Aus der Abteilung für Experimentelle Dermatologie/Allergologie der Klinik und Poliklinik für Dermatologie und Venerologie des Universitätsklinikums
Hamburg Eppendorf
Leitende Direktorin: Frau Prof. Dr. I. Moll
Experimentelle Untersuchung zur Bestimmung der Sensibilisierungspotenz
ausgewählter Cinnamate und eines Kaffeates
Inauguraldissertation zur Erlangung des Grades eines Doktor der Medizin
Dem Fachbereich Medizin der Universität Hamburg vorgelegt von:
Oliver Urban Hamburg
Angenommen vom Fachbereich der Medizin der Universität Hamburg am: 10. Juli 2001
Dekan: Prof. Dr. H.-P. Leichtweiß
Referent: Prof. Dr. B. M. Hausen
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung S. 1
2. Material und Methoden S. 12
3. Ergebnisse S. 17
4. Diskussion S. 21
5. Zusammenfassung S. 29
1. EINLEITUNG
Die in Pflanzen enthaltenen Substanzen können aufgrund des bisherigen Wissensstandes in Primärstoffe mit anaboler, anaplerotischer und allgemein trophischer Funktion und in Sekundärstoffe mit erst partiell geklärten Wirkungsmechanismen (antiparasitäre Wirkungen, abgelagerte Stoffwechsel-metabolite), bzw. teleologisch nicht erfassbaren Funktionen unterteilt werden.
Die seit geraumer Zeit bestehende Tendenz, in verstärktem Maße auf Naturprodukte im Allgemeinen und auf homöopathische Substanzen in der Medizin zurückzugreifen bzw. als Alternative zur Schulmedizin in die Therapie einzubeziehen, ließ die hierdurch auftretenden Nebenwirkungen der Naturstoffe weiter in den Vordergrund rücken (24, 25, 60, 61).
Die aus Pflanzen isolierten Stoffe zeigen ein mannigfaltiges Spektrum biologisch-pharmakologischer Wirkungen. Neben bakteriziden, fungiziden und antiseptischen Effekten konnten sowohl antineoplastische als auch wachstumsstimulierende Effekte auf Neoplasien nachgewiesen werden. Ebenso wurden neuroanaleptische neben neuroleptisch-anxiolytischen Wirkungen beschrieben. Gerade in der Dermatologie erlangten die durch Naturstoffe hervorgerufenen antiallergischen bzw. allergieinduzierenden Wirkungen eine besondere Bedeutung.
Da eine kausale Behandlung des allergischen Kontaktekzems nicht möglich ist, wie zum Beispiel durch eine Hyposensibilisierung, die bei der Allergie vom Soforttyp zur Anwendung kommt, erscheint der derzeit gangbare Weg darin zu bestehen, das auslösende Allergen zu identifizieren, durch prädiktive Tests seine Sensibilisierungspotenz zu erkennen und seine Anwendung zu vermeiden. Prädiktive Tests werden derzeit am lebenden Tier, zumeist an Meerschweinchen, durchgeführt (33).
Einige natürliche Kontaktallergene, die chemisch, um nur einige Stoffklassen zu nennen, Chinone, Catechole, Laktone, Sesquiterpenolaktone, Phenole und Kaffeesäureester umfassen, sind schon lange bekannt. Allergische Reaktionen vom verzögerten Typ werden zum Beispiel durch Liliengewächse, in denen sich Laktone vom Typ des Tulipalin A (α-Methylen-γ butyrolakton) nachweisen lassen, hervorgerufen.
O CH2
O Tulipalin A
Auch die Familien der Primulaceae, Orchidaceae und Papilionaceae, in denen Chinone nachgewiesen wurden (z.B. Primin aus der Becherprimel und (R)-3,4-Dimethoxydalbergion aus Macherium scleroxylon),
O O H 3 C O H 3 C O C H 2 ( R ) - 3 , 4 - D i m e t h o x y d a l b e r g i o n
lassen allergieinduzierende Wirkungen erkennen, ebenso die Compositae (Korbblüter), deren Bestandteile Sesquiterpenolaktone wie zum Beispiel Alantolakton, Parthenolid und Costunolid darstellen.
O O CH2 O Parthenolid O O CH2 Alantolacton Costunolid O O CH2
Bei den Anacardiaceae spielen Phenole, wie die Urushiole aus Toxicodendron diversilobum und Toxicodendron radicans, eine bedeutende Rolle. Hier soll nur eines der drei Urushiole zur Darstellung der Struktur abgebildet werden.
OH
Aus der Pappelart Populus nigra wurden Kaffeesäureester wie zum Beispiel 1,1-Dimethylallylkaffeat isoliert und als Allergene identifiziert (5, 11, 12, 20, 22, 29, 38, 44, 69, 71). HO HO O O 1,1-Dimethylallylkaffeesäureester
Aktuelle Bedeutung erlangte gerade in der letzten Zeit die Verwendung von Propolis und Pappelknospenextrakten in Kosmetika und bei der Heilbehandlung von Hauterkrankungen.
Propolis ist bekannt für seine antiseptischen, adstringierenden, magenberuhigenden, krampflösenden, hautberuhigenden und anästhetischen Eigenschaften (16, 42, 43, 57, 58, 64).
Bakteriostatisch wirkt Propolis auf Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris und ebenso tuberkulostatisch auf Mycobacterium tuberculosis in vitro. Fungistatische Effekte ließen sich gegen Helminthosporiumcarbonum erzielen (9). Daneben soll Propolis die Prostaglandinsynthese hemmen, ein effektives Antioxidationsmittel gegenüber Vitamin C sein und kollagenolytische Enzyme inhibieren (66).
Verbreitet wird Propolis in der Dermatologie bei Neurodermitis, mikrobiell bedingten Ekzemen, Kontaktdermatitiden, Ulcus cruris, Psoriasis, Morphea, Stauungsdermatosen Herpes simplex und Herpes genitalis, wie auch zur antimykotischen Therapie von Dermatophyten eingesetzt.
Besonders häufig wird Propolis in Naturkosmetika angewendet (1, 14, 16, 34, 39, 45, 46, 64).
Eine spezifische Überempfindlichkeit gegen Propolis wurde zuerst bei Imkern beobachtet (6, 7, 41, 53, 60). Seither sieht man allergische Reaktionen überwiegend auf propolishaltige "Natur-" oder "Bio-Kosmetika" (34, 46, 60, 63, 64) und bei der Anwendung als Therapeutikum (52, 55, 56, 68).
Propolis besteht zu etwa 80 % aus Harzen und Wachsen, zu 10 % aus ätherischen Ölen und zu 5 % aus Pollen und Insektenleichen. Mehr als 100 Inhaltsstoffe konnten bisher nachgewiesen und unter anderem als Flavonoide, aromatische Säuren und ihre Ester, aromatische Alkohole und ihre Aldehyde, Coumarine, Aglykone und Terpene klassifiziert werden (8, 10, 16, 39, 42, 43, 54, 55, 58, 65, 66, 70).
1970 wurde mittels Papierchromatographie und UV-Spektroskopie erstmalig 3,4-Dihydroxyzimtsäure ( = Kaffeesäure ) aus Propolis isoliert (9). 1979 wurde in Propolis eine Mischung aus vier Kaffeesäureestern, die für die antimikrobiellen Eigenschaften verantwortlich zu sein scheinen, identifiziert (50, 59). Darüber hinaus wurden Benzylsalicylat und Cinnamylcinnamat gefunden (70).
OH O
O
O O
Cinnamylcinnamat
SCHNEIDEWIND et al. (59) vermuteten außerdem das Vorkommen von Benzylcinnamat und Phenylethylkaffeat, was später durch PAPAY et al. (50) und GREENAWAY et al. (19) bestätigt wurde.
Ebenso wurden weitere Karbonsäureester nachgewiesen.
HEGYI et al. testeten zwölf verschiedene Flavonoide an Propolis-Patienten und konnten nur bei einem Patienten eine positive Reaktion auf Tectochrysin beobachten (27). O O OH H3CO Tectochrysin
Ebenso lieferten die getesteten Flavonoide, Phenole und Zimtsäurederivate in einer Untersuchung von SCHULER und FROSCH (60) keine Hinweise auf eine allergene Potenz. Sie erhielten jedoch ein deutlich positives Ergebnis auf die
Fraktion LB-1, die durch WOLLENWEBER et al. 1987 aus Propolis isoliert worden war und deren Hauptbestandteil von ASAKAWA als 1,1-Dimethylallylkaffesäureester identifiziert wurde (70).
HAUSEN et al. bewiesen anschließend, dass mit 1,1-Dimethylallylkaffeat das Hauptallergen der Propolis gefunden war (25).
Nach einer genaueren Analyse von LB-1 wurden schließlich mittels Gaschromtographie und Massenspektrometrie drei isomere Kaffeesäurepentenylester identifiziert (23).
Demnach besteht LB-1 aus:
HO HO O O 3-Methyl-2-butenylkaffeat ( 54,2% ) HO HO O O 3-Methyl-3-butenylkaffeat ( 28,3% ) HO HO O O 2-Methyl-2-butenylkaffeat ( 4,3% )
Außerdem wurden neben LB-1 noch folgende weitere Bestandteile nachgewiesen (23): HO HO O O Phenylethylkaffeat ( 7,9 % ) HO HO OH O Kaffeesäure ( 1,3 % ) HO HO O O Benzylkaffeat ( 1 % )
WOLLENWEBER und HAUSEN fanden 1988 in Sensibilisierungsversuchen an Meerschweinchen, dass mit Phenylethylkaffeat neben LB-1 eine weitere, ebenso stark allergieauslösende Komponente enthalten ist (23). Benzylsalicylat wurde als moderates drittes Allergen nachgewiesen, während Benzylcinnamat nicht als Allergen eingestuft werden konnte (23, 30).
Patienten mit allergischen Erscheinungen gegenüber Propolis reagieren auch auf Perubalsam, einem harzigen Material aus der Rinde von Myroxylon balsamum, in einer Frequenz von 44 - 90 %, im Durchschnitt 60 %, allergisch. Perubalsam ist in Parfüms und Zigaretten enthalten, kommt in den Produkten der pharmazeutischen Industrie zur Anwendung und wird auch in der Nahrungsmittelindustrie verwandt (7, 51, 54, 56, 63, 64).
Es wurde nachgewiesen, dass das Phänomen der Kreuzreagibilität auf einem teilweise gemeinsamen Allergenspektrum von Propolis und Perubalsam beruht. Chromatographische Analysen demonstrierten unter anderem die Gemeinsamkeit von Benzylbenzoat, Benzylcinnamat, Cinnamylcinnamat und Vanillin.
Demnach haben Perubalsam und Propolis mindestens folgende zehn Bestandteile gemeinsam (15, 17, 23, 25, 31, 54): O O Benzylbenzoat HO Benzylalkohol O OH Benzoesäure Zimtsäure O OH
HO HO OH O Kaffeesäure ( 1,3 % ) Zimtalkohol OH 3-Methoxy-4-hydroxybenzaldehyd (Vanillin) HO OCH3 O Benzylcinnamat O O Benzylisoferulat O O HO H3CO O O Cinnamylcinnamat
Hier spielen Benzoesäure und Zimtsäure, insbesondere deren Ester und sonstige Derivate eine signifikante Rolle. Hausen et al. bewiesen in diesem Zusammenhang, dass mit dem gemeinsamen Bestandteil Benzylisoferulat eines der Hauptallergene des Perubalsam gefunden wurde (26).
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, sieben Derivate der Zimtsäure und des Zimtalkohols und einen Kaffeesäureester auf ihr sensibilisierendes Potential im Test an Meerschweinchen zu untersuchen, um über die oben erläuterte Hypothese Aufschluss zu erhalten.
2. MATERIAL UND METHODEN
Substanzen
Im Rahmen dieses Versuchs wurde die Sensibilisierungspotenz folgender Substanzen geprüft:
Tabelle 1
Substanz Herkunft Struktur
1. Methylcinnamat Fluka AG, CH (S.27)
2. Ethylcinnamat ICN Bromedicals, USA (S.27) 3. Cinnamylpropionat ICN Bromedicals, USA (S.27) 4. Cinnamylisobutyrat ICN Bromedicals, USA (S.28) 5. Cinnamylisovalerat ICN Bromedicals, USA (S.23) 6. Cinnamylcinnamat ICN Bromedicals, USA (S.10) 7. β-Phenylpropylcinnamat ICN Bromedicals, USA (S.25) 8. Cynarin Staatl. Chem. Untersuchungsamt
Oldenburg (natürl. Vorkommen: Bitterstoff aus
Cynara scolymus)
(S.26)
Die hier untersuchten Substanzen wurden über o. a. Firmen bezogen. Da sie jedoch Verunreinigungen enthielten, musste eine Reinigung durchgeführt werden.
Aufarbeitung der Substanzen
Die Reinigung der Substanzen erfolgte mittels Dünnschichtchromatographie (Kieselgel; 0,25 mm).
Als Laufmittelsysteme wurden folgende Gemische getestet: Chloroform / Methanol ( 100 + 1 ) Cyclohexan / Essigester ( 50 + 50 ) Toluol / Methanol ( 80 + 20 )
Toluol / Aceton ( 70 + 30 )
Toluol / Chloroform ( 50 + 50 )
Als geeignetes Laufmittel stellte sich das Gemisch Chloroform/Methanol (100+1) heraus.
Für die Reinigung des Cynarins wurden folgende Systeme getestet, da sich alle oben angeführten Laufmittelgemische hierfür als ungeeignet erwiesen:
Essigester / Methanol / Aqua dest. ( 100 + 16,5 + 13,5) Benzol / Eisessig ( 66 + 33 ) Chloroform / Ethanol 95% / Aqua dest. ( 60 + 30 + 2) Propanol / Essigester / Aqua dest. ( 40 + 40 + 30)
Hierbei stellte sich das Gemisch Propanol / Essigester Aqua dest. ( 40 + 40 + 30 ) als das geeignete Laufmittel heraus.
Die Laufzeit der Substanzen betrug in allen Fällen 60 Minuten.
Jeweils die größte Fraktion wurde unter fluoreszierendem UV-Licht markiert, herausgekratzt und daraufhin mit Aceton, Methanol und Chloroform eluiert. Im
Versuchstiere
Albino-Meerschweinchen 3 Tiere pro Käfig
Gewicht: 280 - 350 g Temperatur: 22 – 25 °C Luftfeuchtigkeit : 50 - 55 % Licht: 10 h Kunstlicht pro Tag
Futter: Altromin® und Wasser ad libitum
Bestimmung der Irritationsgrenze
Drei Kontrolltiere wurden in den gleichen Intervallen wie die Versuchstiere mit einer Emulsion aus FCA und physiologischer NaCl-Lösung, jedoch ohne Wirkstoff, behandelt. Einen Tag vor Auslösung der Erfolgsreaktion wurden Lösungen der zu untersuchenden Substanzen in 1, 3 und 10 %iger Konzentration epikutan, auf eine rasierte Hautstelle appliziert .
Als Lösungsmittel diente für die ersten sieben Substanzen Aceton, zur Lösung von Cynarin wurde Methanol benutzt.
Sensibilisierung
Pro Substanz wurden zehn Meerschweinchen verwendet. Die Sensibilisierung erfolgte mittels einer modifizierten FCA-Methode (FCAT: Freund's Complete adjuvant test).
4 ml FCA ( Suspension aus Mykobakterien in Mineralöl ) + 4 ml physiologische NaCl + 15 mg der zu untersuchenden Substanz wurden zu einer Emulsion vermischt.
Auf dem Rücken der geschorenen und rasierten Tiere wurde jeweils am 1., 5. und 9. Tag des Versuchs die Emulsion halbkreisförmig in sechs Quaddeln intradermal injiziert.
Auslösung
Die ersten sieben Stoffe wurden in Aceton aufgenommen, Cynarin wurde in Methanol gelöst.
Zur Auslösung der Erfolgsreaktion wurden 50µl der Substanzen in drei Verdünnungen (10 %, 3 %, 1 %) auf die rasierten Flanken des Versuchstieres (drei Felder pro Substanz) mittels einer Pipette aufgebracht.
Am 22. Versuchstag, 13 Tage nach dem letzten Sensibilisierungsschritt, wurde die 1%ige Lösung auf das jeweils erste Feld appliziert. Analog erfolgte am 23. Versuchstag der Auftrag der 3%igen und 10%igen Verdünnungen in die weiteren Felder, jedoch nur derjenigen Substanzen, die in diesen Konzentrationen die Irritationsgrenze nicht erreichten.
Beurteilung der Sensibilisierungsreaktion
Die Ablesung erfolgte nach 24 h, 48 h und 72 h. Zur Beurteilung diente folgendes Schema:
Tabelle 2
Bewertung Beurteilung Bewertung in
Zahlen
0 keine sichtbare Reaktion 0
( + ) Fleckenförmige Rötung 0,5
+ Rötung der gesamten Applikationsfläche 1 ++ Rötung, Schwellung, auf Testareal
beschränkt 2
+++ Rötung, Schwellung, Infiltration über
Testfeld hinausgehend 3 Mittlere Reaktionsstärke: mR = Tiere der Anzahl Reaktionen der Summe Beurteilung: mR = 0 – 1 schwach = 1 – 2 mittelstark = > 2 sehr stark
3. ERGEBNISSE
Irritationsgrenze
Die Irritationsgrenze der zu untersuchenden Substanzen wurde in 1%iger, 3%iger und 10%iger Konzentration an drei Kontrolltieren bestimmt.
Tabelle 3
Stoff Irritationsgrenze (Konzentration der
Substanz)
zur Auslösung der Erfolgsreaktion verwendete Substanz Methylcinnamat > 10% 1%; 3%; 10%; Ethylcinnamat 10% 1%; 3% Cinnamylpropionat > 10% 1%; 3%; 10%; Cinnamylisobutyrat 10% 1%; 3% Cinnamylisovalerat > 10% 1%; 3%; 10%; Cinnamylcinnamat 10% 1%; 3% β-Phenylpropylcinnamat > 10% 1%; 3%; 10%; Cynarin > 10% 1%; 3%; 10%;
Die Irritationsgrenze lag bei fünf der acht getesteten Substanzen oberhalb der 10%igen Konzentration. Folglich konnte die Erfolgsreaktion mit allen drei Konzentrationen ausgelöst werden. Bei Ethylcinnamat, Cinnamylisobutyrat und Cinnamylcinnamat hingegen wurde bereits mit der 10%igen Konzentration die Irritationsgrenze erreicht, so dass nur mit den darunter liegenden Verdünnungen ausgelöst werden konnte.
Ergebnisse der Sensibilisierungsversuche
Bei Applikation der 10%igen Lösungen zeigte sich eine insgesamt sehr schwache Sensibilisierungspotenz für Cinnamylpropionat, Cynarin und β-Phenylpropyl-cinnamat.
Die 10%igen Lösungen von Methylcinnamat und Cinnamylisoval,era.t lösten keine nennenswerten Reaktionen der behandelten Hautareale aus. Während die Auslösung der Sensibilisierungsreaktion für Methylcinnamat, Ethylcinnamat, Cinnamylpropionat, Cinnamylisobutyrat und Cinnamylisovalerat, in 1%iger und 3%iger Konzentration appliziert, so gut wie negativ ausfiel, ließ die Anwendung dieser Konzentrationen für Cinnamylcinnamat, β-Phenylpropylcinnamat und Cynarin eine sehr schwache Sensibilisierungspotenz erkennen.
Von allen acht getesteten Substanzen löste β-Phenylpropylcinnamat die stärkste Antwort aus.
Tabelle 4 24h 48h 72h mR sensibilisiert und ausgelöst mit % +++ ++ + (+) 0 +++ ++ + (+) 0 +++ ++ + (+) 0 24h 48h 72h 10 - - - - 10 - - - 1 9 - - - 1 9 0,00 0,05 0,05 3 - - - - 10 - - - - 10 - - - - 10 0,00 0,00 0,00 Methyl- cinnamat 1 - - - - 10 - - - - 10 - - - - 10 0,00 0,00 0,00 3 - - - 1 9 - - - 1 9 - - - 1 9 0,05 0,05 0,05 Ethyl- cinnamat 1 - - - - 10 - - - - 10 - - - - 10 0,00 0,00 0,00 10 - - - 2 8 - - 1 3 6 - - 1 3 6 0,10 0,25 0,25 3 - - - 1 9 - - - 1 9 - - - 1 9 0,02 0,05 0,05 Cinnamyl- propionat 1 - - - 1 9 - - - 2 8 - - - 3 7 0,02 0,10 0,15 3 - - - - 10 - - - - 10 - - - 1 9 0,00 0,00 0,05 Cinnamyl- isobutyrat 1 - - - - 10 - - - - 10 - - - - 10 0,00 0,00 0,00 10 - - 2 1 7 - - - 3 7 - - - 3 7 0,15 0,15 0,15 3 - - - 2 8 - - - 1 9 - - - 1 9 0,10 0,05 0,05 Cinnamyl- isovalerat 1 - - - - 10 - - - 1 9 - - - 1 9 0,00 0,05 0,05 3 - - - - 10 - - - 6 4 - - - 6 4 0,00 0,30 0,30 Cinnamyl- cinnamat 1 - - - - 10 - - - 4 6 - - - 3 7 0,00 0,2 0,15 10 - - 1 3 6 - - 1 4 5 - - 3 2 5 0,25 0,30 0,40 3 - - - 4 6 - - - 4 6 - - 1 5 4 0,20 0,20 0,35 β-Phenyl-propyl- cinnamat 1 - - - 3 7 - - - 4 6 - - 1 3 6 0,15 0,20 0,25 10 - - - 2 8 - - - 5 5 - - - 7 3 0,10 0,25 0,35 3 - - - 1 9 - - 1 3 6 - - 1 5 4 0,05 0,25 0,35 Cynarin 1 - - - - 10 - - - 3 7 - - - 4 6 0,00 0,15 0,20 mR-Werte
Die mR-Werte für die 10%ige Konzentration der verschiedenen Substanzen sind in der folgenden Abbildung im Vergleich dargestellt.
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 beta-Phenylpropylcinnamat Cynarin Cinnamylpropionat Cinnamylisovalerat Methylcinnamat mR 24h mR 48h mR 72h mR-Werte 10%ige Konzentration
Diese Abbildung zeigt die mR-Werte für die jeweilige 10%ige Konzentration der aufgeführten Stoffe. Die Werte der einzelnen Ablesungen nach 24h, 48h und 72h sind hintereinander dargestellt.
4. DISKUSSION
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden sieben Ester der Zimtsäure und des Zimtalkohols und ein Kaffeesäureester hinsichtlich ihres allergieinduzierenden Potentials untersucht. Alle Versuche wurden an Albino-Meerschweinchen durchgeführt.
Einige Hinweise auf das Sensibilisierungsvermögen von Derivaten der Zimtsäure sind bereits aus der Literatur bekannt, so zum Beispiel von Hydroxyzimtsäure, Zimtsäure und Benzylzimtsäureester. Sie werden jedoch in Bezug auf ihre allergenen Eigenschaften widersprüchlich beurteilt (28, 48, 67).
KLECAK et al. beurteilten Benzylcinnamat im Versuch an Meerschweinchen mit vier unterschiedlichen Methoden zur Auslösung der Sensibilisierungsreaktion als mittleres bis starkes Allergen (32).
HAUSEN und WOLLENWEBER bestimmten Benzylcinnamat in experimentellen Versuchen an Meerschweinchen mittels einer modifizierten FCA-Methode als schwaches Allergen. Im Epikutantest an Probanden zeigte sich ebenfalls nur eine schwache Reaktion.
Zimtsäure ließ in ihren Versuchen keinen Hinweis auf eine allergieinduzierende Wirkung erkennen (23).
HJORTH beobachtete 1961 bei 18 - 19 % seiner Probanden, die unter anderem auf Perubalsam allergisch reagierten, eine positive Hautreaktion auf Benzylcinnamat (28).
RUDZKI et al. stellten 1976 hingegen nur eine positive Reaktion auf Benzylcinnamat bei 21 propolissensitiven Patienten fest (55).
HJORTH konnte 1961 bei 26 % Perubalsam-Allergikern positive Hautveränderungen nach Applikation von Zimtsäure feststellen (28). 1990 wurde die Sensibilisierungspotenz der Zimtsäure von OXHOLM et alt. bestätigt, die zwei positive Reaktionen an 15 Perubalsam-Allergikern beschrieben (49).
In der klinischen Studie von OXHOLM et al. wurde neben Zimtsäure auch 25%iges Methylcinnamat in Petrolatum im Epikutantest bei Patienten untersucht. Sie erhielten durchweg negative Ergebnisse.
Die hier hinsichtlich ihrer Sensibilisierungspotenz untersuchten Zimtsäure- und Zimtalkoholester ließen eine, wenn auch schwach ausgeprägte, allergieinduzierende Wirkung im Tiermodell erkennen.
Die Untersuchungen zur Propolis zeigten, dass offensichtlich ihre bedeutenden Allergene in die Gruppe der Kaffeesäureester gehören (23). Neben 1,1-Dimethylallylkaffeat konnte Phenylethylkaffeat als ebenso potenter Sensibilisator nachgewiesen werden. Der mR-Wert von LB-1 wird von HAUSEN et al. 1987 für die Applikation einer 1%igen Konzentration und Ablesung nach 72 Stunden mit 3.0 angegeben (22). Werden die mR-Werte der 0,1%igen Konzentrationen von Lb-1 und Phenylethylkaffeat in den Vergleich gestellt, so ergibt sich nach 72 Stunden mit 2.4 bzw. 2.2 ein äquivalenter Wert.
Betrachtet man die mR-Werte der hier getesteten Zimtalkohol- und Zimtsäure-ester (Ergebnistabelle S. 20), so liegen die Resultate weit unter den Werten der zuvor genannten Kaffeesäureester.
Die Sensibilisierungspotenz von Cinnamylisovalerat ist so gut wie negativ, die von 1,1-Dimethylallylkaffeat hingegen stark positiv. Beide Substanzen weisen erhebliche strukturelle Konformitäten auf. Es stellt sich die Frage, welches Strukturelement dieser beiden Moleküle für die unterschiedliche Intensität der allergenen Wirkung verantwortlich ist.
Beide Substanzen weisen am Seitenkettenende eine analoge Verzweigung der Alkylreste auf, die jedoch bei 1,1-Dimethylallylkaffeat mit einer Doppelbindung in Verbindung steht. O O Cinnamylisovalerat HO HO O O 1,1-Dimethylallylkaffeesäureester
Alkylgruppen fungieren als Elektronen-Donoren, dennoch ist die hier betrachtete Doppelbindung thermodynamisch recht stabil und einem elektrophilen Angriff gegenüber aufgrund sterischer Befrachtung des Überganszustandes durch die Alkylreste relativ geschützt. Zudem spielt der elektrophile Angriff für die Entstehung einer Kontaktallergie keine große Rolle, da die Hapten-komplettierende-Reaktion eher von den nukleophilen Proteinseitenketten der Langerhansdendriten oder der Oberfläche von Makrophagen ausgeht. Ein nukleophiler Angriff an der Doppelbindung des Kaffeates ist undenkbar, da die für die Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung charakteristischen π-Elektronen in der Peripherie des Moleküls angeordnet sind und sie somit das Molekül gegen den Angriff nukleophiler Agentien abschirmen. Der Aspekt der Doppelbindung scheint nicht verantwortlich für die unterschiedliche Reagibilität von
Ein weiterer Unterschied zwischen 1,1-Dimethylallylkaffeat und Cinnamylisovalerat besteht in der inversen Anordnung der Esterbindung. Bei 1,1-Dimethylallylkaffeat steht das Brenzkatechin-Ringsystem in Konjugation mit dem Carbonyl-Sauerstoffatom, was das Zustandekommen von ionogenen Verbindungen, ausgehend vom Sauerstoff, begünstigen würde. Ein nukleophiler Angriff am Carbonyl-Kohlenstoffatom ist denkbar, jedoch ist die Additionsgeschwindigkeit bei Aldehyden und Ketonen größer als bei Estern und wird zudem durch die Doppelbindung in α,β-Position zur Carbonylgruppe weiter abgeschwächt, da hierdurch die konjugative Stabilisierung der Ausgangsverbindung beim Übergang in das Produkt, oder den ihm vorausgehenden Übergangszustand, verloren geht. Unter diesem Aspekt betrachtet ist Cinnamylisovalerat für den nukleophilen Angriff seitens körpereigenem Protein mit der günstigeren Konfiguration der Esterbindung ausgestatt. Methylcinnamat, Ethylcinnamat, Cinnamylcinnamat, β-Phenylpropylcinnamat und Cynarin, die in der vorliegenden Untersuchung ebenfalls getestet wurden, weisen die gleiche Konformation der Esterbindung auf wie 1-,1-Dimethylallylkaffeat oder Phenylethylkaffeat, erreichen jedoch keineswegs die mR-Werte der letzteren Substanzen, was beweisend dafür ist, dass sich die für die Wirkung als Allergen notwendige Hapten-Carrier-Konjugation nicht - oder zumindest nicht ausschließlich - an der Carbonylgruppe abspielt. Der letzte Unterschied zwischen Cinnamylisovalerat und 1,1-Dimethylallylkaffeat findet sich im aromatischen Grundkörper, der im Falle des Kaffeates zwei reagible Hydroxylgruppen trägt, die auch bei einigen anderen Allergenen dem Wirkort der Hapten-Komplettierung zugeschrieben werden konnten. Die Hydroxylgruppen am Ring lassen sich zu einem ortho-Chinon oxidieren. Chinone mit einer längeren Seitenkette sind bekannt für ihre stark sensibilisierenden Eigenschaften (13, 38).
Am Benzolkern des Zimtalkohols befindet sich kein Substituent und die hohe Dichte negativer Ladung oberhalb und unterhalb des Rings, bedingt durch die Delokalisation der π-Elektronen, schirmt die Ring-Kohlenstoffatome gegen den Angriff nukleophiler Agentien ab.
Es ist also offensichtlich, dass die Ursache der hohen Allergenität von 1,1-Dimethylallylkaffeat hauptsächlich auf der Struktur des Ringes mit zwei Hydroxylgruppen begründet ist.
Die Analyse der Struktur von Phenylethylkaffeat bestätigt diese Vermutung. Hier ist in der Seitenkette des Brenzkatechinkerns noch ein weiterer aromatischer Substituent enthalten, der jedoch, wie durch den bereits weiter oben angegebene mR-Wert angedeutet, die Wirkung als Allergen nicht behindert. Cinnamylcinnamat und β-Phenylpropylcinnamat, mit ihren ebenfalls aromatischen Substituenten in der Seitenkette, zeigen dagegen eine sehr geringe Sensibilisierungspotenz. Phenylethylkaffeat HO HO O O O O Cinnamylcinnamat
O O
OH β-Phenylpropylcinnamat
Diese Differenz kann nicht durch die nur um ein Kohlenstoffatom kürzere Seitenkette des Phenylethylkaffeates erklärt werden, sondern vielmehr durch die unterschiedliche Ringstruktur, zumal β-Phenylpropylcinnamat mit immerhin einer Hydroxylgruppe im Ring - wenn auch insgesamt mit sehr schwacher Sensibilisierungspotenz - hier den höchsten mR-Wert von allen untersuchten Substanzen in allen angewandten Konzentrationen erreicht und damit auch deutlich über dem mR-Wert von Cinnamylcinnamat liegt.
Der Kaffeesäureester Cynarin muss, werden die errechneten mR-Werte betrachtet, im allergieauslösenden Potential eher wie die untersuchten Zimtalkohol- und Zimtsäureester eingestuft werden.
O O OH OH COOH O O Cynarin
Cynarin zeigt eine beachtliche Größe und die Molekülkette ist im Mittelteil nicht, wie bei den als allergen wirksam beschriebenen Kaffeesäureestern, rein aliphatisch, sondern enthält noch ein weiteres zyklisches System. Ein solches Ringsystem gibt Anlass, den Aspekt der sterischen Hinderung für die Hapten-Carrier-Konjugation, wie durch BAER et al. in Studien an Katecholen beschrieben, in Betracht zu ziehen (2).
Innerhalb der Gruppe der Zimtderivate lässt sich eine Tendenz der SensibilisierungsPotentiale bezüglich der Molekülgröße feststellen. Die mR-Werte nehmen, wie man aus Tabelle 4 auf S.19 erkennen kann, mit wachsender Seitenkette von Methylcinnamat über Ethylcinnamat und Cinnamylisobutyrat, mit Ausnahme von Cinnamylpropionat, bis zum Cinnamylisovalerat zu. O O Ethylcinnamat O O
O O Cinnamylpropionat O O Cinnamylisobutyrat
Diese steigende Tendenz der mR-Werte setzt sich mit Cinnamylcinnamat und β-Phenylpropylcinnamat fort.
BAER et al. und KURTZ und DAWSON stellten fest, dass die Sensibilisierungsfähigkeit einer Substanz positiv mit der Länge der Seitenkette und der Zahl der Doppelbindungen korreliert ist. Ein Optimum wird bei einer Kohlenstoffseitenkette von 11 bis 12 Kohlenstoffatomen erreicht ( 2, 3, 4, 35, 36, , 37). Dabei steigt das allergisierende Potential aufgrund der mit wachsender Seitenkette größeren Lipophilie.
Ähnliche Ergebnisse erzielten HAUSEN und BEYER in Bezug auf die Sensibilisierungsfähigkeit der Gallate. Bei denen von der Industrie am meisten verwendeten Propylgallate (R=C3), Octylgallate (R=C8) und Dodecylgallate (R=C12) korrelieren die Seitenkettenlängen eindeutig mit den errechneten mR-Werten (21). Diese Feststellungen sind durchaus auf die in dieser Arbeit untersuchten Zimtalkohol- und Zimtsäureester übertragbar.
5. ZUSAMMENFASSUNG
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Sensibilisierungspotenz von sieben Estern des Zimtalkohols und der Zimtsäure sowie eines Kaffeesäureesters zu analysieren. Hierfür wurden die Rohsubstanzen mittels Dünnschicht-chromatographie aufgereinigt. Pro Substanz wurden 10 Albino-Meerschweinchen getestet, wobei die Sensibilisierung mittels einer modifizierten FCA-Methode erfolgte.
Die Ergebnisse zeigen, dass Zimtderivate verglichen mit Kaffeaten derselben Seitenkettenlänge deutlich schwächer sensibilisierend wirksam sind. Innerhalb der Gruppe der Zimtderivate bewirkt eine wachsende Seitenkette eine höhere - wenn auch immer sehr schwach bleibende - Sensibilisierungspotenz.
Studien zur Kreuzreagibilität schienen nicht indiziert, da die evozierten kutanen Reaktionen nur schwacher Natur waren.
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DANKSAGUNG
Ganz besonders danken möchte ich Herrn Professor Dr. B.M. Hausen für die Überlassung des Themas sowie für seine intensive und engagierte Betreuung und Unterstützung im praktischen als auch theoretischen Teil der Arbeit.
Allen Mitarbeitern des Labors und des Tierstalls danke ich für die angenehme Zusammenarbeit und die freundschaftliche Arbeitsatmosphäre.
LEBENSLAUF
Als Sohn der Eheleute Walter und Elisabeth Urban, geb. Albers, wurde ich am 11. November 1964 geboren.
1970 wurde ich im Alter von fünf Jahren in Hamburg eingeschult. Nach Beendigung der Volksschule besuchte ich von 1974 bis 1976 das Gymnasium Oldenfelde in Hamburg. Aufgrund eines Wohnortwechsels nach Schleswig-Holstein besucht ich dann von 1976 bis 1982 das Emil-von-Behring-Gymnasium in Großhansdorf. Ein erneuter Wohnortwechsel meiner Eltern nach München ließ mich meinen schulischen Werdegang in Hamburg beenden, wo ich einschließlich eines zusätzlichen freiwilligen Schuljahres 1984 die Reifeprüfung ablegte.
Zum Wintersemester 1984 nahm ich an der Universität Hamburg das Studium der Medizin auf. Die ärztliche Vorprüfung legte ich im August 1986 ab. Meine klinischen Semester beendete ich im August 1989. Im Juni 1988 nahm ich den praktischen Teil meiner Arbeit auf.
