten Protokollen beschrieben.

3.2.4. Die Auswertung des In-vitro-Kinase-Assays^[6]

Beim Screening der inhibitorischen Wirkung der Hydroxyanthracenderivate auf die Enzyme CK-1, CK-2, GSK-3β wurde der Kontrollwert mit DMSO und ohne Inhibitor, als vollständige Enzym-Substrat-Reaktion zu 100% festgelegt.

Aufgetragen wurde die prozentuale Hemmung des Enzyms bei der entsprechenden Inhibitorkonzentration.

Nach mathematischer Kurvenannäherung mit der Origin Basis Funktion:

Logistik: y = A1 - A2 + A2 1+(x/x0)^p

[3-3] Funktion der mathematischen Kurvenannäherung und Berechnung des IC₅₀-Wertes

wurde die halbmaximale Inhibitorkonzentration x0 bestimmt und als Vergleichsbasis für die Auswertung der verschiedenen Derivate genommen.

In der Graphik sind der Mittelwert der Doppelbestimmungen und die Standardabweichung dargestellt. Vergleichende Aussagen zwischen den untersuchten Enzymen können gemacht werden, da auf gleiche ATP- Konzentrationen geachtet wurde und die Testsysteme auf annähernd gleiche Bedingungen, wie Enzym- und Substratkonzentration, Temperatur und Radioaktivität, adaptiert wurden.

3.3. Zytotoxizitätsbestimmungen mittels MTT-Assay

Kolorimetrisches Analyseverfahren, welches auf der Reduktion des gelben, wasserlöslichen Tetrazoliumsalzes (MTT) zu violettblauen Formazansalzen durch zelluläre Dehydrogenasen stoffwechselaktiver Mitochondrien lebender Zellen basiert.

S N N N N

N CH₃

CH₃ Br

S N N N

N CH₃

CH₃ N

+ H

NADH

NAD⁺

MTT Formazan

[3-4] Stark vereinfachtes Reaktionsschema

Ergebnisüberblick

4.1. Überblick über die virtuell berechneten Docking-KD-Werte

CK-1 CK-2 GSK-3β CDK2/

cyclinA A-1 3.38e-06 3.22e-07 3.04e-06 2.88e-05

A-5 1.21e-05 1.20e-06 8.58e-07 1.28e-05 A-6 4.17e-06 8.50e-06 9.44e-07 4.54e-05 A-7 8.74e-06 8.14e-07 7.14e-06 2.45e-05 A-8 5.32e-06 4.14e-07 6.48e-06 2.75e-05

C-5 7.65e-06 6.48e-06 3.45e-06 1.75e-05 C-6 1.35e-06 1.17e-07 5.80e-07 9.08e-06 C-7 7.14e-07 4.97e-09 8.60e-08 9.67e-07 C-8 2.14e-07 3.36e-08 1.11e-08 9.15e-08

D-4 1.34e-06 2.97e-07 6.54e-07 7.83e-06 D-5 3.63e-07 1.25e-07 1.49e-07 7.77e-07 D-6 7.61e-07 6.02e-07 1.43e-07 2.65e-06

Flavon 1.61e-05 3.87e-06 6.67e-06 4.59e-05 5-Hydroxyflavon 1.14e-05 2.02e-06 8.06e-06 2.00e-05 7-Hydroxyflavon 4.83e-06 1.50e-06 1.08e-05 9.47e-06 Dihydroxyflavon 4.88e-06 1.25e-06 3.83e-06 3.12e-06 Chrysin 2.55e-06 6.42e-07 5.85e-06 1.57e-05 Apigenin 1.34e-06 2.69e-07 1.52e-06 4.22e-06 Luteolin 1.38e-06 4.88e-07 1.67e-06 7.88e-07 Diosmetin 2.36e-06 1.00e-06 3.06e-06 4.64e-06 Kämpferol 5.05e-07 9.91e-07 2.46e-06 2.10e-06 Quercetin 6.89e-07 8.31e-07 5.23e-07 2.43e-06 Myricetin 5.16e-07 8.59e-07 2.73e-06 1.14e-05 Biochanin-A 7.42e-06 1.22e-06 2.74e-06 2.10e-05 Naringenin 1.24e-06 4.07e-07 3.59e-06 7.04e-06 Hydnocarpin 8.86e-07 9.20e-07 6.72e-07 1.49e-06 Silibinin 1.37e-07 1.42e-07 5.89e-07 1.89e-06

[4-1] Übersicht über die in-silico berechneten Docking-KD-Werte

4.2. Überblick über die gemessenen halbmaximalen inhibitorischen Konzentrationen

Verbindung CK-1 CK-2 GSK-3β CDK2/

cyclinA

A-1^[6] 14.1µM 300nM 16.5µM n.d.

A-5^[6] >50µM 46.0µM >50µM n.d.

A-6^[6] >50µM >50µM >50µM n.d.

A-7^[6] >50µM 11.4µM >50µM n.d.

A-8^[6] >50µM 5.1µM >50µM n.d.

B-1 58.0µM 15.1µM 73.0µM n.d.

B-2 55.8µM 10.7µM >100µM n.d.

B-3 >100µM 12.6µM 87.0µM n.d.

B-4^[6] 98.1µM 10.4µM >100µM n.d.

C-5 1.8µM 1.9µM 1.7µM n.d.

C-6 n.d. 13.8µM n.d. n.d.

C-7 13.3µM 5.9µM 12.6µM n.d.

C-8 28.7µM 700nM 31.9µM n.d.

D-4 2.9µM 17.2µM 11.2µM n.d.

D-5 >50µM >50µM >50µM n.d.

D-6 >50µM 600nM >50µM n.d.

[4-2] Übersicht über die in-vitro gemessenen IC50-Werte der verschiedenen Verbindungsklassen

KD-Werte IC50-Werte 7-Hydroxyflavone 1.50E-06 5.0µM 3’,4’-Dihydroxyflavone 1.25E-06 5.5µM Diosmetin 1.00E-06 3.5µM Kaempferol 9.91E-07 1.4µM Myricetin 8.59E-07 700nM Apigenin 2.69E-07 500nM

[4-3] Vergleich der in-silico und in-vitro Daten der Flavonoide für die Proteinkinase CK-2

4.3. Überblick über die gemessenen halbmaximalen zytotoxischen Dosen^[6]

CD50-Hepatozyten CD50-HepG2

A-1 39,9µM 43,5µM

A-5 88,8µM 45,5µM

A-6 34,5µM 32,1µM

A-7 >1mM 64,8µM

A-8 201,4µM 124,3µM

[4-4] Übersicht über die CD50-Werte der Verbindungsklasse A der Anthranoide

Ergebnisdiskussion

5.1. Strukturelle Einblicke

Mit Hilfe theoretischer Computerberechnungen zur Bindungssituation zwischen einem vorgegebenen Enzym und in diesem Fall verschiedener niedermolekularer Verbindungen, wurden erste Hinweise über die Affinität beider Partner zueinander gesammelt. Grundsätzlich konnte gezeigt werden, wo der potentiell in Frage kommende Hemmstoff höchstwahrscheinlich binden wird.

[5-1] Übersicht über die möglichen Aussagen aus virtuellen Dockingstudien

In unserem Fall konnte, wie für Kinasen bereits beschrieben, eine ausgeprägte Präferenz für die ATP-Bindungstasche nachgewiesen werden.

Für die Kinasen CK-1 und CK-2 fanden wir, je nach Typ der zur Verfügung stehenden Inhibitoren, auch eine weitere Bindungsstelle, welche bei