Inaktivierung von Coxiella burnetii bei der Kurzzeiterhitzung von Milch

Tierärztliche Hochschule Hannover

Inaktivierung von Coxiella burnetii bei der Kurzzeiterhitzung von Milch

INAUGURAL – DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften

- Doctor rerum naturalium - (Dr. rer. nat)

vorgelegt von Marcel Wittwer

Ilmenau

Hannover 2020

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Peter Valentin-Weigand Institut für Mikrobiologie,

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover apl. Prof. Dr. Martin Runge

Lebensmittel- und Veterinärinstitut Braunschweig/Hannover,

Niedersächsisches Landesamt für

Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, Hannover

Dr. Klaus Henning

Institut für bakterielle Infektionen und Zoonosen, Friedrich-Loeffler-Institut, Jena

Fachwissenschaftliche Unterstützung: Dr. Katja Mertens-Scholz

Institut für bakterielle Infektionen und Zoonosen, Friedrich-Loeffler-Institut, Jena

1. Gutachten: Prof. Dr. Peter Valentin-Weigand

apl. Prof. Dr. Martin Runge Dr. Klaus Henning

2. Gutachten: Prof. Dr. Andreas Klos

Tag der mündlichen Prüfung: 30.11.2020

I Inhaltsverzeichnis

I. Abkürzungsverzeichnis ... V II. Zusammenfassung ... VII III.Summary ... VIII

1 Einleitung ... 1

Coxiella burnetii – Erreger der Zoonose Q-Fieber 1.1 Historischer Überblick ... 1

1.2 Pathogenese und epidemiologische Verbreitung ... 2

1.2.1 Wirtsspektrum und Infektionsrouten ... 2

1.2.2 Krankheitsverlauf bei Mensch und Tier ... 2

1.2.3 Epidemiologie ... 3

1.3 Bakteriologie ... 4

1.3.1 Morphologie und Klassifizierung ... 4

1.3.2 Genomische Eigenschaften und Genotypisierung ... 5

1.3.3 Morphologischer Entwicklungszyklus ... 6

1.3.4 Virulenzfaktoren und Phasenvariabilität ... 6

1.4 Infektionszyklus ... 7

1.4.1 Invasion immunkompetenter Wirtszellen ... 7

1.4.2 Intrazelluläre Replikation ... 8

1.4.3 Resistenz gegenüber intrazellulärem Stress ... 9

1.5 Kultivierung ... 9

1.5.1 Zellkultur ... 9

1.5.2 Embryoniertes Hühnerei ... 10

1.5.3 Axenisches Medium ... 10

1.6 Biologische Sicherheitseinstufung ... 11

Coxiella burnetii – Internationaler Standard für die Pasteurisierung von Milch 1.7 Geschichte der Milchpasteurisierung ... 11

1.7.1 Anfängliche Studien – Pasteur und andere Pioniere (1824 - 1900) ... 11

1.7.2 Mycobacterium tuberculosis – erster Referenzorganismus (1900 - 1933) ... 12

1.7.3 Coxiella burnetii – neuer Standard der Milchpasteurisierung (1930er Jahre) ... 13

II

1.8 Coxiellen und Milch – aktueller Stand der Wissenschaft ... 14

1.8.1 Gesetzliche Vorschriften der Milchpasteurisierung ... 14

1.8.2 Beurteilung eines 60 Jahre alten Standards auf Basis neuer Erkenntnisse ... 15

1.9 Zielsetzung ... 16

2 Material ... 18

2.1 Chemikalien und Reagenzien ... 18

2.2 Medien und Puffer ... 20

2.3 C. burnetii-Isolate ... 23

2.4 Zelllinien ... 23

2.5 Oligonukleotide ... 24

3 Methoden ... 26

3.1 Zellbiologische Methoden ... 26

3.1.1 Zellkultur und Passage ... 26

3.1.2 Zellzahlbestimmung mittels Neubauerzählkammer ... 26

3.2 Mikrobiologische Methoden ... 26

3.2.1 Übersicht der Kultivierungsmethoden von C. burnetii ... 26

3.2.2 Kultivierung von C. burnetii mittels Zellkultur ... 27

3.2.3 Isolierung von C. burnetii aus Zellkultur mittels Nadelaspiration ... 28

3.2.4 Kryokonservierung infizierter Zellkulturen ... 28

3.2.5 Zellfreie Kultivierung von C. burnetii ... 29

3.2.6 Herstellung von „SCV-angereicherten“ Kulturen mittels Zellkultur ... 30

3.2.7 Herstellung von „SCV-angereicherten“ Kulturen mittels axenischem Medium ... 30

3.2.8 Trocknung von „SCV-angereicherten“ C. burnetii-Kulturen ... 30

3.2.9 Erstellung von Wachstumskurven von C. burnetii in ACCM-2 ... 31

3.2.10 Morphologische Differenzierung von C. burnetii in ACCM-2 ... 31

3.2.11 Viabilitätsnachweis der hitzebehandelten Proben mittels KbE-Bestimmung ... 32

3.2.12 Viabilitätsnachweis der hitzebehandelten Proben mittels Wachstums in ACCM-2 ... 33

3.2.13 Viabilitätsnachweis der hitzebehandelten Proben mittels embryonierten Hühnereiern ... 33

3.2.14 Viabilitätsnachweis der hitzebehandelten Proben mittels Viabilitäts-PCR (vPCR) . 34 3.2.15 Wachstum von C. burnetii unter Stressbedingungen ... 35

III

3.2.16 Genexpression bei unterschiedlichem pH-Wert ... 36

3.3 Molekularbiologische Methoden ... 37

3.3.1 DNA-Isolierung ... 37

3.3.2 Quantifizierung von C. burnetii mittels Real-Time PCR (qPCR) ... 38

3.3.3 RNA-Isolierung ... 39

3.3.4 DNase-Behandlung ... 39

3.3.5 Messung des RNA-Gehaltes ... 40

3.3.6 Reverse Transkription ... 40

3.3.7 Bestimmung der relativen Genexpression mittels (SYBR Green) Real-Time PCR ... 41

3.3.8 Agarose-Gelelektrophorese ... 42

3.4 Technische / physikalische Methoden ... 42

3.4.1 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ... 42

3.4.2 Hitzebehandlung von C. burnetii-Isolaten ... 43

3.5 Statistische Auswertungen und Verfahren ... 46

3.5.1 Untersuchung auf Normalverteilung ... 46

3.5.2 Berechnung der Signifikanz ... 47

3.5.3 Berechnung der D- und z-Werte ... 47

3.5.4 Ermittlung von statistischen Ausreißern ... 48

4 Ergebnisse ... 50

4.1 Verifizierung der Spezifität ausgewählter Oligonukleotide ... 50

4.2 Charakterisierung unterschiedlich kultivierter C. burnetii Nine Mile Phase II-Kulturen ... 51

4.3 Eignung der Nachweismethoden unter Zuhilfenahme des hitzebehandelten NMII-Stammes ... 56

4.4 Breakpoint-Vergleich von in Zellkultur und ACCM-2 gewachsenen NMII-Kulturen unterschiedlicher Zellformzusammensetzung nach Hitzebehandlung ... 61

4.5 Wachstum der C. burnetii-Isolate in ACCM-2 ... 64

4.6 Bestimmung des Breakpoints der C. burnetii-Feldisolate ... 66

4.7 Hitzebehandlung von drei ausgewählten Feldisolaten im Bereich ihres Breakpoints ... 76

4.8 Berechnung der D- und z-Werte der C. burnetii-Isolate M, WDK299 und WDK1188 .. 83

4.9 Ermittlung der Differenzierungszeitpunkte ... 86

IV

4.10 Wachstumsverhalten des NMII-Stammes unter verschiedenen Stressbedingungen . 87

4.11 Genexpression des NMII-Stammes bei unterschiedlichem pH-Wert ... 89

5 Diskussion ... 93

5.1 Ergebnisse der Lebendbestimmung hitzebehandelter Proben auf Basis umfangreich getesteter Nachweismethoden ... 93

5.2 Vergleichende Untersuchung von in Zellkultur und axenischem Medium gewachsenen C. burnetii-Isolaten ... 95

5.3 Neubewertung der gesetzlichen Pasteurisierungsvorschriften auf Basis eines „Worst-case“-Versuchsaufbaus ... 102

5.4 Genexpression der C. burnetii-Zellformen bei pH-induziertem Stress ... 106

5.5 Ausblick ... 116

6 Literaturverzeichnis ... 117

7 Anhang ... 131

8 Danksagung ... 152

9 Förderung ... 153

V I. Abkürzungsverzeichnis

ACCM-2 „acidified citrate cysteine medium-2“ (Angesäuertes Citrat Cystein Medium-2) BGM „buffalo green monkey“ (Nierenzelllinie aus der Grünen Meerkatze)

bp Basenpaar

BSL „biosafety level“ (Biologische Schutzstufe)

CCM „complex Coxiella medium“ (komplexes Coxiellen-Medium) CCV „Coxiella-containing vacuole“ (Coxiellen-enthaltende Vakuole) CHO Ovarien-Fibroblasten-Zelllinie aus Hamstern

dNTP Desoxynukleosidtriphosphat EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EEA1 „early endosome antigen 1“ (frühes endosomales Markerprotein 1) FKS Fetales Kälberserum

GE Genomische Einheiten HCl Hydrogenchlorid, „Salzsäure“

HEL humane Lungen-Fibroblasten-Zelllinie HeLa humane Cervixepithel-Zelllinie

HTST „high-temperature short-time” (Kurzzeiterhitzung) IAP Integrin-assoziiertes Protein

icd Gen der Isocitrat-Dehydrogenase KbE koloniebildende Einheit

L-929 Murine Fibroblasten-Zelllinie

LAMP Lysosom-assoziiertes Membranglykoprotein

LCV „large cell variant“ (metabolisch aktive C. burnetii-Zellform) LPS Lipopolysaccharid

MEM Minimum Essential Medium

MLVA „multiple loci VNTR analysis“ (VNTR-Analyse multipler Genloci) MOI „multiplicity of infection“ (Infektionsmultiplizität)

NMII Coxiella burnetii Nine Mile Phase II (RSA 439)

PBS „phosphate-buffered saline” (Phosphatgepufferte Salzlösung) PCR „polymerase chain reaction” (Polymerase-Kettenreaktion) PMA Propidiummonoazid

VI

RFLP Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus

ROX Rhodamin-X

rpm „revolutions per minute“ (Umdrehungen pro Minute) RPMI Roswell Park Memorial Institute

RT Raumtemperatur

SCV „small cell variant” (sporenähnliche C. burnetii-Zellform) SDS-PAGE “sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis”

(Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese) T4SS Typ-IV Sekretionssystem

TBE TRIS-Borat-EDTA

TEM Transmissionselektronenmikroskopie TLR Toll-like Rezeptor

TRIS Tris(hydroxymethyl)aminomethan UHT-Milch ultrahochtemperierte Milch

Vero Nierenepithel-Zelllinie aus der Grünen Meerkatze VNTR „variable number tandem repeat” (variable Anzahl von

Tandemsequenzwiederholungen)

VII Name: Marcel Wittwer

Titel: Inaktivierung von Coxiella burnetii bei der Kurzzeiterhitzung von Milch II. Zusammenfassung

Bei Coxiella (C.) burnetii, dem zoonotischen Erreger des Q-Fiebers, handelt es sich um ein gramnegatives, obligat intrazelluläres Bakterium mit bi-phasischem Entwicklungszyklus. Der Erreger besitzt eine hohe Resistenz gegenüber zahlreichen intra- und extrazellulären Einflüssen und wird bei Wiederkäuern im Zuge eines meist asymptomatischen Krankheitsverlaufes unter anderem in großer Anzahl über die Milch ausgeschieden. Vor dem Verzehr von Milchprodukten ist es aus verbraucherschutzrechtlichen Gründen dementsprechend erforderlich, dass C. burnetii sowie andere in Rohmilch enthaltene Lebensmittelpathogene ausreichend inaktiviert werden. Die gesetzlichen Vorgaben für die Kurz- (72 °C, 15 s) und Langzeiterhitzung (63 °C, 30 min) von Milchprodukten basieren auf Richtlinien des Codex Alimentarius. Dieser gibt vor, dass C. burnetii als hitzeresistentestes, pathogenes Bakterium in Milch während der Pasteurisierung um mindestens 5 log-Stufen reduziert werden muss. Die zugehörigen Inaktivierungsdaten beruhen jedoch auf über 60 Jahre alten Versuchsreihen. Technologische Weiterentwicklungen moderner Pasteurisie- rungsanlagen sowie neueste wissenschaftliche Erkenntnisse lassen vermuten, dass C. burnetii während der Pasteurisierung möglicherweise stärker inaktiviert wird als im Codex Alimentarius vorgeschrieben. In der vorliegenden Dissertation wurde ultrahochtemperierte Milch mit sechs unterschiedlichen C. burnetii-Feldisolaten inokuliert, diese in einer Pilot- Anlage hitzebehandelt und die dazugehörigen kinetischen Inaktivierungsdaten ermittelt.

Unter Berücksichtigung der vorgeschriebenen 5 log-Stufen-Reduktion des Erregers wurde hierbei sowohl die Wirksamkeit der gesetzlichen Vorschriften bestätigt, als auch ein Potential zur Reduzierung der Pasteurisierungstemperatur um 1 – 2 °C festgestellt. In parallelen Versuchsreihen wurde zudem eine hohe Toleranz von C. burnetii gegenüber unterschiedlichen pH-Werten und Salinitäten ermittelt und darüber hinaus die Zellform- sowie pH-Wert- abhängige Genexpression des Erregers untersucht. Die gewonnenen Daten deuteten darauf hin, dass sich die sporenähnliche Dauerform bei zu niedrigen pH-Werten nicht in die metabolisch aktive Zellform differenziert, obwohl der Erreger seine metabolische Aktivität unter diesen Umständen aufrechterhalten könnte.

VIII Name: Marcel Wittwer

Title: Inactivation of Coxiella burnetii during high-temperature short-time treatment of milk III. Summary

Coxiella (C.) burnetii is a gram-negative, obligate intracellular bacterium with a biphasic developmental cycle and the causative organism of the zoonosis Q fever. The pathogen is resistant towards various intra- and extracellular stressors and known for its asymptomatic aetiopathology in ruminants. Especially cattle, but also sheep and goats can shed the organism amongst others in their milk. Prior to the consumption of milk products and in the terms of consumer protection guidelines, the proper inactivation of C. burnetii, as well as other milk- borne pathogens, is necessary. The legal regulations for the high-temperature short-time (HTST) pasteurization (72 °C, 15 s) and holding method (63 °C, 30 min) are based on recommendations of the Codex Alimentarius. As stated there, C. burnetii, as the most heat- resistant pathogen in milk, has to be reduced of at least 5 log-steps during the pasteurization process. However, the corresponding inactivation data for C. burnetii originate from experimental series performed over more than 60 years ago. The technological progress of modern pasteurization plants, as well as current scientific findings, lead to the assumption that C. burnetii is potentially more intensely inactivated during pasteurization than stated in the Codex Alimentarius. In the present doctoral thesis, ultra-heat treated milk was inoculated with six different C. burnetii field isolates. The samples were heat-treated in a pilot plant and their corresponding kinetic inactivation data calculated. Considering the required 5 log-step reduction of the pathogen, the effectiveness of the legal regulations was confirmed and a potential 1 – 2 °C reduction of the pasteurization temperature detected. The high tolerance of C. burnetii against different pH values and salinity concentrations was determined in parallel performed experiments. Additionally, the cell form- and pH-dependent gene expression of the pathogen was investigated. Referring to this it could be assumed that the differentiation of the spore-like cell form to the metabolic active cell variant was inhibited at low pH-values, even though the ability of C. burnetii to maintain its metabolic activity under these conditions was determined.

1 1 Einleitung

Coxiella burnetii – Erreger der Zoonose Q-Fieber

1.1 Historischer Überblick

Coxiella (C.) burnetii, der Erreger der Zoonose Q-Fieber, wurde in den 1930ern sowohl in Queensland (Australien, (41)) als auch Montana (USA, (39)) zeitgleich entdeckt. Der Begriff des Q-Fiebers wurde von Edward Derrick geprägt, welcher im Jahr 1935 periodisch auftretende Fieberausbrüche unter den Arbeitern eines Schlachthofes in Brisbane (Australien) untersuchte. Die dort auftretenden Symptome konnten keiner damals bekannten Krankheit zugeordnet werden, weswegen Derrick diese als Q-Fieber bezeichnete („query“, „Frage- zeichen“). Derrick war es nicht möglich den unbekannten Erreger zu isolieren und klassifizierte ihn fälschlicherweise als Virus (42). Um den Q-Fieber-Erreger intensiver zu analysieren, sandte er entsprechendes Probenmaterial an Frank Macfarlane Burnet und Mavis Freeman. Diese reproduzierten den Erreger unter anderem in Meerschweinchen und Mäusen und sprachen dem vermeintlichen Virus letztendlich Rickettsien-ähnliche Eigenschaften zu (26).

Zur gleichen Zeit wurde C. burnetii in den USA von Gordon Davis isoliert. Dieser untersuchte Dermacentor (D.) andersoni-Zecken, welche den Vektor des Rocky-Mountain-Fleckfiebers darstellten. Einige der Meerschweinchen, die zur Fütterung der Zecken dienten, entwickelten jedoch dem Rocky-Mountain-Fleckfieber untypische Symptome (39). Ohne Kenntnisse der Arbeit von Burnet und Freeman zu haben, wurde unter Mitwirkung von Herald Rea Cox nachgewiesen, dass der unbekannte, isolierte Erreger filtrierbar war und Eigenschaften sowohl von Viren als auch Rickettsien aufwies (37, 39). Schließlich konnte die Verbindung beider Fälle im Jahr 1938 von Rolla Eugene Dyer nachgewiesen werden (47).

Zur Würdigung der Arbeiten von Burnet und Cox wurde der anfänglich als Rickettsia burnetii bezeichnete Erreger im Jahr 1938 in Coxiella burnetii umbenannt (112). Der aus D. andersoni- Zecken isolierte C. burnetii-Stamm dient noch heute als Referenzstamm. Aufgrund der Tatsache, dass die Zecken beim Nine Mile Creek gesammelt wurden, wird dieser auch als Nine Mile (NM)-Stamm bezeichnet.

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1.2 Pathogenese und epidemiologische Verbreitung

1.2.1 Wirtsspektrum und Infektionsrouten

Als zoonotischer Erreger des Q-Fiebers besitzt C. burnetii ein ausgeprägtes Wirtsspektrum, welches fast das gesamte Tierreich beinhaltet (7). Das größte Infektionsrisiko für den Menschen stellen hierbei vor allem mit Coxiellen infizierte Wiederkäuer wie Rinder, Ziegen und Schafe dar, welche als Hauptreservoir gelten (8, 111, 139). Betroffene Tiere können den Erreger in großer Anzahl über ihre Geburtsprodukte (6, 19), Vaginalausscheidungen (17), Kot und Urin (61, 112) sowie über ihre Milch (149) ausscheiden. Ein Milliliter Milch kann beispielsweise über 1 x 10⁵ Coxiellen enthalten (44), ein Gramm (Schafs)-Plazenta sogar mehr als 1 x 10⁹ (180).

Die Inhalation kontaminierter Aerosole, ausgehend von den organischen Ausscheidungen infizierter Tiere, wird als Hauptinfektionsroute aufgefasst (123, 163, 181). Bereits die respiratorische Aufnahme von etwa zehn Coxiellen kann ausreichen, um beim Menschen eine Infektion auszulösen (162). Entsprechende Windverhältnisse und klimatische Faktoren wie Trockenheit vorausgesetzt, können diese infektiösen Partikel mehrere Kilometer weit transportiert werden (69, 122) und besitzen zudem eine hohe Resistenz gegenüber Umwelteinflüssen (93).

Verglichen mit der Inhalation kontaminierter Aerosole wird das Infektionsrisiko bei der oralen Aufnahme des Pathogens, beispielsweise durch den Konsum von C. burnetii-kontaminierter Rohmilch, als geringer betrachtet (110). Tatsächlich kann die Aufnahme kontaminierter Rohmilch in betroffenen Personen eine Serokonversion auslösen infolgedessen C. burnetii- spezifische Antikörper gebildet werden (14, 53). Das Risiko einer Infektion durch die orale Auf- nahme von C. burnetii wird jedoch nach wie vor diskutiert (30).

1.2.2 Krankheitsverlauf bei Mensch und Tier

Q-Fieber manifestiert sich bei Mensch und Tier in unterschiedlichen Ausprägungen, wobei beim Menschen zusätzlich zwischen einem akuten und einem chronischen Verlauf unter- schieden wird.

Während etwa 60 % der akuten Q-Fieber-Fälle beim Menschen asymptomatisch verlaufen, manifestiert sich die Infektion bei den verbleibenden 40 % oft als selbstlimitierende, Grippe-

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ähnliche Krankheit (112). Zu den häufigsten Symptomen zählen hierbei die einer atypischen Pneumonie, verbunden mit starken Kopfschmerzen sowie Hepatitis (42, 112, 164). Bei etwa 1 – 5 % der primär infizierten Patienten manifestiert sich Q-Fieber als chronische Krankheit (138). Schwangere, Patienten in einem Alter von über 40 Jahren sowie solche mit einem Herzklappenfehler weisen eine vergleichsweise stärkere Prädisposition für den chronischen Krankheitsverlauf auf (116, 132). Besonders bei Letzteren stellt eine Endokarditis das mit Abstand häufigste Krankheitssymptom dar (65, 156, 169). In seltenen Fällen kann sich aus der akuten Erkrankung das chronische Erschöpfungssyndrom entwickeln, welches die zweite längerfristige Manifestation des Q-Fiebers darstellt (109, 138). Typische Symptome sind hierbei anhaltende Erschöpfung sowie Gelenk- und Muskelschmerzen (109).

Mit Coxiellen infizierte Tiere zeigen in den meisten Fällen keine Krankheitssymptome (112, 129). Klinische Manifestationen des Q-Fiebers werden primär bei trächtigen Tieren nach- gewiesen, wobei tierartspezifische Unterschiede bezüglich der jeweiligen Ausprägungen der Symptome existieren. Bei kleineren Wiederkäuern, wie Schafen und Ziegen, treten Fehl- und Totgeburten vergleichsweise häufiger auf als bei Rindern (16, 18, 137). Letztere durchlaufen in der Regel einen harmloseren Krankheitsverlauf, welcher primär durch Metritis und Mastitis gekennzeichnet ist (9, 137). Neben der massiven Exkretion von Coxiellen während des Geburtsvorganges, können infizierte Wiederkäuer den Erreger auch mehrere Wochen über ihre Milch, Fäkalien und Vaginalausscheidungen ausscheiden. Während Letzteres die primäre Sekretionsroute bei Schafen darstellt, scheiden Rinder und Ziegen den Erreger vergleichsweise häufiger über ihre Milch aus (5, 17, 61, 136, 141).

1.2.3 Epidemiologie

In entsprechenden epidemiologischen Studien wurde nachgewiesen, dass C. burnetii weltweit verbreitet ist (112, 129). Lediglich Neuseeland scheint eine Ausnahme darzustellen und frei von Q-Fieber zu sein (78). Der prozentuale Anteil C. burnetii-positiv getesteter Tiere unterscheidet sich hierbei in den einzelnen Ländern in Abhängigkeit zur Nachweismethode sowie der untersuchten Tierart und -anzahl naturgemäß sehr stark. Die Gegenüberstellung vergleichbarer Studien zeigt jedoch, dass sich dies bei einer länderübergreifenden Auswertung relativiert. Serologische Untersuchungsdaten von Wiederkäuern ergaben beispielsweise, dass der Anteil C. burnetii-positiv getesteter Tiere in Europa (0,8 – 79,6 %; x̅ = 15 %), Asien (0,65 – 65,8 %; x̅ = 22,2 %), Afrika (4 – 59,8 %; x̅ = 21,4 %) und Amerika (1,2 – 60,6 %; x̅ = 22 %)

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ähnlich ist (129). Lediglich in Ozeanien wurden bedeutend geringere C. burnetii-positive Tiere (0 – 0,6 %; x̅ = 0,3 %) nachgewiesen, wobei hier jedoch eine vergleichsweise kleinere Studien- anzahl vorliegt (129).

Im Zeitraum zwischen 1947 und 1999 wurden insgesamt 40 humane Q-Fieber-Ausbrüche in Deutschland dokumentiert, wobei sich die jährliche Anzahl von betroffenen Personen ab 1990 stetig erhöhte (74). Obwohl dies teilweise auf verbesserte klinische Nachweismethoden und ein verstärktes Bewusstsein für den Erreger zurückzuführen ist, gehen die Autoren der entsprechenden Studie dennoch von einer gesteigerten Q-Fieber-Fallzahl aus (74). Die Anzahl der jährlichen humanen Ausbrüche (2 – 21; x̅ = 7,9) sowie zugehöriger Einzelfälle (82 – 416, x̅ = 237,4) schwankt zwischen 2001 und 2018 zwar recht stark, deutet insgesamt jedoch nicht auf einen steigenden Trend hin (86). Ein Großteil der in Deutschland dokumentierten, humanen Q-Fieber-Ausbrüche konnte infizierten Schafen bzw. Schafherden zugeordnet werden (59, 130), was in entsprechenden Prävalenzstudien resultierte. Hierbei wurde festgestellt, dass die Anzahl C. burnetii-positiver Schafherden, je nach Nachweismethode, zwischen 26 – 36,6 % (ELISA) bzw. 5 – 13,9 % (PCR) variierte (77, 185).

1.3 Bakteriologie

1.3.1 Morphologie und Klassifizierung

C. burnetii ist ein stäbchenförmiges, obligat intrazelluläres, gramnegatives Bakterium mit einer Länge von ca. 0,4 – 1 µm (45, 112). Aufgrund ähnlicher Eigenschaften wurde der Erreger ursprünglich der Gattung der Rickettsia (Alphaproteobakterien) zugeordnet (179). Spätere Analysen auf Basis der 16S rRNA widerlegten dies jedoch und klassifizierten C. burnetii als ein Gammaproteobakterium (157, 178, 184). Innerhalb der Gattung Coxiella (Familie Coxiellaceae, Ordnung Legionellales) stellt C. burnetii die einzige anerkannte Spezies dar.

Obwohl vermutet wird, dass es sich bei C. cheraxi ebenfalls um einen Vertreter der Gattung Coxiella handelt, konnte dies aufgrund fehlender Genominformationen bisher nicht eindeutig belegt werden (49, 150, 160).

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1.3.2 Genomische Eigenschaften und Genotypisierung

Das Genom des virulenten C. burnetii NM-Referenzstammes wurde im Jahr 2003 sequenziert und umfasst 1.995.275 Basenpaare (bp) (151). Die Genomlänge weiterer, bisher sequenzierter C. burnetii-Isolate variiert zwischen 1,9 – 2,2 Mbp (12, 102, 173, 177). Zusätzlich trägt jedes C. burnetii-Isolat ein extrachromosomales Plasmid. Von diesen wurden bisher vier unter- schiedliche, namentlich QpH1 (37 kbp), QpRS (39 kbp), QpDG (54 kbp) sowie QpDV (32 kbp), identifiziert (76, 138, 142, 143, 170). Eine Ausnahme stellt das Isolat „Scurry Q217“ dar, bei welchem Sequenzen des QpH1-Plasmides integriert im Chromosom nachgewiesen wurden (183).

Zur genaueren Identifizierung sowie der damit einhergehenden, epidemiologischen Beurteilung wurden die unterschiedlichen C. burnetii-Isolate auf Basis verschiedener molekularer Analysemethoden genotypisiert. Erste Klassifizierungen in den 1980ern basierten auf der Plasmid- und Lipopolysaccharid (LPS)-Variation von C. burnetii (63, 143). Anhand dieser Versuche wurde der Erreger in mindestens drei unterschiedliche Gruppen unterteilt, in denen die entsprechenden C. burnetii-Isolate jeweils einen ähnlichen Krankheitsverlauf beim Menschen aufwiesen (76, 143). In späteren Untersuchungen erfolgte die Einteilung hauptsächlich auf Basis von Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)-Analysen.

Hierbei wurde der Erreger in anfänglich vier Gruppen eingeteilt (174). In den 1990er Jahren wurde diese Einteilung durch die Nutzung unterschiedlicher Restriktionsenzyme stetig auf bis zu 20 Restriktionsgruppen erweitert (76, 88, 161). Auf Grundlage von Fortschritten bei der Sequenzierung wurde im Jahr 2006 eine vielversprechendere Methode zur Genotypisierung von C. burnetii etabliert. Diese beruht auf der Analyse variabler Sequenzwiederholungen („variable number tandem repeat“ (VNTR)) unterschiedlicher Genloci („multiple loci VNTR analysis“ (MLVA)). In der entsprechenden Studie wurden 21 unterschiedliche C. burnetii- Isolate mittels MLVA untersucht und diese letztendlich in fünf Genotypen, bestehend aus neun unterschiedlichen MLVA-Mustern, eingeteilt (159). Diese Gruppierung wurde im Jahr 2012, im Zuge einer MLVA-Untersuchung von insgesamt 103 C. burnetii-Isolaten, neu definiert. Der Erreger umfasste nun 41 unterschiedliche Genotypen, welche in vier genomische Gruppen (I - IV) zusammengefasst wurden (89). Innerhalb dieser vier Gruppen wiesen die entsprechenden Isolate ähnliche Eigenschaften bezüglich ihres Plasmids (Gruppe I, II, IV: ausschließlich QpH1; Gruppe II: QpH1, QpRS, QpDV, plasmidlos) bzw. ihres

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Krankheitsbildes (Gruppe I, IV: primär akuter Krankheitsverlauf; Gruppe II: primär chronischer Krankheitsverlauf) auf (89). Basierend auf der MLVA-Methode existieren mittlerweile über 99 unterschiedliche Genotypen von C. burnetii (4, 32, 56, 89, 159).

1.3.3 Morphologischer Entwicklungszyklus

Der Erreger durchläuft einen morphologischen Entwicklungszyklus. Die SCV-Form („small cell variant“) entspricht der sporenähnlichen, extrazellulären Dauerform von C. burnetii, in welcher das Bakterium widerstandsfähig gegenüber Umwelteinflüssen ist (113, 138). Die LCV- Form („large cell variant“) hingegen stellt die metabolisch aktive, replikative Zellform dar (35, 113). Im Zuge der Wirtsinfektion differenziert sich die sporenähnliche Dauerform (SCV) in die metabolisch aktive, replikative Zellform (LCV) und vice versa (35, 113). Während der Replikation weist der Erreger das für Bakterien typische, sigmoide Wachstumsverhalten auf, welches die lag-Phase (Tag 0 - 2; Differenzierung von SCV zu LCV), das exponentielle Wachstum (Tag 2 – 6; Replikation von LCV´s) sowie die stationäre Phase (ab Tag 6;

Differenzierung von LCV zu SCV) beinhaltet (35).

1.3.4 Virulenzfaktoren und Phasenvariabilität

Vollständig intaktes LPS von C. burnetii stellte jahrzehntelang den einzigen bekannten Virulenzfaktor des Erregers dar (118). Von diesem wurde angenommen, dass es C. burnetii maskiert, indem es die Oberflächenproteine des Erregers abschirmt und ihn dadurch vor einer Immunantwort der Wirtszelle schützt (153). Neueste Erkenntnisse lassen jedoch darauf schließen, dass eine LPS-abhängige Reorganisation des Zytoskeletts der Wirtszelle zu einer damit verbundenen Delokalisierung der Toll-like Rezeptoren (TLR) 2 und 4 führt. Dies wiederum resultiert in einer gestörten Immunantwort (36). Mit zunehmender Charakterisierung der Funktion des Typ-IV Dot/Icm („defect in organelle trafficking/intra- cellular multiplication“) Sekretionssystem (T4SS) wurde deutlich, dass dieses System ebenfalls essenziell für das intrazelluläre Überleben von C. burnetii ist. Dieses transportiert Effektorproteine, welche in die Signalkaskade eingreifen, in das Cytosol der Wirtszelle und ist für die intrazelluläre Replikation des Erregers sowie für anti-apoptotische und anti- inflammatorische Gegenmaßnahmen verantwortlich (11, 28, 38, 98, 107). Studien mit T4SS- Mutanten haben gezeigt, dass dieses Transportsystem jedoch nicht an der Phagozytose beteiligt ist (11, 28).

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Des Weiteren werden C. burnetii-Isolate, unabhängig von der SCV- und LCV-Form, anhand ihrer LPS-Zusammensetzung unterschieden und als Phase I und II bezeichnet. Phase I entspricht der virulenten, natürlich vorkommenden Form des Erregers, welche durch ein komplettes LPS („smooth“) gekennzeichnet ist. Bei Phase II handelt es sich hingegen um eine im Labor selektierte Variante, welche durch mehrmaliges Passagieren von Phase I in Zellkultur bzw. embryonierten Hühnereiern erzeugt werden kann (81, 158). In Phase II ist das Fehlen der O-spezifischen Polysaccharidkette und Teilen des Kernoligosaccharids des LPS, mit dem Verlust der Virulenz direkt assoziiert (1, 64, 165, 166).

1.4 Infektionszyklus

1.4.1 Invasion immunkompetenter Wirtszellen

In vivo infiziert C. burnetii primär Monozyten wie Alveoläre Makrophagen und Kupffer-Zellen (94, 155, 175). Im Gegensatz zur Phase I ist die avirulente Phase II von C. burnetii jedoch nicht dazu in der Lage eine Erkrankung in immunkompetenten Menschen oder Tieren auszulösen (118). Die Infektion von immunkompetenten Wirtszellen ist phasenabhängig.

Die SCV-Form von sowohl Phase I als auch Phase II wird durch eine αvβ3 Integrin-vermittelte Phagozytose internalisiert (27). Phase II-Bakterien interagieren zusätzlich mit dem Komplement-Rezeptor 3 (CR3, αMβ2 Integrin), dessen phagozytotische Effizienz von der Aktivierung durch das αvβ3 Integrin sowie dessen Kofaktor CD47 (Integrin-assoziiertes Protein, IAP) abhängt (27). Im Gegensatz zur Phase II ist die Adhäsion von Phase I-Bakterien mit einer deutlichen Reorganisation des Zytoskeletts der Wirtszelle assoziiert (114), was wiederum auf die Interaktion des Phase I-LPS mit TLR4 zurückzuführen ist (80). Als Folge der Umgestaltung des Zytoskeletts wird das αvβ3 Integrin vom IAP sterisch entkoppelt und somit die „normale“

CR3-vermittelte Phagozytose bei Phase I-Bakterien verhindert. Dies resultiert jedoch in einer vergleichsweisen geringeren Internalisierungsrate als bei Phase II-Bakterien (27).

Aufgrund der unterschiedlichen LPS-Zusammensetzung beider Phasen wird angenommen, dass die virulente Phase I, im Gegensatz zu Phase II, TLR2 während der Invasion nicht aktiviert (36, 187). TLR2 wiederum initiiert die Synthese der Zytokine IL-12 (Interleukin 12) und TNF-α (Tumornekrosefaktor-α), welche an der Abwehr intrazellulärer Erreger beteiligt sind (153, 187). Aufgrund der Tatsache, dass die virulente Variante von C. burnetii eine mehr als zehnfach

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geringere IL-12- und TNF-α-Produktion hervorruft, wird angenommen, dass dies die unter- schiedliche Überlebensfähigkeit beider Phasen in immunkompetenten Zellen erklärt (153).

1.4.2 Intrazelluläre Replikation

Nach der Aufnahme in die Wirtszelle durchläuft das C. burnetii enthaltende frühe Phagosom (= entstehende „Coxiellen-enthaltende Vakuole“ (CCV)) die endolysosomale Kaskade. Diese ist durch die Akquirierung des frühen endosomalen Markers RAB5 (GTPase) sowie den autophagosomalen Oberflächenmarker LC3 (Mikrotubuli-assoziiertes Protein light-chain 3) charakterisiert (140). Es wird vermutet, dass die GTPase RAB5 die Fusion des Phagosoms mit frühen Endosomen stimuliert (96, 172). Mit dieser Fusion einhergehend wird die entstehende CCV auf einen pH-Wert von etwa 5,4 angesäuert und zusätzlich das frühe endosomale Markerprotein 1 („early endosome antigen 1“ (EEA1)) akquiriert, welches für den weiteren Reifungsprozess der CCV benötigt wird (96, 172). Im Laufe der weiteren Reifung der CCV fusioniert das Phagosom mit Autophagosomen. Es wird angenommen, dass dies der Akquisition von Nährstoffen und Membranbestandteilen dient (62, 140). Durch weitere Fusionsprozesse erwirbt das Phagosom den späten endosomalen Marker RAB7, die Lysosom- assoziierten Membranglykoproteine (LAMP) 1 und 2 sowie V-ATPasen (25, 96, 140, 172).

Letztere pumpen konstant Protonen in die CCV, wodurch das pH-Milieu auf einen Wert von etwa 5 absinkt (96, 172). Letztendlich erfolgt eine Fusion der CCV mit Lysosomen, infolgedessen die darin enthaltenen Cathepsine und Hydrolasen akquiriert werden (55, 172).

Parallel dazu wird der pH-Wert in der CCV durch die V-ATPasen auf einen Wert von etwa 4,5 verringert (172).

Verglichen mit einer typischen Phagosom-Reifung erfolgt die Anreicherung lysosomaler Enzyme innerhalb der CCV etwa zwei Stunden nach Beginn der Infektion und ist damit um ein Vielfaches verzögert (172). Diese von C. burnetii induzierte Verzögerung wird für die SCV-LCV- Differenzierung sowie die damit einhergehende, pH-Wert abhängige Aktivierung des Metabolismus genutzt (= „acid activation“) (35, 82). Im Anschluss erfolgt die Replikation von C. burnetii innerhalb der CCV, welche 8 bis 48 h nach der Infektion beinahe das gesamte Zytoplasma der Wirtszelle ausfüllt und unter anderem durch die Fusion mehrerer kleiner CCV´s entstanden ist (70, 172). Während der Infektion wird die Lebensfähigkeit der Wirtszelle aufgrund der Inhibition der Apoptose-Signalkaskade sowie der Induktion sogenannter Überlebens-Faktoren jedoch nicht negativ beeinflusst (38, 98, 107, 176). Etwa sechs Tage nach

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der Wirtszelleninfektion ist die CCV komplett mit der LCV-Zellform ausgefüllt, woraufhin diese beginnen sich zurück in die SCV-Zellform zu differenzieren (35).

1.4.3 Resistenz gegenüber intrazellulärem Stress

Die Replikation von C. burnetii innerhalb der Wirtszelle unterscheidet sich im Vergleich zu anderen intrazellulären Bakterien drastisch. Während Mycobacterium (M.) tuberculosis, Legionella pneumophila und Listeria monocytogenes die endolysosomale Kaskade unter- brechen, umprogrammieren bzw. umgehen, wird diese bei Coxiellen lediglich verzögert (54).

Dementsprechend ist C. burnetii innerhalb der Phagolysosom-ähnlichen CCV extremen Bedingungen ausgesetzt. Dies beinhaltet neben dem niedrigen pH-Wert auch oxidativen Stress, welcher durch reaktive Sauerstoff- und reaktive Stickstoff-Intermediate hervorgerufen wird (22). Infolgedessen hat C. burnetii zahlreiche Resistenzmechanismen ausgebildet, um in einem derart lebensfeindlichen Milieu zu bestehen. Neben der Expression von sauren Phosphatasen, welche den oxidativen Stress verringern, werden durch die Bildung von Superoxiddismutasen zusätzlich freie Radikale enzymatisch abgebaut (71, 79). Zudem wird durch den geringen Eisenbedarf des Erregers, der durch die Fenton-Reaktion ausgelöste oxidative Stress auf ein Minimum reduziert (24). Die genomische Integrität von C. burnetii wird durch die konstitutive Expression der für die DNA-Reparatur benötigten Gene sichergestellt (115). Aufgrund dieser Resistenzmechanismen ist C. burnetii in der Phagolysosom-ähnlichen CCV in der Lage zu überleben sowie sich zu replizieren und besetzt dadurch eine einzigartige biologische Nische.

1.5 Kultivierung

1.5.1 Zellkultur

C. burnetii ist in der Lage zahlreiche Zellkulturlinien, wie beispielsweise Vero-Zellen (Nierenepithelzelle, Grüne Meerkatze, (73)), L-929 Zellen (Bindegewebe-Fibroblast, Maus, (8)), HEL-Zellen (Lungen-Fibroblast, Mensch, (133)), HeLa-Zellen (Cervixepithelzelle, Mensch, (15)) und CHO-Zellen (Ovarien-Fibroblast, Hamster, (140)) zu infizieren. Im Unterschied zur in vivo Infektion sind sowohl Phase I als auch Phase II des Erregers in der Lage Zellkulturen zu infizieren und wachstumskinetisch nicht voneinander zu unterscheiden (83).

10 1.5.2 Embryoniertes Hühnerei

Coxiellen können im Dottersack embryonierter Hühnereier propagiert werden (124, 144). Im Zuge von Anzucht- sowie Infektionsversuchen stirbt der Embryo in der Regel innerhalb von zwei Wochen nach der Inokulation bzw. muss in diesem Zeitraum abgetötet werden, um das Schlüpfen von Küken zu verhindern (112, 144). Während die Erregerausbeute im embryo- nierten Hühnerei höher ist als in Zellkultur, erfordert die Ernte jedoch einen größeren Zeitaufwand (144).

1.5.3 Axenisches Medium

Die wirtszellenfreie oder axenische Propagation von C. burnetii wurde im Jahr 2008 mit der Entwicklung eines komplexen Coxiellen-Mediums („complex Coxiella medium“, CCM) möglich (126). Die metabolische Aktivität von C. burnetii konnte in diesem Medium für 24 h aufrecht gehalten werden, eine Replikation fand jedoch nicht statt. Mit der weiteren Entwicklung des Mediums, als angesäuertes Citrat Cystein Medium („acidified citrate cysteine medium“, ACCM) im Jahr 2009, gelang erstmals die axenische Vermehrung von C. burnetii (127). Mithilfe dieser zweiten Variante des Mediums konnte eine bis zu dreifache log-Zunahme innerhalb von sechs Tagen erreicht werden. Im Vergleich zur Kultivierung in Vero-Zellen wurde zudem die Generationszeit des Erregers während des exponentiellen Wachstums in ACCM um etwa 1 – 2 h auf durchschnittlich 9,1 h verringert (35). Durch konstante Weiterentwicklung konnten diese Eigenschaften bei der dritten Generation des Mediums (ACCM-2) im Jahre 2011 bereits erheblich verbessert werden (125). Die log-Zunahme wurde um etwa 1,5 gesteigert und die Generationsdauer von 9,1 h auf 4,7 h nahezu halbiert (125). Darüber hinaus ist ACCM-2 zur Erregerisolation aus klinischen Proben geeignet (20). Im Jahr 2016 erfolgte eine weitere Modifikation des axenischen Mediums, indem im ACCM-2 enthaltene, unbestimmte Komponenten, wie Neopepton und Casaminosäuren, durch genau definierte Salze und Aminosäuren ersetzt wurden (145). Dieses „definierte ACCM“ (ACCM-D) ermöglichte eine nochmal fünf- bis zehnfach höhere Ausbeute sowie ein verlängertes exponentielles Wachstum. Die logarithmische Wachstumsrate war im Vergleich zum ACCM-2 jedoch geringer. Das 2017 entwickelte „definierte, angesäuerte Citrat Medium“ (D-ACM) basiert auf dem gleichen Ansatz wie das ACCM-D, wenngleich bei leicht unterschiedlicher Zusammensetzung (171). Im Vergleich zum ACCM-2 weist das D-ACM ebenfalls eine höhere

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Ausbeute (ca. 2,5-fach größer) sowie ein verlängertes exponentielles Wachstum auf. Wie bereits beim ACCM-D resultiert dies jedoch in einer geringeren Wachstumsrate und zusätzlich in einer verlängerten lag-Phase.

1.6 Biologische Sicherheitseinstufung

Aufgrund der geringen Infektionsdosis, der hohen Resistenz gegenüber Umweltfaktoren sowie der aerogenen Transmission ist C. burnetii (Phase I) entsprechend der Richtlinie 2000/54/EG des europäischen Parlaments und des Rates als BSL-3-Organismus klassifiziert.

Die avirulente Phase des NMII-Stammes darf hingegen in entsprechend ausgerüsteten Laboren der biologischen Schutzstufe 2 gehandhabt werden. Zusätzlich wird C. burnetii vom Zentrum für Seuchenkontrolle und -prävention (Gesundheitsministerium, USA) als biologischer Kampfstoff der Kategorie B gelistet (29).

Coxiella burnetii – Internationaler Standard für die Pasteurisierung von Milch

1.7 Geschichte der Milchpasteurisierung

In den nachfolgenden Abschnitten werden lediglich die bedeutendsten historischen Errungen- schaften bezüglich der Milchpasteurisierung erwähnt, ohne die mitunter unterschiedlichen zugehörigen Entwicklungen auf nationalstaatlicher Ebene zu thematisieren.

1.7.1 Anfängliche Studien – Pasteur und andere Pioniere (1824 - 1900)

Die Ursprünge der Milchpasteurisierung sind mutmaßlich so alt wie „die Kuh und die Verwendung von Feuer“ (148), jedoch geht die erste wissenschaftliche Auseinandersetzung mit dieser Thematik wahrscheinlich auf William Dewees zurück [(66), zitiert nach (182)].

Dieser empfahl bereits 1824, dass Kleinkindern nur erhitzte Milch zum Verzehr gegeben werden sollte, da diese eine längere Haltbarkeit aufwies. Ein weiterer Pionier auf diesem Gebiet war Gail Borden, welcher sich im Jahr 1853 ein Prinzip für die Erhitzung und Eindickung von Milch unter Vakuumbedingungen patentieren ließ. Zu der entsprechend behandelten Milch wurde anschließend Zucker hinzugegeben, um deren Haltbarkeit zu erhöhen (182).

Das heute bekannte Prinzip der Milchpasteurisierung basiert auf den Erkenntnissen von Louis Pasteur aus dem Jahre 1864. Dieser entdeckte, dass durch das Erhitzen und Abkühlen von

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Weinen, bei vergleichsweise niedrigen Temperaturen von etwa 50 - 60 °C, die darin enthaltenen, schädlichen Mikroorganismen inaktiviert wurden (21, 182). In den 1890ern, mehrere Jahre nach der Entdeckung der Pasteurisierung, wurden zahlreiche unterschiedliche Rohmilch-Erhitzungsvarianten kommerziell genutzt. Aufgrund fehlender staatlicher Verordnungen und aussagekräftiger Daten unterschieden sich diese jedoch teilweise hinsichtlich ihrer Erhitzungstemperatur und -dauer sowie der Durchführung recht stark voneinander (40, 182).

1.7.2 Mycobacterium tuberculosis – erster Referenzorganismus (1900 - 1933)

Ungeachtet der Tatsache, dass bereits vor 1900 zahlreiche durch die Milch übertragbare Krankheiten wie Typhus, Scharlach oder Diphterie bekannt waren [zusammengefasst in (167)]

und erste Studien die Vorteile erhitzter Milch aufzeigten, war die Pasteurisierung zu dieser Zeit umstritten (3, 119, 182). Vor allem der Inaktivierungseffekt auf die in der Milch enthaltenen pathogenen Mikroorganismen bei der Verwendung der Kurzzeiterhitzungs- methoden (Heißhaltezeiten von weniger als einer Minute bei ca. 71 °C) wurde angezweifelt (3, 182). Die Skepsis gegenüber der Milchpasteurisierung schwand jedoch allmählich, als im Jahr 1907 der erste kommerzielle Erhitzer mit Erhitzungstemperaturen von 60 - 66 °C und Heißhaltezeiten von über 30 Minuten (Langzeiterhitzung) in Betrieb genommen wurde (119, 182). Problematisch war jedoch, dass nach wie vor keine offiziellen Richtlinien für die Pasteurisierung von Milch existierten (119). Diesbezügliche Forschungen fokussierten zur damaligen Zeit hauptsächlich auf die temperaturbedingte Abtötung des Tuberkuloseerregers M. tuberculosis, da dieser als hitzeresistentestes Rohmilch-Pathogen angesehen wurde (119).

Im Zeitraum von 1883 bis 1906 wurden insgesamt 26 verschiedenen Studien zu dieser Thematik durchgeführt. Aufgrund extrem großer Schwankungen bei der Temperatur (50 – 100 °C) und Heißhaltezeit (1 min bis 6 h) der entsprechenden Versuche konnte jedoch trotz allem keine offizielle Richtlinie für die hitzebedingte Inaktivierung von M. tuberculosis erarbeitet werden (119, 182). Ein wichtiger Schritt in diese Richtung geschah im Jahr 1911, als das Expertengremium des Nationalen Komitees für Milchstandard eine Temperatur-Zeit- Kombination von 62,8 °C und 30 min für die Pasteurisierung von Rohmilch empfahl. Aufgrund der herausragenden Expertise der Komitee-Mitglieder wurde diese Vorgabe weitgehend akzeptiert (119, 182). Angesichts der Tatsache, dass lokale Vertreter der Gesundheitsbehörde

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diesbezüglich jedoch unabhängig entscheiden konnten, existierten nach wie vor kleinere, regionale Unterschiede bei der Milchpasteurisierung (182).

In den darauffolgenden Jahren lag der Fokus der Forschung hauptsächlich darauf einen endgültigen Pasteurisierungsstandard zu etablieren sowie die technisch-physikalischen Mängel der damaligen Pasteurisierungsanlagen zu identifizieren und zu beheben (182). Als Ergebnis dieser Bemühungen [zusammengefasst im öffentlichen Gesundheitsbericht 1925, (120)] wurde im Jahr 1924 die erste gesetzliche Verordnung über die Pasteurisierung von Milch erlassen. Diese definierte die Pasteurisierung als einen 30-minütigen Erhitzungsprozess bei mindestens 61,1 °C, welcher in zugelassenen Pasteurisierungsanlagen stattzufinden hat (121).

Ende der 1920er gewann die umstrittene Methode der Kurzzeiterhitzung nach und nach wieder an Bedeutung. Die Pasteurisierung der Rohmilch erfolgte nun mithilfe eines Plattenerhitzers, wodurch die Grundlagen der HTST-Methode („high-temperature short- time“) geschaffen wurden (182). Aufgrund rasanter technischer Fortschritte und zunehmenden Kenntnissen über die Inaktivierung von M. tuberculosis während der Kurzzeiterhitzung wurde diese Pasteurisierungsmethode letztendlich im Jahr 1933 offiziell anerkannt (182). Die Richtlinien der HTST-Pasteurisierung schrieben vor, dass Rohmilch bei 71,7 °C für 15 s erhitzt werden musste (182).

1.7.3 Coxiella burnetii – neuer Standard der Milchpasteurisierung (1930er Jahre)

Nach der Entdeckung von C. burnetii Ende der 1930er Jahre (39, 41) wurde mit zunehmendem Kenntnisgewinn das Vorkommen des Erregers in Rohmilch nachgewiesen (84, 182).

Dementsprechend erfolgten mehrere Versuchsreihen, um die Inaktivierung von Coxiellen während der Pasteurisierung zu überprüfen. Hierbei wurde entdeckt, dass C. burnetii während der Langzeiterhitzung von Milch in seltenen Fällen nicht vollständig inaktiviert wurde (85).

Untersuchungen während der Routinepasteurisierung von Milch konnten dies in seltenen Fällen sogar für die Kurzzeiterhitzung nachweisen (105). Da der Erreger scheinbar eine größere Hitzeresistenz als M. tuberculosis aufwies (108), waren weitere Forschungen nötig, um C. burnetii effektiv während der Pasteurisierung von Milch zu inaktivieren (85, 105). Eine dementsprechende Studie wurde schließlich von Enright et al. an der Universität von Kalifornien, in Zusammenarbeit mit der öffentliche Gesundheitsbehörde der Vereinigten Staaten von Amerika, durchgeführt (182). Im Jahr 1957 wurden als Ergebnis dieser

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Untersuchung Temperatur-Zeit-Kombinationen von 30 min bei 62,7 °C (Langzeiterhitzung) bzw. 15 s bei 71,7 °C (Kurzzeiterhitzung/HTST) für die Pasteurisierung von Milch empfohlen (50). Diese Temperaturen sollten zusätzlich um 5 Grad Fahrenheit erhöht werden, falls die zu pasteurisierende Milch einen höheren Fettanteil aufweist oder ihr Zucker zugesetzt wurde (2).

In den Folgejahren wurden die Pasteurisierungsvorgaben für Milch erweitert, indem bei gleichzeitiger Erhöhung der Erhitzungstemperatur die Heißhaltezeit verringert wurde. Die jeweiligen Temperatur-Zeit-Kombinationen wurden auf Basis bekannter Inaktivierungsdaten extrapoliert, wobei entsprechend große Sicherheitsspannen berücksichtigt wurden (182).

Milchprodukte, welche für 1 s bei 88,3 °C, 0,05 s bei 95,6 °C oder 0,01 s bei 100 °C erhitzt werden, werden neben der Lang- und Kurzzeiterhitzung heutzutage ebenfalls als pasteurisiert angesehen. Als Ultrahocherhitzt hingegen gelten Milchprodukte, welche für mindestens 2 s bei 137,8 °C erhitzt werden (134).

1.8 Coxiellen und Milch – aktueller Stand der Wissenschaft

1.8.1 Gesetzliche Vorschriften der Milchpasteurisierung

Die internationalen gesetzlichen Grundlagen für die Pasteurisierung von Milcherzeugnissen basieren auf den Richtlinien des Codex Alimentarius. Dieser gibt vor, dass C. burnetii, als hitzeresistentestes, pathogenes Bakterium in Milch, während der Pasteurisierung um mindestens 5 log-Stufen reduziert werden muss (33). Die von Enright et al. (50) im Jahre 1957 erarbeiteten Inaktivierungsdaten stellen hierbei die minimalen Pasteurisierungsvorgaben dar, bei denen dies der Fall ist und besitzen somit bis zum heutigen Tag Gültigkeit (33). Während die benötigten Temperaturen für die Lang- bzw. Kurzzeiterhitzung im Codex Alimentarius von 62,7 °C auf 63 °C bzw. von 71,7 °C auf 72 °C aufgerundet wurden, blieben die Heißhaltzeiten unverändert (33). Obwohl lediglich die 5 log-Reduktion von C. burnetii als minimal zu erfüllendes Pasteurisierungskriterium im Codex Alimentarius erwähnt wird, weist dieser gleichzeitig darauf hin, dass die Pasteurisierung bei höheren Temperaturen und kürzeren Heißhaltezeiten sehr umsichtig durchgeführt werden sollte. Zwar können andere effektive Temperatur-Zeit-Kombinationen durch die Extrapolation der definierten Inaktivierungsdaten berechnet werden, jedoch entziehen diese sich der praktischen Überprüfung durch die Wissenschaft (33). Dies ist der Tatsache geschuldet, dass sich die benötigte Heißhaltezeit bei

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bereits geringen Temperaturerhöhungen von mehr als 72 °C drastisch verkürzen würde.

Beispielweise zeigt die Extrapolation der Inaktivierungsdaten von Enright et al. (50), dass bei einer Erhitzungstemperatur von 80 °C bereits 0,22 s Heißhaltezeit ausreichen würde, um die erforderliche 5 log-Reduktion zu erfüllen (33).

Auf Basis der Richtlinien des Codes Alimentarius ist die Hitzebehandlung von Milch- erzeugnissen in Abschnitt IX, Kapitel II der Verordnung (EG) Nr. 853/2004 des europäischen Parlaments und des Rates gesetzlich festgelegt.

1.8.2 Beurteilung eines 60 Jahre alten Standards auf Basis neuer Erkenntnisse

Ungeachtet der Tatsache, dass sich die Inaktivierungsdaten von Enright et al. (50) in der Praxis offensichtlich bewährt haben, wurde die Hitzeresistenz von C. burnetii in der zugehörigen Studie möglicherweise dennoch falsch eingeschätzt. Die damalige Untersuchung wurde mit größter Sorgfalt und unter Nutzung einer Sicherheitsspanne durchgeführt und war zudem die erste ihrer Art, bei der die Ergebnisse mittels statistischer Regression berechnet wurden (30).

Der Kurvenverlauf der Abtötungskurve wurde jedoch nicht bezüglich seiner Linearität analysiert, wodurch die log-Reduktion von C. burnetii zwischen 4,7 bis 8 Stufen variiert (30).

Dies würde bedeuten, dass der hitzebedingte Inaktivierungseffekt von C. burnetii während der Milchpasteurisierung möglicherweise größer ist als im Codex Alimentarius vorgeschrieben.

Das dies im Bereich des Möglichen liegt, verdeutlicht eine von Hammer et al. im Jahr 2015 veröffentliche Studie, in welcher die Inaktivierung von Mycobacterium (M.) bovis und Mycobacterium (M.) caprae während der Kurzzeiterhitzung in Milch untersucht wurde (68).

Die Stämme wurden hierbei in einer modernen BSL-3-Pilot-Pasteurisierungsanlage erhitzt, welche mit industriell genutzten Erhitzungsanlagen vergleichbar ist und diese in einem kleineren Maßstab authentisch imitiert (68, 128). Von den Mykobakterien wurde zunächst der Temperaturbereich ermittelt, bei dem es bereits zu einem Abtötungseffekt kommt, jedoch noch vermehrungsfähige Bakterien vorhanden sind (sogenannter „Breakpoint“). Darauf aufbauend, wurden im Anschluss die D- und z-Werte von M. bovis und M. caprae bestimmt sowie die zugehörigen kinetischen Inaktivierungsdaten berechnet. Der D-Wert gibt die Erhitzungszeit an, welche für die log-Reduktion der zu untersuchenden Bakterien bei einer bestimmten Temperatur nötig ist. Der z-Wert wiederum entspricht der benötigten Temperaturerhöhung, um den D-Wert auf ein Zehntel zu verringern. Hierbei ergaben die entsprechend gewonnenen Inaktivierungsdaten, dass die Mykobakterien bei einer

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Pasteurisierungstemperatur von 72 °C und einer Heißhaltezeit von 15 s, um mindestens 18 log-Stufen reduziert wurden (68). Ungeachtet der Tatsache, dass sich die Inaktivierungs- daten von M. bovis und M. caprae nicht pauschal auf C. burnetii übertragen lassen, liefert die Studie dennoch wichtige Erkenntnisse bezüglich des Potentials moderner Pasteurisierungs- anlagen. Durch die Verwendung von Erhitzungsverfahren, welche dem aktuellen Stand der Technik entsprechen, könnte während der Pasteurisierung von C. burnetii ebenfalls ein Inaktivierungseffekt hervorgerufen werden, welcher die geforderten 5 log-Stufen übertrifft.

1.9 Zielsetzung

Die nachträgliche Analyse der ursprünglichen Studie von Enright et al. (30, 50) sowie aktuelle Forschungsergebnisse von Hammer et al. (68) liefern Hinweise darauf, dass C. burnetii während der Kurzzeiterhitzung von Milch möglicherweise stärker inaktiviert wird, als im Codex Alimentarius vorgeschrieben. Sollte sich dies bewahrheiten, wäre eine Absenkung der Pasteurisierungstemperatur, bei gleichzeitiger Einhaltung der Sicherheitsanforderungen, möglich. Dies hätte sowohl positive Auswirkungen auf die Milchindustrie („CO2-footprint“), als auch auf den Verbraucher (Geschmack, „Naturbelassenheit“). Ziel dieser Dissertation war es, die Inaktivierungskinetik von C. burnetii während der Kurzzeiterhitzung von Milch zu ermitteln. Hierfür sollte ultrahochtemperierte (UHT)-Milch, welche mit sechs ausgewählten C. burnetii-Feldisolaten unterschiedlicher tierischer Herkunft (jeweils zwei vom Rind, Schaf und Ziege) inokuliert wurde, in einer industriemaßstabgetreuen BSL-3-Pasteurisierungsanlage erhitzt werden. Die Propagation der Isolate erfolgte in ACCM-2, nachdem diese mittels Zellkultur reaktiviert wurden. Vor der Verwendung der Feldisolate sollte der Versuchsaufbau zunächst mit dem avirulenten Nine Mile Phase II-Stamm (NMII) getestet werden. Zusätzlich sollte vor Beginn des Hauptversuches sichergestellt werden, dass das Wachstum in ACCM-2 keinen negativen Einfluss auf die Hitzeresistenz der Coxiellen hat. Hierfür wurden sowohl in Zellkultur, als auch in ACCM-2 gewachsene Kulturen des avirulenten NMII-Stammes hergestellt und diese hinsichtlich ihrer Hitzeresistenz, während der Kurzzeiterhitzung in Milch, analysiert. Im Anschluss sollten die Breakpoints der sechs Feldisolate bestimmt und tierspezifisch verglichen werden. Davon ausgehend wurden schließlich die D- und z-Werte der drei hitzeresistentesten Isolate ermittelt. Der Erregernachweis erfolgte durch die Bestimmung

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koloniebildender Einheiten (KbE), mithilfe des Wachstums in ACCM-2, durch das Beimpfen embryonierter Hühnereier sowie mittels Viabilitäts-PCR (101, 125, 144).

Aufgrund der Tatsache, dass C. burnetii eine hohe Resistenz gegenüber Umweltfaktoren bzw.

oxidativen und pH-Wert-abhängigen Stress aufweist, sollte zusätzlich die Genexpression unter Stress mit normalen Kulturbedingungen verglichen werden. Ausgehend von einer synchronisierten „SCV-angereicherten“ Kultur wurden zunächst die Zeitpunkte der morpho- logischen Differenzierung ermittelt. Im Anschluss sollte das Wachstum des Erregers bei unterschiedlichen pH-Werten und Salinitäten dokumentiert und dadurch Situationen einer stressbedingten Replikation simuliert werden. Gleichzeitig sollte die Expressionsanalyse ausgewählter Gene Aufschluss über mögliche Mechanismen der Resistenz geben. Die entsprechenden Versuche wurden mit dem avirulenten NMII-Stamm in ACCM-2 durchgeführt.

18 2 Material

2.1 Chemikalien und Reagenzien

Die in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien und kommerziell erhältlichen Testsysteme sind in Tabelle 1 und 2 aufgeführt.

Tab. 1: Chemikalien.

Name Hersteller

ACCM-2 Sunrise Science Products, San Diego, Kalifornien

Agarose Bio&SELL, Feucht, Deutschland

UltraPure Agarose, Invitrogen / Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts

Ampuwa Fresenius Kabi AG, Bad Homburg vor der Höhe,

Deutschland

Chloroform Merck, Darmstadt, Deutschland

Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Merck, Darmstadt, Deutschland

DNA-Ladepuffer New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts

DNA-Marker Jena Bioscience, Jena, Deutschland

Ethanol Berkel AHK, Berlin, Deutschland

Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) AppliChem, Darmstadt, Deutschland Fetales Kälberserum (FKS) Bio&Sell, Feucht, Deutschland

Glucose VWR International, Radnor, Pennsylvania

Glutaraldehyd Merck, Darmstadt, Deutschland

Glycerin Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland

Isopropanol Th. Geyer, Renningen, Deutschland

Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri

L-Glutamin Lonza, Basel, Schweiz

Lysozym Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri

Max Bacterial Enhancement Reagent Invitrogen / Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts

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Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts Maxima SYBR Green qPCR Master Mix Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts MEM-Vitamin-Lösung Merck, Darmstadt, Deutschland

Natriumchlorid (NaCl) Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland Natriumhydroxid (NaOH) Merck, Darmstadt, Deutschland Natriumkakodylat Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland Nicht-essentielle Aminosäuren Merck, Darmstadt, Deutschland

PCR-Wasser Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts

Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) Merck, Darmstadt, Deutschland

PMAxx^TM Biotium, Fremont, Kalifornien

RedGel DNA/RNA Färbung Bio&SELL, Feucht, Deutschland

Reinstwasser Reinstwasseranlage arium® pro + 0,2 µm

Sartopore® Filter, Sartorius, Göttingen, Deutschland

Rhodamin-X (ROX) Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts RNase-freies Wasser Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland

RPMI 1640-Medium Biochrom, Berlin, Deutschland

Saccharose Merck, Darmstadt, Deutschland

Salzsäure (HCl) Merck, Darmstadt, Deutschland

Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS) Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland

TRIS-Borat-EDTA (TBE)-Puffer (10-fach) SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Deutschland Trizol Reagenz Invitrogen / Thermo Fisher Scientific, Waltham,

Massachusetts

Trypsin/EDTA-Lösung Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri

Uranylacetat Plano GmbH, Wetzlar, Deutschland

Wolframatophosphorsäure Plano GmbH, Wetzlar, Deutschland

20 Tab. 2: Kommerzielle Testsysteme.

Name Bestandteil Hersteller

High Pure PCR Template Preparation Kit

- Binding-Puffer - Elutionspuffer

- Inhibitor Removal-Puffer - Proteinase K

- Waschpuffer

Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland

Qubit RNA Broad-Range Assay Kit

- Qubit-Puffer - Qubit-Reagenz

- Qubit-Standards (0 ng/µl, 100 ng/µl)

Invitrogen / Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts TaqMan^TM Reverse

Transcription Reagents Kit

- dNTP´s - MgCl2-Lösung

- MultiScribe reverse Transkriptase - RNase-Inhibitor

- RT-Puffer

- Zufallshexamere

Applied Biosystems / Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts

TURBO DNA-free^TM Kit - 10-fach Puffer - DNase

- DNase Inaktivierungs-Reagenz

Invitrogen / Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts

2.2 Medien und Puffer ACCM-2-Medium:

36,96 g ACCM-2 (entspricht einer Verpackungseinheit) 123,75 ml RPMI 1640

1,25 ml 200 mM L-Glutamin

ad 1000 ml Reinstwasser (bzw. ad 500 ml für 2-fach Konzentrat)

- auf pH-Wert von 4,75 einstellen

- Sterilfiltration (0,2 µm Porengröße; Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) - Lagerung bei 4 °C

21 Cox-Lyse-Puffer:

6,25 ml 2 M Tris-HCL, pH 7,5 1 ml 0,5 M EDTA

200 mg Lysozym (50400 Units/mg) ad 50 ml Reinstwasser

- Lagerung bei 4 °C

Glutaraldehydfixan:

10 ml Glutaraldehyd 1,8 g Glucose

ad 100 ml Kakodylatpuffer (pH 7,2)

- Lagerung bei 4 °C

Kakodylatpuffer:

21,4 g Natriumkakodylat ad 1000 ml Reinstwasser

- auf pH-Wert von 7,2 einstellen - Lagerung bei 4 °C

RPMI 1640-Medium:

465 ml RPMI 1640

5 ml nicht-essentielle Aminosäuren 5 ml MEM-Vitamin-Lösung

25 ml FKS

- Sterilfiltration (0,2 µm Porengröße; Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) - Lagerung bei 4 °C

22 Saccharose-Glycerin-Puffer:

23,105 g Saccharose 25 ml Glycerin ad 250 ml Reinstwasser

- Sterilfiltration (0,2 µm Porengröße; Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) - Lagerung bei 4 °C

Saccharose-Phosphat-Puffer:

1,061 g NaCl 0,436 g KH2PO4

1,913 g Na2HPO4

21,393 g Saccharose ad 250 ml Reinstwasser

- auf pH-Wert von 7,4 einstellen

- Sterilfiltration (0,2 µm Porengröße; Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) - Lagerung bei 4 °C

Uranylacetat-Lösung:

0,1 g Uranylacetat ad 10 ml Ampuwa

- Lagerung bei Raumtemperatur

Wolframatophosphorsäure-Lösung:

0,1 g Wolframatophosphorsäure ad 10 ml Ampuwa

- auf pH-Wert von 7,2 einstellen - Lagerung bei Raumtemperatur

23 2.3 C. burnetii-Isolate

Die in dieser Arbeit verwendeten Coxiella-Isolate, welche aus der Stammsammlung des Friedrich-Loeffler-Institutes (Jena, Deutschland) entnommen wurden, sind in der Tabelle 3 aufgeführt. Alle Arbeiten fanden unter BSL-2- bzw. BSL-3-Bedingungen entsprechend der Risikogruppe statt.

Tab. 3: Übersicht des in der vorliegenden Arbeit genutzten NMII-Stammes sowie der C. burnetii-Feldisolate.

C. burnetii

FLI Proben- Nummer

Referenz Risiko-

gruppe

Herkunft Einsender Jahr

NMII (RSA439)¹ /² Zecke Slowakische Akademie

der Wissenschaften /² 2 Bru180 18QC1770 Rind, Abort Veterinäramt Aulendorf 1999 3

M 18QC1771 Rind, Nachgeburt CVUA Stuttgart 2001 3

S1 18QC1772 Schaf, Abort CVUA Stuttgart 1997 3

WDK1188 18QC1773 Schaf, Abort CVUA Stuttgart 1999 3

WDK2932 18QC1774 Ziege, Abort CVUA Stuttgart 1998 3

WDK299 18QC1775 Ziege, Nachgeburt CVUA Stuttgart 2004 3

1 zur Verfügung gestellt von L. Skultety (Bratislava, Slowakei)

2 keine Angaben vorhanden

2.4 Zelllinien

In der vorliegenden Arbeit wurde die adhärente Nierenzelllinie aus der Grünen Meerkatze („buffalo green monkey“; BGM) verwendet. Die Zellen entstammten der Zellbank des Friedrich-Loeffler-Institutes (Riems, Deutschland).

24 2.5 Oligonukleotide

Die in dieser Arbeit für die Transkriptionsanalyse verwendeten Oligonukleotide sind in Tabelle 4 aufgeführt. Sie wurden mithilfe der Bioinformatik Software Geneious (Version 10.2;

Biomatters Ltd., Auckland, Neuseeland) sowie des Online-Tools von Genscript ((58);

Piscataway, New Jersey) entworfen. Kriterien waren eine Fragment-Länge zwischen 70 und 150 bp sowie ein Schmelzpunkt der Primer im Bereich von 60 °C. Die Synthese der Primer erfolgte durch Eurofins ((51); Eurofins Scientific Se, Luxemburg).

Tab. 4: Oligonukleotide für die Transkriptionsanalyse.

Gen (CBU_Nr.) Bezeichnung Sequenz

Fragment- Länge scvA (CBU_1267a) scvAF 5´-TGT CCA ACA ACA ACG TGG AAA-3´ 72 bp

scvAR 5´-TGA TTT GGT CGA CGT GGG TT-3´ 72 bp nhaP.1 (CBU_1259) nhaP.1F 5´-GAT GCC ACT GTC CGC TTC GT-3´ 121 bp

nhaP.1R 5´-CAC CTC CAG GCT GCG AAT GA-3´ 121 bp nhaP.2 (CBU_1590) nhaP.2F 5´-TGC TGT TTG CTG GCG CTC TA-3´ 100 bp nhaP.2R 5´-ACC GTG GAA ACG ATG GTG CT-3´ 100 bp rpoS (CBU_1669) rpoSF 5´-CCC AGA AGA CGT CGC ACA TT-3´ 92 bp

rpoSR 5´-GCA CAT CAA TCG ACG TTG CAC-3´ 92 bp csrA2 (CBU_1050) csrA2F 5´-AGG TAA CCA AGT CCG TCT AGG G-3´ 113 bp

csrA2R 5´-CAC CCT GGT CTT CTG ACT GAG C-3´ 113 bp groL (CBU_1718) groLF 5´-CTG GTG ACG CCG GTG ACA TT-3´ 150 bp groLR 5´-CAG TCG CAG CGC CCA CTT TA-3´ 150 bp recA (CBU_1054) recAF 5´-CTC GGG CGC TGT TGA TCT GA-3´ 127 bp recAR 5´-GCG CAG CGC TTG TGA CAT TA-3´ 127 bp tolB (CBU_0090) tolBF 5´-CAA CAT GGT CGC CCG ATG GA-3´ 93 bp

tolBR 5´-GCC GTC CCG TAG CCA AAT CT-3´ 93 bp rosB (CBU_0459) rosBF 5´-CGC TGG AGT CAG TCT CGC AT-3´ 71 bp rosBR 5´-AAT CCC GCA CCG GCT TCA AA-3´ 71 bp ahpC1 (CBU_1706) ahpC1F 5´-GCC CGT CGG AGT TGA TTG CT-3´ 145 bp

25

ahpC1R 5´-ACC GGA CCG ATT CCT CCC TT-3´ 145 bp rpoD (CBU_1596) rpoDF 5´-TCT ACC GCG CTC AAC GAA AC-3´ 93 bp

rpoDR 5´-CGA TGG CAA CGC GAC GAT TA-3´ 93 bp com1 (CBU_1910)¹ com1F 5´- GCA CTA TTT TTA GCC GGA ACC TT-3´ 75 bp com1R 5´-TTG AGG AGA AAA ACT GAA TTG AGA-3´ 75 bp

1aus Brennan et al. (23) entnommen

26 3 Methoden

3.1 Zellbiologische Methoden

3.1.1 Zellkultur und Passage

BGM-Zellen (10, 35) wurden in RPMI 1640-Medium bei einer Temperatur von 37 °C sowie 5%igem CO2-Gehalt in Zellkulturflaschen (Greiner Bio-One, Kremsmünster, Österreich) kultiviert. Ein Mediumwechsel wurde alle vier bis sechs Tage durchgeführt, indem das alte Medium abgenommen und durch frisches ersetzt wurde. Beim Passagieren wurden die adhärenten BGM-Zellen mit 1%igem Trypsin von der Gefäßoberfläche gelöst und in ein 50 ml Reaktionsgefäß transferiert. Die Trypsinlösung wurde durch Zentrifugation (900 x g, 5 min, RT) entfernt und die Zellen in neuem RPMI 1640 Medium resuspendiert. Nach Bestimmung der Zellzahl (siehe 3.1.2.) wurden die Zellen mit 1 x 10⁴ Zellen/ml neu ausgesät.

3.1.2 Zellzahlbestimmung mittels Neubauerzählkammer

Die Anzahl der BGM-Zellen wurde mithilfe einer Neubauerzählkammer (Kammerhöhe 0,1 mm, Blaubrand, Wertheim, Deutschland) bestimmt. Hierfür wurde das zugehörige Deckglas auf der Zählkammer platziert und die durch Pipettieren zugegebene BGM-Suspension kapillarisch aufgenommen. Für jede Zellzahlbestimmung wurden vier Großquadrate (jeweils 1 mm²) ausgezählt, welche wiederum aus jeweils 16 Gruppenquadraten bestanden. Nachdem der Mittelwert der gezählten Zellen ermittelt wurde, erfolgte die Zellzahlbestimmung pro ml Suspension. Hierfür wurde das Volumen der vier Großquadrate (entspricht 0,4 µl; 4 x 1 mm² Fläche x 0,1 mm Kammerhöhe) mit dem Faktor 2500 multipliziert.

3.2 Mikrobiologische Methoden

3.2.1 Übersicht der Kultivierungsmethoden von C. burnetii

Der NMII-Stamm und die Feldisolate wurden sowohl in Zellkultur als auch in axenischem Medium propagiert. Ihre Kultivierungsbedingungen variierten in Abhängigkeit des Unter- suchungszwecks. Bei der Kultivierung des NMII-Stammes lag der Fokus vor allem auf der Herstellung von Kulturen mit unterschiedlichem LCV/SCV-Verhältnis. Die Feldisolate hingegen

27

wurden fast ausschließlich in größerem Maßstab in axenischem Medium propagiert. Die jeweiligen Kultivierungsmethoden sind nachfolgend in Abbildung 1 schematisch dargestellt.

Abb. 1: Übersicht der Kultivierungsmethoden beim NMII-Stamm (A) sowie den Feldisolaten (B). Die blau hervorgehobenen Zahlen geben die zugehörigen, nachfolgenden Methoden- abschnitte an.

3.2.2 Kultivierung von C. burnetii mittels Zellkultur

Vor der Infektion wurden die BGM-Zellen (1 x 10⁵ Zellen/ml) im Medium ausgesät und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Infektion der BGM-Zellen erfolgte mit einer MOI von 50 in Zellkulturflaschen (NMII: T175; Feldisolate: T25; Greiner Bio-One, Kremsmünster, Österreich).

Die Kulturen wurden bei 37 °C inkubiert und mehrmals wöchentlich mit einem Lichtmikroskop (CK30, Olympus, Tokio, Japan; 200 – 400-fache Vergrößerung) visuell kontrolliert. Ein Mediumwechsel wurde alle vier bis sechs Tage durchgeführt. Die Ernte der Zellkulturen