- Einleitung
- Alkoholumsatz mit enzymgesteuerten Reaktionen - Das NAD/ADH-System
- Allgemeines
- Reaktionsmechanismus - Das Oxidasesystem
- Experimentelle Arbeiten mit ADH - Präparation
- Maßlösungen - Probelösungen
- Immobilisierung des Glases - Optimierung der Parameter - Die stopped-flow-Technik - Durchführung der Messungen
- Absorptionsmessung in Lösungen Meßergebnisse
- Absorptionsmessung mit immobilisierten Enzymen, Meßergebnisse - Fluoreszenzmessung in Lösungen, Meßergebnisse
- Zusammenfassung zu den Experimenten mit Dehydrogenasesystemen - Experimentelle Arbeiten mit AO
- Präparation
- Parameter Optimierung - Durchführung der Messungen - Ergebnisse
- Zusammenfassung zu den Experimenten mit AO - Zusammenfassung und Ausblick
- Literatur und Anhang Einleitung
Alkohole gehören zur großen Gruppe organischer Verbindungen mit einer oder mehreren Hydroxylgruppen. Je nach der Anzahl der C-C-Bindungen, die vom OH- tragenden Kohlenstoffatom ausgehen, unterscheidet man primäre, sekundäre oder tertiäre Alkohole. Alkohole mit einer OH-Bindung am aromatischen Ring bezeichnet man als Phenole.
Während die Alkohole mit ein bis zehn Kohlenstoffatomen in flüssiger Form vorliegen, erscheinen die höheren Alkohole fest, fast paraffinartig.
Die chemischen Eigenschaften werden bestimmt durch die Hydroxylgruppe, die die Umsetzung des Alkohols nach verschiedenen Reaktionsarten ermöglicht, so z.B.
durch Oxidation, Dehydrierung, Reduktion, Dehydratation, Alkylierung, Veresterung oder Addition.
Besondere Bedeutung kommt Alkoholen als Lösungs- oder Verdünnungsmittel für Lacke, Vorprodukte für Weichmacher und Waschmittel, als Zwischenprodukt bei der Aldehydherstellung zu oder auch als Desinfektionsmittel bzw. Arzneimittelzusatz.
Das Ethanol spielt außerdem noch in der Lebensmittel- und Genußmittelindustrie eine besondere Rolle.
Seit man nun die Alkohole und ihre vielfältigen Einsatzmöglichkeiten vom Lösungs- bis hin zum Genußmittel kennt, aber auch um ihre toxische Wirkung weiß, ist man bestrebt, mit ständig verbesserten Methoden die quantitativen und qualitativen Analysen durchzuführen.
Im Mittelpunkt des Interesses steht dabei natürlich das Ethanol. Es zu detektieren und dabei von anderen Alkoholen zu unterscheiden, ist in vielen Bereichen von Wichtigkeit. Besonders hervorzuheben sind dabei u.a. die Bereiche der Medizin, die Lebensmittelforschung, die Biotechnologie oder der Umweltschutz.
Bisher wurde für diese Analysen vorrangig die Gaschromatografie eingesetzt, für medizinische Untersuchungen außerdem die Widmark-Methode und der Dräger- Alcotest.
Neben diesen seit langer Zeit bekannten und fast schon klassisch zu nennenden Methoden wurden zahlreiche spektrofotometrische Detektionsmöglichkeiten entwickelt, so z.B. für die Reaktion von Alkoholen mit 3,5-Dinitrobenzoylchlorid in Pyridinform zu den korrespondierenden Benzoaten, die nach der Extraktion mit Cyclohexan in einem NAOH - Aceton - Gemisch eine intensive Färbung hervorruft.
Das gleiche gilt für die Phenylcarbamate aus der Reaktion von Alkoholen mit Phenylisocyanaten.
Parallel dazu versucht man aber auch seit langem, Alkohole als Gemische kinetisch über die unterschiedlichen Reaktionsgeschwindigkeiten zu bestimmen.
Eine Methode ist es, Alkohole mit Pyridin und Essigsäureanhydrid zu einem definierten Zeitpunkt t zu versetzen, um dann in gewissen Zeitabständen den Umsatz der Reaktion durch Titration zu vermessen und als Umsatz-Zeit-Diagramm die Reaktionsgeschwindigkeit aufzutragen. Diese Methode ist sehr zeitaufwendig und auf Grund des hohen Pyridinverbrauches nicht ungefährlich. Eine 2. Variante der kinetischen Analyse ist die Detektierung der Oxidation verschiedener Alkohole mittels Silber(II)-Perchlorat durch Aufzeichnung der variierenden Silberkonzentrationen im sichtbaren Bereich. Die Geschwindigkeit dieser Oxidation wird sehr stark von der Struktur der Alkohole beeinflußt. Neuerdings nehmen Forschungen auf dem Gebiet der Sensorik einen breiten Raum ein.
Mit gleicher Intensität wird aber auch die Entwicklung der stop-ped-flow-Technik einschließlich einer gut handhabbaren on-line-Computerauswertung betrieben, die die Vermessung der enzymgesteuerten Alkoholumsätze ermöglicht. Für die kinetische Behandlung ist es ausreichend, den 1. Teil des Umsatzes, den dynamischen Bereich, zu detektieren. Die Einstellung des Gleichgewichtszustandes muß nicht abgewartet werden, so daß der Zeitaufwand gering gehalten werden kann.
Besonders geeignet scheint die stopped-flow-Technik bei der Überwachung und Aufklärung des Mechanismus enzymgesteuerter Reaktionen.
Zusammenfassung und Ausblick
Im Verlauf der Untersuchungen zeigte es sich, daß die enzymatische Konzentrations- bestimmung aliphatischer Alkohole als Einzelkomponente oder als Gemische möglich ist.
Bei Nutzung der Dehydrogenase sind photometrische und fluorimetrische Methoden gleichwertig einsetzbar, wenn über das Vermessen der kinetischen Daten Konzen- trationen berechnet werden sollen. Die notwendige Software zur Datenaufnahme wie auch zur Analyse und somit zur Rückberechnung der Konzentration ist verfügbar und weiträumig anwendbar.
Bei dem Oxidasesystem ist nach umfassender Kalibrierung ebenso eine schnelle Konzentrationsbestimmung der Alkohole in reiner Form oder als Gemisch möglich.
Es ist dabei unerheblich, welcher Art die Proben sind. Industrieabwässer zeigen keinen veränderten Fehlerbereich gegenüber Fermentorlösungen, Haushaltwässern oder Grundwässern, so daß eine exakte Bestimmung in vielen Bereichen möglich wird. Aromatische Alkohole konnten auf diese Weise nicht bestimmt werden, da sie entweder zu lange Reaktionszeit oder aber gar nicht umgesetzt wurden. Allerdings beeinflußte ihr Vorliegen in der Probenlösung die Analyse bzw. ihre Auswertung in keiner Weise.
Somit wurde eine weitere Möglichkeit geschaffen, in kürzester Zeit Alkoholgemische so aufzutrennen, daß eine Aussage über die Konzentrationen möglich wird.
Positiv wirkt sich dabei die Besonderheit der Enzymanalyse aus, die es ermöglicht, in einem Stoffgemische Einzelstoffe hochselektiv, d.h. also spezifisch zu erfassen, ohne daß vorher störanfällige Trennverfahren erforderlich wären.
Die Ergebnisse der Untersuchungen wurden teilweise als Poster beim "12th International Symposium on Microchemical Techniques" in Córdoba vorgestellt bzw.
zur Veröffentlichung in den Fachzeitschriften "Talanta" und "Analytical Chemistry"
eingereicht.
