Infektionsdynamik von Salmonella Paratyphi B d-Tartrat+ im Masthähnchenbestand sowie deren Bekämpfung in der Primärproduktion

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Tierärztliche Hochschule Hannover

Infektionsdynamik von Salmonella Paratyphi B d-Tartrat+ im Masthähnchenbestand sowie deren Bekämpfung in der Primärproduktion

INAUGURAL – DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von Franziska Kloska Steinheim/Westfalen

Hannover 2017

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Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Günter Klein^†

Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit PD Dr. Carsten Krischek

Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Günter Klein^†

Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit PD Dr. Carsten Krischek

Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Silke Rautenschlein, PhD Klinik für Geflügel

Tag der mündlichen Prüfung: 02. Mai 2017

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Meinen Eltern und Christof

„Alles menschliche Können ist eine Summe von Geduld und Zeit“

(Honoré de Balzac)

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Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis ... I Publikationsverzeichnis ... II

1 Einleitung ... 1

2 Publikationen ... 5

2.1. Infection Dynamics and Antimicrobial Resistance Profile of Salmonella Paratyphi B d-tartrate Positive (Java) in a Persistently Infected Broiler Barn ... 7

2.2. Implementation of a Risk-orientated Hygiene Analysis for the Control of Salmonella Java in the Broiler Production ... 9

3 Zusammenfassung der Ergebnisse und übergreifende Diskussion ... 10

3.1. Infektionsdynamik von S. Java im Masthähnchenbestand ... 10

3.2. Risikoorientierte Hygieneanalyse von persistent mit S. Java besiedelten Ställen ... 12

3.3. Zur antimikrobiellen Multiresistenz von S. Java und ihrer Bedeutung für die öffentliche Gesundheit ... 15

3.4. Überlegungen zur Methodik der vorliegenden Arbeit ... 18

4 Zusammenfassung ... 21

5 Summary ... 23

6 Literaturverzeichnis ... 25

7 Danksagung ... 36

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I Abkürzungsverzeichnis

CIP Ciprofloxacin E. coli Eschericia coli

ECOFF epidemiological cut-off value EU Europäische Union

FOX Cefoxitin

HACCP Hazard Analysis of Critical Control Points KbE Kolonie bildende Einheiten

MIC minimal inhibitory concentration NAL Nalidixinsäure

qPCR quantitative PCR S. Salmonella

SPC Spectinomycin spp species pluralis STR Streptomycin TET Tetrazyklin TMP Trimethoprim

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II Publikationsverzeichnis

Teile dieser Arbeit sind bereits veröffentlicht:

FRANZISKA KLOSKA, MARTIN BEYERBACH, GÜNTER KLEIN (2017):

Infection Dynamics and Antimicrobial Resistance Profile of Salmonella Paratyphi B d-tartrate Positive (Java) in a Persistently Infected Broiler Barn

Int. J. Environ. Res. Public Health, 14, 101 DOI: 10.3390/ijerph14010101

FRANZISKA KLOSKA, MAXIMILIAN CASTEEL, FREDERIK WILMS-SCHULZE KUMP, GÜNTER KLEIN (2017):

Implementation of a Risk-orientated Hygiene Analysis for the Control of Salmonella Java in the Broiler Production

Curr. Microbiol., 74, 356-364 DOI 10.1007/s00284-017-1199-9

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EINLEITUNG

1 1 Einleitung

Die Salmonellose des Menschen wird häufig durch die Aufnahme von mit Salmonellen kontaminiertem Geflügelfleisch hervorgerufen (BRYAN & DOYLE, 1995). Zu einer bestimmten Zeit dominieren immer nur wenige Serovare innerhalb einer Tierpopulation oder innerhalb eines Landes. Globale Pandemien können z.B. durch S. Enteritidis und Typhimurium DT 104 hervorgerufen werden, wobei von Zeit zu Zeit auch seltene Serovare, u.a. S. Paratyphi B d-Tartrat+ (kurz: Java), humane Erkrankungsfälle bedingen können (MIKO et al., 2002).

Kontaminationsmöglichkeiten von Fleisch treten entlang der gesamten Geflügelfleisch- Produktionskette auf und werden daher im Fokus der Lebensmittelsicherheit bereits auf der Stufe der Primärproduktion bekämpft. In der EU wurden für das Jahr 2013 ca. 85.000 humane Salmonellose-Fälle bekannt, von denen 43,6 % hospitalisiert werden mussten. 7,5 % des im Einzelhandel der EU angebotenen Geflügelfleischs war 2013 mit Salmonellen belastet (EFSA UND ECDC, 2015). Im Rahmen der europaweiten Gesetzgebung wird ein Schwerpunkt auf die Ermittlung des Vorkommens, der Verbreitung und die Möglichkeiten der Bekämpfung der Salmonellen gelegt. Nach der EU-Zoonose-Richtlinie 2003/99/EG des europäischen Parlaments und des Rates zur Überwachung von Zoonosen und ihren Erregern sollen Maßnahmen zum Schutz der öffentlichen Gesundheit unter anderem bei Salmonella spp.

getroffen werden. Eine Reduzierung der Salmonellen-Prävalenz auf der Stufe der Primärproduktion wird in den Verordnungen 2160/2003 und 200/2012 des europäischen Parlaments und des Rates gefordert. Um das Vorkommen von Salmonella spp. auf Karkassen am Schlachthof zu reduzieren und so letztlich auch die Anforderungen der Verordnung

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EINLEITUNG

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2073/2005 zu erfüllen, erkannte bereits HOOVER et al. (1997), dass u.a. die Reduzierung der Salmonellen-Prävalenz auf Ebene der Primärproduktion unerlässlich ist.

Neben den gesundheitlichen Folgen darf man die ökonomischen Folgen für die Landwirte nicht unberücksichtigt lassen. Sobald Salmonellen bei der routinemäßigen Untersuchung gemäß der Verordnungen 200/2012 und 2073/2005 während des Mastzyklus bzw. als Prozesshygienekriterium am Schlachthof festgestellt werden, kommt es zu finanziellen Einbußen für den Landwirt, die sich im Abzug von ca. einem Cent pro Kilogramm Lebendgewicht niederschlagen. Dies entspricht, bei einem Deckungsbeitrag pro Tier nach Abzug der Kosten für den Kükeneinkauf sowie der Futter- und Betriebskosten von etwa 30 Cent immerhin einem Gewinnverlust von ca. 5 % pro Mastdurchgang.

Die Salmonellen-Serovare Paratyphi B d-Tartrat- und d-Tartrat+ sind Biovare des Serotyps 1,4,[5],12:b:1,2, die beim Menschen paratyphoides Fieber beziehungsweise eine Gastroenteritis hervorrufen können (DENNY et al., 2007). Das d-Tartrat fermentierende Biovar Java (Salmonella Paratyphi B d-Tartrat+) scheint im Gegensatz zu dem nicht d-Tartrat fermentierenden Biovar Salmonella Paratyphi B d-Tatrat- eine geringere Virulenz gegenüber dem Menschen zu besitzen (HUEHN et al., 2009). Erkrankungsfälle sind unter anderem beschrieben in Frankreich, verursacht durch kontaminierten Ziegenkäse (DESENCLOS et al., 1996) sowie in weiteren europäischen Ländern durch aus den Niederlanden importiertes Geflügelfleisch (BROWN et al., 2003). Dieses Serovar spielt daher aus lebensmittelhygienischen Gründen und aus Sicht des Verbraucherschutzes eine Rolle.

Seit den 1990er Jahren beobachtet man ein Vorkommen dieses Serovars vor allem in Deutschland und den Niederlanden bei Broilern sowie in Hähnchenfleisch (MIKO et al., 2002; VAN PELT et al., 2003; EFSA UND ECDC, 2013; EFSA UND ECDC, 2015).

Aufgrund hoher Prävalenzen in den Niederlanden (53,5 %) und Deutschland (20,7 %) war es

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EINLEITUNG

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2010 mit 4,6 % das dritthäufigste nachgewiesene Serovar in Geflügelfleisch innerhalb der EU (EFSA UND ECDC, 2012). In der nationalen Grundlagenstudie zur Erhebung der Prävalenz von Salmonellen in Broilerbetrieben, die durch das Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR) 2005-2006 durchgeführt wurde, betrug der Anteil von S. Java 15,45 % aller nachgewiesenen Serovare in Broilern (EFSA, 2007).

Es wird angenommen, dass S. Java Resistenzgene auf die kommensale Darmflora bzw. andere Salmonella-Serovare übertragen und damit zur Ausbreitung der Resistenz gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen beiträgt (GOLDSTEIN et al., 2001, MIKO et al., 2002). MIKO et al. (2002, 2003) konnten zeigen, dass die Resistenzen gegen Streptomycin, Spectinomycin und Trimethoprim von Transposon Tn7 vermittelt werden. Ihre Konjugationsexperimente belegen eine erfolgreiche Übertragung der Ampicillin-, Sulfonamid-, Tetrazyklin- sowie Trimethoprimresistenz der seit 1995 dominierenden klonalen Linie von S. Java. 87 % dieser 39 untersuchten Isolate wiesen eine Resistenz gegen Trimethoprim, Streptomycin, Sulfonamide, Nalidixinsäure, und/oder Ampicillin auf. MIKO et al. (2002, 2003) konnten mit ihren Daten das Auftreten multiresistenter S. Java-Stämme in Deutschland seit den 1990er Jahren belegen.

S. Java-Stämme weisen neben Resistenzen gegenüber Fluorchinolonen auch Resistenzen gegenüber Cephalosporinen auf, die oftmals als Mittel der Wahl bei humaner invasiver Salmonellose gelten (DAVIES et al., 2013). HUEHN et al. (2009) konnten in ihrer Studie aufzeigen, dass es zwei klonale Linien innerhalb von S. Java gibt, die sich durch die Exprimierung des O:5 Antigens unterscheiden. O:5 negative Varianten sind multiresistent und stammen mit wenigen Ausnahmen von belgischem, niederländischen oder deutschem Geflügel, während O:5 positive Stämme eine weitaus heterogenere Gruppe, sowohl vollkommen empfindlich gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen als auch multiresistent, mit

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EINLEITUNG

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zusätzlichen Virulenzfaktoren darstellen. Die Salmonella Genomic Island I (SGI I), ein komplexes Integron der Klasse I, die u.a. Resistenzen gegen Sulfonamide vermittelt, konnte nur in O:5 positiven Stämmen nachgewiesen werden.

Eine Rückkehr zur Salmonellenfreiheit scheint nach Infektionen mit S. Java besonders schwer, da dieses Serovar im Stallgebäude und der -umgebung überaus effektiv persistieren kann und besonders gut an das Masthähnchen angepasst ist (VAN IMMERSEEL et al., 2004;

DAVIES et al., 2013).

Im Rahmen dieser Dissertation wurde die Infektionsdynamik von S. Java in einem Broilerbestand im Nordwesten Deutschlands über drei Mastzyklen aufgezeigt. Hierbei wurde die KbE S. Java/g Kot ermittelt. So konnte ein Verlauf der Populationsdynamik unter Feldbedingungen dargestellt werden. Des Weiteren wurde eine mögliche, bisher nicht etablierte Hygieneanalyse kritischer Kontrollpunkte in Anlehnung an ein HACCP-Konzept zur Beseitigung von S. Java in Hähnchenställen etabliert sowie ihre Anwendung in der Praxis evaluiert. Hierbei handelte es sich um eine begleitende, risikoorientierte Analyse der durchgeführten Reinigungs- und Desinfektionsmaßnahmen an zuvor festgelegten kritischen Kontrollpunkten mittels Wisch- und Tupferproben, die auf das Vorkommen von Salmonellen untersucht wurden.

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PUBLIKATIONEN

5 2 Publikationen

Im Rahmen dieser Dissertation sind zwei Publikationen entstanden.

Publikation 1: FRANZISKA KLOSKA, MARTIN BEYERBACH, GÜNTER KLEIN (2017) Infection Dynamics and Antimicrobial Resistance Profile of Salmonella Paratyphi B d- tartrate Positive (Java) in a Persistently Infected Broiler Barn

Int. J. Environ. Res. Public Health, 14, 101 DOI: 10.3390/ijerph14010101

 Idee und Konzeption: Franziska Kloska, Prof. Dr. Günter Klein

 Experimentelle Umsetzung: Franziska Kloska

 Auswertung der Ergebnisse: Franziska Kloska, Dr. Martin Beyerbach, Prof.

Dr. Günter Klein

 Verfassen des Manuskriptes: Franziska Kloska, Dr. Martin Beyerbach, Prof.

Dr. Günter Klein

Publikation 1 befasst sich mit der Infektionsdynamik von S. Java im Masthähnchenbestand und liefert wertvolle Hinweise für das Infektionsgeschehen unter Feldbedingungen dieses Serovars mit Bedeutung für die öffentliche Gesundheit. Ferner wird die Multiresistenz gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen belegt.

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PUBLIKATIONEN

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Publikation 2: FRANZISKA KLOSKA, MAXIMILIAN CASTEEL, FREDERIK WILMS- SCHULZE KUMP, GÜNTER KLEIN (2017)

Implementation of a Risk-orientated Hygiene Analysis for the Control of Salmonella Java in the Broiler Production

Curr. Microbiol., 74, 356-364 DOI 10.1007/s00284-017-1199-9

 Idee und Konzeption: Franziska Kloska, Prof. Dr. Günter Klein, Dr. Frederik Wilms-Schulze Kump

 Experimentelle Umsetzung: Franziska Kloska, Dr. Maximilian Casteel

 Auswertung der Ergebnisse: Franziska Kloska, Dr. Maximilian Casteel, Dr.

Frederik Wilms-Schulze Kump

 Verfassen des Manuskriptes: Franziska Kloska, Dr. Maximilian Casteel, Prof.

Dr. Günter Klein

In dieser Publikation wurde die Reinigung und Desinfektion in persistent mit S. Java infizierten Ställen mithilfe einer risikoorientierten Hygieneanalyse evaluiert und kritische Kontrollpunkte identifiziert.

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PUBLIKATIONEN

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2.1. Infection Dynamics and Antimicrobial Resistance Profile of Salmonella Paratyphi B d-tartrate Positive (Java) in a Persistently Infected Broiler Barn

Franziska Kloska^1,2, Martin Beyerbach³, Günter Klein²

1 Veterinary Practice and Laboratory Wilms-Ellert-Klosterhalfen, Lohe 13, D-49429 Visbek, Germany, franziska.kloska@tiho-hannover.de

2 Institute of Food Quality and Food Safety, University of Veterinary Medicine, Bischofsholer Damm 15, D- 30173 Hannover, Germany, guenter.klein@tiho-hannover.de

3 Institute for Biometry, Epidemiology and Information Processing, University of Veterinary Medicine, Bünteweg 2, D-30559 Hannover, Germany, martin.beyerbach@tiho-hannover.de

* Correspondence: (guenter.klein@tiho-hannover.de), Telephone number: +49 (0) 511/8567256, fax: +49 511- 856827256, (franziska.kloska@tiho-hannover.de), Telephone number +49-176 21 99 49 46

Abstract: The infection dynamics of S. Java were examined in three consecutive rearing periods on a broiler farm in Northwestern Germany which had been persistently infected with S. Java for more than five years. The barn was investigated for Salmonella occurrence after cleaning and disinfection to verify the persistent contamination of the broiler house with S.

Java before the start of the first rearing cycle. Confirmation of Salmonella absence in day-old chicks (time-point 1) as well as early establishment of infection between days 5–7 (time-point 2) were confirmed by caecal swabs prepared for qPCR and classical microbiological methods.

At three time-periods (between days 11–15 (time-point 3), days 25–28 (time-point 4), and days 38–40 (time-point 5)) caecal content was examined for colony forming units (CFU) Salmonella/g. In general, there was an increase in Salmonella Java load at time-point 4 compared to time-points 3 and 5. Therefore, we observed a bell-shaped course of infection

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PUBLIKATIONEN

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resulting in higher rates of Salmonella CFU/g prior to prethinning than at final slaughter. The antimicrobial susceptibility testing revealed resistance to tetracycline, fluorquinolones, trimethoprim, and cefoxitin.

Keywords: Infection dynamics; S. Java; broilers; antimicrobial resistance; veterinary public health

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PUBLIKATIONEN

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2.2. Implementation of a Risk-orientated Hygiene Analysis for the Control of Salmonella Java in the Broiler Production

Franziska Kloska^{1,2, ǂ}, Maximilian Casteel¹, Frederik Wilms-Schulze Kump¹, Günter Klein^{2, ǂ}

1 Veterinary Practice and Laboratory Wilms-Ellert-Klosterhalfen, Lohe 13, D-49429 Visbek, Germany

2 Institute of Food Quality and Food Safety, University of Veterinary Medicine Hannover, Bischofsholer Damm 15, D-30173 Hannover, Germany

ǂ Corresponding authors: guenter.klein@tiho-hannover.de, franziska.kloska@tiho-hannover.de Fax + 49 511 856-82 7256, Tel +49-511-856-7256

Abstract This field study aimed to establish a risk-orientated hygiene analysis on two broiler farms in Northwestern Germany for the practical use in broiler housing to evaluate the success of disinfection procedures for eradicating S. Java. The risk-orientated hygiene analysis enables fast, reproducible and cost-effective testing of broiler farms and in turn helps minimize the public health risk ensuing from S. Java. Farms were tested before and after cleaning as well as after disinfection according to a risk-orientated hygiene analysis for the presence of Salmonella DNA with qPCR. Positive PCR samples were confirmed by classical microbiology. Before cleaning, all checkpoints were tested positive for Salmonella DNA.

Salmonella reduction of ca 66 % of the sampled points could be achieved by intensive cleaning. A first disinfection on farm A and B failed to completely eradicate S. Java. A second disinfection followed and finally achieved a Salmonella-free status of the barns.

During nine rearing periods, farms were tested weekly with boot swabs for Salmonella and at slaughter carcasses were tested for Salmonella status. No Salmonella were detected in these examinations. The two studied broiler farms have, to date, remained free of Salmonella.

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ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE UND ÜEBERGREIFENDE DISKUSSION

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3 Zusammenfassung der Ergebnisse und übergreifende Diskussion

3.1. Infektionsdynamik von S. Java im Masthähnchenbestand

Masthähnchen wurden sowohl qualitativ als auch quantitativ zu verschiedenen Zeitpunkten auf das Vorkommen von S. Java untersucht. Bereits bei der zweiten Untersuchung zwischen fünftem und siebtem Lebenstag wurde eine Besiedelung mit S. Java festgestellt, wobei Eintagsküken immer frei von S. Java waren. Wir haben daher gezeigt, dass eine Besiedelung bereits zu einem äußerst frühen Zeitpunkt erfolgt, was die Tatsache belegt, dass S. Java in höchstem Maße an das Masthähnchen angepasst ist (VAN IMMERSEEL et al., 2004). Einen Höhepunkt der Kolonisation konnten wir bei der Untersuchung einige Tage vor dem Vorfangen feststellen, der sowohl in den qualitativen als auch den quantitativen Untersuchungen statistisch signifikant war (p < 0,05, Publikation 1, Tabelle 3 und 5). Bei der abschließenden Untersuchung der Tiere nach dem Vorfangen und wenige Tage vor dem Endfang fiel die Besiedelung mit S. Java, insbesondere in quantitativer Hinsicht, ab.

Scheinbar nimmt also die Anzahl der KbE S. Java /g Kot der Tiere im gesteigerten Alter der Hähnchen ab. Andererseits erwartet man, dass gerade der erhöhte Stress durch das Vorfangen zu einer erhöhten Ausscheidung und folgend einer erhöhten Prävalenz von S. Java führt, wie für Campylobacter spp. beschrieben (CAMERON et al., 2012). Dies wurde in unserer Studie jedoch nicht belegt. Ähnliche Beobachtungen wurden von VAN IMMERSEEL et al. (2004) gemacht: Je älter die Tiere, desto schwieriger war der direkte bakteriologische Nachweis aus Kloakentupfern ohne Voranreicherung (2/32 im Alter von fünf Wochen bzw. 0/32 Tieren im Alter von sechs Wochen waren im direkten mikrobiologischen Ausstrich positiv). Ein Nachweis gelang oftmals erst nach nicht-selektiver und folgender selektiver Anreicherung.

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Auch in vorliegender Untersuchung zum Zeitpunkt 5 waren weniger Tiere im direkten kulturellen Nachweis positiv (Publikation 1 Tabellen 3, 4, 5), und dies obwohl eine erhöhte Stresssituation aufgrund des Vorfangs vorangegangen war. Ein positives Ergebnis wurde dann erst nach Anreicherung und folgendem qPCR-Nachweis erhalten. Es kann vermutet werden, dass in höherem Alter der Tiere und mit stärkerer Ausprägung des Immunsystems eine subletale Schädigung des Erregers bzw. Verminderung seines Vorkommens erfolgen kann, so dass der Nachweis erst nach Anreicherungsverfahren gelingt.

Weitere Untersuchungen, insbesondere zur Interaktion des Immunsystems mit S. Java sind daher nötig, um diesen Sachverhalt hinreichend erklären zu können. Ferner wurde belegt, dass eine antibiotische Therapie zwar dazu führt, dass das Salmonellenvorkommen minimiert wird (Publikation 1, Tabelle 4), der Erreger jedoch keineswegs eliminiert werden kann und eine antibiotische Therapie daher zur Bekämpfung von Salmonellen nicht sinnvoll ist.

S. Senftenberg ist ein Serovar, das – ebenso wie S. Java in Deutschland – in Frankreich zu einer persistenten Besiedelung von Hähnchen führt. Es besitzt nur ein geringes Vermögen – im Gegensatz zu S. Java – in Enterozyten der Masthähnchen einzudringen (VAN IMMERSEEL et al., 2004) und so die Intestinalwand zu passieren (BOUMART et al., 2012), so dass es weitere Faktoren geben muss, die eine Persistenz begünstigen. ALLEN et al.

(2001) konnten zeigen, dass die Virulenz von Salmonella und ihre Fähigkeit zur Invasivität, und damit zur Persistenz, nicht immer miteinander korrelieren müssen. Die Kolonisation wird von verschiedenen Faktoren wie Rasse und Alter, das jeweilige Serovar, das Vorkommen von Virulenzgenen und seinen Fähigkeiten, z.B. des Widerstands gegenüber reaktivem Sauerstoffradikal, sowie weiteren exogenen Faktoren wie z.B. antimikrobielle Therapie, Stress oder eine parasitäre Infektion (Kokkzidiose) beeinflusst. Dieses komplexe Zusammenspiel führt zu der beobachteten Variabilität an Salmonellenserovaren bei ihren

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jeweiligen Wirten und erklärt die Unterschiede in der Invasivität und der Virulenz sowie dem Vorkommen unterschiedlicher Serovare in verschiedenen Ländern (BAILEY, 1988; FOLEY et al., 2013).

Ferner exprimieren die S. Java Isolate des Masthähnchens nicht das O:5 Antigen, wohingegen Isolate mit O:5 Antigen scheinbar weitere Virulenz- sowie Fimbriengene besitzen, die ihnen ermöglichen, mit einer größeren Bandbreite an Wirten zu interagieren (HUEHN et al., 2009).

O:5 negative Isolate rufen beim Menschen eine milde Gastroenteritis hervor. O:5 positive Isolate allerdings führen zu enterischem Fieber (SELANDER et al., 1990). Dies kann bedingt sein durch das Vorkommen unterschiedlicher Virulenzfaktoren, wie z.B. das Vorkommen der Salmonella Genomic Island 1 (gemäß HUEHN et al. (2009) nur in O:5 positiven Serovaren), von Plasmiden und unterschiedlichen Toxinen sowie Fimbrien und Flagellen, die das Auftreten humaner Erkrankungen begünstigen können.

3.2. Risikoorientierte Hygieneanalyse von persistent mit S. Java besiedelten Ställen

S. Java gehört in Deutschland und den Niederlanden zu einem der am häufigsten vorkommenden Serovare im Hähnchenmastbestand (EFSA UND ECDC, 2012). Es ist ausgezeichnet an das Hähnchen angepasst (VAN IMMERSEEL et al., 2004). In der tierärztlichen Praxis ist bekannt, dass es gut in der Stallumgebung persistieren kann und Hähnchen, die folgend auf einen S. Java positiven Mastzyklus eingestallt werden, ein hohes Risiko besitzen, mit S. Java besiedelt zu werden und so ebenfalls mit Salmonellen belastet der Schlachtung zugeführt werden. Aufgrund der Erkrankungsgefahr für den Menschen ausgehend von Salmonellen in Verbindung mit dem Verzehr tierischer Produkte, insbesondere Geflügelfleisch und Eiern, hat die EU eine strenge Gesetzgebung geschaffen,

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die das Risiko einer Infektion mit Salmonellen senken soll. Bereits auf der Ebene der Primärproduktion, also z.B. im Hähnchenstall, wird versucht, die Salmonellen-Prävalenz zu senken. Wir haben in Studie 2 aufgezeigt, dass eine effektive Reinigung und Desinfektion die Reinfektion mit S. Java im folgenden Mastzyklus effektiv verhindern kann. Die etablierte risikoorientierte Beprobung des Stalls und seiner Umgebung ähnelt einem HACCP-Konzept und wird inzwischen auch in praxi auf weiteren S. Java belasteten Farmen angewendet und zeigt hier gute Erfolge. Die in Studie 2 untersuchten Farmen sind nun bereits seit ca. drei Jahren frei von S. Java. Eine gesteigerte „awareness“ gegenüber der Erregereinschleppung, als auch eine verbesserte Biosicherheit haben mit großer Wahrscheinlichkeit dazu beigetragen, dass es nicht erneut zu einem Auftreten einer Salmonella-Infektion kam. So stellten auch FRASER et al. (2010) fest, dass eine verbesserte Biosicherheit die Prävalenz von Salmonella spp. als auch Campylobacter spp. wirkungsvoll verringern kann. Hierbei gilt es laut FRASER et al. (2010) zu berücksichtigen, dass eine inverse Beziehung zwischen den Kosten einer Präventionsmaßnahme und der Bereitschaft von Landwirten, diese anzuwenden, existiert.

Ein weiterer wichtiger Punkt in der Verbesserung der Biosicherheit war die Abschaffung der gängigen Praxis des Vorfangens eines Teils der Tiere mit 32 bis 35 Lebenstagen. Viele Studien (ROSE et al., 1999; NAMATA et al., 2009; CAMERON, 2012) konnten aufzeigen, dass das Verbringen betriebsfremder Personen oder betriebsfremden Equipments, als auch die erhöhte Stresssituation für die Tiere, eine Einschleppung von Salmonella spp., als auch von Campylobacter spp., in den Betrieb begünstigen können. Sicherlich dürfen die ökonomischen Nachteile, die sich für den Landwirt durch die Abschaffung des Vorfangens ergeben, nicht außer Acht gelassen werden. Über den gesamten Mastzyklus betrachtet führt er weniger Tiere mit einem geringeren Gewicht zur Schlachtung, wodurch sich sein Gewinn verringert. Des Weiteren konnte in vorliegender Dissertation gezeigt werden, dass eine Verschleppung von S.

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Java potentiell durch kontaminierte Personen oder Gegenstände, die beim Vorfangen genutzt werden, erfolgen kann. Die in Publikation 2 untersuchten Farmen infizierten sich zum Zeitpunkt des Vorfangens über einen kontaminierten Radlader (persönliche Kommunikation, Andreas Wilms-Schulze Kump), der zuvor auf einer persistent mit S. Java infizierten Farm genutzt und vor seiner Verbringung auf die weiteren Farmen nicht effektiv gereinigt und desinfiziert wurde. Jeder Landwirt muss daher diese mögliche Präventionsstrategie individuell mit seinem Schlachthof/seiner Integration besprechen, um den wirtschaftlichen Schaden für seinen Betrieb so gering wie möglich zu halten. Zu bedenken ist auch, dass der Verlust bei persistenter S. Java-Infektion des Betriebs ca. 5 % des Deckungsbeitrags nach Abzug der Küken-, Futter- und Betriebskosten beträgt.

Des Weiteren werden in der Literatur oftmals wildlebende Vektoren als Salmonellenreservoir diskutiert (KRABISCH & DORN, 1980; HENZLER & OPITZ, 1992; DAVIES & WRAY, 1995; DAVIES & WRAY, 1996; LIEBANA et al., 2003), wobei in den Studien Elterntier- oder Legehennenbestände untersucht wurden. Diese sind mit weit mehr Equipment ausgestattet als Masthähnchenställe, so dass es hier für wildlebende Vektoren, insbesondere Mäuse, leichter ist, sich zu verstecken. Das regelmäßige Ausstallen und Entmisten sowie Reinigen und Desinfizieren der Masthähnchenställe erschweren dagegen scheinbar eine Etablierung von Mäusen (GRADEL & RATTENBORG, 2003).

Darüber hinaus ist die Stallumgebung ein wichtiger Faktor bezüglich der Reinfektion mit Salmonella spp. (RODRIGUEZ et al., 2006). In der untersuchten Farm A (Publikation 2, Tabelle 2) konnten wir, vermutlich aufgrund der schwierigen Zugänglichkeit des Außengeländes, trotz erfolgten Ausbringens von Branntkalk, noch S. Java in der Sockenprobe nachweisen. Hier war also eine effektive Hygieneschleuse mit strikter Schwarz-Weiß-

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Trennung wichtig, um eine Einschleppung in den Stall zu verhindern, was auch als wertvolle Präventionsmaßnahme in der Literatur beschrieben ist (HENKEN et al., 1992).

Die wichtigste Präventionsmaßnahme zur Verhinderung einer Salmonelleninfektion ist die Einstallung von Küken in einen Salmonellen-unbelasteten Stall. Eintagsküken sind in der Regel nicht mit Salmonellen infiziert, so dass, im Falle von S. Java, dem Stall als Infektionsquelle die größte Bedeutung zukommt. In Publikation 1 wurde vor Start des ersten Mastzyklus die in Studie 2 evaluierte Hygienekontrolle zum Nachweis der Persistenz von S.

Java in der Tierumgebung angewandt (Publikation 1, Tabelle 2). Der Erreger konnte an sieben von 15 Kontrollpunkten nachgewiesen werden. Die kontaminierte Umgebung der Tiere war daher mit größter Wahrscheinlichkeit die Infektionsquelle der Küken mit S. Java, da die Eintagsküken in allen drei Mastzyklen frei von Salmonella spp. waren. Eine frühe Infektion der Küken mit S. Java wurde bereits zum ersten Untersuchungszeitpunkt zwischen Tag fünf bis sieben nachgewiesen.

Zusammenfassend muss betont werden, dass das Verbringen von Eintagsküken in einen salmonellenfreien Stall nötig ist sowie penibelste Hygiene beim Vorfangen einzuhalten ist, um eine Infektion der Hähnchen mit S. Java zu verhindern und so das Gesundheitsrisiko für die öffentliche Gesundheit ausgehend von S. Java auf Ebene der Primärproduktion zu senken.

3.3. Zur antimikrobiellen Multiresistenz von S. Java und ihrer Bedeutung für die öffentliche Gesundheit

Einige in Studie 1 gewonnene S. Java Isolate wurden auf ihre Sensitivität gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen, sowohl mittels Mikrodilutionsverfahren als auch teils im Agardiffusionsverfahren, getestet. Es stellte sich heraus, dass alle untersuchten Isolate

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(eins/pro Mastdurchgang) multiresistent gegenüber TET, NAL, CIP, TMP, SPC, STR und FOX waren. In einer Studie von MIKO et al. ( 2002) wurden unterschiedliche S. Java Isolate molekulargenetisch untersucht. Die aus dem Zeitraum 1960 bis 1993 stammenden Isolate gehörten einer genetisch heterogenen Gruppe, mit nur vereinzelten Resistenzen, an. Ab 1995 trat ein dominierender Klon auf. 87 % der ab diesem Zeitraum untersuchten Isolate waren multiresistent. 2003 konnten MIKO et al. belegen, dass die Multiresistenz durch ein chromosomal lokalisiertes Klasse 2 Integron vermittelt wird. Integrons erleichtern die Insertion weiterer Resistenzgene in das bakterielle Genom (VAN DUIJKEREN et al., 2003).

Das Kernspektrum der Resistenz richtete sich gegen Trimethoprim, Spectinomycin und Streptomycin und wurde von der Genkassette dfrA1-sat1-aad1 vermittelt (MIKO et al., 2003).

Ferner wurde eine Resistenz gegenüber Fluorchinolonen (NAL, CIP) festgestellt, die insbesondere deswegen kritisch zu sehen ist, da diese antimikrobiellen Wirkstoffe oft das Mittel der Wahl bei einer invasiven humanen Salmonellose sind (ANGULO et al., 2002).

Bereits VAN PELT et. al (2003) konnten eine Zunahme der Resistenz S. Javas gegenüber Ciprofloxacin nachweisen. Die in dieser Dissertation untersuchten Isolate waren ebenso resistent gegenüber Nalidixinsäure und Ciprofloxacin. Genetische Analysen von Salmonellenisolaten mit verminderter Empfindlichkeit gegenüber Fluorchinolonen belegen in einigen Fällen eine Klonalität, dennoch scheint die Resistenz in den meisten Isolaten durch de-novo Mutationen entstanden zu sein (Allen & Poppe 2002), wodurch eine Ausbreitung der Resistenz durch horizontalen Gentransfer mittels mobiler genetischer Elemente in diesem Fall nur eine untergeordnete Rolle spielt. Dafür spricht ebenso, dass bakteriämische Salmonellenisolate in den USA zu weniger als 1 % resistent gegenüber Fluorchinolonen sind (STEPHEN et al., 2003).

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Die von uns untersuchten Isolate wiesen darüber hinaus eine Resistenz gegenüber Cefoxitin auf. Cefoxitin ist ein sehr sensitiver Parameter für den Nachweis von AmpC-Bildnern (BRONZWAER, 2008). AmpC-bildende Bakterien weisen eine Resistenz gegenüber allen β- Laktam Antibiotika, Cephalosporinen der zweiten und dritten Generation sowie gegenüber Cephamycinen auf. Empfindlich sind sie gegenüber Cephalosporinen der vierten Generation und Carbapenemen. Eine Einschätzung, ob es sich bei den untersuchen Isolaten um AmpC- Bildner handelt, ist anhand rein phänotypischer Untersuchungen schwer. In vorliegender Untersuchung z.B. konnten wir keine Resistenz gegenüber Ampicillin im Mikrodilutionsverfahren feststellen, wohl aber liegen die ermittelten MIC-Werte in Studie 1 für Cefotaxim, einem Cephalosporin der dritten Generation, genau auf dem für Salmonella spp. etablierten ECOFF.

Cefotaxim dagegen eignet sich für den Nachweis von BlaCTX-M-Enzymen (BRONZWAER, 2008). Diese zählen zur Gruppe der ESBL-Enzyme. ESBL-Bildner sind resistent gegenüber den meisten β-Laktam Antibiotika, Cefotaxim sowie weiteren Cephalosporinen der dritten und vierten Generation, jedoch empfindlich gegenüber Cefoxitin.

Das Monitoring der Resistenz in Indikatorbakterien, wie fäkalen E. coli und Enterococcus spp. sowie pathogenen Erregern mit zoonotischem Potential (u.a. Salmonella spp. und Campylobacter spp.) kann einen wertvollen Hinweis auf nicht nur die klonale Resistenzausbreitung, sondern auch auf die Ausbreitung mittels horizontalem Gentransfer geben. Inwieweit es durch die Besiedelung des Hähnchens mit S. Java und einer nicht auszuschließenden Kontamination des Fleischs mit diesem Erreger zu einer Exposition des Verbrauchers mit diesem Erreger kommt, ist Gegenstand vielfältiger Diskussionen. In der Literatur sind diverse Erkrankungsfälle beim Menschen, bedingt durch verschiedene Expositionsquellen, wie z.B. durch importiertes Hähnchenfleisch, kontaminierten Ziegenkäse,

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oder aber Aquarien mit tropischen Fischen sowie kontaminierte Alfalfa-Sprossen beschrieben (BROWN et al., 2003; DESCENCLOS et al., 1996; GAULIN et al., 2002; STRATTON et al, 2001). Somit ist nicht nur Hähnchenfleisch allein von Bedeutung, denn weit mehr Erkrankungsfälle sind z.B. in Deutschland durch den Kontakt zu Reptilien beschrieben (TOBOLDT et al., 2012). Darüber hinaus ist zu bedenken, dass die an das Hähnchen angepassten Isolate kein O:5 Antigen exprimieren. Isolate mit diesem Antigen scheinen eine Reihe weiterer Virulenzfaktoren zu besitzen und können so vermutlich eine größere Zahl an unterschiedlichen Wirten, darunter den Menschen, infizieren (HUEHN et al., 2009).

3.4. Überlegungen zur Methodik der vorliegenden Arbeit

Die Kosten der in Studie 2 dargestellten Reinigungs- und Desinfektionsmaßnahmen in Verbindung mit der umfangreichen Beprobung beliefen sich auf ca. 25.000 Euro pro Stall, so dass die Landwirte ein großes Interesse hatten, keine erneuten Reinigungs- und Desinfektionsmaßnahmen, die sich bisher als am effektivsten zur Bekämpfung von S. Java herausgestellt haben, durchführen zu müssen. Verschiedene Präventionsmaßnahmen (vgl.

Abschnitt 3.2) wurden daher ergriffen, um eine Salmonelleneinschleppung zu verhindern.

Andererseits gilt es zu berücksichtigen, dass die hohen Kosten ein nicht zu vernachlässigender Grund für den geringen Studienumfang – nur drei Ställe auf zwei Farmen– sind, da nur wenige Landwirte bereit waren, diese Kosten zu tragen.

Zur Methodik der vorliegenden Arbeit ist weiterhin anzumerken, dass eine selektive Anreicherung dann durchgeführt wurde, wenn es um den qualitativen Nachweis von Salmonellen in der qPCR ging und die aus der nicht-selektiven Anreicherung extrahierte Probe in der qPCR zu einem inhibierten Ergebnis führte. SARLIN et al. (1998) hat die nicht-

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selektive und folgende selektive sowie die alleinige selektive Anreicherung auf ihr Vermögen, durch eine Chlorbehandlung subletal geschädigte Salmonellen nachweisen zu können, untersucht. Hier wurden zwar nur marginal, aber signifikant (p < 0,05) mehr Salmonellen mit nicht-selektiver gefolgt von selektiver Anreicherung detektiert. In Studie 2 haben wir gezeigt, dass bereits die nicht-selektive Anreicherung in der nachfolgenden qPCR verwendet werden konnte. Dies erlaubt eine weitere Zeiteinsparung von einem Tag, was insbesondere wichtig war, um ggf. den Reinigungs- und Desinfektionsprozess anpassen zu können. Dies resultierte aber teilweise in vermehrt inhibierten Proben, wie u.a. von PONTIROLI et al. (2011) für komplexe Matrizen wie Erdboden oder Faezes beschrieben. Hier erfolgte dann eine selektive Anreicherung mit nachfolgendem qPCR-Verfahren. Des Weiteren erfolgte keine semiquantitative Analyse der untersuchten Kontrollpunkte wie von WALES et al. (2006) beschrieben, wobei in genannter Studie semi-quantitative Untersuchungen und qualitative Untersuchungen ähnlich sensitiv waren. Aufgrund der höheren Kosten, verbunden mit einem nur marginalen Erkenntnisgewinn, wurde diese Untersuchung nicht durchgeführt.

In den durchgeführten direkten bakteriologischen Salmonella-Nachweisen in Studie 1 haben wir den Brilliant-Grün-Agar verwendet. In durchgeführten vergleichenden Voruntersuchungen mit weiteren Nährböden, die für den Salmonella-Nachweis geeignet sind, stellte sich der Brilliant-Grün-Agar für unsere Untersuchungen (Direktnachweis von Salmonellen aus Blinddarmkot von Masthähnchen) als am brauchbarsten dar. Die Begleitflora war am geringsten, so dass Salmonellen-verdächtige Kolonien gut detektiert werden konnten.

Brilliantgrün als selektives Agens inhibiert grampositive, einige coliforme und andere gramnegative Bakterien. Es gilt jedoch zu berücksichtigen, dass keine Hemmung von Proteus spp. und einigen Pseudomonas spp. erfolgt, die morphologisch Salmonella-Kolonien ähnlich

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sind, weswegen das serologische Screening einer Reihe von verdächtigen Kolonien nötig ist bzw. einige Kolonien möglicherweise falsch positiv als Salmonellen gewertet wurden.

Eine völlige Fehleinschätzung des bakteriellen Wachstums wurde jedoch dadurch ausgeschlossen, dass jede Kotprobe simultan mit der direkten bakteriologischen Untersuchung auch in der qPCR nach nicht-selektiver und selektiver Anreicherung zum Genomnachweis von Salmonella spp. untersucht wurde.

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ZUSAMMENFASSUNG

21 4 Zusammenfassung

Franziska Kloska

Infektionsdynamik von Salmonella Paratyphi B d-Tartrat+ im Masthähnchenbestand sowie deren Bekämpfung in der Primärproduktion

S. Java ist das d-Tartrat fermentierende Biovar des Serovars S. Paratyphi B. Es kommt in der Masthähnchenhaltung in Deutschland und den Niederlanden vor und spielt hier eine zunehmende Rolle. Im Falle humaner Erkrankungen ruft das Hähnchen-assoziierte Serovar eine milde Gastroenteritis hervor. Bedeutsam ist es daher aufgrund seiner antimikrobiellen Multiresistenz und seiner möglichen Bedeutung für die öffentliche Gesundheit. S. Java persistiert nach einmaliger Infektion gut in der Umgebung des Hähnchenstalls und führt so zur folgenden Infektion der neu eingestallten Küken. Auch der wirtschaftliche Schaden dieses Serovars ist nicht zu vernachlässigen.

In dieser Dissertation wurde die Infektionsdynamik von S. Java im Masthähnchenbestand unter konventionellen Mastbedingungen in drei aufeinanderfolgenden Mastdurchgängen von Juni bis November aufgezeigt. Zum Einen erfolgte der Nachweis der Einstallung salmonellenfreier Eintagsküken sowie die Bestätigung der Infektion mit S. Java der Masthähnchen bereits im Alter von fünf bis sieben Tagen (Zeitpunkt 1). Quantitative Analysen zur Bestimmung von S. Java in KbE/g Zäkuminhalt sowie Untersuchung des Zäkuminhalts in der qPCR zur qualitativen Analyse wurden zu folgenden Zeitpunkten durchgeführt: Zeitpunkt 3 (Tag 11-15), Zeitpunkt 4 (Tag 25-28), Zeitpunkt 5 (Tag 38-40).

Sowohl in der quantitativen als auch der qualitativen Analyse sind zum Zeitpunkt 4 im

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ZUSAMMENFASSUNG

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Vergleich zu den Zeitpunkten 3 und 5 signifikant (p < 0,05) mehr Tiere mit zudem höheren Gehalten an S. Java infiziert. Insofern sind die Tiere zum Zeitpunkt des Vorfangens stärker belastet als zum Hauptfang mit ca. 40 Masttagen. Außerdem werden diese jüngeren Tiere in der Regel als Frischgeflügel vermarktet, was die Exposition des Verbrauchers mit S. Java aufgrund mangelnder Küchenhygiene erhöhen kann.

Der Nachweis antimikrobieller Resistenz gelang gegen die Wirkstoffe CIP, NAL, TET, TMP und FOX. Daher sind die getesteten Isolate multiresistent. Die Rolle für die öffentliche Gesundheit, sowohl durch das Hervorrufen von Krankheitsfällen, als auch durch die Übertragung von Resistenzgenen auf kommensale und/oder pathogene Bakterien sollte Gegenstand weiterer Studien sein.

Des Weiteren wurde in vorliegender Dissertation eine risikoorientierte Hygieneanalyse von persistent mit S. Java besiedelten Ställen vor, während und nach Reinigung und Desinfektion erarbeitet. Durch die effiziente und zeitsparende Untersuchung der Wisch- und Tupferproben, die an festgelegten Stellen im Stall sowie dessen Umgebung entnommen wurden mittels qPCR wurde rasch der aktuelle Infektionsstatus des Stalls ermittelt. Dies ermöglichte eine zeitnahe Anpassung im Reinigungs- und Desinfektionsprozess. Die untersuchten Ställe waren nach zweimaliger Desinfektion frei von S. Java. Alle folgenden Mastdurchgänge wiesen keine Salmonelleninfektion auf.

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SUMMARY

23 5 Summary

Franziska Kloska

Infection Dynamics of Salmonella Paratyphi B d-tartrate+ in Broilers and its Control in the Primary Production

S. Java is the d-tartrate-fermenting biovar of the serovar S. Paratyphi B. It occurs in chicken rearing farms in Germany and the Netherlands and plays an increasing role. In the case of human diseases, the chicken-associated serovar causes mild gastroenteritis. It is important because of its antimicrobial multiresistance and its potential impact on public health. S. Java persists in the environment of chicken housings and thus leads to following infection of the newly housed chickens. The economic damage of this serovar cannot be neglected as well.

In this dissertation, the infection dynamics of S. Java were demonstrated in broilers kept under conventional rearing conditions in three successive rearing periods from June until November.

On the one hand, Salmonella-free day-old chicks were confirmed but infection with S. Java of the broilers occurred at the age of five to seven days (time-point 1). Quantitative analyses for the determination of S. Java CFU/g caecal content as well as further investigation of the caecal content in the qPCR for qualitative analysis were carried out at the following times:

time-point 3 (day 11-15), time-point 4 (day 25-28), time-point 5 (day 38-40). Both, quantitative and qualitative analyses revealed that statistically significant (p <0.05) more animals were tested positive at time-point 4 having a higher load of S. Java CFU/g caecal content compared to time-points 3 and 5. In this respect, the animals carry more S. Java CFU/g caecal content at prethinning than at final slaughter at about 40 days of age. In

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SUMMARY

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addition, these younger animals are usually marketed as fresh poultry, which may increase the exposure of the consumer to S. Java due to a lack of kitchen hygiene.

Detection of antimicrobial resistance was possible against the following antimicrobials: CIP, NAL, TET, TMP and FOX. Therefore, the tested isolates are multiresistant. The role for public health, on the one hand by evoking human illness, as well as by the transfer of resistance genes to commensal and/or pathogenic bacteria, should be subject of further studies.

Furthermore, a risk-oriented hygiene analysis of persistently infected barns with S. Java was developed before, during and after cleaning and disinfection of broiler housings. By the efficient and time-saving examination of the swabs, which were taken at fixed points in the barn as well as their surroundings, qPCR quickly determined the current infection status of the barns, which allows a quick adjustment in the cleaning and disinfecting process. The housings to be tested were free of S. Java after two disinfection steps. All subsequent rearing periods had no Salmonella infection.

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DANKSAGUNG

36 7 Danksagung

Ich danke meinem Arbeitgeber, der Tierarztpraxis WEK in Visbek, sowie Professor Klein für die Überlassung des interessanten und in der Geflügelpraxis aktuellen, oft diskutierten Themas sowie die gute Betreuung und konstruktive Kritik der Dissertation. Meinem Arbeitgeber sei zudem dafür gedankt, dass ich die Arbeit in Verbindung mit der Tätigkeit in der Geflügelpraxis anfertigen konnte. Herrn Prof. Klein danke ich insbesondere dafür, dass er trotz seiner Erkrankung immer ein offenes Ohr für mich gehabt hat und mir bis zuletzt mit Rat zur Seite stand.

Herrn PD Dr. Carsten Krischek danke ich für die problemlose Übernahme der Betreuung der Dissertation und die freundliche und unkomplizierte Hilfestellung!

Zudem danke ich Herrn Dr. Martin Beyerbach für die zeitnahe und schnelle Unterstützung bei der statischen Auswertung sowie für die vielen hilfreichen Telefonate.

Frau Frances Sherwood-Brocks danke ich für die zügigen englischen Korrekturen der Manuskripte.

Meinen Kollegen danke ich für die angenehme Arbeitsatmosphäre, die lustigen Diskussionen am Morgen sowie für die Unterstützung bei der Fertigstellung dieser Arbeit. Die täglichen Telefonate vermisse ich!

Den Mitarbeitern aus dem Labor WEK danke ich für die allzeit gewährte exzellente und natürlich auch humorvolle Unterstützung bei der Analyse der Proben im Labor.

Den beteiligten Landwirten danke ich für die Teilnahme an den durchgeführten Studien und die offene, interessierte und herzliche Unterstützung meiner Arbeit.

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DANKSAGUNG

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Ich danke meinen Freunden, dass sie immer ein offenes Ohr für mich hatten und mich in Zeiten, in denen es nicht so voran ging wie gewünscht, aufmunterten. Schön, dass es euch gibt und ihr an die Fertigstellung dieser Arbeit geglaubt habt!

Christof danke ich dafür, dass er immer die Ruhe bewahrt hat und ganz unaufgeregt und schier unerschütterlich an mich geglaubt hat. Meiner Mutter und Christof danke ich für die geduldige Korrektur der Dissertation.

Meinen Eltern danke ich für die fortwährende Unterstützung auf meinem Lebensweg und meinem Vater insbesondere dafür, dass er für jede Lebenslage den passenden Spruch parat hat. Lehrjahre sind nun einmal keine Herrenjahre!