Analytik und Epidemiologie von Paralytic-Shellfish-Poisoning-Toxinen (PSP) in Lebensmitteln

Analytik und Epidemiologie

von Paralytic-Shellfish-Poisoning-Toxinen (PSP)

in Lebensmitteln

Abschlussarbeit

im Postgradualstudium Toxikologie und Umweltschutz der Universität Leipzig

Monika Reichhart

Dipl.-Ing. (FH) Lebensmitteltechnologie

Sonthofen, Juli 2013

Inhalt

Abkürzungsverzeichnis ... 3

Tabellenverzeichnis ... 4

Abbildungsverzeichnis ... 4

1 Algentoxine in Lebensmitteln... 5

1.1 Algenvergiftungen ... 5

1.2 Detoxifikation ... 8

2 Paralytic-Shellfish-Poisoning- (PSP-)Toxine mit Schwerpunkt Saxitoxin ... 9

2.1 Allgemein ... 9

2.2 Biosynthese ... 11

2.3 Toxische Wirkung ... 11

2.4 Saxitoxin (Mytilotoxin) ... 11

2.5 Struktur und Eigenschaften ... 12

2.5.1 Carbamoyltoxine ... 13

2.5.2 N-Sulfocarbamoyltoxine ... 13

2.5.3 Decarbamoyltoxine ... 14

2.5.4 Deoxydecarbamoyltoxine ... 14

3 Saxitoxin als Biologischer Kampfstoff ... 15

4 Monitoring und Management ... 16

4.1 Mögliche Managementstrategien gegen Cyanobakterien ... 18

4.2 Regelungen ... 18

5 Auftreten von PSP ... 20

5.1 Randbedingungen für das Auftreten von Vergiftungen ... 20

5.1.1 Salzwasser ... 21

5.1.2 Süßwasser ... 21

5.2 Symptomatik ... 22

5.3 Prävention und Therapie ... 22

5.4 Toxizität ... 23

5.5 Regionales Auftreten von PSP-Toxinen, toxinbildenden Algen und Vergiftungsfällen ... 24

5.5.1 Europa ... 25

5.5.2 Amerika ... 30

5.5.3 Australien ... 30

6 Analytik ... 31

6.1 Probenvorbereitung ... 32

6.2 Maus-Bioassay ... 32

6.3 Chromatographische Methoden ... 33

6.3.1 HPLC ... 33

6.3.1.1 Auftrennung ... 33 Seite 1

6.3.1.2 Detektion ... 34

6.3.2 Immunochromatographie ... 36

6.3.3 DC/HPTLC ... 37

6.4 Serologische Methoden ... 37

6.4.1 ELISA ... 37

6.4.2 RIA ... 40

6.5 Fluorimetrische Methoden ... 40

6.6 Kapillarelektrophorese ... 41

6.7 Weitere Bioassays ... 41

7 Zusammenfassung und Ausblick ... 42

Literaturverzeichnis ... 43

Anhang 1: Muschelernte ... 46

Anhang 2: Monitoring-Programme für Phycotoxin-bildende marine Algen ... 47

Anhang 3: Grenzwerte für PSP-Toxine 1991 / 2013 ... 49

Anhang 4: Algenanzucht zur Toxinproduktion ... 51

Anhang 5: Beispiele für HPLC-Parameter ... 52

Anhang 6: Beispiele für DC/HPTLC-Parameter ... 53

Anhang 7: Organisationen/Programme ... 54

Seite 2

Abkürzungsverzeichnis

a Jahr

ACN Acetonitril

AOAC Association of Official Analytical Chemists APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionisation API Atmospheric Pressure Ionisation

ASP Amnesic Shellfish Poisoning (Amnesie hervorrufende Algentoxine) AZP Azaspiracid Poisoning

Ca Calcium

Cu Kupfer

dcNeo Decarbamoylneosaxitoxin dcSTX Decarbamoylsaxitoxin

Da Dalton

dc-ELISA direkt kompetitiver ELISA DC Dünnschichtchromatographie

DSP Diarrhetic Shellfish Poisoning (Muschelvergiftung mit Diarrhoe) ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

Em Emissionswellenlänge ESI Elektrospray Ionisation Ex Extinktionswellenlänge FAB Fast Atom Bombardement FLD Fluoreszenz-Detektor

GTX Gonyautoxin

h Stunde

HAB Harmful Algal Bloom

HPLC High Performance Liquid Chromatographie HPTLC High Performance Thin Layer Chromatography k.A. keine Angaben

kg Kilogramm

KG Körpergewicht

LFGB Lebens- und Futtermittelgesetzbuch

MG Molekulargewicht

MS Massenspektrometrie

MU Mauseinheit

N Stickstoff

Na Natrium

Neo Neosaxitoxin

NRL Nationales Referenzlabor

NSP Neurologic Shellfish Poisoning (Muschelvergiftung mit neurologischen Störungen)

P Phosphor

PSP Paralytic Shellfish Poisoning (Muschelvergiftung mit Lähmungserscheinungen)

rel. relativ

RIA Radioimmunoassay

RP Reversed Phase (Umkehrphase) Rt Retentionszeit

ssp Subspecies

SPE Solid Phase Extraction

STX Saxitoxin

STXeq Saxitoxin-Äquivalent

t Tonne

TLC Thin Layer Chromatography (Dünnschichtchromatographie) UTLC Ultra Thin Layer Chromatography

UV Ultraviolett

VO Verordnung

Vol Volumen

Wo Woche(n)

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Tabellenverzeichnis

Tabelle 1-1: Ausgewählte Vergiftungen durch Algentoxine ... 6

Tabelle 1-2: Grenzwerte für lebende Muscheln gem. VO (EG) 853/2004 Kap V 2 (11) ... 8

Tabelle 2-1: PSP-produzierende Dinoflagellaten ... 9

Tabelle 2-2: PSP-produzierende Cyanobakterien ... 9

Tabelle 2-3: PSP-produzierende Rotalgen ... 10

Tabelle 2-4: Dinoflagellaten mit vielfältigem Toxinbildungsvermögen ... 10

Tabelle 2-5: Cyanobakterien mit vielfältigem Toxinbildungsvermögen... 10

Tabelle 2-6: Carbamoyltoxine ... 13

Tabelle 2-7: N-Sulfocarbamoyltoxine ... 13

Tabelle 2-8: Decarbamoyltoxine ... 14

Tabelle 2-9: Deoxydecarbamoyltoxine ... 14

Tabelle 5-1: LD50-Werte von PSP-Toxinen ... 23

Tabelle 5-2: Toxizität beim Mensch ... 23

Tabelle 5-3: Toxizität der PSP-Toxine(6) ... 24

Tabelle 5-4: Ergebnisse des PSP-Monitoring in Europa ... 27

Tabelle 6-1: Molare Massen der PSP-Addukte im MS ... 36

Tabelle 6-2: Relative Fluoreszenzintensitäten und relative Toxizitäten der PSP-Toxine(6) ... 41

Tabelle A1-1: Wichtige als Lebensmittel genutzte Muscheln ... 46

Tabelle A1-2: Wichtige als Lebensmittel genutzte Schnecken ... 47

Tabelle A2-1: Monitoring-Programme für Phycotoxin-bildende marine Algen ... 47

Tabelle A3-1: Grenzwerte/Nachweise für PSP-Toxine ... 49

Tabelle A4-1: Algenanzucht zur Toxinproduktion ... 51

Tabelle A5-1: Beispiele für HPLC-Parameter ... 52

Tabelle A6-1: Beispiele für DC/HPTLC-Parameter ... 53

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1-2: In Europa vorkommende marine Biotoxine ... 6

Abbildung 2-1: Strukturformel von Saxitoxin und seinen Derivaten (28) ... 12

Abbildung 6-1: Prinzip direkt kompetitiver ELISA ... 38

Abbildung 6-2: Prinzip indirekt kompetitiver ELISA ... 39

Seite 4

1 Algentoxine in Lebensmitteln

1.1 Algenvergiftungen

Verschiedene Algen sind in der Lage mehr oder weniger potente Giftstoffe zu bilden, darunter auch einige der potentesten Nicht-Protein-Toxine (1). Sie sind weltweit zu finden, sowohl im Salz- als auch im Süßwasser. Von den marin lebenden Algen-Spezies wurde die Toxinbildung bisher bei etwa 2% (~80 Arten) nachgewiesen(1; 2; 3). Etwa 75% davon gehören zu den Dinoflagellaten (3).

Dinoflagellaten überwintern als Cysten im Sediment. Bei günstigen Bedingungen entwickeln sich mobile Zellen, die den Meeresboden verlassen und im Wasser schweben. Zur Nahrungsgewinnung filtern Muscheln das Phytoplankton mit maximal 2 Liter pro Stunde aus dem Wasser heraus und reichern dabei die Algentoxine im Körper an. Für Muscheln sind die Toxine in der Regel unschädlich. Bei massenhafter Vermehrung der Algen (Algenblüte, mehrere Mio. Zellen pro Liter) nimmt die Toxinkonzentration in den Tieren jedoch derart zu, dass deren Genuss für höhere Fische, Vögel, Meeressäuger, aber auch für den Mensch, gesundheitliche Beeinträchtigungen bis hin zu Todesfällen zur Folge haben kann. Weltweit sollen Algen pro Jahr für etwa 6000 Vergiftungsfälle bei Menschen und für hohe Verluste in der Muschelindustrie und im Tourismusgewerbe (Sperrungen von Erntegebieten und Badestränden) verantwortlich sein (4). Einige der als Lebensmittel genutzten Muscheln und Meeresschnecken sind in Anhang 1 genannt. Gerade bei Cyanobakterien (früher: „Blaualgen“) kann man davon ausgehen, dass in der log-Phase der Wachstumskurve 10-20% des Toxins außerhalb der Zelle vorliegen (5). Je mehr Algen absterben, desto höher ist die Toxinkonzentration im Wasser.

Einige Toxingruppen werden nach den durch sie verursachten Symptomen benannt, zum Beispiel PSP (Paralytic Shellfish Poisoning – Schädigung des Nervensystems), DSP (Diarrhetic Shellfish Poisoning – Schädigung des Verdauungstrakts), ASP (Amnesic Shellfish Poisoning – Gedächtnisverlust), NSP (Neurologic Shellfish Poisoning – Schädigung des Nervensystems). Wie Abbildung 1-1 zeigt, handelt es sich vielfach um Neuro- und Hepatotoxine. Tabelle 1-1 gibt einen Überblick über die zugehörigen Toxine und deren Produzenten.

Abbildung 1-1: Einteilung der Algentoxine

Algentoxine Neurotoxine

Anatoxin-a Anatoxin-a(s)

PSP NSP Spirolide

Hepatotoxine

Microcystin

Nodularin Cylindro- spermopsin

sonstige

DSP ASP Ciguatera

AZP Palytoxin

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Während ASP- und PSP-Toxine zu den hydrophilen Toxinen mit einem Molekulargewicht <500 Da zählen, sind NSP-, DSP-, AZP- (Azaspiracid-Poisoning-), Pecteno-, Yessotoxine und zyklische Imine stark lipophil mit einem Molekulargewicht zwischen 600 und 2000 Da (4).

Abbildung 1-2: In Europa vorkommende marine Biotoxine

Tabelle 1-1: Ausgewählte Vergiftungen durch Algentoxine Ver-

giftung

Toxine chem.

Struktur

Toxinbildner Lebens- mittel

Wirkprinzip Effekt PSP Saxitoxin und

Derivate

Alkaloide, Purin- derivate (Tetra- hydropurin)

Dinoflagellaten:

Alexandrium(6; 7; 4) Gymnodinium(6; 7; 4) Pyrodinium(6; 7; 4) Protogonyaulax(8) Cyanobakterien(1) Rotalgen(1)

Muscheln Blockade von Na⁺-Kanälen

Parästhesien schlaffe Lähmungen

DSP Okadasäure Dinophysis- toxin 1-2 Pectenotoxine Yessotoxine

Polyether- toxine

auf Rotalgen lebende (8) Dinoflagellaten:

Dinophysis(6; 1; 8; 2;

4)

Prorocentrum(6; 1; 8;

2; 4)

Protoceratium(6; 4)

Muscheln Krabben

Inhibierung von Protein-

Phosphatasen

Übelkeit, Erbrechen, Durchfall

ASP Domosäure Amino-

säure- Derivat (modifi- zierte Glutamin- säure(8))

Kieselalgen:

Nitzschia ssp(1; 2) Pseudonitzschia ssp(1;

6; 4) Rotalgen:

Chondria armata(1)

Muscheln Krabben (1) Fische (Sardinen, Anchovis) (1)

Freisetzung endogener exzitatorischer Neurotransmitter

Übelkeit, Erbrechen, Durchfall, Benommenheit;

hohe Dosis:

Verwirrtheit, Halluzinationen, Gedächtnisverlust, z.T. bleibende neurolog.

In Europa vorkommende marine Biotoxine hydrophil

PSP ASP

lipophil DSP AZP Yessotoxine

Palytoxin

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Symptome NSP Brevetoxine cyclische

Polyether- toxine

Dinoflagellaten:

Gymnodinium (6; 1; 2) (=Karenia) (4)

(=Ptychodiscus) Chatonella (4) Phalacroma (4)

Muscheln Wellhorn- schnecken (1)

Aktivierung von Na⁺-Kanälen

neuronal + gastrointestinal:

Parästhesien Ichthyotoxisch Erbrechen, Durchfall Cigua-

tera (marin)

a) Ciguatoxine (= Ciguatera- toxine, Gambier- toxine)(1) b) Maitotoxin

Polyether- toxine

Dinoflagellaten:

Gamberdiscus toxicus (6; 1; 2)

Fisch (>400 Arten, v.a.

große Raub- fische)(1)

a) Aktivierung von Na⁺-Kanälen b) Aktivierung von Ca²⁺-Kanälen

- neuronale (Heiß- Kalt-Umkehr, Kribbeln, Juckreiz) - gastrointestinale (Übelkeit, Er- brechen, Durchfall) - kardiale

(Bradykardie) Beschwerden;

Schwäche, Angstzustände, Depression Tetrodo-

toxin

Tetrodotoxin und Derivate

Verschiedene marine Bakterien; z.B.

Shewanella alga(6)

Kugelfisch Blockade von Na⁺-Kanälen

Parästhesien Lähmungen Cyano-

toxine (Hepato- toxine) (Süß- wasser)

a) Microcystine b) Nodularin c) Cylindro- spermopsin

cyclische Hepta- peptide (c) Alkaloid

Cyanobakterien:

(a) Microcystis(1; 6; 9) (a) Oscillatoria(1; 9) (=Planktothrix)(9) (a) Anabaena(1; 9) (a) Aphanizomenon(1) (a) Nostoc(1; 9) (b) Nodularia(10; 9) (c) Cylindrospermopsis (9)

(c) Aphanizomenon ovalisporum(9) (c) Umezakia(9) (c) Raphidiopsis

Trink- wasser, Bade- wasser, Algen- präparate

Inhibierung von Protein-

Phosphatasen

Schädigung der Leber, inneres Verbluten

Cyano- toxine (Neuro- toxine)

a) Anatoxin-a b) Anatoxin-a(s)

Alkaloide (a/b) Anabaena(10; 9) (a) Aphanizomenon(10;

9)

(a) Oscillatoria (=Planktothrix)(10; 9) (a) Cylindrospermum(9)

Trink- wasser

(a) Acetylcholin- agonist

(b) Inhibitor der Acetylcholin- esterase Paly-

toxin

Palytoxin und Derivate

Ostreopsis(6) Zerstörung von

Zellen

Hämolyse Spirolide Spirolid-

derivate

Alexandrium (6; 4) unbekannt neurotoxisch

AZP Azasirazid- derivate

Azadinium (4) unbekannt gastrointestinale

Beschwerden

Von Jaime(6) wurde die Pazifische Auster (Hepatopankreas, Mantel, Kiemen, Adduktor, Gonaden und der verbleibende Rest), die Gemeine Strandschnecke (Darmgewebe, Muskelgewebe, Rest), die Herzmuschel (Hepatopankreas, Fuß, Rest) und die Miesmuschel (Hepatopankreas, Mantel, Kiemen, Adduktor, Gonaden, Rest) nach Fütterungsversuchen auf PSP-Toxine untersucht. Die höchsten Toxingehalte wurden dabei im Verdauungssystem gefunden, die niedrigsten im Muskelgewebe (Fuß, Adduktor).

Beim Verzehr von Meeresfrüchten ist die Entfernung des Verdauungsapparats – außer beim Seite 7

Fugu/Kugelfisch – unüblich. Zum Beispiel bei PSP gibt es keinerlei sensorische Veränderungen (Geruch, Geschmack, Aussehen) bei der Mahlzeit.

Für unterschiedlich hohe Toxingehalte in verschiedenen Tierarten spielt neben der Zelldichte der Algen auch tierartspezifische Faktoren (Empfindlichkeit/Resistenz der Tiere gegenüber den Toxinen, Art und Menge der Algenaufnahme, Filtermechanismus/-Wirkung, Akkumulations-/

Ausscheidungsrate, Abwehrmechanismen wie Schalen-Schließen oder Senkung der Filterrate, Mobilität…) eine Rolle. Die EU hat in der VO (EG) 853/2004 Grenzwerte für verschiedene Toxine in lebenden Muscheln festgelegt.

Tabelle 1-2: Grenzwerte für lebende Muscheln gem. VO (EG) 853/2004 Kap V 2 (11)

Grenzwerte

PSP-Toxine 800µg/kg

ASP-Toxine 20mg Domoinsäuren / kg

Okadasäure, Dinophysistoxine und Pectenotoxine gesamt 160µg Okadasäure-Äquivalent / kg

Yessotoxine 1mg Yessotoxin-Äquivalent / kg

Azaspiracide 160µg Azaspirazid-Äquivalent / kg

Eine andere potentielle Quelle für Algentoxine sind bestimmte Nahrungsergänzungsmittel. Diesen wird eine positive Wirkung auf die Gelenke nachgesagt und meist als Vitaminkapseln mit Muschelextrakt verkauft.

1.2 Detoxifikation

In Wasser ohne toxinbildende Algen nimmt die Toxinmenge in lebenden Meeresfrüchten mehr oder weniger schnell ab. Man unterscheidet schnell entgiftende (mehrere Tage bis Wochen) und langsam entgiftende (Monate bis Jahre) Tiere. Hier sind vor allem Tierart, Höhe der Kontamination, biologische Faktoren, Stärke der Bindung an das Gewebe maßgeblich(6). Auch die Art des Toxins spielt eine Rolle. Eine völlige Entgiftung der Meerestiere ist unwahrscheinlich. Versuche zur Beschleunigung der Entgiftung mittels Temperatur, Salzgehalt, Chlor, Ozon und Elektrostimulation verliefen negativ (12).

Das Umsetzen der Muscheln in unbelastete Gebiete ist auch in Europa erlaubt (13), beinhaltet aber auch die Gefahr einer Verschleppung der Toxinbildner.

Kochen inaktiviert die Toxine nicht bzw. nicht ausreichend. Nach Fehlhaber (14) soll durch

„gründliches Kochen“ eine Zerstörung von 70% der Toxine erfolgen. Diese Angabe rechtfertigt aber keine Empfehlung zur Anwendung bei Lebensmitteln! Ein Teil des Toxins geht in die Kochflüssigkeit über, wobei sich der Verlust aber nach der Tierart, der Körperregion des Tiers und dem Toxinderivat richtet (15). Laut WHO (16) erfolgt keine Inaktivierung in 120°C heißem Wasser.

Durch Zugabe von alkalischen Substanzen können die Toxine zwar inaktiviert werden. Dies ist aber bei Lebensmitteln nicht praktikabel, da der Genusswert erheblich leidet. Auch Einfrieren der kontaminierten Lebensmittel brachte nicht den erhofften Erfolg (12).

Der Chemical Hygiene Plan der Harvard University (17) listet die Wirksamkeit einiger Verfahren zur Inaktivierung von Saxitoxin im Labor:

- Autoklav (1h / 121°C) nein

- 2,5% NaOCl + 0,25N NaOH /30min ja

- 2,5% NaOCl/30min ja

- 1,0% NaOCl/30min ja

- 0,1% NaOCl/30min ja

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2 Paralytic-Shellfish-Poisoning- (PSP-)Toxine mit Schwerpunkt Saxitoxin

2.1 Allgemein

Zu den PSP-Toxinen zählt man Saxitoxin und 20 strukturell sehr ähnliche Derivate. Sie werden produziert von Dinoflagellaten, Cyanobakterien und Rotalgen. Bei den Dinoflagellaten oder Panzergeißlern handelt es sich um 2µm – 2mm große begeißelte Einzeller, die – ebenso wie die Cyanobakterien – im Salz-, aber auch im Süßwasser vorkommen. Die einzelligen Cyanobakterien wurden früher als Blaualgen bezeichnet, werden aber heute aufgrund ihres Zellaufbaus zu den Bakterien gerechnet. Die zu den Rotalgen gehörige Gattung Jania ist ein 4cm bis 30m langes, verzweigtes Feines Korallenmoos im Meerwasser.

PSP-produzierende Dinoflagellaten (Panzeralgen/Panzergeißler):

Tabelle 2-1: PSP-produzierende Dinoflagellaten

Gattung Art

Alexandrium(1; 6; 2; 3; 7; 18) (früher Gonyaulax)

A. tamarense (3; 4; 19; 15)

= Gonyaulax tamarensis

= Gonyaulax excavata

= Protogonyaulax tamarensis

= Gessnerium tamarensis

= Gessnerium tamarensis excavata

A. lusitanicum (4) A. minutum (4)

= A. excavata (15)

A. tamiyavanichii (4) A. cantenella (19; 20; 15) A. fundyense (20; 21; 6; 15) A. catenella (20)

A. angustitabulatum (20) A. ostenfeldii (22; 5) A. cohorticula (15) A. fraterculus (15)

Gymnodinium(1; 6; 3; 7) G. catenatum(2; 4; 20; 15) Pyrodinium(6; 1; 3; 7) P. bahamense(2; 4; 20; 15),

P. brevis (4), P. brevisculata (4) Protogonyaulax(8)

PSP-produzierende Cyanobakterien (Blaualgen):

Tabelle 2-2: PSP-produzierende Cyanobakterien

Gattung Art

Anabaena(2; 23; 5; 24) A. flos-aquae(25),

A. circinalis(6; 25; 10; 26; 5; 20), A. lemmermannii (20)

Aphanizomenon(2; 23; 5; 24) A. flos-aquae(6; 25; 10; 26; 5), A. gracile (20)

Cylindrospermopsis (5; 24) C. raciborskii(25; 5; 20) Seite 9

Lyngbya(2; 5; 24) L. wollei(6; 25; 10; 5; 20)

Microcystis M. aeruginosa(25)

Oszillatoria (=Planktothrix)(1; 2; 24; 20) Rivularia (20)

PSP-produzierende Rotalgen:

Tabelle 2-3: PSP-produzierende Rotalgen

Gattung Art

Jania(1; 2)

Die Algen können in der Regel mehrere Toxine gleichzeitig produzieren. Beispiele werden in den folgenden Übersichten gezeigt:

Dinoflagellaten:

Tabelle 2-4: Dinoflagellaten mit vielfältigem Toxinbildungsvermögen

Toxinbildner Toxine¹

Alexandrium andersoni STX, NEO (20)

Alexandrium catenella STX, GTX1-4, NEO,B1-2, C1-4 (20) Alexandrium cohorticula STX, GTX1-4 (20)

Alexandrium fundyense STX, NEO, GTX1-4, C1-2, B1 (20) Alexandrium minutum

(= A. lusitanicum)

GTX1-4 (20; 27)

Alexandrium ostenfeldii GTX2-3, B2, C1-2 (20) und Spirolide (22; 27)

Alexandrium tamarense STX, NEO, GTX1-4, B1, C1, C2, C4 (20) oder atoxisch (27) Alexandrium tamiyavanichi STX, GTX1-4, B1, C1-4 (20)

Gymnodinium catenatum STX, NEO, Spuren GTX2-3, B1-2, C1-4 (20) Pyrodinium bahamense STX, NEO, B1-B2 (20)

Cyanobakterien:

Tabelle 2-5: Cyanobakterien mit vielfältigem Toxinbildungsvermögen

Toxinbildner Toxine²

Anabaena circinalis STX, GTX1-4, C1-2, dcGTX2-3 (20)

Microcystine, Anabaena-Peptide und Anatoxine – oder atoxisch (25) Anabaena flos-aquae STX, Anatoxin-a, Microcystin (25)

Aphanizomenon flos-aquae STX (25; 10; 5), Neo(10; 5), Anatoxin-a(25), Microcystin(25) Aphanizomenon gracile STX, Neo (20)

Cylindrospermopsis raciborskii

STX, Neo (5) + GTX2-3 (20)

Lyngbya wollei mind. 9 PSP-Toxine (5) (dcSTX, dcGTX2-3, acetyliertes STX (20) Microcystis aeruginosa STX, Anatoxin-a, Microcystin(25)

Rivularia ssp GTX2, GTX4 (20)

Die Toxinproduzenten werden im Phytoplankton von Muscheln direkt aufgenommen. In der weiteren Nahrungskette gelangen die Toxine dann in Schnecken, Tintenfische, Krabben, Seesterne, Hummer, Krebse und Fische (6). Bei Muscheln reichern sich die Toxine im Verdauungsapparat (Hepatopankreas = Verdauungsdrüse), aber auch in Siphon, Ovar, Kiemen und Muschelfleisch an

1 Quelle (20): keine Angaben zu Nicht-PSP-Toxinen

2 Quelle (20): keine Angaben zu Nicht-PSP-Toxinen

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(6). Konzentrationen bis zu 10 mg Saxitoxin pro 100g Muschelfleisch sind möglich (28). Ein Teil der Toxine wird im Stoffwechsel der aufnehmenden Tiere derivatisiert, wobei sowohl giftigere als auch weniger giftige Derivate möglich sind.

Die Toxinbildner kommen weltweit in kalten wie tropischen Küstengewässern vor. Eine Weiterverbreitung ist – außer durch Wind, Wellen, Strömung – mit Schiffen (Ballastwasser, Algenbewuchs) und durch Transport von belasteten Muscheln möglich. Je nach Klimazone und Jahreszeit schwankt die Zahl der Algen beträchtlich. So werden in unseren Breiten sogenannte Algenblüten vorwiegend in den Sommermonaten beobachtet.

Im Süßwasser vorkommende toxinbildende Cyanobakterien können unter Umständen auch Trinkwasser vergiften. Ab einer Zelldichte von etwa 2000/ml(10) spricht man hier von Algenblüte.

Der Mensch meidet in der Regel dieses Wasser als Trink- oder Badewasser aufgrund seiner sensorischen Eigenschaften (Aussehen, Geruch, Geschmack). Die Gefahr durch Aerosole beim Duschen gilt als gering (10). Vergiftungen bei Vieh durch algenhaltige Tränken und von Wasservögeln sind dagegen dokumentiert.

2.2 Biosynthese

Die Toxinproduktion hängt von verschiedenen Bedingungen ab, wobei keine direkte Korrelation zwischen Wachstumsrate und Toxinproduktion besteht. Einige Stämme verlieren in der Kultur ihre Fähigkeit, Toxine zu bilden (29).

Im Dunkeln bei Raumtemperatur unterliegen die Toxine Hydrolyse-Reaktionen (5), so dass andere PSP-Toxine oder auch ungiftige Produkte entstehen können.

2.3 Toxische Wirkung

Die Carbamoyltoxine stellen die gefährlichste Gruppe dar. Bei ihnen ist die Bindung an die Membranoberfläche am stärksten (6). Danach kommen die Decarbamoyltoxine und die relativ gering toxischen N-Sulfocarbamoyltoxine.

Die PSP-Toxine blockieren die Außenseite der Na⁺-Kanäle (nicht aber die K⁺-Kanäle) und verhindern das passive Einströmen von Na⁺-Ionen. Es kann kein Aktionspotential entstehen. Durch diese Störung der Erregungsleitung kommt es zu Muskelschwäche, Lähmungen und Ateminsuffizienz, da der Muskel oder Nerv auf den Reiz nicht mehr anspricht. Die Wirkungsweise ist reversibel und entspricht aufgrund der Bindung an den identischen Rezeptor der des Tetrodotoxins (30; 1).

2.4 Saxitoxin (Mytilotoxin) Summenformel: C10H17N7O4

Molekulargewicht: 229.29 g/mol

CAS 35523-89-8

Der Name Saxitoxin leitet sich ab von der Venusmuschel Saxidomus giganteus, aus der das Toxin Seite 11

1957 erstmals isoliert wurde(6).

Am Puringerüst (3,4,6-Trialkyltetrahydropurin) sind die zwei Guanidingruppen für die biologische Aktivität von Bedeutung(29) (Strukturformel siehe Abbildung 2-1). Wie alle PSP-Toxine ist es in saurem Milieu äußerst stabil, während es bei leicht alkalischem pH rasch inaktiviert wird. Auch die hohe Polarität und die Löslichkeit in Wasser, Methanol und Ethanol entspricht der der anderen Derivate.

Bei zwei menschlichen Saxitoxin-Opfern wurde ein hoher Anteil an Neosaxitoxin und Gonyautoxine 1 und 4 in Urin und Gallenflüssigkeit sowie Decarbamoyltoxine in Leber, Niere und Lunge gefunden. Im Mageninhalt waren dagegen Saxitoxin und eine Mischung aus Gonyautoxinen nachweisbar, so dass von einer enzymatischen Metabolisierung beim Menschen ausgegangen werden kann. Die Ausscheidung erfolgte innerhalb von 24h hauptsächlich über die Niere(1).

2.5 Struktur und Eigenschaften

Bei Saxitoxin und seinen 20 Derivaten handelt es sich um relativ kleine (250 – 500 Da), wasserlösliche Tetrahydropurine. Charakteristisch für PSP-Toxine ist der an mehreren Positionen substituierte Hydropurinring mit einem hohen Stickstoffanteil (35%), zwei Guanidinogruppen sowie einer hydratisierten Carbonylfunktion am C12-Atom.

Durch Variationen des Restes R4 werden unterschieden:(6; 28) 1. Carbamoyltoxine (Carbamattoxine)

2. N-Sulfocarbamoyltoxine 3. Decarbamoyltoxine 4. Deoxycarbamoyltoxine

Die Reste R1-R3, unterschiedlich besetzt mit Wasserstoff-, Hydroxy- und Sulfatgruppen, unterteilen wiederum jede dieser Gruppen und bestimmen Stabilität und Toxizität(6).

Strukturformel:

Abbildung 2-1: Strukturformel von Saxitoxin und seinen Derivaten (28)

Polarität: stark polar

Löslichkeit: stark hygroskopisch, gut wasserlöslich(6; 1; 8; 2; 28)

Löslich in Ethanol und Methanol, nahezu unlöslich in anderen organischen Lösungsmitteln(6; 28)

Stabilität: im sauren Milieu stabil(1; 6; 2), Seite 12

im alkalischen Milieu (pH >8): Oxidation zu fluoreszierenden Purinderivaten(1) Werden durch Kochen nicht inaktiviert.(6; 1; 2)

UV-Absorption: keine UV-Absorption(6; 18)

Fluoreszenz: kein Chromophor, keine natürliche Fluoreszenz

Im Organismus der Algen und der Mitglieder der Nahrungskette können durch enzymatische Umlagerungen bzw. Abspaltungen (Epimerisierung, Dehydroxylierung, Esterspaltung, Decarboxylierung) Metabolite der einzelnen Toxine entstehen. So können zum Beispiel aus den weniger toxischen und relativ instabilen N-Sulfocarbamoyltoxine (die mit den 11ß-Epimere der Gonyautoxine die Hauptkomponenten in verschiedenen Algenspezies bilden)(6) die gefährlicheren Carbamoyltoxine entstehen(2). Derselbe Effekt kann bei der Verarbeitung der Lebensmittel (zum Beispiel bei der Konservenherstellung) auftreten (18).

2.5.1 Carbamoyltoxine

Alle Carbamoyltoxine reagieren basisch, da ihre Guanidinogruppen im physiologischen pH-Bereich in protonierter Form vorliegen (6). Allerdings nimmt ihre Basizität von Saxitoxin (STX) über Neosaxitoxin (Neo) (jeweils doppelt positiv geladen) zu den Gonyautoxinen (1 positive Nettoladung) ab(6).

R4: H2N-COO

Tabelle 2-6: Carbamoyltoxine

Toxin Ab-

kürzung

Synonym R1 R2 R3 MG

[g/mol]

Saxitoxin STX - H H H 301

Neosaxitoxin Neo N-1-Hydroxysaxitoxin OH H H 317

Gonyautoxin 1 GTX1 C-11α-Hydroxyneosaxitoxinsulfat OH H OSO3- 412 Gonyautoxin 2 GTX2 C-11α-Hydroxysaxitoxinsulfat H H OSO3- 396 Gonyautoxin 3 GTX3 C-11ß-Hydroxysaxitoxinsulfat H OSO3- H 396 Gonyautoxin 4 GTX4 C-11ß-Hydroxyneosaxitoxinsulfat OH OSO3- H 412 Durch Bakterienenzyme im Organismus der Muschel kann

- die Sulfatgruppe am C11-Atom abspalten und es entsteht aus GTX2/3 STX und aus GTX 1/4

Neo

- die N1-OH-Gruppe abspalten und es entsteht aus GTX1/4  GTX2/3 und aus Neo STX(6)

2.5.2 N-Sulfocarbamoyltoxine R4: ^-O3S-NH-COO

Tabelle 2-7: N-Sulfocarbamoyltoxine

Toxin Ab-

kürzung

Synonym R1 R2 R3 MG

[g/mol]

B1 (GTX5) - N-21-Sulfosaxitoxin H H H 380

B2 (GTX6) - N-21-Sulfoneosaxitoxin OH H H 396

C3 - N-21-Sulfo-C-11α-

Hydroxyneosaxitoxinsulfat

OH H OSO3- 492

C1 - N-21-Sulfo-C-11α-

Hydroxysaxitoxinsulfat

H H OSO3- 476

C2 - N-21-Sulfo-C-11ß- H OSO3- H 476

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Hydroxysaxitoxinsulfat

C4 - N-21-Sulfo-C-11ß-

Hydroxyneosaxitoxinsulfat

OH OSO3- H 492

Die N-Sulfocarbamoyltoxine leiten sich von den Carbamoyltoxinen ab, sind aber wesentlich weniger toxisch als diese. Sie reagieren kaum noch basisch, da ihre Guanidinogruppen deprotoniert vorliegen(6).

Enzymatisch und durch saure Hydrolyse ist die Bildung von Carbamoyl- und Decarbamoyltoxinen möglich (6). Überhaupt sind die N-Sulfocarbamoyltoxine im sauren Milieu sehr instabil und hydrolyseempfindlich(6). Dies wirkt sich auch auf die Probenaufarbeitung aus, da bei Hydrolyse des essigsauren Probenextrakts eine Umwandlung (Abspaltung der N-Sulfo-Gruppe am N21-Atom) zu den korrespondierenden Carbamoyltoxinen stattfindet(6). Die N-Sulfocarbamoyltoxine können erst anschließend in einem zweiten Lauf mittels Differenzrechnung quantifiziert werden.

2.5.3 Decarbamoyltoxine R4: OH

Tabelle 2-8: Decarbamoyltoxine

Toxin Ab-

kürzung

Synonym R1 R2 R3 MG

[g/mol]

dcSTX Decarbamoylsaxitoxin H H H 258

dcNeo Decarbamoylneosaxitoxin OH H H 274

dcGTX1 Decarbamoyl-C-11α- Hydroxyneosaxitoxinsulfat

OH H OSO3- 369 dcGTX2 Decarbamoyl-C-11α-

Hydroxysaxitoxinsulfat

H H OSO3- 353

dcGTX3 Decarbamoyl-C-11ß- Hydroxysaxitoxinsulfat

H OSO3- H 353

dcGTX4 Decarbamoyl-C-11ß- Hydroxyneosaxitoxinsulfat

OH OSO3- H 369

Die Decarbamoyltoxine leiten sich chemisch von den Carbamoyltoxinen durch Abspaltung der Carbamatgruppe ab. So entsteht unter Einwirkung von 7,5 N Salzsäure bei 110°C dcSTX aus STX mit einer Ausbeute von 75%(6). Chemisch und enzymatisch sind die Decarbamoyltoxine sehr stabil (6).

2.5.4 Deoxydecarbamoyltoxine R4: H

Tabelle 2-9: Deoxydecarbamoyltoxine

Toxin Ab-

kürzung

Synonym R1 R2 R3 MG

[g/mol]

doSTX H H H 242

doGTX2 H H OSO3- 337

doGTX3 H OSO3- H 337

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3 Saxitoxin als Biologischer Kampfstoff

Außer über Schalentieren können die Toxine auch über Trinkwasser oder über Aerosole aufgenommen werden. Inhalation von Saxitoxin führt innerhalb weniger Minuten (16) zum Tod durch Atemlähmung. Auch die Kontamination von konventioneller Munition zur Beschleunigung des Todes war bereits angedacht (28). Militärische Studien zu diesen Themen sind geheim eingestuft.

Mit Ausnahme einiger Eiweißtoxine (Botulinumtoxin, Ricin) ist Saxitoxin eine der giftigsten Substanzen (28). Aufgrund seiner hohen Toxizität und seiner möglichen militärischen Nutzbarkeit gilt Saxitoxin mit seinen Derivaten als potentieller Gefahrstoff biologischen Ursprungs, der kriminell, terroristisch oder militärisch nutzbar ist (früher „B-Kampfstoff“) und ist in der internationalen C-Waffen-Konvention (31) und im deutschen Kriegswaffenkontrollgesetz (32) gelistet. Dies ist auch einer der Gründe, weshalb das Reintoxin für die Herstellung von Standardlösungen für die Analytik vor allem seit den Terroraktivitäten nach dem 11. September 2001 weltweit schwer zu erhalten ist.

Die synthetische Herstellung von Saxitoxin ist schwierig, aber seit 1977 möglich. Zur Isolierung aus Muscheln wurden in einem Experiment 8 Tonnen Muscheln verwendet, um 1 Gramm Saxitoxin zu isolieren (16). In Australien wurde die bis 1999 höchste Menge PSP-Toxine aus lyophilisierten Cyanobakterien mit 3,4mg/g Trockenmasse veröffentlicht (5). Labor Spiez (28) spricht von max.

10mg/100g Muschelfleisch.

Wegen der guten Wasserlöslichkeit steht zu befürchten, dass Saxitoxin und seine Derivate nach oberflächlicher Kontamination des Bodens in Grund- und Oberflächenwasser verbreitet werden kann. In der Schweiz zeigte um 2007 eine Studie mit den ähnlich gut wasserlöslichen Mycotoxinen Deoxynivalenol und Zearalenon die Verbreitung vom Weizenfeld in Drainagewasser und aufnehmende Bäche und Flüsse. Dies bedeutet, dass Toxine – natürlichen oder unnatürlichen Ursprungs – mit vergleichbaren Eigenschaften, ein nicht überschaubares Risiko darstellen könnten.

Interessant wäre die Frage, ob/inwieweit Pflanzen eine Toxinkontamination aus Boden oder Luft aufnehmen können. Einerseits wäre dies eine Gefahr für Lebens- und Futtermittel, andererseits könnten diese Pflanzen als Indikatoren für eine früher erfolgte Kontamination dienen. In den geprüften Literaturstellen gab es keine Hinweise auf Untersuchungen von Boden oder Pflanzen im Einzugsgebiet von (natürlich) kontaminierten Gewässern.

4 Monitoring und Management

Internationales Monitoring bezüglich Algen oder deren Toxine im Wasser oder in Meeresfrüchten kann eine Vielzahl von Vergiftungsfällen verhindern. Allerdings sind neben den hohen Kosten für das Monitoring bei Ernteverboten Einschränkungen in der Fischereiwirtschaft und/oder im Tourismus (Badeverbote) verbunden, was zu zum Teil erheblichen finanziellen Einbußen in den betroffenen Bereichen führt.

Monitoring bezüglich bestimmter Algenspezies birgt jedoch die Gefahr, dass andere Spezies – zum Beispiel neu in dieses Gebiet eingeschleppte Arten – unentdeckt bleiben.

IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) führte 1990 das Projekt „Overview of current legislation on phycotoxins and plant toxins“ durch (33):

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Bis 1991 meldeten 21 Länder aktuelle oder geplante Richtlinien gegen ein oder mehrere marine Phycotoxine oder toxinbildende marine Algen. Die Regelungen erstreckten sich hauptsächlich auf PSP/Saxitoxin/Gonyautoxin, DSP/Okadasäure, ASP/Domoinsäure, NSP/Brevetoxin, Ciguatera.

Dabei gab es Unterschiede in den Grenzwerten vor allem bei PSP und DSP.

- Keine Regelungen meldeten damals:

• Europa: Belgien, Luxemburg, Rumänien, Schweiz, Ungarn,

• Amerika: Bolivien, Brasilien, Chile, Ecuador, Guinea Bissau, Honduras, Kolumbien, Mexiko, Peru, San Salvador,

• Afrika: Ägypten, Äthiopien, Burkina Faso, Kamerun, Kenia, Malawi, Sudan,

• Asien: Indien, Jemen, Jordanien, Syrien,

- Monitoring über ein oder mehrere Toxine betrieben in:

• Europa: Dänemark, Deutschland, Frankreich, Irland, Italien, Niederlande, Norwegen, Österreich, Portugal, Schweden, Spanien, UK

• Amerika: Kanada, Guatemala, USA

• Asien: Hong Kong, Japan, Singapur, Südkorea

• Australien: Australien, Papua Neuguinea

- Muschelgebiete wurden geschlossen bei Überschreitung bestimmter Algenkonzentrationen in:

Australien, Dänemark, Irland, Südkorea, USA (Florida)

- Muschelgebiete wurden geschlossen bei Nachweis der Toxine in Muscheln: Niederlande

- Muschelgebiete wurden geschlossen bei Auftreten der Toxinproduzenten im Wasser und gleichzeitig Nachweis der Toxine in Muscheln: Italien

- Monitoring erfolgte nur bei bestimmten Anlässen: Norwegen

In der Regel wurde zunächst die massenhafte Vermehrung von Algen beobachtet. Bei Überschreitung eines Grenzwerts für die Anzahl toxinbildender Algen pro Liter wurde meist die Ernte von Muscheln präventiv verboten. Nach Einführung solcher Monitoring-Programme sank die Zahl der Vergiftungen fast gegen Null. Probleme treten heute eigentlich nur noch auf, wenn Warnungen nicht beachtet werden oder bei privatem Sammeln an nicht überwachten Strandabschnitten.

Risikomanagement ist abhängig von epidemiologischen Daten. Allerdings können Algenspezies plötzlich in Gegenden auftreten, in denen sie bisher nicht zu finden waren, und können dort großen Schaden anrichten. Wenn das Monitoring nur auf bestimmte Spezies ausgelegt ist, könnte das Auftreten dieser neuen Art zu spät erkannt werden. Einige Monitoring-Programme und Toxingrenzwerte in verschiedenen Ländern sind in den Anlagen 2 und 3 genannt.

Der Import und Export von Meeresfrüchten wird inzwischen in vielen Ländern ebenfalls streng kontrolliert. Beim Import von Lebensmittel mariner Herkunft in die USA muss ein Memorandum of Understanding (MOU) zwischen dem Ministerium des exportierenden Landes und der United States Food and Drug Administration (USFDA) existieren (18). Bei Importen in die EU durch Nicht-EU- Länder wird die Einhaltung der Anforderungen für den europäischen Markt kontrolliert.

Zentrale Referenzlabore der EU führen ein EU-weites Algen-Monitoring durch. Die nationalen Laboratorien der einzelnen EU-Staaten haben die Aufgabe, nationale Monitoring-Programme analytisch zu begleiten und die Einhaltung nationaler Regelungen bezüglich der Kontamination von Fischereierzeugnissen und lebenden Muscheln mit Algentoxinen zu überwachen (18). In Deutschland werden hauptsächlich Miesmuschelproben aus den ausgewiesenen Muschel- Erzeugungsgebieten im Schleswig-Holsteinischen Wattenmeer ganzjährig, und während der Saison intensiviert, auf Algentoxine untersucht. Hinzu kommt eine zeitlich begrenzte Probenahme in der südlichen Flensburger Förde. In den letzten Jahren (Stand 2012) wurden hier Algentoxine gar nicht oder nur in sehr geringen Konzentrationen gemessen (34).

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4.1 Mögliche Managementstrategien gegen Cyanobakterien

Zur Vermeidung von Gefahren durch Cyanotoxine in Trinkwasser gehören Verhinderung von Algenblüte und Entfernung von Toxinen während der Wasseraufbereitung. In Deutschland liegt dabei das Hauptaugenmerk auf Microcystin.

Wesentlich bei der Algenblüte ist die Verringerung der anorganischen Nährstoffe (insbesondere Stickstoff, Phosphor), wobei auch der Phosphor in tieferen (anaeroben) Zonen und im Sediment einbezogen werden muss.

Mögliche weitere Managementstrategien:

- Verringerung des Nährstoffeintrags

- Mechanische Maßnahmen zur Verringerung der Algenzellzahl bei der Wasseraufbereitung (Koagulation, Flockung, Sedimentation, Ultra-/Mikrofiltration)(10). Allerdings werden hierbei die Zellen zerstört und damit intrazelluläre Toxine freigesetzt, falls vorher Oxidationsmittel zugefügt wurden(10).

Lösliche Toxine können durch mechanische Methoden nicht entfernt werden(10).

- Zusatz von Algiciden (Cu-sulfat, Cu-citrat, Cu-enolat…)(10). Dies ist nur sinnvoll vor Eintreten der Algenblüte und nur in stehenden, kleinen Gewässern. Das Problem ist, dass die benötigten Substanzen selbst toxisch sind.

- Vertikale Durchmischung der Wassersäule (Fontäne, Sprudler) - Flussrate erhöhen

- Biologische Maßnahmen:

• Einsatz von Fischen oder Zooplankton, die Phytoplankton aufnehmen

• Einsatz von Bakterien (gegen Algen oder Toxine)

- Inaktivierung der Toxine durch Bindung an Aktivkohle oder mit Oxidationsmitteln(10)

Die Wirkung von pulverisierter Aktivkohle (30mg/L, 1h Einwirkzeit) scheint unterschiedlich für die PSP-Toxine zu sein, je nach Molekulargewicht des Toxins und Porenvolumen der Aktivkohle(10).

- Cave: Ozon als Oxidationsmittel zerstört die PSP-Toxine nicht ausreichend(10)!

4.2 Regelungen

Einige Regelungen, die die betreffenden Länder bezüglich der Toxine und/oder der Toxinbildner erlassen haben:

Cyanobakterien:

Einige Länder haben für Badegewässer einen Grenzwert von 15.000-20.000 Cyanobakterien pro ml in der obersten Wasserschicht festgelegt.(9) Das Umweltbundesamt(9) empfiehlt für Deutschland eher die Messung der Cyanobakterien-Biomasse oder der Toxinkonzentration, da hier häufig fädige Cyanobakterien vorkommen, deren Zellzahl nicht gezählt werden kann, und die Zellgröße der verschiedenen Arten stark variiert.

Deutschland:

- Fisch-Verordnung 08.08.1988.

- Fischhygiene-Verordnung 31.03.1994 / 08.06.2000 (aufgehoben 2007) - Richtlinie 91/492/EWG vom 15.07.1991

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Niederlande:

Das Monitoring in den Niederlanden erstreckt sich über PSP-, ASP- und DSP-Toxine in Muscheln und deren Produzenten in Wasser, wobei das Hauptaugenmerk bei DSP liegt (4).

UK:

In Großbritannien gelten insbesondere die Orkney und Shettland Inseln als Hauptgebiete für das Auftreten der Toxinbildner (3; 22). In diesen Gegenden werden die Muschelerntegebiete für Mytilus edulis) bereits bei relativ niedrigen Zellzahlen von <2000 Zellen pro Liter gesperrt (22) (Stand 2009). Seit den Vergiftungsfällen von 1968 in Nordost-England wird Muschelfleisch regelmäßig untersucht (22). Dieses Monitoring-System wurde 1991 mit der EU Shellfish Hygiene Directive erweitert auf alle Muschelgebiete und auf die Erfassung von Algen-Zellzahlen (22).

Schottland:

SEPA Scottish Environment Protection Agency weist 78 Muschel-Erzeugungsgebiete aus (35).

EU:

Richtlinie 91/492/EWG vom 15.07.1991 (13)

zur Festlegung von Hygienevorschriften für die Erzeugung und Vermarktung lebender Muscheln (Auszüge)

- Erlaubt Dekontamination von lebenden Muscheln

- Legt Zuständigkeiten für die Einhaltung von Hygienevorschriften und Kontrollen fest - Gibt Vorgaben für Erzeugungsgebiete, Sammelbedingungen, Umsetzgebiete, Gesundheits-

kontrollen und Sperrung von Erntegebieten

- Bestimmt die Erstellung eines Verzeichnisses der freigegebenen Erzeugungsgebiete - Vorschriften für die Ernte und Beförderung

- Vorschriften für das Umsetzen - Mikrobiologische Anforderungen

- Kapitel V: Vorschriften für wasserlösliche Toxine (PSP):

 „Biologische Analyse – ggf. in Verbindung mit einem chemischen Saxitoxin- Testverfahren – oder jeder anderen nach dem Verfahren des Artikels 12 dieser Richtlinie anerkannten Methode“

 Max. 80µg/100g Muschelfleisch

 „Bei Anfechtung ist die biologische Methode als Referenzverfahren heranzuziehen.“

- Kapitel VI: Vorschriften über Gesundheitskontrollen und Produktionsüberwachung

 Periodische Überwachung der Erzeugungs- und Umsetzgebiete um toxinproduzierendes Plankton und Biotoxine in lebenden Muscheln nachzuweisen

 Stichprobenpläne

VO EG 853/2004 vom 29.04.2004 (11) (Auszüge)

- Es können Behandlungsmöglichkeiten für Muscheln festgelegt werden.

- Es können anerkannte Analysemethoden für marine Biotoxine festgelegt werden.

- Es können Grenzwerte und Analysemethoden für andere marine Biotoxine festgelegt werden.

- Es können Stichprobenpläne, Methoden und Analysetoleranzen zur Überprüfung der Einhaltung der Hygienevorschriften festgelegt werden.

- Abschnitt VII Kapitel II: Vorschriften für Erzeugungsgebiete

 „Die Erzeuger dürfen lebende Muscheln nur in Erzeugungsgebieten mit einer festgelegten Lage und Abgrenzung ernten, welche die zuständige Behörde […] als Gebiete der Klasse A, B oder C eingestuft hat.“

 „Lebensmittelunternehmer dürfen in Erzeugungsgebieten der Klasse A geerntete lebende Muscheln nur für den unmittelbaren menschlichen Verzehr in Verkehr bringen, wenn diese Muscheln die Anforderungen des Kapitels V erfüllen.“

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 „Lebensmittelunternehmer dürfen in Erzeugungsgebieten der Klasse B geerntete lebende Muscheln erst nach Aufbereitung in einem Reinigungszentrum oder nach dem Umsetzen zum menschlichen Verzehr in Verkehr bringen.

 „Lebensmittelunternehmer dürfen in Erzeugungsgebieten der Klasse C geerntete lebende Muscheln erst zum menschlichen Verzehr in Verkehr bringen, wenn diese gemäß

Buchstabe C dieses Kapitels für einen langen Zeitraum umgesetzt worden sind.“

- Vorschriften für die Ernte und die Behandlung nach der Ernte - Vorschriften für das Umsetzen lebender Muscheln

- Kapitel V: Hygienevorschriften für lebende Muscheln

 Max. 800µg/kg (im ganzen Tierkörper oder in allen essbaren Teilen gesondert gemessen)

Es wird diskutiert, den Grenzwert von 800µg/kg auf 375µg/kg abzusenken, was der deutschen Fischhygiene-Verordnung vor Einführung des EU-Rechts entspräche (36).

Australien:

-

In USA werden bereits seit 1925 Anstrengungen unternommen, die Bevölkerung vor PSP zu schützen (37). Seit 1958 gilt ein Grenzwert von 80µg Saxitoxin/100g. Bei Überschreitung werden Erntegebiete geschlossen (37; 14).

-

Grenzwert: 160µg/100g (14)

Bei Überschreitung Schließung der Erntegebiete.

5 Auftreten von PSP

Es kommt weltweit immer wieder zu Vergiftungsfällen, da sich giftige Muscheln sensorisch nicht von ungiftigen unterscheiden und weil die Toxine beim Kochen nicht inaktiviert werden. Weltweit werden pro Jahr etwa 2000 Fälle beschrieben, von denen etwa 15% tödlich enden (38). Lediglich geringe Mengen der Toxine gehen bei der Zubereitung in das Kochwasser oder in das Bratenfett über, so dass diese grundsätzlich entsorgt werden sollten.(29)

5.1 Randbedingungen für das Auftreten von Vergiftungen

Während das Risiko bei Muscheln aus dem Handel oder in Restaurants relativ gering ist (zumindest in Ländern mit ausreichender Lebensmittelüberwachung), sind vor allem Personen betroffen, die in Gebieten, die für giftige Muscheln bekannt sind oder deswegen (zeitweise) gesperrt sind, diese für den Eigenbedarf sammeln.

Während in den gemäßigten Zonen im Sommer gehäuft Algenblüten und somit auch giftige Muscheln vorkommen, und im Winter eher weniger, so lässt sich für die tropischen und subtropischen Gebiete kein derartiger Anhaltspunkt festlegen. Aufgrund des fortschreitenden

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Klimawandels und der damit verbundenen Erwärmung der Weltmeere steht zu befürchten, dass toxinproduzierende Algen in Zukunft eher verstärkt auftreten werden. Für die weltweite Verschleppung der Toxinbildner ist oftmals der Mensch verantwortlich (Schiffsbewuchs, Ballastwasser, Muschel-Umsetzung, Fischfang, Aquakultur, Tourismus…).

Prinzipiell können alle Wassertiere, die giftige Algen filtrieren, selbst giftig werden (29). Dasselbe gilt für Konsumenten (z.B. Wellhornschnecken), die wiederum diese Algenfresser (z.B. Muscheln) auf ihrem Speiseplan haben. Entscheidend für die Gefahr für den Menschen ist die Resistenz dieser Tiere gegen das Gift und deren Überleben bis zum Fang bzw. bis zur Ernte.

5.1.1 Salzwasser

Die minimale Wachstumstemperatur der Dinoflagellaten liegt bei 8-10°C (14). Versuche zum Toxinbildungsvermögen mit den verschiedenen Faktoren, wie Temperatur, Salzgehalt, Nährstoffgehalt, Licht, Schadstoffe... brachten offensichtlich noch keine zufriedenstellenden Ergebnisse. Dies wäre wichtig für die Vorhersage von Gefahrensituationen.

5.1.2 Süßwasser

In gemäßigten Zonen kommen im Winter hauptsächlich Kieselalgen im Süßwasser vor, gefolgt von Grünalgen im Frühjahr/Frühsommer, während die Dinoflagellaten und Cyanobakterien (Blaualgen) mit den gelbgrünen Algen erst im Spätsommer/Herbst zu erhöhten Zellzahlen anwachsen(10). In tropischen Seen, wo die Temperatur gleichmäßig hoch ist, können die Cyanobakterien das ganze Jahr über die Algenpopulation dominieren (10). Wenn Licht, Temperatur und Nährstoffangebot einzelne Cyanobakterien-Arten begünstigen, können diese zu einer Zellzahl von 10⁶ pro Liter anwachsen (10). Dank gasgefüllter Vesikel in der Zelle schweben Cyanobakterien in unterschiedlichen Wassertiefen. Bei geeigneten Temperatur- und Lichteinwirkungen kommen sie massenhaft zur Photosynthese an die Oberfläche und sind als „Algenblüte“ (Harmful Algal Bloom HAB) sichtbar. Mit Hilfe des Winds sammeln sie sich in bestimmten Gewässerregionen. Zum Schutz der Badenden vor den Toxinen im Wasser wird dann oft Badeverbot ausgesprochen.

Die Zelldichte-Bestimmung erfolgt mikroskopisch (Lugol-fixierte Probe, dunkel gelagert, Zählkammer, Vergrößerung 400x) oder mit Hilfe des Chlorophyll-a-Gehalts (DIN 38412)(9).

• Nährstoffe:

Vor allem der Anstieg von Stickstoff und/oder Phosphor im Wasser fördert das Wachstum von Cyanobakterien(25; 10). Erfahrungsgemäß erfolgt in flachen, durchmischten Gewässern unter 0,04 mg/L Gesamt-Phosphor kaum Massenentwicklung von Cyanobakterien (9). Bei tiefen und thermisch stabilen Gewässern liegt diese Schwelle bei 0,01 – 0,02 mg/L(9).

Auch der Mangel an anderen Mineralstoffen (Fe, Mn, Co, Cu, Zn...) wirkt limitierend auf Wachstum und Toxinbildung.(25)

Ein Anstieg von Stickstoff und Phosphor kann aus landwirtschaftlicher Düngung, Klärwerksablauf oder städtischem Regenwasserablauf resultieren. Vor allem eutrophe Badeseen mit einer Sichttiefe

<2m können stark mit Cyanobakterien und den verschiedenen Toxinen belastet sein.

Die photometrische Phosphor-Bestimmung erfolgt gemäß DIN 1189(9).

• Temperatur

Wassertemperaturen >20°C fördern das Wachstum (25), so dass Algenblüten vor allem im Spätsommer auftreten.

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• pH-Wert

pH-Werte <6 fördern das Wachstum von eukaryontischem Phytoplankton, während pH-Werte >8 die Cyanobakterien begünstigen(25).

• Turbulenzen

Cyanobakterien bevorzugen Gewässer ohne Turbulenzen(10). Turbulenzen beeinflussen auch den Zusammenschluss von Einzelzellen zu Algenblüten negativ.

• Biotische Faktoren

Andere Phytoplankton-Arten, Fraßdruck durch Zooplankton beeinflussen die Zelldichte.

5.2 Symptomatik

Nach einer schnellen Resorption aus dem Magen-Darm-Trakt entwickeln sich innerhalb von 5-60 Minuten nach dem Verzehr kontaminierter Muscheln Kribbeln und Brennen um Lippen, Zunge und Gesicht, was sich weiter in Nacken, Arme, Beine, Finger und Zehen ausbreitet. Die Parästhesien (Missempfindungen) wandeln sich später in Taubheit und Lähmungen um. Koordinationsstörungen der Muskulatur werden begleitet von allgemeiner Schwäche, Schwindelanfällen, Gleichgewichtsstörungen, Kreislaufschwäche / Blutdruckschwankungen sowie Artikulations- und Schluckschwierigkeiten. Auch Übelkeit, Erbrechen, Durchfall und/oder Lähmung der Gesichtsmuskulatur und Doppelsehen oder vorübergehende Blindheit sind möglich.

Höhere Dosen – auch in Verbindung mit der durchaus möglichen Aufnahme von weiteren Toxinen aus derselben Mahlzeit – können innerhalb von 2-12 Stunden zum Tod durch Atemlähmung oder Kreislaufversagen führen. Sofern der Vergiftete die ersten 24 Stunden überlebt, ist eine vollständige Gesundung nach 3-4 Tagen ohne Spätfolgen möglich(6; 1; 2).

Herz- und Kreislauffunktionen bleiben meist unbeeinträchtigt (29). Die Blutparameter zeigen keine auffälligen Befunde (29). Die Ausscheidung erfolgt über den Urin.

Die Aussagen, ob die vermehrte Aufnahme kleinerer Dosen zu einer gewissen Resistenz führen kann, sind widersprüchlich.

Von den weltweit ca. 2000 menschlichen Vergiftungsfällen pro Jahr enden 15% tödlich (19).

5.3 Prävention und Therapie

Es existiert – wie beim Tetrodotoxin – kein Antidot, so dass eine Behandlung nur symptomatisch erfolgen kann (Magenspülung, Aktivkohle, falls nötig Intubation/Beatmung). Auf Grund der Reversibilität der Na⁺-Kanal-Blockade und der relativ schnellen Ausscheidung über den Urin, ist die Erholung möglich, sofern der Patient die ersten 12-24 Stunden überlebt. Diuretika können hilfreich sein (16).

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5.4 Toxizität

PSP-Toxine wirken vor allem in Warmblütern, wobei offensichtlich die einzelnen Tierarten, aber auch die einzelnen Individuen, Unterschiede in ihren Empfindlichkeiten aufweisen. Für einen erwachsenen Menschen kann eine Dosis von 1-4mg tödlich sein (6). Tabelle 5-1 zeigt eine Übersicht über die LD50-Werte bei verschiedenen Applikationsarten und verschiedenen Versuchstieren.

Tabelle 5-1: LD50-Werte von PSP-Toxinen

Tierart Applikation Toxin LD50 [µg / kg KG] Quelle

Mensch oral PSP 15-50 (6)

Maus oral PSP 260-263 (6; 8)

Maus oral Saxitoxin 263 (7)

Maus i.p. Saxitoxin 9 (29)

Maus i.p. Saxitoxin 3-10 (7)

Maus i.v. PSP 2,4-3,4 (1)

Maus inhalativ Saxitoxin 2 (39)

Ratte oral PSP 192-212 (6; 8)

Affe oral PSP 277-800 (6; 8)

Hase oral PSP 181-200 (6)

Meerschweinchen oral PSP 128-135 (6)

Katze oral PSP 254-280 (6)

Hund oral PSP 180-200 (6)

Taube oral PSP 91-100 (6)

Maus LOAL Saxitoxin 1,5 (19; 15)

Maus NOAL Saxitoxin 0,5 (19; 15)

In Tabelle 5-2 sind die Symptome beim Menschen in Abhängigkeit von der Konzentration gezeigt.

Tabelle 5-2: Toxizität beim Mensch

Toxin Symptom Dosis Quelle

PSP leichte Parästhesien 2000-10000 MU (29)

STX leichte Parästhesien 0,5-1µg (40)

PSP erste paralytische Symptome

10.000-20.000 MU (29)

PSP letale Dosis 20.000-40.000 MU (29)

letale Dosis 11.000-35.000 MU (480-4375 MU/kg) Kinder: 140-600 MU/kg

(29)

STX letale Dosis 1-4mg (5000-20000 MU) (7)

letale Dosis (Minimum Kinder) (vermutet)

25µg/kg (16)

STX Vergiftungssymptome ab 85 µg / Aufnahme (8)

PSP tödlich 456-12400µg STXeq/Aufnahme (1)

PSP Überlebt 144-1660µg STXeq / Aufnahme (1)

PSP tödlich (1 Fall) 60µg STXeq / Aufnahme (1)

Saxitoxin und Neosaxitoxin sind die giftigsten Vertreter der PSP-Toxine. Zum Vergleich der verschiedenen Derivate und deren unterschiedlicher Toxizität wurden Saxitoxin-Äquivalente (STXeq) eingeführt. 1mg Saxitoxin entspricht 5500 Mauseinheiten (MU) ( 1 MU = 0,18 STXeq) (6). Bei Verwendung von Nicht-Bioassays müssen zur Bestimmung der Gesamttoxizität in einem Lebensmittel möglichst alle 21 Toxine quantifiziert werden. Mit Hilfe des individuellen Toxizitätsfaktors wird für jedes einzelne in der Probe enthaltene PSP-Toxin das Saxitoxin- Äquivalent (STXeq/kg) berechnet und damit die Gesamttoxizität ermittelt (siehe Tabelle 5-3).

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Tabelle 5-3: Toxizität der PSP-Toxine(6)

Toxin MU/µmol µg STXeq/µmol relative Toxizität

STX 2100 378 100

Neo 2300 414 110

GTX1 1900 342 90

GTX2 1000 180 48

GTX3 1600 288 76

GTX4 1900 342 90

dcSTX 900 162 43

DcNeo 900 162 43

dc GTX1 950 171 45

dc GTX2 380 68 18

dc GTX3 380 68 18

dc GTX4 950 171 45

B1 150 27 7

B2 150 27 7

C1 17 <1 <1

C2 - - -

C3 17 1 1

C4 - - -

Bei einem maximalen Toleranzwert von 40-80µg/100g enthält eine 300-g-Muschelmahlzeit 120- 240µg PSP. Dies bewirkt bei einer 70-kg-Person eine Dosis von 1,7-3,4µg/kg KG. Dies wiederum bedeutet (für einen 70-kg-Mensch) eine Überschreitung bis Verdopplung des LOAL von 1,5µg/kg KG (19; 15). Somit ist schon für eine relativ schwere Person ein riskanter Level erreicht!

Bei den unterschiedlichen Zubereitungsvarianten von Lebensmitteln ist eine Umwandlung der beinhalteten Toxine in giftigere oder weniger giftige Derivate möglich. Besonders bei saurer Zubereitung ist trotz gewisser Verluste in die Kochflüssigkeit durch Extraktion und Derivatisierung eine noch höhere Gefährdung nicht auszuschließen (15).

5.5 Regionales Auftreten von PSP-Toxinen, toxinbildenden Algen und Vergiftungsfällen

Toxische Cyanobakterien kommen weltweit vor (außer Antarktis)(10). PSP kann – wie ASP, DSP und AZP – weltweit auftreten, während NSP hauptsächlich auf USA und Neuseeland beschränkt ist (4). Nach dem ersten Auftreten von PSP 1927 in Kalifornien, wurden die Toxine bis in die 1970er Jahre nur in europäischen, nordamerikanischen und japanischen Gewässern nachgewiesen (4).

Später kamen Chile, Südafrika, Australien und andere Länder hinzu (4).

Die meisten europäischen Länder, USA, Kanada, einige Länder Mittelamerikas und Ozeaniens, Australien, Japan, Südkorea und einige arabische Staaten (ROPME) haben Monitoring Programme und Regelungen zur Kontrolle bestimmter Algenspezies und/oder Muscheln eingeführt. In den meisten Ländern gelten 40-80µg PSP bzw. STXeq / 100g Muschelfleisch als Obergrenze.

In einigen Ländern werden in Muschelerntegebieten die Art und Anzahl der Algen im Wasser regelmäßig kontrolliert. Bei Erreichen eines Grenzwerts (action limit) werden Maßnahmen ergriffen. Diese reichen von verstärkten Kontrollen bis hin zur Sperrung des Erntegebiets. Teilweise werden zur Vorhersage auch Satellitenunterstützung und die Kontrolle von Cysten im Sediment herangezogen. Seit Einführung der Monitoring-Programme ging die Zahl der Vergiftungsfälle zurück(6).

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