Contributo alla conoscenza di una granulosi di Eucosma griseana (Hiibner) (Tortricidae, Lepidoptera)

Clnssificnzionc di Oxford; 132: 151A : 153 l•l9H

Contributo alla conoscenza di una granulosi di Eucosma griseana (Hiibner) (Tortricidae, Lepidoptera)

quale fattore limitante il pullulamento dell'insetto nella Engadina alta

cli M,mro E. ,\lartii;n1111i •

Istituto ;,·izzero di ri, erchc forestali e Istituto entomoloi;ilo

<lei l'olitc,cnÌLo federale, Zurigo

Introduzione

2 Cenni storici

21 Sulla tortrkc del lnrirc

INDICE

22 Sulln mnlattin dello tortrice del larice 3 Materiali e metodi

31 Purifii-uzione del ,·irus 32 Dosaggio elci , i rus . 33 Ra,·roha delle larve

M ,\Hc,·omento delle larve e delle pure 35 lnotulozionc <lcllc Inn·c

36 Titolazione del potere patogeno 37 l'rcpnrati istologici

38 l\lisurc igicnid1c

•I Ln granulosi lun·olc ,I) Sintomatologia 42 Istologia patologica 43 Patogenesi

•M Durata della ,·itu . ,)5 Specificità del virus

,)6 Trasmissione del virus da generazione n gcnernzionc ,

i; Lo cpizoozio degli onni 1953-1955 .

51 Fluttuazioni del numero di indi,·idui della tortri,~c 52 Distrihuzionc gcogrnficn dei focolai epizootici 53 ~lortolitù cousnto dal ,·ìrus

5-1 Considerazioni generali 6 Il potere patogeno del 1·irus 7 •\lcuni nitri fattori di mortnlitù

il Uno microsporidiosi 72 L'inanizione 8 Conclusioni 9 Rinssunti . IO Bibliografia

l'~glno .'li2 374- 374 376 378 378 379 380 381 382 38,1 385

;186 387 387 388 391 393 394 395 395 395 397 398 -I02 405 ,108 408

·l09 410 411 Hl

• l'rcscnte indirizzo dcll"auturc: Dcpartrnent of Biologica) Contro!, Unil'ersity of Calì- fornia, 1050 Snn Pablo Ave., Alhany 6, California.

1 Introduzione

Nel 1857 A.Dava 11 (fig. l) pubblicava per primo una serie di osservazioni eseguite sul pullulamento della tortrice del larice, Eucosma griseana (Hiibner)^1, nelle Alpi elvetiche. Da allora e fino a oggi la tortrice del larice non ha mancalo di preoccupare i forestali e gli entomologi svizzeri. Ma ebbe a trascorrere quasi un secolo dalla pubbli- cazione delle osservazioni del Dava 11 prima che il problema della limitazione del pul- lulamento dell'insetto fosse messo sotto nuova luce, e ciò non più in base ad osservazioni superficiali, ma ad analisi profonde del fenomeno biologico. Sotto questa nuova luce, un gruppo di studiosi si è proposto di indagare le cause della variazione cli densità di alcune popolazioni ² di E. grisearia, ciò che è un problema eminentemente ecologico.

Essi avevano la speranza di trarre dalla conoscenza acquisita nozioni necessarie pe,r combattere con durnturo successo un insetto così temibile.

L'ing. H.

J

e n n y, capo dell'Ispettorato forestale del Cantone Grigioni, decideva nel 19-16 di far eseguire in ogni comune in cui si fosse nolala la presenza della tortrice del larice rilievi che permettessero di stabilire la distribuzione dell'insetto e l'importanza dei danni da esso causali nei lariceti. In seguito ai risultati di questi rilievi l'ispettore

J

e n n y affidò nel 1948 al dolt. C. A ^II e r, allora assistente scientifico presso l'Ispettorato forestale del Cantone Grigioni, il compito di studiare le pos~ihilità di lolla conlro la tortrice del larice. Una co1111111itù <li studiosi venne organizzata sollo la guida del prof.

doti. O. S c h ne i cl e r-0 re li i, giù dircllorc <lell'Istituto entomologico del Politecnico federale in Zurigo. ì\c prese In successione

il

dirctlore attuale del medesimo Istituto, prof. clou. P. Bo ve y. Così ebbe a svilupparsi via ,·ia piÌI ampiamente un'organizzazione la quale ha per scopo lo studio cli tutti quei prohlcmi bio-ccologici che possono o sem- brano avere una certa importanza per la soluzione del compito assunto: la lolla contro l'insetto.

Uno dei primi frutti di questo nuovo periodo d'inclagini è lo studio di Do I f (1950), il quale stabilisce l'importanza elci danno causato dalla tortrice in un determinalo ter- ritorio, l'Engadinu alta. Il mancato accrescimento elci larici, secondo Do I f, è di circa il 30

%

ogni anno in cui vi sia pullulamento dell'insetto: una perdita incontestabil- mente grave. Il risultato dello studio del Do I f è confermalo da E.Bado u x (1952), il quale inoltre fa notare che a questa perdita 1rnr elevala (il 30

%

di prmluzione) si

1 Lu specie Ericosnw grijc,m11 ( H ii h ne r) è anche nota sotto mollissimi altr.i nomi: poicl1è troppo lungo sarebbe c1ui clcrwarc tulli i sinonimi, rncc-omnnclo ol lettore le liste di li e i n r i ,. lr (1923) e di Es e 11 eri e h (1 !J:ll). Nella lcucrnlurn onglosossonc lo nostra specie è più nota sollo il nome di Zcimf1/,cr11 dirrim1t1 (C. u e né e). Di <[IICsln srt:cic lii ok s y rn o v 0955) ho descritto due forme, diHcrcnziohili per i loro 1:ornlleri morfologici e biologici. Le lnn·c d'una delle due forme virnno sul pino ennhro (/'i1111.~ Ceml,rn L.), sul 1oino mui:o (l'i111L, Mugo Tu r r n) e sul pino cni;udincsc (/'i1111., .,ilr-c.,cri., L. ,·ur. cngadfocn.~ìs H e e r), 11ucllc dell'uhru sul )orice europeo (Larix dccù/11<1 l\l i 11 e r) c. lnlrnltu, sull'nliclc rosso (Picc11 c:rccl.~11 Link).

Se non snrìt altrimenti spcrificalo, sì trnllcri1 in seguilo sohunlo cl,•llu dormu ,lei lnrire1>, In pii, frc11ucnte in Engndinn.

• L'so il termine <po11oluzinn1• 1wl s<enso ,li I',. u r I (in Al l ce, Emerso n, l' u r k,

I' a r k e Se hm i d t, J 9,i9): .i,\ 110111tlntion is o group of lh ing in,lividuols set in o frnm<J thol is lirnitcd und dclinc,l in nsp1•ct of lioth lime ond spore.>

372

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Jnjl~tflllllltrr, U,11(11 D. ertlltr.J,

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!t)d ij,r~,!)oum•I ,rf,6rlnl noon•lll,6, lm !Dur'6f,6nlll I i&ogtn ftorf I• .\; t 9 n t ~•• !Badi)rudrrrl In trn1hr9, 1um !Dnlfr von i lh, ~O !llw, tronlo IS,611>ttJ1tgdlt1. 11111 Soft3mltr 11>11\rn tn ••• 61 ... ••f•ll. hr

!)oamal 1• )lrfr111 1Jrrlft 1• lltltrn.

Tortrlx plnlcolnnn.

Zrlltr.

Nou velia l'ha lene d u 111élèze.

Cet inseclr assez peu connu des ento111oloi;iste,, n'a jamais éM citi, cncore dans les ouvrages roresliers. R1t1e- bourir, lui-mtlme, n'en a pas foil me111ion dan, ses c.i:cel- lents ~crils: bien que J'on dnivc, 11arail-il, ,~ ranger 1lans Ics insectes très nuisililes.

Monsit'ur Zeller de Glngau qui ra dècrit. un dr.s premiers. lni o dunné le nom de Torlrix. pi11icohna.

Hubner, ovanl lui, l':ivail figure d~ns son nnvrage sur Ics papillons d'Europe (europtiisrhe Srhrnollcrlinge) fig 135.

,ous le no111 do T. griscana; mais la ligure qu'il en dou-

!l•l•e••a vnr. u

fig. l

Ln primn 11nginn del ln\oro di A.Da\' a 11, del no,·emhre 1857; D n \' n I I fu uno dei primi n riconoscere l'importnnzn forestale dello tortrire del lnrice.

:.,j ::

aggiunge quella dovuta alla diminuita o addirittura mancante fruttificazione dei larici devastati dalla tortrice: danno questo molto grave, «puisqu'il compromet le renouvelle- ment, donc la vie mcme des mélèzeins». In sei pubblicazioni (Ba 1 te n s w e

il

e r, 1955;

Kaelin e Auer, 1954; Maksymov, 1955; Maksymov e Auer, 1955; Marti- gn on i, 1954 e 1955) e in vari rapporti annuali ³ furono comunicati alcuni risultati delle ricerche eseguite a partire dal 194-9 in Engndina. Il presente lavoro s'inserisce pure in questa serie di pubblicazioni.

II primo mio scopo fu di stabilire se la malattia delle larve della tortrice, malattia giù menzionata in passato da alcuni studiosi, esiste anche in Engadina, e se poi la pre•

senza del morbo fosse accertata, determinarne l'agente patogeno. Nel 1953, in seguito alla scoperta del virus che è causa di un morbo fatale per le larve di E. griseana, mi pro- posi di studiare quale importanza la malattia può avere nella determinazione delle flut•

tuazioni di densità dell'insetto e, in generale, quale è il decorso dell'epizoozia.

Le ricerche, delle quali viene trullato nei capitoli che seguono, furono eseguite negli anni dal 1950 al 1955. Tutta\·in, in seguito ad occupazioni che mi tennero lontano dal- l'Engadina nell'estate del 1951 e, in parte, in quella del 1952, soltanto una serie limitata di osservazioni poterono essere fatte in quei due anni. Il materiale dell'anno 1951 fu raccolto e gentilmente messo 11 mia disposizione dal dott.J.K, M aksy mo v. collabora- tore scientifico del prof. doli. P. Bo ve y.

Lo studio di una epizoozia da virus in popolazioni d'insetti ha richiesto In messa a punto di metodi nuovi di ricerca 4 • Il lavoro di sperimentazione dovette essere fatto sul posto, durante la stadio larvale dell'insetto, lontano dai laboratori dei centri universitari cd in condizioni tutt'altro che favorevoli a questo tipo di indagini. L'insetto è assai restio ad un facile metodo di allevamento in laboratorio e l'esistcnzn di una diapausa allo sta•

dio embrionale non ha permesso finora la produzione di più di una generazione all'anno.

Queste e molte nitre difficoltà mi sono trovate dinanzi, cd è grazie al continuo appoggio dell'amico dott. C. A u e r se sono riuscito a perseverare nelle ricerche. Gli rivolgo l'es- pressione della mia profonda gratitudine.

Desidero esprimere i miei sentiti ringraziamenti al prof. doti. P. Bo ve y, capo della comunità cli studi, che mi fu sempre l11rgo di consigli e che mise generosamente a mia disposizione parte dei fondi devoluti ·all'Istituto entomologico del Politecnico federale per questi lavori; così pure sono riconoscentissimo al prof. dott. O. S c h ne i de r•

Or e 11 i, il quale mi ha iniziato al metodo sperimentale in biologia e che mi fu guida esperta nel corso del primo anno di ricerche. Grato sono pure al prof. doti. H. B urger, ex-direttore dell'Istituto svizzero di ricerche forestali, al prof. dott. E. A. S te in ha u s, direttore del Laborntory of insect pathology, University of California, Berkeley, al

~ Hopporti onnunli di C. Auer, W. Bnltensweiler, P. 80\"cy, J. K. i\Inksymov e .:\I. E. ìll art i g n on i ; di questi rapporti esistono solo pochi esemplari, riser\'ati ai membri della romunitìi. di studi ed agli Istituti pnrtecipnnti ni larnri. I dati contenuti in detti rnpporti e ancora inediti saranno oggetto di prossime p11bblica2.ioni dn parte dei rispettivi outori. Sono assai grato ni doti. C. A u e r e J, K. ,Ma k s y mo\', i qunli mi hnnno generosamente per- messo di usare molti dei dati contenuti nei loro rapporti.

• Per n go 11 o ricordo nello prefa:t.ionc olio suo «Tecnica microbiologico> (Ho e p I i, Milano, 1945) che <un buon sperimentatore deve essere nnzitullo un buon tecnico>.

sig. K. M. 1-1 u g h es dello stesso Laboratorio, al dou. J.

K.1\1

a k s y mo v nonchè a tulli gli altri col leghi della comunità cli studi che ìn rnrie occasioni mi hat1110 off crto un aiuto indispensabile per la continuazione delle ricerche.

Con particolarn riconoscenza ricordo l'aiuto ,!atomi eia\ prof. clou.A. Linde r del Politecnico federale e dell'Università dì Ginevra nel corso dell'analisi matematico-sta•

tistica di alcuni dati sperimentali e cosi pure l'assistenza che mi venne fornita dal prof.

dott.A. K u rt h, direllore dell'Istituto svizzero di ricerche f oreslali, il quale ha immesso nuovo dgore nella nostra comunità di studi e che ha accettato generosamente di pubbli- care il presente scrillo nelle cMemoric> dell'Istituto che egli dirige.

li dou.C.Aucr, il signor V.di S11vero cd

il

prof.dott.E.A.Steinhaus si sono assunti la fatica della lcuurn critica del manoscritto. Sono molto gfalo a loro per avervi apportato correzioni e miglioramenti, pur considerandomi solo responsabile delle opi- nioni qui espresse e degli errori ancora presenti.

2 Cenni storici

21 Sulla tortrice del larice

Le principali ragioni per cui la tortrice del larice fu cd è oggetto di molta allenzioneda parte di forestali cd entomologi sono due: in un primo tempo l'importam:a dei danni da essa causali preoccupcì in modo 1mrticolarc i forestali (Oavall e Coaz furono ispellori forestali); più tardi i hiologi. scoprendo le flulluaziuni di densità elci le popo- lazioni del l'insello, si dedicarono allo studio 1lelle gradazioni ⁵ di E. grisemw.

Esaminando i la\'OrÌ pubblicati clic riguardano E.grisemia si può distinguere tre periodi di st1uli e ricerche. Nel primo periodo furono accumulale, pcrù non sempre sistemuticamcntc, notizie sulla distribuzione, sui clnnni e sulle abitudini della tortrice.

Alcuni autori emisero anche varie ipotesi sull'origine delle fluttuazioni cli clensità: un Ano II i III o ( 1857) e Da v 11 II (1857) ,·i1lero nell'uccellagione praticala allora nel Pie- monte e nella Lombardia una delle cause d'aumento del numero degli insetti. Ra t z e.

li ^li r g (1868) attribuiva invece al clima la responsabilità dell'aumento riel la popola- zione della tortrice ^11• Queste ipotesi non erano però sufficientemente fotulatc. Oltre ai lavori già citali ricordo ancora quelli cli Yon Etzel (1880), Coaz (1880)⁷ e Ma- re se h ( 1881). Di non trascurabile im1wr1unzu sono pure i rapporti dei sen izi fore- 6 Userò il termine otgru<luzionc:1> (inglese: <gro,!ution ; 1t•1l1·,wo: ._Gru<lutìon>) nel M•11~0 di Ho,

<le II h e i ¹¹¹ e r 0938): ~In stu<lying a11iuu1) pDp11lutiu11s wc 1ldi11c a gradntion as thc inh·nal lictwc,·n u1u, lnwest point of 1he po11ulu1ion ehh and thc next, tlms indndin~ 01w full ^\\UII' of 1l1c f1111·1ua1iu11.•

4 <,\ llcrmcist werden sich, we1111 nurn <lic U rsuclu:n l(rn•~cr I nsektcn-I nrn<ioncn gr,ùndlkh 11111t•r-

s11,·ht, <lìcsdhcn mcl1r uls klimnlischc unii mctcorisehc uu,·hwcìscn lns,cn.» ( H u t z eh u ,r i;,

18611, )I. 63-6,l.)

' Co az u,·c,·a giù allora in.Jili<lnulo la chia,·c d<'I prol,lcmu, Egli Kr.i\'C lnfutti (11180, p.118-89):

«.Noch hlciht uns <lic llofCnun;; iihrig, <lass <lic 7'urtri.T pi11in1lcmll, glci1·l1 wii, \'on JU6éi ani )11()6,

so uuch \'1111 11179 nuf 111110 \'crschwi11dc11 m.rdc. Snllte dii·s wirklil'h dt-r Fnll scin, so ,·crluugl Wisscnschuft und Forstscl1111z rnn uns dic Ursnchc <liesc~ \'crscln.-indcns zn rrgrii11dc11,l>

371-

stali: particolare interesse per la presente ricerca rh·estono i rendiconti del Cantone Grigioni (Ano n imo, 1865, 1866a, 1866b e altri).

;\/cl secondo periodo, che inizia con le importanti e fondamentali pubblicazioni di Schernthaner (1892) e Coaz (1894,),

la

biologia e la distribuzione dell'insetto furono oggetto di studi intensi. A questi due lavori seguono, in ordine cronologico, quelli di Standfuss (189-1-), Escherich e Baer (1909), Anonimo (1909 e 1911), Coaz (1912), l\foreillon (1912), Anonimo (1913), Enderlin (1913), Fuchs (1913), Coaz (1917), Standfuss (1917), H.Badoux (1919 e 1922), Barbey (1927), Nìigeli (1929), Barbey (1933), Thomann {1929) e Prell (1930).

Escherich (1931) riassume i risultati delle ricerche fatte fino allora e traccia contemporaneamente le grandi linee della ricerche future, definendo il problema cen- trale degli studi su E.grisca11a^8• Così ha inizio il terzo periodo, principalmente di ri- cerca ecologica; su Ile necessità di questa ricerca scrive S c h ne id e r -O re 11 i ( 194.S).

In Austria J ah n (1948a, 194.Sb, 19tJ.9a) e S chimi t s che k e J ah n (1952) studiano alcuni aspetti di una gradazione. In Svizzera si cominciano studi su larga scala nel 1949 e si costituisce la comunità di studi di cui si è parlato nell'introduzione. Da parte fore- stale si determina la distribuzione (H. Bado ux, 1937 e 1938) e l'importanza dei danni della tortrice (Dolf, 1950; E.Badoux, 1952).

Un primo esperimento di lotta chimica secondo criteri scientifici fu eseguito in Sviz- zera nel 1946 con DDT (Me ye r, 1947) ed un secondo esperimento, con una miscela di DDT e ECE nel 1953 (Mak sy mo v e A u e r, 1955). Mentre in ambedue gli esperi- menti le larve di E.grisea11a si sono dimostrate molto suscettibili all'azione insetticida di preparati a base di DDT e ECE, assai diversi sono i dati concernenti il numero di insetti utili o indifferenti della fauna silvestre morti in conseguenza del trattamento chimico.

Me y e r trova su tele di racco ha della superficie complessiva di 9, 7 m~, in quattro con- teggi, in media solo 47 individui morti, appartenenti a specie di insetti utili o indiffe- renti, per ogni mille larve di tortrice uccise. M'll ks y mo v e A u e r trornno invece su una superficie di 30 m2• in 6 conteggi, in media ben 2286 individui di specie utili o indif- ferenti per ogni mille larve di E.griscana. L'esperimento di Maksymo\· e Auer ha chiaramente dimostrato che non è possibile combattere la tortrice del larice con DDT e

ECE

senza arrecare grave danno a tutta la fauna entomologica del lariceto.

I

risultati ottenuti indicano che altri metodi di lotta contro questo temibile insetto devono essere studiati, prima di agire così drasticamente su una parte tanto importante della fauna di tutta una foresta O•

8 dlii Jcm lctzten, nlso drithm Jnhr dcr Frosspcrìoùc bridtt dic Grnd1111tion mcist dcrmnMen plotzlich uh, doli im folgcnden Johr ~cwi>hnlid1 nur noch ganz scltcn Falter odur Raupcn zu findcn sind. Wodurch di~e pliitzlichc Krisis noeh einer bestimmtcn Douer rnrursocht wird, wiirc spezicll eini;chcrulcr Untcrsuclmngcn wert.> (Es e 11 eri eh, 1931, p. 32<1.) Bisogna 1·crn- 111entc ammirare In chiarezza con c:ui Con z (1880), mcz:i:o secolo primo di Es eh eri eh, a1·e1·11 definito il problema.

• < ••• solnngc die l\Iiiglichkcit cincr BukiimpCung des Liirchenwicklcrs au[ hiologisther Grund-

lnge nicht ausgcschlossen ist, k11nn cinc Grossfliic:hcnopplikotion der chcmi~cl1cn Priiparnte im Waldc nidtt hcfiirwortct wcrdcn,> (J\t a k s y mo ^1· e A ^II e r, 1955, p. 490.)

22 Sullo mnlnttia della tortrice del larice

Già nel 1865 furono notati nel Cantone Grigioni «indizi» rn che lascia, ano prevedere una diminuzione della densità di popolazione della tortrice nell'anno seguente (Ano - n imo, 1866b). Quali esattamente fossero stati questi indizi non sappiamo, mn è proba- bile che si tratti dei fenomeni più tardi descritti da Conz (1894). Verso In fine del1a terza gradazione engadincse di cui esistono notizie, Con z (1880) accennò per In prima ,•oha a malattie della tortrice del larice 11 •

Nel 1888, nel corso della quarta gradazione engadinesc, una malattia probabilmente epizootica fu osservala da Co nz (1894) nel le popolazioni dì E.griscmw: la descrizione di Coaz non contiene dettagli sul quadro patologico, ma non è da escludere che si sin trattato già al lorn di una epizoozia causata da virus ^t:?. Con ardite parole Co a z indicò pure la possibilità di combnllcre In tortrice con un agente patogeno, sotlolincando l'ur- genza di ricerche in quel campo^1:1• In modo simile si esprime Stnndfuss (1894, p.8-9). Mentre Th o man n (1929) non ebbe occasione di osservare epizoozie in pupo•

lozioni della tortrice, sia nei suoi allevamenli di laboratorio come nei lariceti, De 1 Guerci o (1929) nolò a due riprese, nel 1927 e nel 1928, il diffondersi di una malattia epizootica fra le larve di E.grisrmia in Val d'Aosta 14• Causa della malaUia sarebbe stato, secondo De I G u e re i o, un E11tomococc11s .i:non ancora detcrminnlo~, un orga•

nismo situato filogeneticamente frn funghi cd alghe da una parie e batteri dall'altra. Il nome generico E11to111ococc11s è stato usato dn De I Guerci o per gli ipotetici agenti di quelle malallic chiamate allora .i:giallumc» cd oggi in gran parie allribuitc al gruppo delle JJOlicdric. Poichè De I Guerci o non entra in clcllagli patologici mn si limita ad alcune osservazioni generali sull'importan:r.a della epizoozia, è impossihilc stabilire oggi se le larve fossero veramente affette da policdrin come egli crede:

il

lavoro di

so < ••• indcsscn schcincn, wcnigsteos im Ohcrcngudin. Anzcirlwn ,·orhumlcn zu scin, dass dicscr

Wuld,crdcrhcr im Ahnchmcn bcgriffcn ist., (A 110 11 i 111 o, 11166 I,, p. 109.)

11 <Tritt niichslcs Juhr tlus lnsekt "icdcr in 1'11nssu, auC, so i.si uus;;cr n11f ùic insd,tcnfrcsscndcn Viigcl 1111r nnrh nuC Hiilfc scitcns dcr khrwumonc unti anstLrkcndcr l'il:z.krnnklwilf'n unlcr dc11 ltuupcn zu lrnlfcn., (Co u z, Hl/IO, Jl. 89.)

" c.Z11glciclr wurcn dic WìpCchricl,c his lrcrnntrr ZII l'flnnzcn 1·011 nur 20 t'm Jliìllt' umsponncn.

Das Vn~pinntn gt•selruh ort lolrcdrt rnn Zw .. ig z11 Zwcig, so dass dns gn1121i lliinrnelwn 11111-

schlciert crsclrien. Dicsc Gcspinsthilùungen unti dus Wit1fdn dcr Ruupcn lies,,.•n nuf dic Wi1,fcl- krnnkhcit (SrlrluHsuch1, Flu<'herìc) sclrlicsscn, unti wirklich fond dcnn u11t'h dcr Frnss im Untcr- cngndin clarnit so zicmlich scincn Al,schluss, •• ,> (Con z, llt9-I, p. Il.)

•~ C' • •• und miisstcn wir dcn dcr Huupc dcs grnucn Liirdicnwicklcrs verdt!rhliclrcn Bucillns, dcn dic Nntur mii so 1111ss,·rordcntlicl1crn Erfolg zur Anwc,ulurrg l1rh1g1, crst nodi ou~lirrdig mnchcn.

Jcdenfnlt,; sin<l die l1t trcffcndcn Versuchc sd,011 bei dcm sporudisd1cn Auflrclcn ùcs Wicklcrs 11ml soforl unms1cll1:n, dumit clic Wiplclkranklrcit nodi irn i;l1:khe11 .lnhr siclr cinslcllc und jcùcn- fnlls im zwciten dcrn Fruss cin Ende l,crcitc,> ( C o a z , IH9•1, p, 1 i.)

u

~ u

clirnrlanu-1110 elci numero dcll'insctlo (Stcg111wpl)'c:l111 ,linimw Gn, o Tortrice diniunu del larice) ha luogo nel secondo anno a causa tli un mkrnhio, d1c, con lnrghc1.1.n 110\c\'Olc e prov- ' idcnzinlc inn-,,\c le larve e gli nitri stndi ,h•lln Tur1rit e, i;iì, al secondo 011110 tlclln s11n azione;

sil·cl11'· 111 terzo anno la Torlrit-c scompare e le piante riprcrulono il loro norrnulc nntlnrc.> (De I G II e r r i o, 1929, p. 2:i2.) Ed ancora~ .:Dulia inlt•nsiti, con In 1111nlt• h· lan·c si pnisentuno 111tat·<·n1e du ,1111·s1i rnirrol,i, si Jlnlrchhe ••onsi1diurc cli non ••seguire alnm lrallnmcnto di difesa, pen·hè i dclii rnirrnhi, tra non Molto, unnnno rugiont? completu della inlc•,lionc.-. (h i, Jl, 232.)

Del Guercio contiene infatti molte e gravi inesnttezzelli, e non è improbabile che l'autore abbia scambiato una malattia da \"irus per un'altra.

Prell (1930), all'oscuro delle constatazioni fotte da Del Guercio, afferma di non conoscere l'esistenza di epizoozie in popolazioni della tortrice del larice.

Nel corso di un pullulamento negli anni 1945, 1946 e 1947 Schneider-Orelli ebbe campo di osservare, in Engadina e altrove, la presenza di una malattia in gran numero di larve di E. griseana. Dall'esame di lettere scambiate fra S eh ne id e r- 0 re I li e gli Ispettori forestali di circondario ing.

J.

Guido n e ing. O. W in k I e r ¹⁶ risulta che la malattia deve aver avuto una grande importanza nella riduzione del numero degli insetti nell'estate del 1947.

La Jahn (194911, 1949b, 1949c) annovera una malattia di E.griseana fra le cause principali del declino d'una gradazione della tortrice in Austria nel 1948. Secondo la J ah n si tratterebbe di una poliedria. Sfortunatamente, ella non ha eseguito prepara•

zioni istologiche nè ha tentato di mettere in evidenza le unità virus all'interno delle inclusioni poliedriche: riesce quindi oggi estremamente difficile stabilire se i poliedri rinvenuti dalla J ¹¹ h n nelle larve ammalate e morte erano veramente inclusioni di ori•

gine intracellulare causate dall'infezione da virus oppure, come a mc sembra più pro- babile, prodotti di metabolismo a base di acido urico o urati (Ma rt i gn on i, 195-1-;

Krieg, 1955). Le strutture interne dei cristalloidi descritte dalla Jahn (1949a) e visibili in alcune figure (ivi, fig.12b e 12c) sono caratteristiche di alcuni tipi di cristal- loidi di acido urico presenti nei tubi malpighiani di varie specie di insetti.

Nel luglio del 1953 Martignoni (1954) rinvenne larve di E.griseana ammalate e morte, nella Engadinn alta: alla diagnosi risultò trattarsi di granulosi i;,

La scoperta e la descrizione della granulosi sono <li data relativamente recente (P a i 11 o t, 192611); la diagnosi non è facile e la malattia è ancora poco conosciuta:

casi tipici di granulosi sono stati constatati solo in 17 specie di insetti, finora. La pre•

senza nei cadaveri delle larve di cristalloidi provenienti dal lume dei tubi malpighiani è un fenomeno abbastanza frequente ed atto a trarre in inganno chi non abbia qualche esperienza nella diagnosi delle malattie da virus degli insetti (K rie g, 1955). Pur non essendo esclusa la presenza anche simultanea di granulosi e poliedria in individui di una determinata specie di insetti (tab. l), le ragioni sopra esposte invitano a pensare, dopo accurato esame delle notizie a nostra disposizione sulla malattia di E. griseana, che le epizoozie ricorrenti da ormai quasi un secolo e sicuramente constatate a partire dal 1888 in Engadina alta sono dovute ad una virosi del gruppo delle granulosi. Persona}.

mente, non ho potuto mai trovare una sola larva affetta da poliedria, pur avendo esa-

" S le in ha u s non si esprime troppo favorevolmente sul la\'Oto di De I G u ere i o qui citato.

Egli lo definisce <tone of thc most pcrplexing ond incongruous papcrs en:r published in the field of inscct patholog)'>. Ed in seguito afferma: , ... nt ony rate it is difficult lo imngine ju5t what il wns tl111t D e I G u e r t· i o snw in his prepnrntions.> (S le i n h n u s, 1949, p. ,~20.)

16 Queste lettere sono state gcnti!mcutc messe a mia disposizione dal prof. doti. O. S e h n e i d e r • O re 11 i,

11 Il tenninc iuglc,e Ìl cgranulosis>; in lingua tedesca In mnlattin Ìl stata designato col nome di cKnpsclviniskrnnkheit>, in lin,;ua frnnre!'c q;pscndo-grnsscric> e, recentemente, ,i:grannlosc>.

Insetti su•cdtihili ad nmbt!duc le ,·iro~i, 1101iedria ti grnnulu~i

f'un,t, fo m11rim111,1 e I I h. l

f.lwrìstm1c1m1 /11111i/1·rn11fl H.:lnn.)

b ti(:mcnc '" mc,1 (Il r11 r ~ l lùn:,m ~cgclrlm S r h i f f.

/'ieri, rt1/1<1C (I,.)

l'sc11rfolc1in 1111i1mw·ta (Ilo~·.)

I. u 1q! 1• n l111 .-11 ( I 9'i(, l ,. W e i s C! r ( 19.'ili) llcrgul d C 19~9)

S t ,. in h a 11 s ( 1919) I' a fl I o l 09:{6)

5 Il C I! I Ili li Il ( ) 9:16 I I'

T n II a <l n (I 95;1)

f:hapman e Glascr

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Fonti

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Bcrgold Cl91U)

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Thum 1•so11 (1951) T11nu1l11 (1%~)

mi11ato strisci, sezioui istologiclw e ultre preparazioni 111icro,;co11iche cli oltn• qualtro•

mila lnn·e di E.grisl'(ltlll.

Si tratta ilei sccoll(lo caso, dopo quello di C11co1xi11 11111ri1ra11t1 (llh.) 11ell'aha Valle del Heno (Ilucher. 195H). in cui una granulosi assume forma cpiwoticu e si inseri,;ce in quel urmplcsso cli forze naturali che riescono u dccinmre le popolazioni degli i11selli.

La maggior parte delle epizoozie da \ irus sl11<liute nel passalo 1lagli entomologi sono do\ulc a polieclrit'. Troppo poco si sa invece sulle granulosi e questa ,; una ragione <li più per intensificare lo studio cli una malallia che raramente possiede 1111 così cle\ oto potenziale epizootico. Il caso della lorlrice cliniunu ciel larice mi semhra icleale per questo studio, poichè le gradazioni hanno 1111 periodo rcluli\amenle l,rc\'c e µli insclli sono distribuiti su un territorio mollo ben definito.

3 Materiali e metodi

31 Purificazione del ,·irus

Il metodo di purificazione del ,·irns è stulo clcscrillo da \la rl i g11011 i (195-1). Per le inoculazioni furono usate sospensioni di granuli prh-e di unilù ,·irus lihere. 11 grado di p11rificazio11e tielle sospensioni fu clctenuinuto mcdiunlt· il microscopio elellronieo, 11er contrasto di fase ccl in campo m-curu. Come si vedrà in seguito, per lo studio elci 11otcre pulogcuo cli 1111 viru"' 1·· necessario usure sospen,-ioni costituite di 1111 unico si,.tema I inclusioni sole o uni là virus liherc) oppure slaliilirc la proporzione di unità rirus lihcre in esse presenti.

371-l

32 Dosaggio del virus

Le sospensioni di granuli furono preparate con acqua bidistillata sterile deacidifi- cata per ebollizione. Per il dosaggio del virus nella sospensione di partenza si seguì due Yie:

a) Microdosnggio dell'azoto contenuto nella sospensione, secondo il metodo D u ma s tR.

Va notato che il dosaggio dell'azoto per combustione della materia organica per- mette di operare su piccoli quantitatÌ\·i di questo elemento con una precisione supe•

riorc a quella del metodo micro · K j e Id ha

I.

b) Valutazione numerica diretta cd indiretta dei granuli. Per la valutazione numerica diretta fu utilizzato il conta-microbi di Petroff-Hnusser cd il microscopio a contrasto di fase. Il conta-microbi di P et r o f f •Ha u s se r, giù usato nel campo della patologia degli insetti da Bi r d tu e W ha I e n (1953), ha

il

vantaggio di avere una cellula profonda soli 20 /I, mentre i soliti ematocitometri (così quello di Brcuer) hanno una profondità di 100 /I· Inoltre, il conta-microbi usato ha lo spcs•

sore di un portaoggetti normale (1,4 mm), permettendo così di servirsi per In nume•

razione anche dei condensatori per campo oscuro e dei sistemi ottici per contrasto di fase, ciò che non è possibile senza speciali accorgimenti con l'ematocitometro di Breuer, su cristallo dello spessore di 4,7 mm. Il numero dei granuli fu dcter•

minato per un volume corrispondente alla profondità di campo dell'obbiettivo per contrasto di fase Z e i s s Opto n 40/0,63, cquiYalcnte a !' 9,36 per le sospensioni usate: infatti, dato il forte movimento browniano delle inclusioni nonchè in consi- derazione dell'ingrandimento usato, è difficile eseguire conteggi successh·i in due campi sovrapposti senza commettere errori. Moltiplicando il numero di granuli determinato per mm² per il fattore 107 si ottiene il numero di granuli per mm:¹ della sospensione esaminata.

La valutazione numerica indiretta fu eseguita in base ai valori d'analisi chimica della sospensione di partenza e del peso medio delle inclusioni calcolato in base alle loro dimensioni misurate al microscopio clellronico (!VI a r li g non i, 1954,). Per il peso specifico dell'uni là Yirus fu usalo il valore 1,30 (secondo Ber go I cl, 1953) e per quello del materiale capsulare il valore 1,36211•

I risultati ottenuti sono: contenuto d'azoto D u ma s della sospensione di partenza, 0,047

% ;

numero di inclusioni contenute nella medesima sospensione, fra 57

x

10° e 54-7 x 10¹¹ granuli per cm:1•

Per tutte le successive diluzioni si usò la medesima sospensione cli partenza ed acqua bidistillata sterile deacidificata per ebollizione. Nel seguito ci si riferirà alla con-

16 Il ùosnggio dell'uzoto fu eseguito dul Lnhorntorio micronnalitico A. P c i s k e r. R i I te r, Drugg.

,. Dc\'O al Ùoll. F. T. Il i r ù, Snult Stc. ;\lnric, utili informazioni (195,0 sul ,·onln-micrul,i di P e I r o f f • H n u s s e r.

~0 Il \'Olore 1,36 fu dctcrminulo dnl doli. G. H. O erg o Id, Snult Ste. i\laric, per le proteine ùcll'inclusionc policùricu di larve ginllumosc di Purtlwtria dis11ar ( L.); esso mi fu gcnlilmenli;

comunicnto dnl prof. doli. E. A.SI e in h n u s nel 1955.

ccntruzione elci singoli inoculi rispcllo ullu sospensione di partenza (la cui concentro•

zione è 1: l) e non giù alla percenlunle <li azoto in essi contenulo: a questa si può risa•

lire mcclianlc semJ1licc calcolo.

Poichè nel caso di E. gri.~cwu, In composizione <lei virus e delle inclusioni non è noia, si eviterà anche di parlare del contenuto di proteine degli inoculi. Esistendo note•

,oli variazioni 11el\a composizione <lei \'irus patogeni per gli inselli (Bcrgold, 1953), ritengo preferibile in questo caso il riferimento ai <lati elcll'analisi elcmcnlarc.

33 Ruccoltu cJcllc lur,·c

331 l't'r la clct1•rmÌlw:io111• dc•i limiti gcograf ici dt:lla 1•pi:;oo:i11

Per il calcolo della clcnsitù cli popolazione cli E.grisrn,w nei lariceti dell'Engadina vengono raccohi ogni unno, a partire 1lul 19-19, campioni di lane secorulo i metodi dc- scriui da K a e I in e A u e r (1954,L Il perrnunle mlelctto alla sezione ili statisticu del laliornlorio eia campo ili Zuoz procc1lc alla i1l1•11tificazio11e cd al conteggio degli inselti.

Le lar\'c morie o presumibilmente ammalate mi \"eni,nno regolarmente trasmesse dalla sezione di statistica. Fu co,.ì possibile esaminare, negli i.corsi anni, 1111 gran numero di lnrrn provenienti da lullu lu rnllata. I noltrc, in molti cosi dubbi o di particolare inter- esse, ebbi ud esegui re personalmente i prelcrnmcnli cli rnuleriule.

li materiale ruccolto per la sezione di statistica 11011 pote, u essere usalo per ricerche di caraltere quantilaliH> nè per la sperimentazione in luhorulorio; in molti cosi infalli le larve vcniva110 conservale alcuni giorni in rcfrigerunlc e 11011 pote\'11110 \'enir adollale misure igieniche Iuli da impedire un coutagio. Questo muteriulc, a parte le lune prele•

vale per la diagnosi, fu in gran parte deslinolo a cassoni d'allevamento con «hol•\1 ire barrieu (seconclo F i 1111 e y, f l 1111 de r s e S mi I h, 191,7), per la procluzionc in mossa

<li virus.

332 Per la spcrimcnta:icmc in laboratorio

Negli anni ]95,1. e 1955 furono prelevali campioni cli larve di determinala enti1ù.

specialmente per le ricerche di patologia. Una 11erson11 mmtila degli nllrczzi di sic11re7.za raccomandati dui servizi forestali (gli si essi usati dal 11ersonalc addetto al la racco ha di lnn e per In sezione di statistica; A ^II e r, 1950) saliva sui larici prescelti e gettava dal- l'albero tre loUi di rami, rispellivumente dal primo, secondo e ultimo terzo della chioma, slucc:rndoli a caso. Da ognuno cli questi lotti venivano raccolte 60 larve, possibilmente sc11zu toccarle, lasciandole ru-i loro fuscelli di foglie. Le 180 larve venh·ano immcdiatn- 11Jente Lrusporlate iu lalioralorio, 11110 parie di esse poste in isolamento nei recipienti di S te in ha us ( vedi oltre). le rimanenti utilizzale per gli esumi del coso ((liug11osi, esami ematologici, ccc.) o fissate; per le future ricerche istologiche.

:- mo

lig. 4

Scaffale a ripiani mobili, per l'ol•

lernmcnto di grandi serie di lnn·e, se, omio S t e i n h o u s.

lig. 5

Tuhctto usato per l"nllc,·omcnto di pupe, in isolamento, in celio a umi•

<lilii costante; in basso, a destra, lo griglia mctallieo.

Ili;. 9

;\li.-rotoroo n motore usato nel corso del presente studio (nci;otÌ\·o: SLA).

34 Allevamento delle larve e delle pupe

Le larve usate nel corso della sperimentazione venivano allevale secondo il metodo S te in ha u s²¹ in recipienti cilindrici di cartone dello spessore di 1 mm, aventi un dia- metro esterno di 89-90 mm e alti 100 mm. I cilindri hanno un fondo pure di cartone, mentre come coperchio si usa il fondo di scatole di P et r i, tenuto in posto da un cla- stico (fig. 2). In alcuni casi fu pure usato il metodo descritto da Eh ren hard t, Ba eh- m a n n, Diercks e Voge] (1953), inserendo fra il fondo cd il coperchio di scatole di P et r i un cilindro di cartone: questi recipienti non sono tuttavia cosi stabili come i primi descritti: essi, cnivano perciò usati solo in casi di emergenza.

Data la permeabilità del cartone, l'umidità relativa del l'atmosfera nella scatola di allevamento, in presenza di foglie e di acqua, risultò solo del 5

%

superiore n quella esterna, misurata nell'intervallo d'umidità 55-70

%-

Per le misurazioni nell'interno del cilindro fu usato un igrometro secondo Howell e Craig (1939) oppure un piccolo igrometro di precisione Lambrecht. I recipienti d'allevamento descritti da Lan- ge n bue h ( 1954,) non furono usali per questo studio, poich~ il rinno,·amento del mate- riale nutritivo è abbastanza laborioso e In loro costruzione relativamente complicata. Le scatole d'allevamento di cartone sono facilmente sterilizzabili, assai leggere ( un cilin- dro di c11rtone del tipo 11s11to pesa solo 28 g) e di basso costo.

Segmenti lunghi circa 10 cm di rami di due anni, ciascuno con quallro o cinque rosette di foglie, costilui\'!lno il nutrimento della l11rve. La base di questi rametti di larice veniva infiss11 in cotone idrofilo inserito a sua volta in un tubo di vetro del dia- metro di 19-20 mm, lungo 50 mm, riempilo d'acqua. I rametti così preparati o «bou- quets:, (Stei nha us, 1953) venivano messi nei recipienti d'allevamento con l'apice verso il basso (fig.3), il cotone rimanendo costantemente imbevuto d'acqua. Ad una temperatura media di 15° C le foglie si conservavano cosi fresche per quattro o cinque giorni.

I recipienti d'allevamento venivano numerati e ordinati su ripiani mobili di uno scaffale modello S te in ha u s (fig..t.). Ogni scatola conteneva una sola larva.

Appena formata, ogni pupa veniva prelevata con cura dal recipiente di cartone e messa in un tubo di vetro del diametro di 10 mm e lungo •IO mm. Tali tubi, chiusi me- diante un dischetto di rete metallica n maglie fini o di mussola, tenuto in posto da un coperchietlo d'alluminio forato (fig.5) vcni\'ano conservali fino allo sfarfallamento in un'atmosfera con 73-78

%

di umidità relati\•a. La costanza dell'umidità era garantita da una soluzione satura di cloruro di sodio.

' 1 Il pror. doli, E. A. SI e in ha u s si sene di questo melodo dell'alle\'11mento, ideato nel suo lnhorntorio, già dn rnri anni e con suc-1csa-0. T n no d 11 (1953, p. 236) ne dà 11n11 hrern dcs<·ri- zione,

35 Inoculazione delle lune

Per l'ìnfczione sperimentale delle larve furono seguiti clue metodi: iniezione nel- l'emocele, perforando la faccia plantare (secondo O erg o I ti, 1951) della prima zampa uclduminule dcslrn, oppure penetrando nella ca\ itù del corpo nei pressi dell'attacca•

tura ,!ella zampa all'ucldomc; e, metodo 11ìì1 frequentemente usato, introduzione della sospensione virulenta nel canale ulimenlure uttrmerso lo slomodeo. La inoculazione per os presenta ulcuni importanti vantaggi ril>pcllo alla iniezione intracmocclica: a) non

e

8

Apftnre1·1 hio ^1,cr il 111Ì1To,ln-ul!i:io ,ohunrlrit o dcll"i1101·11l11; ,\: ,·ite 111i,·ron11•1ri,·u:

Il: , crnii·ru: C: mollu.

:si ferisce la lnr\'a, e\'itando 1111 tra1111111 che potrchbe agire, direllarncnle o indircHamentc ( .rstrcss») sul decorso clclla malattia; b) si opera in condizionì piì1 prossime alle nalu•

rali, poicl1è l'infezione ha luogo normalmente attra\·crso lo stomotleo e 11011 per ferite clcll'i11tcg11111ento. Questo melotlo cl'inoculazione è staio dcscrillo tlettugliutamcnte da l\lurtignoni (1955). Per il tlosn;!g:io rnlumelrico dell'inoculo fu usalo 1111 appa·

recchio di propria costruzione!!: (fig.6) 11011 molto dissimile da quello clcscrillo da O II t k y e F est ( 19,1-2). La capaci1ì1 1lclla !>i ringu è cli 1 cm'1• L'ugo. 1111 capillurc di

\'Clro, ~ staio ,lcscrillu ila \larlil!'IIOni (1955) (fig.7). Per le inuculazioni per \ia

orale occorre passare l'orificio del ~·upillure ulla fiamma, per arrotondarne i margini

~ L'up11ur,·1·,·hin fu rn,truilo nel luborulorio mc1·1·n11ì1 o ,lcll'l~tìlllto s, i1.zcru ,li ri,·, rdu• fort-~lali ,fol sii;nor dlpl. 1cd1. T. S p r i n ~-

:-m2

lig. 7

Ago usato per le microinoculazioni, secondo J\l II r li g non i (1955);

A: ca11ill11rc metallico, raccorciato, di un ago (gagc 20) per.iniezioni ipodermiche;

n:

capillare di \"Ciro;

e:

ccrnlacca.

taglienti; per le iniezioni intraemoceliche invece dev'essere tralasciata questa opera•

zione2:1•

Per verificare il funzionamento dell'apparecchio le seguenti misure di controllo si sono dimostrate assai efficaci:

a) Presenza di bollicine d'aria nella smnga e nel capillare: il liquido continua ad uscire dall'ago anche dopo arresto del movimento dello stantuffo (D u t k y, 1942);

b) Presenza di corpi estranei nel capillare o capillare di diametro troppo piccolo: su un foglio di carta liscia non assorbente vengono depositate dieci gocce di liquido, corrispondenti ad avanzamenti uguali dello stantuffo; i diametri delle gocce, misu•

rati al microscopio stereoscopico, sono disuguali.

Ogni capillare veni\•a usato solo per la inoculazione di una data sospensione ad un unico lotto di larve, di regola 15, indi scartato. Dopo ogni inoculazione la punta del capillare ,·enirn disinfetlata con la soluzione seguente (Mc C u 11 o eh, 1945):

Formalina (38

% )

Nitrito potassico Idrossido di sodio

Etanolo (95

% )

q. s. ad

130 0,15 g 0,012 g 1000 cm:¹

Prima di procedere ad una nuova inoculazione, circa 5 mma di liquido \'etti\'ano espulsi dal capillare e<l eliminati.

La quantità di liquido iniellato negli animali da esperimento era generalmente 1 mm:1• Tale dose vien sopportata senza complicazioni i;ià dalle larve di quarta età, sia per via intraemocelica, sia per ingestione. E' importante che la larva sia narcotizzala 11rima di 11rocedere all'inoculazione, poichè la vivace reazione dell'insetto al conlatlo

: 3 Dopo lo puhulicazione della mia nolo in qScicncc> (1955), il dott.K. l\lor11morosd1 del Rockcfcllcr lnstitulc for Mcdil'al Rc5c11rch, New York, ha arnlo lo cortcsi11 di indicarmi due sue comunic11zioni II mc prima non note (MII r II morose h, 1951 e 1952) in cui egli descri\'c un ago da lui usato per inornlarc un l"irus cAsterycllow5> di Callistcplius chincnsis Ne es nd la< Il•

noma di /lfacrostclcs divis11s Uh I e r, ago non molto diierso da quello che io 1150 par le iniezioni intrnemocclichc.

dell'ago potrebbe portare 11 lesioni traumatiche con conseguente morte per setticemia.

Per la narcosi fu scelto etere etilico, per una durata di 30 secondi (M 11 r ti g non i, 1955). Questo narcotico determina una paralisi flnecicln totale: il rilassamento dei mu•

scoli è ben revcrsiLilc cd il ritorno alla normnlilù avviene da qualche minuto 11 mezz'ora do)>o l'inizio 1lcl111 narcosi, gradatamente. Sin In narcosi all'etere etilico come In ino- culazione cli l mm:s di acqua biclistillnta sterile non hanno, da sole, effetto nocivo sulle I nrvc di E. grise1111a ( tab. 2).

EfTello dello norcosi con etere etilico e della inoculazione intraemoceliea di I mm~

tul,. 2 di ac11ua bidistillala sterile su E. gri~1mna (larve di qMorbt età)

Trattam1•nto

I

^{LDn·e tHl.ato}

I ^L,,, ..,., "

J>UJ>e morie lrnmai:lni

Nnn:osi soln 13 2 li

Nurco~i e ₁₃

{I 13

ioornlo steri!,•

Lu dose di 1 mrn:¹ inoculata in larve di tortrice di quarta etù corrisponde n 15,5

%

del loro peso (il peso medio delle larve di quarta ctit essendo 6,il6 mg) e in larve di quinta clù al ~1,6

%

elci loro peso ( il peso medio di lar\'C di quinta etù essendo 27,4, mg).

Il peso delle larve ì• importante per il calcolo delle dosi letali dei virus, dosi che vanno espresse anche per gli insetti in funzione elci loro peso, e non solo dei loro stadio cd etù.

36 Titolazione del potere patogeno

Per In titolazione del potere patogeno del virus fu seguito il metodo del dosaggio biologico n risposln alternativa. Non potendomi dilungare qui sulle due ipotesi su cui si basa questo metodo, nel caso della titolazione del potere patogeno dei virus, rimando il lettore alle recenti analisi di Schrnmm (195,i) e di Plus (1954). cime egli potrà trovare anche esaurienti notizie bibliogrnfiche sull'argomenlo.

Ogni lotto di lnn•c comprendeva almeno 15 individui. Per la valu1a1.ione statistica servivano solo le torve morie sicuramente di granulosi ( In diagnosi macroscopica do- veva essere confermala dall'esame microscopico di strisci con sislema ottico per con- trasto di fase e obbiettivo Zciss Op ton •I0/0,63) e gli individui che com1>ivano nor- malmente la metamorfosi. Questo metmlo di valutazione, giù usato da ne r go I d

(1947), è raccomandabile quando non si verifichino altre cause di morte oltre la virosi.

Se vi sono nitre cause cli morte il metodo non dù risultati rigorosamente corretti. Allo scopo di evitare risultati viziati, anche le larve morte in seguilo ad altre malattie o per inanizione o per In presenza cli enlomofagi dovrebbero essere comprese nei calcoli. Alla luce di recenti stmli matematico-statistici (Sampforcl, 1952) si pensa di poter trn•

vn.re il mo(lo di correggere i dati di dosaggio biologico quando intervengono due o più cause di morte: alcuni matematici si stanno presentemente interessando del problema, tra questi il dotl. M. H. Sa m p f or cl, Aberdeen, cui devo preziosi suggerimenti.

La necessità d'un metodo più preciso d'analisi matcmatico-stallsl1ca risulta dalle seguenti semplici considerazioni. Si supponga che di un gruppo di 15 larve inoculate con virus 2 muoiano in seguilo alla presenza di parassiti endofngi e 3 muoiano cli granu•

!osi. Le rimanenti IO compiano la metamorfosi normalmente. Le due lane attaccale dagli entomofagi possono morire sin prima che trascorra il periodo d'incubazione della malattia, sia una volta superato il periodo di massima durata della vita per la malattia in questione. Secondo il metodo con,·enzionale, in ambedue i casi la mortalità. dovuta a I ,•i rus risu ha

p=3/l3:23,l

%-

E' chiaro che in uno dei due casi questo valore non può essere corretto. E precisa- mente nel secondo caso: infatti le 2 lan·c vittime dei parassiti sono da considerare come sopraHissule ai fini ael dosaggio biologico, poichè morte in un periodo in cui non ,·i sarebbe stata più alcuna vittima dell'infezione sperimentale. In questo caso il valore

corretto sarebbe dunque

p= 3/15

=

20,0

%

oV\'ero ben 13,4.

%

meno della 11erccntunle determinata secondo le regole convenzionali.

In pratica, In situazione non è mai così chiara come nell'esempio, altrimenti sarebbe cosa facile correggere i valori. Le cause di mortalità possono infatti agire anche con- temporaneamente. I \'al ori calcolati secondo il metodo coli\ enzionnle sono dunque , i- zinti, ma non sempre nella stessa misura; i valori reali si troveranno in una posizione intermedia fra i due valori massimo e minimo stabiliti come nell'esempio.

Nei casi in cui vi furono individui morti di granulosi nei lotti cli controllo (larve inoculate con acqua bidistillata slcrile), la mortalità fu calcolata secondo Ab bo t l

(1925) cd il coefficiente w modificato secondo Finn ey. Le rette di regressione probit furono calcolate secondo Finncy (1952).

37 Preparati istologici

La fissazione del materiale avveniva con la soluzione di Duboscq-Brasil ( o Bo u in alcoolico) oppure con formolo salino di Po I i card, seguito oppur no da trattamento al bicromato potassico secondo R egn ud (soluzione al 3 % ) . Il materiale rimaneva in Bo u in alcoolico per circa •18 ore, \'eniva poi lavato e conservato in etanolo al 70

%.

In Po li card il materiale rimaneva fino a 4mesi: il liquido serve infatti bene anche per la conservazione dei preparati. La durala del trattamento con bicromato po•

tassico variava da 24 a 72 ore. Per sezioni sottili bastai·ano di solito 24 ore.

I metodi di colorazione usati erano i seguenti:

a) Ematossilinn secondo ì\l a y e r (cmallume), seguila da eosina acidificata;

b) Ematossìlina secondo Il e id e n ha in, preceduta o no da trattamento con fenolo al 5%,secondoLnngenbuch (1956);

c) Azan secondo H e id e n ha i 11 ;

d) Azzurro di hromofcnolo secondo M u;,: i u, B r l! \\· e r e A Ife tl (1953), con o se111.a lraHumenlo ull'ucido cloridrico (soluzione normale) u 60° C durante 10 minuti, secondo X eros { 1953).

l\luteriulc fissalo secondo Po I i ca r cl-Il e g n II d e coloralo all'emalossi lina di II e id e ^II h u i ^II ì• il piì1 adallo per lo studio delle alterazioni istologiche. Tessuti fissali in D u bo se q. B r usi I e colorali con azzurro <li hromof enolo senza pre, io lrutlamenlo nll'aci<lo cloridrico danno pure ottimi preparati. Assai pratica, ma non così soddis- facente è In colorazione con l'email urne di Ma re r.

Le lan·c o parli di esse venivano incluse ( dopo disidratazione con alcool etilico e benzoato di metile e passaggio in benzolo) in «Tissucmat~ Fisher (11111110 di fusione fra 50 e 5:1° C).Per itlentificarc le singole larve ,·i si altaccava una strisciolina di carta (con il numero del preparato) mediante albume di uo,,o, secondo Ga ten by e Bea ms.

La curia sì stacca\'a solo dopo solidificazione della 1mraffina. Per preparare sezioni di gru11pi numerosi di larve, a scopi statistici, gli inselli vcni\'ano collocali sulle punte di una serie di 20 aghi fusi in un blocco di piombo (fig.8): si polern così trusporlnre simnhaneamcnte le 20 larve da tm liquido all'altro e infine in ~Tissucmal». Prima <lclla completa soli1lificuzione della paraffina gli aghi \'Cli irnno c.,,,tratti llallc larve. Era così possibile studiare un grande numero di sezioni istologiche in serie di 20 i111li,illui per J►ortuoggelli, con un c1111si1lcre,olc risparmio di tempo.

Il microtomo usato per la 11repara7io11e delle sezioni istologiche è tm H e i eh e r t

«Om S:. secondo l\l i II o I, collegato con 1111 motore clcurico (220 V, 0,9 A) (fig. 9) cd

1111 reostato a nucleo anulare (O,'). A. 900 Q). Premendo 1111 pedale si nzicmn

il

rcoslalo, potell(lo così mriarc la \ clocilù cli rotazione del microtomo eia unn decina cli giri a llO al minulo ²~. Le sezioni a,e,·ano 11110 spessore variabile da:-\ a 6 11; di solito si prdcriva

11110 !<pcssore di 4 I'·

Le sezioni venivano allaccale ai ,·ettini con fissati,o all'albume di 110\0 secondo von Apnlhy ccl infine .montate in «Cacclax:. A Bayer.

38 l\lisurc igieniche

In generale furono seguile le regole proposte dn Stcinhnus (1953) per c\'ilare il sorgere di epizoozie fra gli animali soggelti a sperimentazione. Il materiale usalo per l'allevamento degli insetti \'cniva sterilizzato in autoclave oppure ad uria calda. Gli slrumcnti con i quali vcniva110 toccali gli insetti erano disinfcllati con la soluzione <li Me C u 11 oc h (,·ccli sopra). La preparazione ciel nutrimento per le lnr,·c nHcnirn in 1111 locale scpurnto. Sia le larve che le pupe erano allernlc in numero di una per recipiente, così da evitare 1111 contagio.

~~ Il motore clcttrii·o fo rnllcguto ul mirro\011111 mc1liu111t• 1111 giunto id,·uto ,lui signor T. Spring, di11l. tedi. Lu costrndouc ,lei giunto e ,lt-1 si~kmn <l'un·clcrnziunc ,. pure nru•ru ,lei signor S p r i II g e fu csq:;uitu nel luhorutorio 11u:,:e1u1i1·0 d1·ll'Istitutr, s\·i,.zcro Ji ricerche forestali.

386

I rametti di larice usati per la preparazione dei 4:bouquets> venivano raccolti in unn giovane piantagione, dove In tortrice esiste solo sporadicamente e dove non si consta•

tarano mai casi di granulosi. Questa precauzione è assolutamente inevitabile (si veda anche Steinhnus, 1953), datn l'impossibilità di sterilizzare gli aghi di larice senzn modificarne le proprietà nutritive. L'importanza del nutrimento nella etiologia delle malattie dn virus degli insetti è molto grande: per questa ragione si è voluto evitare, nel corso del presente studio, ogni trattamento che potesse modificare la qualità delle foglie.

4 La granulosi larvale

41 Sintomatologia

La malnttin è stata riscontrata in ognuna delle cinque età larvali di E. grisemw. ì\" on si sono studiati i sintomi nelle larve della prima, seconda e terza età, essendo estrema- mente difficile produrre l'infezione sperimentale e seguire il decorso della malattia con accuratezza in larve così giovani. Quanto si dirà vale per le larve della quarto e quinta etù. Le osservazioni furono eseguite nel laboratorio da campo, ad una temperatura me•

dia giornaliera di 15,5° C nel 1954, e di 15,1

°

C nel 1955.

Due dei primi segni con in quali la malattia si manifesta sono la inappetenza della lan•a e la lentezza dei suoi movimenti. Questi sintomi appariscono 3 o ^i}. giorni dopo l'inoculazione. Se la larva viene sottoposta a stimoli meccanici, si nota dapprima una reazione meno violenta di quella di larve sane, mentre col progredire dell'infezione la reazione può anche scomparire completamente. Se la larrn si sposta, ciò che avviene di rado se gli individui sono malati, il movimento è lento, malsicuro e lascia l'impressione che manchi il senso dell'equilibrio. L'addome è inerte, paralizzato. La mancata o defi- citaria nutrizione ha come conseguenza un ritardo o un arresto dcll'nccre!Scimento lar•

vale. Nel caso presente non furono eseguite determinazioni di peso, ma Mar ti g non i (1952) potè constatare che lnrve di l'eridroma marguritosa (Haw,) affette da granu- losi pesavano solo il 32,6

%

di larve sane della medesima età, otto giorni dopo l'ino·

culazione. Con l'avanzare della mnlnttia, l'addome si ingrossa e le membrane congiun•

tive addominali, normalmente trnnslucide, assumono il colore biancastro dei sottostanti tessuti infetti. L'ultimo paio di pseudozampe assume, particolarmente sulla faccio pian•

tare, la medesima colorazione biancastra.

Poco prima della morte, la mobilità dell'individuo cessa completamente e subentra un rilassamento muscolare simile a quel lo che si ottiene dopo narcosi all'etere etilico (paralisi flaccido). La paralisi sembra colpire prima l'addome e progredire poi verso il torace ed il capo, come nel caso di Persectania ewù1gii West w. (Lo w e r, 195-1,).

Le larve possono essere colte dalla morie nell'interno dei fascetti di foglie do esse usati come dimora, oppure sugli aghi o sui rametti di larice, dove a\'evano esplicato la loro attività, rimanendovi appese per l'ultimo paio di zampe addominali (fig.10). In tal caso, seppure non così tipici, si riscontrano post mortem i caratteri del «terzo stadio>

descrilln (In Lo w e r (195,1.) nel decorso della ;:-runulosi della larva di /'. ewirigii. I cada- veri delle larve morte <li granulosi non si 1m~senlnno mai contraili, raccorciati; al con•

lrario, l'inlegumcnto è disteso al massimo. !\elle scatole d'allevamento le lnn·e amma- lale spesso abbandonano il rametto di larice per rimanere quasi immobili sul foll(lo del reci11ienle; oppure muoiono atlaccale al la parete del rccipienle, aggruppale alle rugo•

sitù del cartone con gli uncinetti ambulacrali, il capo verso

il

basso. Se le larve ven•

gono colte dal male ancora nel sacco sericeo da esse formalo all'interno <lei fascelti cli foglie, difficilmenle si riesce a liberarle da questo leggero tessuto: la tela rimane impi- gliala negli uncinelli delle pseudozampe, conseguenza questa della 11aralisi addominale.

L'integumento è assai fragile e si può lacerare con facilità anche prima della morie degli individui infetti. ì\'e esce allora un liquido biancastro, denso, costituito di corpu- scoli <!"inclusione del virus e cli prodolli di disintegrazione dei tessuti.

Se la parete intestinale è ancora in talla, il liquido è nella maggior parte elci casi prirn cli flora batterica.

Esamìnan,lo con il microscopio a contrasto di fase il liquido prelevato dall'emocele di larve morenti ^o appena morte. si nota la presenza degli innumercrnli granuli, carni·

!eristici clellu granulosi, e 1lcllc choulcs hyalines» clcscrille da P a i 11 o ^{L (} 19:17) e rin•

venule ()Oi in f(llasi lulli i casi di granulosi osscrrnti finora. Cosa siano queste \'cscicolc sferiche ancora 11011 si su con cerlezzn. 11mmslantc l'allcnzionc ri\·oha a questo fenomeno da \ari st11diosi (1-lughes e Thump;,011, 1%1). l'uillot (1937) afferma che le cboules:. escono Julle cellule infelle ciel tessuto udiposo.

<12 lstolo~iu putologicu

Lo studio della istologia (llltologica fu eseguilo su s1r1.ioni di oltre 50 larve, varia•

mente fissale e colorale. Gli indh·idui furono fissali a \ari stadi di S\iluppo della ma•

lauiu.

Le alterazioni patologiche suno limilalc ull'epidcrmide e ai corpi grassi ::^{5 :} in alcuni

i:USÌ, anche cellule dei dischi immaginali alari subiscono gravi alterazioni; gli organi

ematopoietici meso- e metatoracici (A r v y, 1953) presenti anche in E.griseana e così intimamente connessi ai dischi immaginali, non mostrano invece alcuna alterazione patologica.

l'.na delle 11rimc reazioni visibili nel lessulo adiposo di larve infclle è lu prolifcrn- iionc elci lrofociti («proliféralion cellulaire» ,li l'aillol, 193-1.), accompagnala da una leggera ipertrofia elci nuclei: la presenza cli figure mitotiche nei coq>i grassi <lopo inoculazione cli \'Ìrns della granulosi è stata giù notala nelle lane di E11:wa scgd11m Se h i f f. ( «pseudugrasscric11 1 e 2; P u i 11 o t, 19,H, 1935 e 1936) e di l'eridroma mar-

::, In uuu miu 1m·,·1·1li·nlc noln (i\l u r I i g n 1111 i, 195,1-) osscnurn d,c uhnu7.io11i Jllllologidw tml4'\'ullo c~so,rc 1·1111~tuluk (con ccrte7.lll" ~nlo rlt") ll·ssuto uJil'O!l<l, Le 1·1·l111lc c11itlcrmid1c si 11rcsc11tu\'1Lllo, lll'llc sezioni studiutc, sì !ci;:;crnwntc ìugrossntc, mn il numero di lun 1, t:snminnle ern 1ruI1po ,.,,jguo 1u:r pcrmcllcn: di d, t.-rminurc lu cunsu d,·ll'ingrossnmcntu r 1·orn111u1uc di eseguire uno ~111Jio i~lopnlologi,·o c11mplcto.

388

fig, lO

Le lan·c di E. gri,ean11 morte in ~eguito a grimulo~i si rimcngono frequentemente sui rametti di lari,·e, apJJesc per l'ultimo paio di zampe addominali; si noti, in questo esemplare

di quinta età, la distensione dell'integumento.