Untersuchungen zum Mißbrauch von GHB und verwandten Verbindungen bei Patienten in Substitutionstherapie

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Untersuchungen zum Mißbrauch von GHB und verwandten Verbindungen bei Patienten in

Substitutionstherapie

Abschlussarbeit

Postgradualstudium Toxikologie und Umweltschutz der Universität Leipzig

Dipl.-Chem. Andreas Preidel

Dessau, 4. Januar 2015

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Danksagung

Die vorliegende Arbeit wurde im Rahmen und neben meiner beruflichen Tätigkeit in der Abteilung Drogen- und Medikamentenanalytik des MVZ Labor Dessau GmbH angefertigt.

An dieser Stelle möchte ich mich ganz herzlich bedanken bei:

Herrn Dr. Michael Böttcher und Frau Dr. Juliane Böttcher-Lorenz, die mir die Möglichkeit der Durchführung des Postgradualstudiums gegeben haben. Desweiteren danke ich Herrn Dr. Böttcher für die Bereitstellung des bearbeiteten Themas sowie seine stete Diskussionsbereitschaft.

Herrn a.o. Univ. Prof. Dr. Thomas Keller (Gerichtsmedizin Salzburg-Linz, Österreich) für die Durchführung der GHB-Messungen mit dem enzymatischen Test.

Herrn Prof. Dr. Torsten Arndt und Mitarbeiter (Labor Bioscientia, Ingelheim) für die Bereitstellung der Proben der Kontrollgruppe.

Herrn Dr. Andre Scholer (Universitätsspital Basel, Schweiz) für die Bereitstellung von positiven GHB-Proben.

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Inhaltsverzeichnis

Seite

1 Einleitung 3

2 Literatur 5

2.1 Pharmakologie und Physiologie von GHB 5

2.2 Missbrauch 6

2.3 Nachweisbarkeit von GHB 6

2.3.1 endogenes GHB im Urin 6

2.3.2 endogenes GHB im Blut 7

2.3.3 endogenes GHB im Speichel 7

2.3.4 endogenes GHB im Haar 7

2.3.5 Pharmakokinetik von GHB nach Konsum 8

2.4 Nachweismethoden 9

2.4.1 Gaschromatographie-Massenspektrometrie 9 2.4.2 Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie 10

2.4.3 Enzymatischer Test 10

2.5 GHB-Isomere 11

2.6 gamma-Butyrolacton und 1,4-Butandiol 11

3 Experimentelles 13

3.1 LC-MS/MS Methode 13

3.2 Methodenvalidation der LC-MS/MS-Methode 14

3.3 Enzymatischer Test 15

3.4 Proben 15

3.4.1 Kontrollgruppe 15

3.4.2 Patientengruppe 15

3.4.3 Proben für Methodenvergleich 16

4 Ergebnisse 17

4.1 Leistungsdaten der LC-MS/MS Methode 17

4.2 GHB-Konzentrationen in der Kontrollgruppe und Cutoff-Ableitung 19

4.3 GHB-Konzentrationen in der Patientengruppe 20

4.4 Untersuchungen mit dem enzymatischen Test 21

5 Diskussion 26

6 Literaturangaben 28

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1 Einleitung

Gamma-Hydroxybuttersäure (GHB) ist ein Vorläufer und Metabolit des im Gehirn dämpfend wirkenden Neurotransmitters Gamma-Amino-Buttersäure (gamma-Aminobutyric-Acid, GABA). GHB ist eine farblose und geruchlose Flüssigkeit mit leicht salzigem Geschmack.

Neben seiner eingeschränkten Bedeutung als Medikament, z.B. Behandlung der Narkolepsie, ist es als missbrauchsrelevante Droge zu betrachten. Einerseits geschieht dies als „recreational drug“ im Rahmen von z. B. Tanzpartys und andererseits als K.O.-Tropfen unter Ausnutzung der betäubenden Wirkung für Raub- und Vergewaltigungsdelikte („drug facilitated crime“/„drug facilitated sexual assault“) (siehe Übersicht bei [Madea et al. 2009]).

Der für GHB benutzte Begriff “liquid ecstasy“ erweckt fälschlich den Eindruck der Verwandtschaft mit den Amphetaminen (MDMA). Es gibt keine chemische Strukturverwandtschaft des GHB mit der Gruppe der Amphetamine.

Mit Einschränkung der Nutzung von GHB, in Deutschland 2002, wurden und werden die technischen Lösungsmittel gamma-Butyrolacton (GBL) und 1,4-Butandiol (BD) als Quelle der Synthese bzw. als Ersatz von Drogenkonsumenten benutzt [Palmer 2004].

Beide Substanzen werden nach oraler Aufnahme sehr schnell zu GHB umgewandelt (Abb. 1). Die Wirkung von GHB ist stark abhängig von der Dosis und ist anabol, euphorisierend, aphrodisierend aber auch sedierend. In Deutschland ist GHB in Anlage III des BtMG (verkehrsfähige und

verschreibungsfähige Stoffe) gelistet. Eine Verwendung außerhalb des medizinischen Bereiches ist nicht gestattet.

Abb.1: enzymatische Umwandlung von GBL und BD zu GHB

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Verwendung findet GHB für Anästhäsie, Behandlung von Narcolepsie sowie Alkohol- und Opiatentzug [Saudan et al. 2005]. Es ist aber auch als Steroid-Alternative im Bodybuilding missbraucht wurden.

Entzugssymptome bei Abhängigen [Palmer 2004] sind Angst, Zittern, Schlafstörung/-losigkeit, Tachykardie, Verwirrtheit, Paranoia, Ruhelosigkeit, Delirium und Halluzinationen.

Aufgrund des Auftretens von GHB im GABA-Stoffwechsel ergibt sich die Notwendigkeit der Verwendung eines Cutoff-Wertes zur Unterscheidung von endogen gebildetem und exogen

aufgenommenem GHB. Der Nachweis von verabreichtem bzw. missbräuchlich konsumiertem GHB stellt sich als schwierig dar. Das Nachweisbarkeitsfenster beträgt im Urin nur ca. 10 Stunden. Die Halbwertzeit beträgt 30-40 min [Johansen et al. 2011].

Der GHB-Abbau erfolgt enzymvermittelt zu Bernsteinsäure, die im Citratzyklus zu CO2 und Wasser abgebaut wird. Damit ist der längere Nachweis über z.B. Phase-II-Metabolite nicht möglich. Der Gesamtabbau ist als Reaktion nullter Ordnung beschreibbar. GHB ist routinemäßig nicht in den üblichen Drogenscreenings mit Immunoassay enthalten. Seit kurzem ist jedoch ein enzymatischer Test [Hasan et al. 2011] erhältlich, der ein schnelles und preiswertes Screening, auch in

Laboratorien ohne chromatographische Möglichkeiten, erlaubt.

Untersuchungen zur Prävalenz [Ureda et al. 2010] in der Notaufnahme des San Francisco General Hospital mit 670 Urinproben ergaben mit einem Teststreifen (PortaGHB test, PortaScience, Moorestown, NJ) sechs grenzwertig positive Proben (Cutoff: 10 mg/L).

Das Anliegen der vorliegenden Arbeit ist die Überprüfung des in der Literatur verwendeten Cutoffs von 10 mg/L und die Untersuchung des möglichen Beikonsums bei opiatabhängigen Patienten in Substitutionstherapie sowie der Vergleich des enzymatischen Testes mit der eigenen LC-MS/MS- Methode.

Die bisher publizierten Nachweismethoden für GHB sind fast nur GC-MS-Methoden [De Paoli et al. 2008]. LC-MS/MS-Methoden fanden bisher nur wenig Verwendung.

In der vorliegenden Arbeit wurde eine schnelle LC-MS/MS-Methode für den routinemäßigen und forensischen Nachweis von GHB und den verwandten Verbindungen gamma-Butyrolacton (GBL) und 1,4-Butandiol (BD) in Körperflüssigkeiten und Lösungen entwickelt. Darüberhinaus wurden die in humanen Proben insbesondere bei Alkoholikern und Diabetikern in höherer Konzentration nachweisbaren Verbindungen [Holm et al. 2010] alpha-Hydroxybuttersäure (AHB) und beta- Hydroxybuttersäure (BHB) in die Methode einbezogen.

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2 Literatur

2.1 Pharmakologie und Physiologie von GHB

GHB wurde 1990 erstmals zu pharmakologischen Zwecken synthetisiert und in Europa als intravenöses Narkotikum zugelassen. In den 1980er wurde es in den USA in Fitness- und

Gesundheitszentren angeboten. Vor allem Bodybuilder konsumierten GHB wegen angepriesener muskelaufbauender Wirkung durch Freisetzung von Wachstumshormonen und wegen des

aphrodisierenden Effekts [Andresen et al. 2008]. Zahlreiche Intoxikationen führten 1990 zu einer Verschreibungspflicht. Die Zulassung zur Behandlung von Patienten mit Narkolepsie mit

Kataplexie erfolgte in den USA 2001 und 2005 in Europa.

[Borgen et al. 2004] berichten über eine achtwöchige Studie mit 13 Narkolepsie-Patienten mit Kataplexie (3 männliche und 10 weibliche im Alter zwischen 24 und 52 Jahre). Die Patienten erhielten eine Dosis von 4.5 g GHB pro Tag. Zur Untersuchung der Abbaukinetik wurden vor der GHB-Gabe und bis 7 Stunden danach jeweils 18 Plasmaspiegelbestimmungen durchgeführt. Diese Untersuchung erfolgte zu Beginn der Studie und nach achtwöchiger Anwendung. Im Steady State zeigten sich in den Proben nach achtwöchiger Einnahme leicht erhöhte Peakspiegel im Vergleich zu den Proben am Studienbeginn. Es zeigte sich über die Studiendauer keine Veränderung in der Abbaukinetik. Die Halbwertzeit betrug zu Studienbeginn 0.72 bzw. 0.76 h am Ende.

Als seltene autosomal rezessive Funktionsstörung die zu erhöhten GHB-Konzentrationen führt, ist SSADD (Bernsteinsäure-Semialdehyd-Dehydrogenase Mangel, engl.: succinic semi-aldehyde dehydrogenase deficiency) bekannt. Sie entsteht durch Mangelfunktion oder Deaktivierung der Bernsteinsäure-Semialdehyd-Dehydrogenase. Dadurch führt der Bernsteinsäure-Semialdehyd- Abbau zu GHB. Die Anreicherung von GHB erfolgt im Gehirn, Rückenmarksflüssigkeit sowie Blut und führt zu einer vermehrten Ausscheidung von GHB. Als weitere Stoffe die bei dieser

Stoffwechselstörung auftreten, sind die Produkte der β -Oxidation 3-keto-4-Hydroxybuttersäure und 3,4-di-Hydroxybuttersäure in diesen Patienten zu finden [Brailsford et al. 2010]. In Patienten mit dieser Erkrankung sind bis 105 µg/mL GHB im Serum und 260 µg/mL GHB im Urin [LeBeau et al.

2002] nachweisbar gewesen.

Bei gleichzeitigem Konsum von BD und Alkohol erfolgt ein verlangsamter Abbau des BD, weil das Enzym Alkoholdehydrogenase Ethanol bevorzugt [Shannon et al. 2000].

Unter den Einfluß von GHB kommt es zu anterograder Amnesie. Dies bedeutet, dass die Konsumenten sich nur lückenhaft an die Zeit unter Drogeneinfluß erinnern können. Deswegen erfolgt u.a. der Missbrauch als KO-Tropfen.

Entzugssymptome bei abhängigen Konsumenten beginnen 1-6 h nach letzter Einnahme und dauern 3-15 Tage [Palmer 2004].

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2.2 Missbrauch

Ein Missbrauch erfolgt sowohl als “recreational drug“ im Rahmen von z. B. Tanzpartys und andererseits als K.O.-Tropfen unter Ausnutzung der sedierenden und amnestischen Wirkung für Raub- und Vergewaltigungsdelikte. Die steile Dosis-Wirkungskurve kann leicht eine Überdosierung bewirken. Einen Anhaltspunkt für die dosisabhängige Wirkung ist bei [Kintz et al. 2003] zu finden:

10 mg/kg Amnesie, 20 – 30 mg/kg schlafinduzierend, ab 50 mg/kg Anästhesie.

[Lenz at al. 2008] berichten über eine Patientin, die nach GBL-Konsum, in komatösem Zustand und ohne Schutzreflexe in der Notaufnahme des Krankenhaus gebracht wurde. Sie wies keine äusseren Verletzungen auf und die Vitalwerte sowie die Schädel-Computertomographie waren ohne

pathologisches Ergebnis.

Eine Behandlung bei Intoxikation erfolgt vorallem supportiv durch Sauerstoffgabe ggf. Beatmung, Herzüberwachung, Pulsoximeterie, Blutdrucküberwachung. Eine Gastro-intestinale

Dekontamination wird als wenig sinnvoll angesehen. Der Einsatz von Aktivkohle sollte nur bei grosser Menge und Konsum weiterer Substanzen erfolgen, wenn keine Kontraindikation gegeben ist.

2.3 Nachweisbarkeit von GHB 2.3.1 endogenes GHB im Urin

[Andresen et al. 2010] untersuchten 50 Urinproben im Rahmen einer toxikologischen Analyse mit GCMS nach Umsetzung von GHB zu den Trimethylsilyl-Derivaten. Die Proben sind von Patienten ohne GHB-Missbrauchsvorgeschichte nach stätionärer Entgiftung. Die Autoren fanden GHB- Konzentrationen zwischen 0.64 mg/L und 4.20 mg/L. Aufgrund dieses Ergebnisses schlagen sie vor den Cutoff auf 6 mg/L zu senken.

[Brailsford et al. 2010] untersuchten Proben von 1126 Frauen mit GCMS nach saurer Umwandlung zu GBL und fanden Werte zwischen 0 und 5.5 mg/L. Die erhaltenen Werte waren unabhängig von pH-Wert, Alter, BMI und Rasse. In einer Gruppe von 50 nicht schwangeren Frauen fanden [Crookes et al. 2004] mit GCMS nach Silylierung GHB-Werte zwischen 0.1 und 1.46 mg/L.

[LeBeau et al. 2002] untersuchten eine Gruppe von aus 3 Frauen und 5 Männer von denen 7 Afroamerikaner waren, mit einer Headspace-GCMS-Methode. Es wurden Proben über einen Zeitraum von einer Woche gesammelt. Für die Männer wurden 0.00-6.63 mg/L und für die Frauen 0.00-1.70 mg/L gefunden. Aufgrund dieser Ergebnisse wird ein Cutoff von 10 mg/L zur

Unterscheidung von endogenem und exogenem GHB empfohlen.

In einer weiteren Studie mit einer vergrößerten Anzahl von 207 Probanden (77 weiblich, 130 mänlich) fanden [LeBeau et al. 2006] für die Männer 0-2.7 mg/L und für die Frauen 0.0-0.98 mg/L.

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Die Ergebnisse waren von Rasse, Schwangerschaft bzw. Beimedikation unabhängig. Die Ermittlung der Werte erfolgte mit GC/MS nach Umwandlung zu GBL als „Gesamt-GHB“. Trotz das ihre Werte deutlich unterhalb 10 mg/L liegen schlagen sie vor an diesen Wert als Cutoff festzuhalten.

2.3.2 endogenes GHB im Blut

Einen Cutoff von 1 mg/L GHB im Serum schlägt [Steinecke 2007] vor. Hingegen plädieren [Andresen et al. 2010] für einen Cutoff von 4 mg/L, basierend auf einer Untersuchung von 50 Seren, mit GCMS nach Umwandlung zum Trimethyl-Silyl-Derivat. Ihre gefundenen

Konzentrationen liegen zwischen 0.62 mg/L und 3.24 g/L.

In postmortalen Blutproben nachweisbare Konzentration von GHB sind stark von den Lagerungsbedingungen abhängig. Es wurden bis 197 mg/L GHB gefunden, welches durch Bakterien erzeugt wurde [Steinecke 2007].

2.3.3 endogenes GHB im Speichel

In einer Untersuchung mit GCMS von 20 Probanden, die aus dem Laborpersonal rekrutiert wurden, wurde in einem Fall ein Wert von 29 mg/L gefunden, der nicht erklärt werden konnte [De Paoli et al. 2008]. Die Proben wurden mittels Sarstedt Salivette (Nümbrecht, Deutschland) gesammelt.

In einer Gruppe von 120 Probanden wurden Werte zwischen 0.15 – 3.33 mg/L gefunden [De Paoli et al. 2011]. Es wurde kein signifikanter Einfluss von Alter, Geschlecht, Gesundheitszustand, Medikamenteneinnahme sowie Ess- und Trinkgewohnheiten der Probanden gefunden.

Im Speichel betragen die nachweisbaren Konzentrationen etwa 1/3 bis 1/4 der Konzentrationen in vergleichbaren Plasmaproben [Abanades et al. 2007].

2.3.4 endogenes GHB im Haar

In einer Gruppe von 24 Personen ermittelten [Kintz et al. 2003] Werte von 0.5 bis 12 ng/mg. Es wurde kein Einfluss der Haarfarbe und des Geschlechtes sowie keine Variation über die Länge des Haarschaftes gefunden. Im proximalen Segment wurden erhöhte Werte gefunden, die mit Eintrag durch Schweiß und geringen Auswascheffekten erklärt werden. Die Kalibration erfolgte in

künstlichem Melanin, weil kein GHB-freies Haar gefunden werden konnte.

[Willis et al. 2012] berichten in ihrem Posterbeitrag anläßlich der Tagung SOFT 2012 (Boston, USA) über eine Untersuchung von Haarproben von 100 Probanden. Der Mittelwert beträgt 0.39 +- 1.12 ng/mg bei einem maximalen Wert von 6.02 ng/mg. Es wurden aber nur für 16 Proben

Messwerte über der Bestimmungsgrenze der Methode (LoQ: 0.4 ng/mg) gefunden. Werden nur diese Proben betrachtet ergibt sich ein Mittelwert von 2.41 +- 1.76 ng/mg und entsprechend ein Wertebereich von 0.41 bis 6.02 ng/mg.

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2.3.5 Pharmakokinetik von GHB nach Konsum

In einer Untersuchung von [Kintz et al. 2003] wurden von einem freiwilligen Probanden 25 mg GHB pro kg Körpergewicht konsumiert. Die Menge liegt etwas unter der Dosierung die für die Verwendung als KO-Tropfen (30 – 50 mg/kg) Anwendung findet. Die Haar-Probennahme erfolgte einen Monat nach dem Konsum. Die segmentielle Analyse ergab für das korrespondierende Segment 2.4 ng/mg. Zum Verglich wurden in den anderen Segmenten Werte zwischen 0.6 und 0.8 ng/mg gefunden.

[Abanades et al. 2007] führten eine Konsumstudie mit fünf Probanden durch und verabreichten eine GHB Dosis von 50 mg GHB pro kg Körpergewicht. Dies entspricht 3.7 +-0.3 g GHB absolut. Es wurden Urin, Plasma und Speichel-Proben gesammelt. Die Autoren fanden ein Speichel/Plasma- Verhältnis zwischen 0.2 und 0.5. In den Urinproben der Sammelzeit 0-3 Stunden nach Einnahme wurden als Mittelwert 60.6 mg und in den Urinproben der Sammelzeit 3-6 Stunden als Mittelwert 6.3 mg GHB gefunden. Dies bedeutet, dass im Mittel nur 2 % der verabreichten Menge

wiedergefunden wurden und damit 98 % zu CO2 und Wasser verstoffwechselt wurden. Eine andere als die renale Ausscheidung ist bisher nicht bekannt. Ausgewählte pharmakokinetische Daten zeigt Tabelle 1.

Tab. 1: Pharmakokinetische Daten von GHB in Plasma und Speichel, nach oraler Aufnahme von 50 mg/kg (Mittelwert +- Standardabweichung) nach [Abanades et al. 2007]

Plasma Oral Fluid

Cmax [µg/mL] 83.1 +- 10.7 29.6+-17.5

tmax [h] 0.6 +-0.1 0.5

t1/2 [h] 0.71 +-0.15 1.27 +-0.27

[Drummer 2010] berichtet in einer Übersichtspublikation, dass nach einer GHB-Einnahme von 25 mg GHB pro kg Körpergewicht Serumpeakspiegel zwischen 24 und 102 mg/L und nach Einnahme von 50 mg/kg Serumpeakspiegel zwischen 48 und 125 mg/L gefunden wurden.

Die Untersuchungsgruppe von [Haller et al. 2006] bestand aus sieben Männern und neun Frauen unterschiedlicher ethnischer Herkunft. Die Probanden nahmen 50 mg GHB pro kg Körpergewicht in der Form des Medikamentes „Xyrem“ ein. Einige Probanden nahmen zusätzlich 0.6 g Alkohol pro kg Körpergewicht auf. Die Ergebnisse der zeitlich gestaffelten Auswertung der gefundenen GHB-Konzentration in den Urinproben zeigt Tabelle 2.

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Tab. 2: Mittlere Urin-GHB-Konzentrationen und Wertebereich von 16 Probanden nach Einnahme von 50 mg/kg „Xyrem“ nach [Haller 2006]

0-3 h 3-6 h 6-12 h 12-24 h

Mittelwert Bereich Mittelwert Bereich Mittelwert Bereich Mittelwert Bereich GHB (mg/L) 168.1 14.9-

598

157.3 0-787 3.8 0-35.9 <5 <5

GHB/Kreatinin

(µg/mg) 939.0 80-

4176

250.9 0-1082 5.5 0-70.9 0 0

[Kavanagh et al. 2001] untersuchten das Ausscheidungsprofil im Urin einer 1 g und einer 2 g Dosis GHB mit einem 100 kg schweren freiwilligen Probanden. Diese Dosierungen entsprechen 10 bzw.

20 mg GHB pro kg Körpergewicht. Sie fanden eine maximale Nachweiszeit für GHB von 10 h.

Nach Gabe von 1 mg GHB konnten nach 1.5 h noch 16.5 mg/L GHB nachgewiesen werden. Nach Gabe von 20 mg/kg wurden nach 2 h 29.1 mg/L GHB nachgewiesen.

2.4 Nachweismethoden

2.4.1 Gaschromatographie-Massenspektrometrie

[Kintz et al. 2003] beschreiben ihre Methode mit einem Finnigan TSQ 700 GC-MS/MS-Gerät für die Analytik von Haarproben. Die nach alkalischen Auflösen der Proben und Extraktion mit Ethylacetat erhaltenen Extrakte werden mit N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide und 1%

Trimethylchlorsilan derivatisiert. Die für die Auswertung verwendeten Ionen sind m/z= 233 als Precursorion und die Produktionen m/z=147 und m/z=148. Der lineare Bereich der

Kalibrationsgerade reicht von 0.2 bis 20 ng/mg.

[Crookes et al. 2004] stellen eine Methode für Urinproben vor, die eine Nachweisgrenze von 0.1 mg/L bietet. Die Kalibrationskurve ist von 0.1 bis 2 mg/L linear. Die Derivatisierung erfolgte durch Silylierung nach Extraktion mit Ethylacetat.

[LeBeau et al. 2006] verwenden eine Headspace-GC-MS-Methode in der die Bestimmung des

„Gesamt-GHB“ nach Umwandlung zu GBL erfolgte. Die Probenvorbereitung erfolgte durch Extraktion mit Dichlormethan nach Umsetzung mit konzentrierter Schwefelsäure. Die Methode hat eine Nachweisgrenze (LoD) von 0.06 mg/L und eine Bestimmungsgrenze (LoQ) von 0.19 mg/L.

Über eine besonders ungewöhnliche Methode zur Unterscheidung von endogenem und exogenem GHB berichten [Saudan et al. 2005] unter Verwendung einer GC-Isotopen-Verhältnis-MS Methode.

Die Methode beruht auf verschiedenen Verhältnissen der ¹²C- und ¹³C-Isotope abhängig von der Herkunft des in den GHB-Molekülen enthaltenen Kohlenstoffes.

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Einen nicht unbedeutenden zeitlichen und präparativen Aufwand bei GCMS-Analysen stellt die Derivatisierung dar.

2.4.2 Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie

[Johansen et al. 2011] stellen eine nach internationalen Standard EN ISO/IEC 17025 akkreditierte LC-MS/MS-Methode zur Bestimmung von GHB und Analoga (GBL, BD, gamma-Valerolacton) in Vollblut und Urin vor. Die Methode hat für Vollblut eine Nachweisgrenze von 1 mg/kg. Die

Kalibrationsgerade ist von 1 bis 100 mg/kg Vollblut linear. Die Probenvorbereitung erfolgt durch Proteinfällung mit saurem Methanol. Urinproben werden mit saurem 10 %-igem Methanol 10-fach verdünnt. Als interner Standard wird GHB-d6 verwendet. Die Methode findet Anwendung bei vermuteten „DFSA“ (drug-facilitated sexual assault) sowie Fahrten unter Drogeneinfluss und Intoxikationen mit diesen Substanzen. Die chromatographische Laufzeit beträgt 19 min. Es wurde das Phänomen der In-source Umwandlung von GHB zu GBL beobachtet. Deshalb wurde auf eine chromatographische Separation beider Substanzen geachtet. Die Substanzen alpha-

Hydroxybuttersäure und beta-Hydroxybuttersäure wurden bezüglich möglicher Interferenzen untersucht. Die Detektion erfolgte mit einem Quatromicro-Tandem-MS-System im positiven Elektrospray-Modus.

[Fung et al. 2004] beschreiben eine Methode auf einem PE SCIEX API 3000 mit APCI-Quelle im Negativmodus. Als analytische Trennsäule wird eine C18-Aqua-Säule mit der mobilen

Phasenmischung 90% 5mM Ameisensäure / 10% ACN verwendet. Die Methode hat eine chromatographische Laufzeit von fünf Minuten. Die Bestimmungsgrenze der beschriebenen Methode liegt bei 0.1 mg/L. Die Methode wurde zur Bestimmung von GHB in verschiedenen Hirnregionen von Ratten verwendet. Die Probenvorbereitung erfolgte durch SPE-Aufarbeitung mit Varian Bond Elute SAX.

[Kaufmann at al 2007] benutzen zur GHB-Quantifizierung in Urin und Serumproben eine Pauli- Ion-Trap nach Derivatisierung zu den n-Butylester-Derivaten. Ein Vergleich der matrixabhängigen Extraktionausbeute mit tert-Butyl-Methylether und Ethylacetat in Serum und Urin ergab mit Ethylacetat die besseren Wiederfindungen.

2.4.3 Enzymatischer Test

Ein seit kurzem kommerziell erhältlicher enzymatische Test (EA) [Hasan et al. 2011] beruht auf GHB-Dehydrogenase, welche die Umsetzung von GHB zu Bernsteinsäuresemialdehyd katalysiert.

Das Enzym wird von E. coli erzeugt, das mit der Gensequence von Ralstonia eutropha modifiziert wurde. Im Test zeigt GBL 4% Kreuzreaktivität, die aber wegen der schnellen Umwandlung von

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GBL im Körper ohne diagnostische Bedeutung ist. Der enzymatische Test eignet sich aufgrund der geringen Kreuzreaktivität nur bedingt zum Nachweis von GBL in Flüssigkeiten und Mageninhalt.

Für alle anderen GHB-Precursoren und Analoga zeigt der Test keine Kreuzreaktivität. Ethanol zeigt 3 mg/L GHB pro 1.06 g/L Ethanol an. Die getesteten gängigen missbrauchsrelevanten Drogen und Medikamente zeigten keine Kreuzreaktivität. Der beschriebenen Test ist erhältlich bei Bühlmann Laboratories AG Schönenbuch (Schweiz). Ein Test dauert auf einem klinisch-chemischen

Analysator (z.B. Konelab 30) weniger als 8 min. Der Messbereich des Testes erstreckt sich von 5 bis 250 mg/L. Die Bestimmungsgrenzen liegen bei 4.4 mg/L für Serum und 2.8 mg/L für Urin. Als Cutoff werden 10 mg/L für Serum und 15 mg/L für Urin verwendet.

2.5 GHB-Isomere

Die beiden Konstitutionsisomere alpha-Hydroxybuttersäure (AHB) und beta-Hydroxybuttersäure (BHB) sind natürlich vorkommende Substanzen [Wood 2004]. AHB ist eine Fruchtsäure und wurde in Äpfeln und Apfelsaft gefunden. BHB ist ein Ketonkörper aus dem Stoffwechsel beim Fasten bzw. bei Mangelernährung. Erhöhte Werte von BHB im Urin sind durch Ketoacidose möglich. Dies können unter anderem diabetische Ketoacidose (Typ 1 Diabetis) und alkoholische Ketoacidose sein.

Vorhandenes BHB beeinflusst den Bicarbonat-Wert sowie den pH-Wert des Blutes [Holm et al.

2010].

2.6 gamma-Butyrolacton und 1,4-Butandiol

Im Gegensatz zu GHB finden GBL und BD weitverbreitete Nutzung in der chemischen Industrie [Palmer 2004]. Im Jahre 2000 wurden in den USA 338 000 Tonnen BD zum Beispiel zur

Herstellung von Tetrahydrofuran, Polybutylenterephthalatharzen und GBL sowie Polyurethanen verwendet.

GBL ist eine farblose Flüssigkeit mit saurem, seifenartigem Geschmack. Es ist mischbar mit Alkohol, Wasser, Ketonen und Estern. Strassennamen sind z.B. „Blue Nitro“, „Gamma-G“ oder auch „Fire Water“. Die reguläre Verwendung des Lösungsmittels besteht als Farbentferner, Graffiti- Entferner, Nagellackentferner und Reinigungsmittel.

1,4-Butandiol (BD) ist eine farblose viskose Flüssigkeit. Sie ist mischbar mit Wasser und Alkohol.

Strassennamen sind z.B. „Blue Rain“, „Thunder“, „Somato Pro“ und „Pine needle oil“. In seiner technisch Anwendung ist es ein „Weichmacher“ bzw. ein industrielles Zwischenprodukt.

Die leichtere Verfügbarkeit des GBL ausnutzend sind auf dem „Schwarzmarkt“ aus GBL und Natronlauge bestehende GHB-Kits erhältlich.

Durch schnelle Umwandlung im Körper ist die Aufnahme von BD oder GBL nicht von der Aufnahme von GHB zu unterscheiden.

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Die Plasmahalbwertzeit von GBL beträgt weniger als 60 Sekunden aufgrund der schnellen

Umwandlung zu GHB unter Wirkung der 1,4-Lactonase [Madea et al. 2009]. Dies führt dazu, dass nach 5 min nur noch 3% der zugeführten bzw. resorbierten GBL-Menge im Körper vorhanden sind.

Die Umwandlung von BD erfolgt unter der Wirkung der Enzyme Alkoholdehydrogenase und Aldehyddehydrogenase. Die Wirkung setzt nach 5-20 min. ein und hält 2-3 h an.

Zielanalyt ist nach Einnahme von BD, GBL und natürlich auch von GHB das GHB für Urinproben, Blutproben und Haarproben. Bei Intoxikationen, bei denen der Mageninhalt untersucht wird, ist auch auf GBL und BD zu prüfen.

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3 Experimentelles

3.1 LC-MS/MS Methode

Die Probenvorbereitung erfolgte durch Vorlegen von 100 µL Probe in einem Eppendorf-Cup und Zugabe von 10 µL Interner Standard-Lösung und 300µL Methanol. Die Interne-Standard-Lösung hatte eine Konzentration von jeweils 100 µg/mL GHB-d6 und GBL-d6 in Acetonitril. Nach dem Mischen der Proben wurden diese zentrifugiert und anschließend 200 µL des Überstandes bei 50 °C im Stickstoffstrom zur Trockne eingedampft. Die Proben wurden mit 250 µL Wasser wieder

aufgenommen und in ein 700 µL Glassinsert überführt und in einem MTPL-Format Rack im Autosampler positioniert. Es wurden 10 µL injiziert.

Die Messungen wurden mit einem Waters Acquity UPLC-System, welches mit einem Waters XEVO TQ-Detektor verbunden war, durchgeführt. Die chromatographische Trennung erfolgte mit einer auf 40°C temperierten Waters 2.1 x 150 mm HSS T3 1.8 µm Säule. Die mobile Phase A bestand aus 0.2 % Ameisensäure in Wasser und mobile Phase B aus Methanol. Die isokratische Trennung erfolgte innerhalb von 6 Minuten bei einer Flussrate von 0.25 mL/min mit einer Zusammensetzung von 96 % A und 4 % B.

Die Detektion der Massenübergänge erfolgte im positiven Elektrospray-Multiple Reaktion

Monitoring Modus (ESI+, MRM). Die genauen Ionisierungsbedingungen sowie die Massenlage der Moleküle und deren Fragmente wurden in einem Tuning im Rahmen der Methodenentwicklung optimiert. Die Kapillarspannung betrug 0.5 kV und der Quellenblock wurde auf 150 °C geheizt. Der Desolvationsgasstrom von 1000 L/h (Stickstoff) wurde auf 500 °C geheizt. Als Conegas wurden 25 L/h (Stickstoff) und als Kollisionsgas 0.15 mL/min Argon verwendet.

Die Cone-Spannungen betrugen 12 V (GHB, AHB, BD), 10 V (BHB) sowie 24 V (GBL) Es wurden folgende Übergänge gemessen:

GHB

Quantifier-Ion 105.0 > 87.0 1. Qualifier-Ion 105.0 > 45.3 2. Qualifier-Ion 105.0 > 69.0

GHB-d6

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GBL

Quantifier-Ion 87.0 > 45.0 1. Qualifier-Ion 87.0 > 43.0

GBL-d6

BD

AHB

Quantifier-Ion 105.0 > 58.9 1. Qualifier-Ion 105.0 > 77.0

BHB

3.2 Methodenvalidation der LC-MS/MS-Methode

Die verwendete Methode wurde für GHB nach Richtlinien der GTFCh validiert und als forensische Methode nach DIN 17025 akkreditiert.

Die Arbeitsbereichs-9-Punkt-Kalibration wurde im Bereich 1 – 50 mg/L für GHB/GBL mit

gespiktem Negativurin durchgeführt. Nachweis- und Bestimmungsgrenze wurden entsprechend der forensische Richtlinie mit 11 äquidistanten Kalibratoren im Bereich 0.1 bis 1 mg/L unter

Verwendung der Software Valistat (Arvecon GmbH, Walldorf) ermittelt. Die Selektivität der

Methode sowie die Matrixeinflüsse wurden durch Aufarbeitung und Messung von 10 verschiedenen Urinproben ohne Analyt und ohne Internem Standard (Leerprobe) sowie von 10 verschiedenen Urinproben mit Internem Standard (Nullprobe) untersucht. Ionensuppression wurde durch post- column-Infusion von 5 mg/L GHB/GBL und Injektion von 5 unterschiedlichen aufgearbeiteten Urinproben untersucht.

(16)

3.3 enzymatischer Test

Die Messungen mit dem enzymatischen Test wurden von den Kollegen der Gerichtsmedizin

Salzburg – Linz an der Universität Salzburg durchgeführt. Es wurde ein Methodenvergleich mit um 10 mg/L GHB aufgestockten Urinproben sowie mit positiven Proben durchgeführt. Ferner wurde die Kreuzreaktivität der Substanzen GBL, AHB und BHB untersucht.

3.4 Proben

3.4.1 Kontrollgruppe

Als Kontrollgruppe zur Festlegung des GHB-Cutoffs dienten Urinproben von 100 weiblichen und 100 männlichen Probanden ohne Drogenmissbrauchs-Vorgeschichte (Proben von Mitarbeitern des Labors Bioscientia, Ingelheim). Für die verwendeten Urinproben wurde der Kreatinwert bestimmt (Jaffe-Methode, Reagenz: Thermo Fisher auf Olympus AU 680). Die Verteilung der Proben bezüglich Probandendaten und Kreatininverteilung zeigt Tabelle 3.

Tab. 3: Daten der Probanden der Kontrollgruppe

weiblich männlich

Alter [Jahre] 3 - 85 3 - 81

Gewicht [kg] 13 - 120 15 - 131

Kreatinin Mean [mg/dL] 91 107

Kreatinin Median [mg/dL] 82 105

Kreatinin Bereich [mg/dL] 5 - 238 1 - 279

3.4.2 Patientengruppe

Urinproben zur GHB-Bestimmung in der Patientengruppe stammten aus routinemässigen und zufällig ausgewählten Urinproben zur Drogenanalytik von 500 verschiedenen Patienten in Substitutionstherapie, aus dem Raum Berlin. Für die verwendeten Urinproben wurde der Kreatinwert bestimmt (Jaffe-Methode, Reagenz: Thermo Fisher auf Olympus AU 680). Die

Verteilung der Proben bezüglich Probandendaten, Kreatininverteilung und Substitutionsbehandlung zeigt Tabelle 4.

(17)

Tab. 4: Daten der Probanden der Patientengruppe

weiblich männlich

Anzahl Probanden 125 375

Alter [Jahre] 18 - 88 19 - 66

Kreatinin Mean [mg/dL] 147 156

Kreatinin Median [mg/dL] 120 139

Kreatinin Bereich [mg/dL] 10 - 608 10 - 647

Anzahl Probanden Methadon substituiert

55 184

Methadon-Tagesdosis [mL] 0.4 – 17.5 1 - 30

Anzahl Probanden Polamidon substituiert

52 117

Polamidon-Tagesdosis [mL] 1 - 22 2.5 - 22

Anzahl Probanden Buprenorphin substituiert

18 71

Buprenorphin-Tagesdosis [mg] 0.8 - 20 0.8 - 24

3.4.3. Proben für Methodenvergleich

Aus den Proben unseres Labors wurden 20 Urinproben mit steigendem Kreatininwert ausgewählt und mit 10 mg/L GHB aufgestockt. GHB-positive Urinproben stammen aus unserem Labor oder wurden von A. Scholer (Universitätsspital Basel, Schweiz) zur Verfügung gestellt. Diese wurden mit dem enzymatischen Test und der LC-MS/MS-Methode ggf. nach Verdünnung gemessen.

(18)

3 Ergebnisse

4.1 Leistungsdaten der LC-MS/MS Methode Selektivität/ Matrixeinflüsse:

Zum Teil wurden GHB-Signale detektiert die dem endogenen Vorkommen zugeschrieben werden.

Deshalb wurden die selben Proben auch mit Internem Standard versetzt vermessen. Die

Quantifizierung ergab Werte im Bereich der Nachweisgrenze. Es waren keine Störungen durch exogene oder endogene Substanzen nachweisbar. Co-Elutionen konnten keine nachgewiesen werden.

Im Infusionsexperiment ergab sich ein deutlicher die Ionisation verstärkender Matrixeffekt (Ion enhancement) im Bereich 1.1 min bis 1.3 min sowie ein die Ionisation verringernder Matrixeffekt (Ion suppression) im Bereich 1.3 bis 2.1 min. Da die Analyten deutlich später als die Matrixeffekte eluieren, ergeben sich für die Analytik keine Hinweise auf Störungen.

Arbeitsbereich und Linearität/Verdünnungsgrenze gamma-Hydroxybuttersäure: bis 50 mg/L gamma-Butyrolacton: bis 50 mg/L

Analytische Grenzwerte nach DIN 32645:

Nachweisgrenzen:

gamma-Hydroxybutersäure: 0.22 mg/L gamma-Butyrolacton: 1.38 mg/L

Bestimmungsgrenzen:

gamma-Hydroxybutersäure: 0.41 mg/L gamma-Butyrolacton: 3.83 mg/L

In Abbildung 2 sind Beispielchromatogramme für GHB und den internen Standard GHB-d6 gezeigt.

Die Peaklagen der Vorläuferverbindungen bzw. Isomere zeigen die Abbildungen 3 und 4. Das in Abbildung 3 zu sehende Phänomen eines Signals in den GBL-Spuren zur Retentionszeit von GHB ist auf eine Insource-Umlagerung zurück zu führen und wurde auch von [Johansen et al. 2011] und [Wood et al. 2004] berichtet. Im Falle des internen Standards GHB-d6 ist der Effekt ebenfalls zu beobachten. Da die Insource-Umlagerung für GHB und GHB-d6 auftritt, wird die GHB-

Quantifizierung nicht beeinträchtigt. Die in Abbildung 4 zu sehenden GHB-Signale im beta-

(19)

Verbindungen und dem Vorliegen beider Verbindungen in der injizierten Lösung. Für alpha- Hydroxybuttersäure wurden andere Übergänge verwendet.

min

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50

%

0 100

F7:MRM of 3 channels,ES+

105.032 > 68.972 GHB_110918Standard-3 Smooth(Mn,2x2)

Standards

1.936e+005 3.08

14028 185997

1.81

6.86 3.80

min

%

0 100

Standards

5.827e+005 3.08

41014 547991

0.90

3.81

4.67

min

%

0 100

Standards

5.134e+006 GHB

3.08 350258 4756086

0.24

3.80

6.86

GHB

BHB

BHB BHB

min

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50

%

0 100

Standards

1.203e+005 3.02

10599 119443

min

%

0 100

Standards

8.073e+005 3.02

70060 805399

min

%

0 100

Standards

7.491e+006 GHB-d6

3.02 650228 7470983

GHB-d6

Abb. 2: Beispielchromatogramm GHB und GHB-d6

min

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50

%

0 100

Standards

8.601e+005 3.75

92484 803240

3.08

0.41

min

%

0 100

Standards

2.761e+006 GBL

3.75 328574 2672083

3.08

0.42

GBL GBL

aus GHB

GBL aus GHB

min

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50

%

0 100

Standards

2.811e+005 3.64

28296 277724 3.02

1.57

min

%

0 100

Standards

4.018e+005 3.64

41088 399883 3.02

min

%

0 100

Standards

1.541e+006 GBL-d6

3.64 156361 1533151 3.02

GBL-d6

GBL-d6 aus

GHB-d6 GBL-d6 aus GHB-d6 GBL-d6 aus GHB-d6

Abb. 3: Beispielchromatogramm GBL und GBL-d6

(20)

min

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50

%

0 100

Standards

3.634e+006

3.15 584558 3613696

min

%

0 100

Standards

6.514e+007 3.15

10599544 64798748

min

%

0 100

Standards

1.308e+008 1,4-Butandiol

3.15 24407426 129601808 min

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50

%

0 100

Standards

2.193e+005

4.68 24602 216823

min

%

0 100

Standards

3.057e+005 alpha-Hydroxybuttersäure

4.68 31523 296657

min

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50

%

0 100

Standards

1.518e+005 3.08

1.79 2.71

6.85 3.81

3387 33160

5.55

min

%

0 100

Standards

5.722e+005

3.81 54032 524857 3.08

1.20 4.67 5.54 6.83

min

%

0 100

Standards

4.649e+006 3.08

1.19

beta-Hydroxybuttersäure 3.81

244641 2395243

6.85

1,4-Butandiol

1,4-Butandiol alpha-Hydroxybuttersäure

beta-Hydroxybuttersäure beta-Hydroxybuttersäure GHB

GHB GHB

Abb. 4: Beispielchromatogramme alpha-Hydroxybuttersäure, beta-Hydroxybuttersäure und 1,4- Butandiol

4.2 GHB-Konzentrationen in der Kontrollgruppe und Cutoff-Ableitung

In der Kontrollgruppe konnte bei 200 untersuchten Proben von männlichen und weiblichen Probanden aller Altersgruppen in keinem Fall GHB >2 mg/L nachgewiesen werden.

Die Darstellung der Ergebnisse als Histogramme zeigt Abbildung 5. Für die Darstellung wurden alle Messwerte die unterhalb der Bestimmungsgrenze waren, auf 0.049 mg/L gesetzt und sind somit in der ersten Klasse der Histogramme zu finden.

Insbesondere auch unter Berücksichtigung der Ergebnisse aus der Patientengruppe (siehe 4.3) scheint es daher möglich den etablierten Cutoff von 10 mg/L auf 2 mg/L abzusenken, wenn die GHB-Bestimmung mit LC-MS erfolgt.

(21)

0 10 20 30 40 50 60 70 80

AnzahlProben 0.25 2.25 4.25 6.25 8.25 10.25 12.25 14.25 16.25

GHB Konzentration [mg/L], Klassenbreite 0.5 Mean: 0.33 mg/L Median: 0.25 mg/L n = 100

Kontrollgruppe, weiblich Cut-off 2 mg/L

mean: 0.27 mg/L median: 0.25 mg/L

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

AnzahlProben 0.25 2.25 4.25 6.25 8.25 10.25 12.25 14.25 16.25

GHB Konzentration [mg/L], Klassenbreite 0.5 Mean: 0.27 mg/L Median: 0.25 mg/L n = 100

Kontrollgruppe, männlich Cut-off 2 mg/L

Abb. 5: Histogramme der Verteilung der GHB-Konzentrationen in der Kontrollgruppe (n=200)

4.3 GHB-Konzentrationen in der Patientengruppe

In den Urinproben der Patientengruppe (n=500) konnte in 499 Proben kein GHB über dem von uns ermittelten Cutoff von 2 mg/L nachgewiesen werden. In einer Probe konnte eine GHB-

Konzentration von 25.4 mg/L nachgewiesen werden. Die Darstellung der Ergebnisse als Histogramm zeigt Abbildung 6. Für die Darstellung wurden alle Messwerte die unterhalb der Bestimmungsgrenze waren, auf 0.049 mg/L gesetzt und sind somit in der ersten Klasse der Histogramme zu finden.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

AnzahlProben 0.25 2.25 4.25 6.25 8.25 10.25 12.25 14.25 16.25

GHB Konzentration [mg/L], Klassenbreite 0.5

GHB - LCMS [ug/ml] n=125

Mean: 0.46 mg/L Median: 0.25 mg/L n = 124

Patientengruppe, weiblich

positive Probe (25.4 mg/L) nicht dargestellt

Cut-off 2 mg/L

0 40 80 120 160 200 240 280 320 360

AnzahlProben 0.25 2.25 4.25 6.25 8.25 10.25 12.25 14.25 16.25

GHB Konzentration [mg/L], Klassenbreite 0.5

GHB - LCMS [ug/ml] n=375

Mean: 0.28 mg/L Median: 0.25 mg/L n = 375

Patientengruppe, männlich Cut-off 2 mg/L

Abb. 6: Histogramme der Verteilung der GHB-Konzentrationen in der Patientengruppe (n=500)

(22)

4.4 Untersuchungen mit dem enzymatischen Test

Die Histogramm der vergleichenden Untersuchung der Kontrollgruppe mit dem enzymatischen Test zeigt Abbildung 7. Es ergibt sich im unteren Konzentrationsbereich eine unspezifische

Messwerterhöhung die nicht durch das endogen vorhandene GHB erklärt werden kann (vgl. Abb.

5). Ein falsch positives Ergebnis in der Gruppe der männlichen Probanden wurde mit 15.1 mg/L gemessen.

0 5 10 15 20 25 30 35

0.25 2.25 4.25 6.25 8.25 10.25 12.25 14.25 16.25

GHB Konzentration [mg/L], class width 0.5 mean: 1.24 mg/L median: 0.82 mg/L n = 100

Kontrollgruppe, weiblich Cut-off 10 mg/L ?

0 5 10 15 20 25 30

0.25 2.25 4.25 6.25 8.25 10.25 12.25 14.25 16.25

GHB Konzentration [mg/L], class width 0.5 mean: 1.44 mg/L median: 1.06 mg/L n = 100

Kontrollgruppe, männlich Cut-off 10 mg/L ?

Abb. 7: Histogramme der Verteilung der GHB-Konzentrationen in der Kontrollgruppe (n=200) im enzymatischen Test

Für die unspezifische Messwerterhöhung scheinen Kreuzreaktionen mit endogenen

Urinbestandteilen verantwortlich zu sein, deren Ausmaß mit der Konzentriertheit der Probe,

ausgedrückt durch die Kreatininkonzentration, korreliert (Abb. 8). Es wurde die Differenz zwischen dem Messergebnis des enzymatischen Tests und dem Ergebnis der LC-MS/MS-Methode dargestellt.

Für Messergebnisse der LC-MS/MS-Methode die unterhalb der Bestimmungsgrenze waren, wurde ein Wert von 0.5 mg/L in der Berechnung verwendet. Messergebnisse des enzymatischen Testes ≤ 0.5 mg/L wurden ebenfalls auf 0.5 mg/L gesetzt.

(23)

Abb. 8: Zunehmende Abweichung der Messergebnisse des enzymatischen Testes mit steigendem Kreatiningehalt der verwendeten Urinproben

Das falsch positive Ergebnis bei 15.1 mg/L in der männlichen Probandengruppe wurde nicht dargestellt.

Zur Bestätigung dieses Phänomens unspezifischer Kreuzreaktion in Abhängigkeit von der

Matrixkonzentration wurden 20 Urinproben unterschiedlicher Kreatinin-Konzentration jeweils mit 10 mg/L GHB versetzt und die Wiederfindung mit LC-MS/MS und dem enzymatischen Test bestimmt.

Die Ergebnisse der vergleichenden Untersuchung an 20 Urinproben zeigt Tabelle 5. Es ist wiederum eine mit steigendem Kreatiningehalt zunehmende falsch hohe Messung der GHB-Konzentration im enzymatischen Test zusehen. Eine graphische Darstellung zeigt Abbildung 9.

0 2 4 6 8 10 12 14 16

DifferenzEA-LCMS[mg/L]

0 50 100 150 200 250 300 350 400

Kreatinin [mg/dL]

Abb. 9: Zunehmende Abweichung der Messergebnisse des enzymatischen Testes mit steigendem Kreatiningehalt der verwendeten Urinproben

-1 0 1 2 3 4 5

0 50 100 150 200 250

Kontrollgruppe, weiblich n=100

-1 0 1 2 3 4 5

0 50 100 150 200 250 300

Kontrollgruppe, männlich n=100

(24)

Tab. 5: Vergleichende Untersuchung von 20 Urinproben die mit 10 mg/L GHB aufgestockt wurden.

Geschlecht Kreatinin [mg/dL]

pH GHB-

Konzentration (LCMS) [mg/L]

GHB-

Konzentration (EA)

[mg/L]

m 341 6.2 11.8 27.5

m 326 7.2 11.0 21.4

m 322 5.5 10.6 23

w 315 6.2 13.1 33.45

(Ausreisser)

w 304 6.7 11.7 23.5

w 288 6.3 10.7 22.4

m 261 7.4 11.1 21.4

m 230 7.8 11.2 20.9

m 226 5.9 11.0 22.8

m 220 6.1 11.2 20.7

m 186 7.9 15.0 20.6

m 153 5.6 10.6 16.9

m 148 5.8 10.3 17.7

w 111 6.9 10.3 15.1

m 106 7.8 10.5 16

w 92 7.7 11.9 16.7

m 53 6.1 10.4 14

m 33 6.8 10.6 11.7

w 28 5.4 11.1 13.2

m 21 6.6 10.7 12.2

14 m 21-341 Mean: 11.3 Mean: 19.6

6 w Mean: 188 Median: 11.0 Median: 20.6

Median: 203 SD: 1.1 SD: 5.4

CV: 9.9% CV 26.6%

GHB mit EA: Korrelation mit Kreatinin r²=0.910, 1 Ausreisser (33.5 mg/L)

Abweichungen in der LC-MS/MS-Bestimmung vom Aufstockwert 10 mg/L werden dem endogenen Gehalt der verwendeten Urinproben zugeschrieben.

Zur Abklärung möglicher Kreuzreaktionen der Isomere AHB und BHB wurden Urinproben und NaCl-Lösung mit steigenden Mengen der Analyten versetzt. In Tabellen 6 und 7 sind die

Messergebnisse der Kreuzreaktivitätsuntersuchungen gezeigt. Die Konformationsisomeren AHB und BHB zeigen bis zur getesten Konzentration von 400 mg/L keine Kreuzreaktivität und können somit nicht für das o.a. Phänomen verantwortlich sein.

(25)

Tab. 6: Kreuzreaktivität von alpha-Hydroxybuttersäure im enzymatischen Test

Analyt [mg/L] Matrix GHB EA

(Cutoff 5 mg/L)

positiv/negativ Bewertung

AHB 25 Urin 2.1 negativ

AHB 25 physiologische NaCl-Lösung 0 negativ

Tab. 7: Kreuzreaktivität von beta-Hydroxybuttersäure im enzymatischen Test

(Cutoff 5 mg/L)

BHB 25 Urin 1.0 negativ

BHB 25 physiologische NaCl-Lösung 0 negativ

BHB 400 physiologische NaCl-Lösung 0.1 negativ

Zur Abklärung der Eignung des Testes für die Untersuchung von Flüssigkeiten auf GBL wurde auch dessen Kreuzreaktion untersucht (Tab. 8).

Tab. 8: Kreuzreaktivität von gamma-Butyrolacton im enzymatischen Test

(Cutoff 5 mg/L)

GBL 0 Negativurin 2

GBL 25 Urin 0.7 negativ

GBL 200 Urin 6.4 POSITIV

GBL 25 physiologische NaCl-Lösung 0.3 Negativ

GBL 200 physiologische NaCl-Lösung 14.1 POSITIV

GBL 400 physiologische NaCl-Lösung 32.1 POSITIV

(26)

Es ist nur bei sehr hohen GBL-Konzentrationen eine Kreuzreaktivität zu verzeichnen. Die aber in der Praxis für die Untersuchung von Urinproben ohne Relevanz ist, weil GBL im Körper sehr schnell zu GHB umgewandelt wird.

Einen Methodenvergleich des enzymatischen Testes mit der LC-MS/MS-Methode zeigt Abbildung 10. Der enzymatische Test zeigt gute Übereinstimung mit den Ergebnissen der LC-MS/MS-

Methode (Korrelationskoeffizient 0.99). Damit eröffnet der enzymatische Test die Möglichkeit eines relativ schnellen Screenings auf GHB ohne die Notwendigkeit aufwendiger Chromatographie.

Problematisch stellt sich die geringe „Onboard-Stabilität“ der Reagenzien dar (4 Wochen). Damit dürfte der Test vor allem für Laboratorien mit hoher Nachfrage nach GHB-Screenings von Bedeutung sein.

0 500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 3.500 4.000 4.500 5.000 5.500 6.000 6.500 7.000 7.500 8.000 8.500 9.000 9.500

GHB-EA[mg/L]

0 500 1.500 2.500 3.500 4.500 5.500 6.500 7.500 8.500 9.500

GHB - LCMS [mg/L]

GHB enzymatic [mg/L]

GHB enzymatic assay [mg/L]

Lineare Regression: (N = 20) y = a + bx

0E+000 <= x <= 9.500 a = 17.0804 b = 0.9865

Korrelationskoeffizient = 0.9904 Eta²= 0.9809

0 200 400 600 800 1.000

GHBEA[mg/L]

0 500 1.000

GHB - LCMS [mg/L]

8 spls. (40%) contained GBL conc. range: 5.0 to 64.1 mg/L

Abb. 10: Methodenvergleich des enzymatischen Testes mit LC-MS/MS (n=20)

(27)

5 Diskussion

In den Urinproben der Patientengruppe (n=500) konnte nur in einem Fall GHB (25.4mg/L) über dem selbst ermittelten Cutoff (2 mg/L) nachgewiesen werden. Da nur in 0.2% der untersuchten Proben ein GHB-Konsum nachgewiesen werden konnte, erscheint ein häufiger oder

gewohnheitsmäßiger und damit kontrollbedürftiger Beikonsum bei substituierten Patienten, im Raum Berlin, auch unter Berücksichtigung des kurzen Nachweisfensters unwahrscheinlich.

In keiner der 200 Proben aus der Kontrollgruppe konnte GHB über 2 mg/L nachgewiesen werden.

Unter Berücksichtigung dieses Ergebnisses und des Ergebnisses der Patientenstudie, der kurzen Nachweiszeit von GHB und der Bedeutung des Nachweises einer unwissentlichen Aufnahme von GHB sollte der Cutoff für die Unterscheidung von endogenem GHB und missbräuchlich

konsumiertem GHB auf 2 mg/L gesenkt werden.

Die Methode zeigt keine Interferenzen durch die natürlich vorkommenden „Ketonkörper“ und GHB-Isomeren alpha-Hydroxybuttersäure (AHB) und beta-Hydroxy-Buttersäure (BHB). Die Methode kann somit auch verwendet werden um auf diese Substanzen zu testen.

Die vorgestellte Methode erlaubt es auch Flüssigkeiten, bei denen der Verdacht besteht, dass sie GHB bzw. dessen Vorläufersubstanzen enthalten, zu untersuchen. Dies konnte in mehreren forensisch relevanten Fällen genutzt werden.

Die unspezifische Erhöhung der GHB-Konzentrationen im enzymatische Assay zeigt eine leichte Korrelation mit den Kreatininwerten. Dies wird insbesondere deutlich, wenn Urinproben mit hohen Kreatininwerten für die Aufstockversuche verwendet wurden.

Die gefundenen Signale im enzymatischen Test stellen für die Substanzen AHB und BHB keine echte „Kreuzreaktivität“ dar. Bis zu hohen Konzentrationen wurden keine signifikaten Signale für AHB und BHB gefunden. Gamma-Butyrolacton zeigte bei Konzentrationen von 200 und 400 mg/L ein falsch positives Ergebnis. Für die Analytik von Urinproben ist das ohne Relevanz.

Aufgenommenes GBL wird im Körper sehr schnell zu GHB umgesetzt und zum weitaus überwiegendem Teil als solches ausgeschieden.

Werden verschiedene GHB-negative Urine um 10 mg/L GHB aufgestockt, zeigte sich im enzymatischen Assay eine matrixabhängige Wiederfindung. Hoch konzentrierte Urine, charakterisiert durch den Kreatininwert, zeigten Wiederfindungen bis zu 300%.

(28)

Diese Ergebnisse zeigen, dass insbesondere bei schwach positiven Ergebnissen des enzymatischen Testes eine Bestätigungsanalyse mit chromatographisch-massenspektrometrischen Verfahren notwendig ist. Eine Absenkung des Cutoffs unter 10 mg/L ist für den enzymatischen Test nicht möglich.

(29)

6 Literaturangaben

Abanades, S.; Farre, M.; Segura, M.; Pichini, S.; Pastor, A.; Pacifici, R.; Pellegrini, M.; de la Torre, R. 2007. Disposition of gamma-Hydroxybutyric acid in conventional and nonconventional biologic fluids after single drug administration: Issues in methodology and drug monitoring. Therapeutic Drog Monitoring 29: 64-70

Andresen, H.; Stimpfl, T.; Sprys, N.; Schnitgerhans, T.; Müller, A. 2008. Liquid Ecstacy – ein relevantes Drogenproblem. Deutsches Ärtzteblatt 105: 599-603

Andresen,H.; Sprys, N.; Schmoldt, A.; Mueller, A.; Iwersen-Bergmann, S. 2010. Gamma-

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Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und nur unter Verwendung der angegebenen Literatur und Hilfsmittel angefertigt habe.

Dessau, 04. Januar 2015