Spurenanalyse von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen in menschlichem Gewebe / eingereicht von Sebastian Friedl

JOHANNES KEPLER UNIVERSITÄT LINZ Altenberger Straße 69 4040 Linz, Österreich Eingereicht von Sebastian Friedl Angefertigt am Institut für Analytische Chemie Beurteiler / Beurteilerin o. Univ.-Prof. DI Dr. Wolfgang Buchberger Monat Jahr März 2021

Spurenanalyse von

polyzyklischen

aromatischen

Kohlenwasserstoffen in

menschlichem Gewebe

Masterarbeit

zur Erlangung des akademischen Grades

Diplom-Ingenieur

Im Masterstudium

Eidesstattliche Erklärung

Ich erkläre an Eides statt, dass ich die vorliegende Masterarbeit selbstständig und ohne fremde Hilfe verfasst, andere als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel nicht benutzt bzw. die wörtlich oder sinngemäß entnommenen Stellen als solche kenntlich gemacht habe.

Die vorliegende Masterarbeit ist mit dem elektronisch übermittelten Textdokument identisch.

Linz, 30.März 2021

Kurzfassung

Polycyclische aromatische Kohlewasserstoffe (PAK) sind eine große Stoffgruppe, welche aufgrund einiger von der internationalen Agentur für Krebsforschung (IARC) als karzinogen eingestuften Vertreter immer wieder im Fokus steht. PAKs entstehen bei der Verbrennung von organischem Material bei hohen Temperaturen. Sie werden über die Nahrung und die Atmung in den Körper aufgenommen.

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Analyse von PAKs in menschlichem Fett- und Lungengewebe. Ziel ist es herauszufinden, ob sich die Konzentration an PAKs oder die Karzinogenität der gefundenen PAKs bei gesundem und pathogenem Gewebe unterscheiden. Lungengewebe wurde hierfür zunächst lyophilisiert. Anschließend wurde das Gewebe mit Natriumsulfat verrieben und mit Hexan extrahiert. Das Extrakt wurde durch Ausschütteln mit Acetonitril und anschließender Festphasenextraktion gereinigt. Die Analyse der Proben erfolgte mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Fluoreszenz-Detektor (HPLC-FLD). In der Probe eines Patienten konnte Naphthalin und Pyren nachgewiesen werden. Fettgewebe wurde weitestgehend analog zu Lungengewebe aufgearbeitet. Die Proben wurden nicht lyophilisiert. Insgesamt wurden 19 Proben von elf verschiedenen Patienten analysiert. Keine der Proben von pathogenem Gewebe zeigte eine erhöhte Konzentration an PAKs im Vergleich zu gesundem Gewebe desselben Patienten. Es konnten keine PAKs nachgewiesen werden, welche von der IARC als karzinogen eingestuft werden. Es zeigte sich allerdings ein Trend wonach Patienten mit Tumor eine erhöhte Konzentration an PAKs aufwiesen.

Lungengewebe vom Schwein wurde auf hydroxylierte PAKs und PAK-Glucuronide untersucht. Die Proben wurden lyophilisiert und mit Acetonitril extrahiert. Anschließend wurde die Probe hydrolysiert. Die Analyse der Proben erfolgte mittels HPLC-FLD. Bei einem Vergleich mit einer nicht hydrolysierten Probe wurden erhöhte Konzentrationen an 2-Hydroxynaphthalin und 9-Hydroxyphenanthren festgestellt. Dies deutet auf die Anwesenheit von PAK-Glucuroniden hin. Diese Ergebnisse konnten allerdings nicht durch eine Analyse mittels HPLC-Massenspektrometrie bestätigt werden.

Es wurde untersucht ob sich broncho-alveoläre Lavage (BAL) als Alternative, für die nicht invasive Probenahme eignet, um PAKs im menschlichen Körper zu analysieren. 10 Proben BAL wurden auf PAKs untersucht. Die Proben wurden nach der Zugabe eines internen Standards direkt mittels HPLC-FLD analysiert. Naphthalin, Fluoren, Acenaphthen und Anthracen konnten in sehr geringen Mengen nachgewiesen werden. Aufgrund der polaren Eigenschaften von BAL scheint eine Anreicherung von PAKs unwahrscheinlich.

Abstract

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) form a large group of compounds, and some of them are classified as carcinogenic by the International Agency for Research on Cancer. They are formed during the combustion of organic compounds at high temperatures. The human body may take up PAHs via food and respiration.

During this work human lung and fat tissue was analyzed to identify differences in concentration and carcinogenicity of the found PAHs in healthy and pathogenic tissue. In the first step lung tissue was lyophilized. Afterwards the sample was ground with sodium sulfate and subsequently extracted with hexane. The extract was cleaned by liquid-liquid extraction with acetonitrile and solid phase extraction. The samples were analyzed using high performance liquid chromatography and fluorescence detection (HPLC-FLD). Naphthalene and pyrene were found in one human sample. Fat tissue samples were not lyophilized. Otherwise, they were prepared like lung tissue. A total of 19 samples from eleven different patients were available. None of the pathogenic samples showed higher concentrations than the healthy tissue of the same patient. No carcinogenic PAHs were found in any of the samples. There was a trend which showed that there were higher concentrations of PAHs in the tissue of patients which had a tumor.

Hydroxylated PAHs and PAH-glucuronides were analyzed in the lung tissue of a pig. The samples were lyophilized and subsequently extracted with acetonitrile. Afterwards the samples were hydrolyzed and analyzed using HPLC-FLD. In comparison to a non-hydrolyzed sample the analysis showed higher peaks of 2-hydroxynaphthalene and 9-hydroxyphenahtren. This indicates the presence of PAH-glucuronides. However, the results could not be verified by HPLC and mass spectrometry.

Bronchoalveolar lavage (BAL) was tested as a substitution for non-invasive sampling to analyze PAHs in humans. Ten samples were available. After addition of an internal standard the samples were directly analyzed using HPLC-FLD. Naphthalene, fluorene, acenaphthene and anthracene were found in very small concentrations. There is probably no enrichment of PAHs in BAL because of the difference in polar properties.

Inhaltsverzeichnis

Eidesstattliche Erklärung ... II Kurzfassung ... III Abstract ... IV Inhaltsverzeichnis ... V Abbildungsverzeichnis ... VII Tabellenverzeichnis ... VII Abkürzungsverzeichnis ... IX Vorwort ... X 1 Einleitung ... 1 2 Theoretischer Teil ... 2

2.1 Struktur und Eigenschaften von PAKs ... 2

2.1.1 Alternierende und nicht-alternierende PAKs ... 3

2.1.2 Kata- und peri-kondensierte PAKs... 4

2.2 Karzinogene Wirkung von PAKs ... 5

2.3 Vorkommen und Aufnahme [7] ... 7

2.4 PAKs in Lebensmitteln ... 7

2.5 Analyse von PAKs ... 8

2.6 Analyse von PAK – Metaboliten ... 10

2.7 Broncho-Alveolären-Lavage (BAL) ... 11 3 Experimenteller Teil ... 12 3.1 Chemikalien ... 12 3.2 Geräte ... 12 3.2.1 GC-MS ... 12 3.2.2 HPLC-FLD ... 14

3.3 Methodenentwicklung für die Analyse von Lungengewebe ... 15

3.3.1 Aufarbeitung des Lungengewebes nach der Methode in Abbildung 2-10 ... 15

3.3.2 Lyophilisierung des Lungengewebes ... 16

3.3.3 Solid Phase Extraction (SPE) ... 17

3.3.4 HPLC-FLD ... 17

3.4 Broncho-Alveolären Lavage ... 18

3.4.1 BAL-Matrix ... 18

3.4.2 Aufbereitung von BAL-Proben ... 18

3.5 Analyse von hydroxylierten PAKs in Lungengewebe vom Schwein ... 19

4.1 Einfluss unterschiedlicher Laufmittel bei der SPE auf die Wiederfindung der

Analyten ... 21

4.2 Vergleich der Wiederfindung bei der Analyse mittels GC-MS und HPLC-FLD ... 22

4.3 Ergebnisse für die Analyse von PAKs in Schweinelunge ... 23

4.4 Ergebnisse der Analyse von PAKs in menschlichem Lungengewebe ... 24

4.5 Vergleich der Konzentration an PAKs in gesundem Fettgewebe und Tumorgewebe ... 25

4.6 Ergebnisse der Analyse von PAKs in BAL mittels HPLC-FLD ... 26

4.7 Ergebnisse der Analyse von OH-PAKs in einer Schweinelunge ... 26

5 Zusammenfassung ... 30 Anhänge ... XXXII Literaturverzeichnis ... XXXIV

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 2-1 Strukturformel von Acenaphthen, Acenaphthylen, Anthracen. ... 2

Abbildung 2-2 Strukturformel von Benz[a]anthracen, Benzo[b]fluoranthen, Benzo[g,h,i]perylen. ... 2

Abbildung 2-3 Strukturformel von Benzo[a]pyren, Chrysen, Dibenzo[a,h]anthracen. ... 2

Abbildung 2-4 Strukturformel von Fluoranthen, Fluoren, Indeno[1,2,3-cd]pyren. ... 3

Abbildung 2-5 Strukturformel von Naphthalin, Phenanthren, Pyren. ... 3

Abbildung 2-6 Darstellung eines alternierenden (links im Bild) und eines nicht-alternierenden PAKs. ... 4

Abbildung 2-7 Strukturformeln von Anthracen und Pyren mit hervorgehobenen quartären C-Atomen. ... 4

Abbildung 2-8 Verlauf der metabolischen Aktivierung von BaP zu den reaktiven Spezies (anti-BPDE und syn-BPDE), welche an die DNA binden; Cyp = Cytochrom P450 [4]. ... 5

Abbildung 2-9 Methode zur Analyse von PAKs in Fettgewebe, welche bereits an der JKU entwickelt wurde. ... 10

Abbildung 3-1 Lyophilisiertes Lungengewebe (links) und verriebenes Lungengewebe (rechts). ... 16

Abbildung 3-2 Vergleich von lyophilisierten (links und mitte-links) und ungetrockneten Proben (rechts und mitte-rechts). ... 16

Abbildung 4-1 Ergebnisse für die Wiederfindung bei verschiedenen Eluenten für die SPE. Die Analyten sind aufsteigend nach Retentionszeit geordnet. ... 22

Abbildung 4-2 Chromatogramm: Analyse von OH-PAKs in einer Schweinelunge aufgestockt mit 100 ng pro g Gewebe Mischstandard. ... 27

Abbildung 4-3 Chromatogramm: Analyse von OH-PAKs in einer Schweinelunge mittels HPLC-FLD ohne Aufstockung. ... 28

Abbildung 4-4 Analyse von OH-PAKs in einer Schweinelunge. Vergleich einer Probe mit Hydrolyse und einer Probe ohne Hydrolyse. ... 29

Tabellenverzeichnis

Tabelle 0-1 Abkürzungsverzeichnis ... IX Tabelle 2-1 Die häufigsten PAKs und ihre Einteilung in Gruppen nach karzinogener Wirkung [5]. ... 6

Tabelle 2-2 Grenzwerte von PAKs in Lebensmitteln [10]. ... 8

Tabelle 2-3 Methoden zur Analyse von PAKs in verschiedenen Probenmaterialien. ... 9

Tabelle 3-1 Chemikalien. ... 12

Tabelle 3-2 Temperaturprogramm der GC-MS-Analyse ... 13

Tabelle 3-3 Injektionsparameter ... 13

Tabelle 3-4 MS-SIM-Zeitfenster ... 13

Tabelle 3-5 Laufmittelgradient für die HPLC-Analyse ... 14

Tabelle 3-6 Auflistung der Anregungs- und Emissionswellenlängen ... 15

Tabelle 3-7: Einwaagen für die Aufarbeitung von Lungengewebe nach der Methode aus Abbildung 2-10 ... 15

Tabelle 3-8 Vergleich der gelösten Menge an Gewebe bei der Extraktion von lyophilisierten und ungetrockneten Proben... 17 Tabelle 3-9 Laufmittelgradient für die Analyse von OH-PAKs in einer

Tabelle 3-10 Auflistung der Anregungs- bzw. Emissionswellenlängen und der

Retentionszeiten für die Analyse von OH-PAKs ... 20 Tabelle 4-1 Ergebnisse für die Wiederfindung bei verschiedenen Eluenten für die

SPE. ... 21 Tabelle 4-2 Vergleich der Wiederfindung bei GC-MS- und HPLC-FLD-Messung bei

identer Probenvorbereitung. ... 23 Tabelle 4-3 Zusammenfassung der Ergebnisse für die Analyse von Schweinelunge

mittels unterschiedlicher Methoden ... 24 Tabelle 4-4 Ergebnisse der Analyse von PAKs in menschlichem Lungengewebe ... 25 Tabelle 4-5 Ergebnisse der Analyse von PAKs in BAL mittels HPLC-FLD ... 26

Abkürzungsverzeichnis

Tabelle 0-1 Abkürzungsverzeichnis

Abkürzung

vollständiger Ausdruck

1-OH-Pyr

1-Hydroxypyren

2-OH-Nap

2-Hydroxynaphthalen

3-OH-B[a]P

3-Hydroxybenzo[a]pyren

9-OH-Phe

9-Hydroxyphenanthren

ACN

Acetonitril

ASE

Accelerated Solvent Extraction

BaA

Benzo(a)anthracen

BaP

Benzo(a)pyren

BbF

Benzo(b)fluoranthen

BPDE

(±)-anti-7β,8α-dihydroxy-9α,10α-epoxy-7,8,9,10-tetrahydro-benzo[a]pyren

CHR

Chrysen

Cyp

Cytochrom P450

DAD

Dioden Array Detektor

DCM

Dichlormethan

FLD

Fluoreszenz Detektor

GC

Gaschromatographie

HPLC

High Performance Liquid Chromatographie

IARC

International Agency for Research on Cancer

ISTD

Interner Standard

MS

Massenspektrometer

OH-PAK

Hydroxylierte polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe

PAK

Polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe

Q-TOF

Quadrupol-Time of flight

Vorwort

Ein besonderer Dank gilt meinen Eltern, welche mich, während all dieser Jahre immer unterstützt haben.

Bei Univ. Prof DI Dr. Wolfgang Buchberger möchte ich mich für die ausgezeichnete Betreuung bedanken. Ein großer Dank gilt auch Univ. Prof. Mag. Dr. Christian Klampfl und DI Dr. Markus Himmelsbach welche es mir ermöglichten an zahlreichen Projekten des Instituts teilzunehmen, und ich so wichtige Erfahrungen für die Zukunft sammeln konnte. Natürlich möchte ich mich auch noch beim großartigen Team des Instituts bedanken die mir immer mit Rat und Tat zur Seite standen.

1

Einleitung

Polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) bilden eine große Stoffgruppe, welche bei der Verbrennung von organischem Material bei hohen Temperaturen entstehen. Der menschliche Körper nimmt PAKs über die Atmung oder die Nahrung auf. Aufgrund der karzinogenen Wirkung einiger Vertreter rückte die Analyse dieser Gruppe in den letzten Jahren immer wieder in den Vordergrund.

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Methodenentwicklung für eine routinemäßige Untersuchung von PAKs in menschlichem Fett- und Lungengewebe. Hierbei wird auch untersucht, ob sich die Konzentration und Art der gefundenen PAKs in gesundem Gewebe und pathogenem Gewebe unterscheiden. Vertreter der PAKs, welche von der internationalen Agentur für Krebsforschung (IARC) als karzinogen eingestuft werden, stehen dabei verstärkt im Fokus. Hierzu gehört vor Allem Benzo[a]pyren, welches in der aktuellen Forschung oft als Marker für PAKs verwendet wird. Außerdem wird in der vorliegenden Arbeit das Lungengewebe auf PAK-Metaboliten untersucht, welche bei der Aktivierung im Körper entstehen und letzten Endes für die karzinogene Wirkung verantwortlich sind.

Um die Exposition von Menschen gegenüber PAKs zu messen wird nach möglichst geringen invasiven Möglichkeiten gesucht, um Proben zu entnehmen. Bisher wurde hierfür der menschliche Urin auf PAK-Metaboliten untersucht. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Möglichkeit der Untersuchung von PAKs in broncho-alveolär Lavage.

2

Theoretischer Teil

2.1

Struktur und Eigenschaften von PAKs

Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe sind Verbindungen, welche aus mindestens zwei oder mehreren Benzolringen bestehen. Einzelne Verbindungen enthalten ebenso 5-Ringe. Die Abbildungen 2.1-2.5 zeigen die Strukturen einiger häufig vorkommender PAKs.

Abbildung 2-1 Strukturformel von Acenaphthen, Acenaphthylen, Anthracen.

Abbildung 2-2 Strukturformel von Benz[a]anthracen, Benzo[b]fluoranthen, Benzo[g,h,i]perylen.

Abbildung 2-3 Strukturformel von Benzo[a]pyren, Chrysen, Dibenzo[a,h]anthracen.

Abbildung 2-4 Strukturformel von Fluoranthen, Fluoren, Indeno[1,2,3-cd]pyren.

Abbildung 2-5 Strukturformel von Naphthalin, Phenanthren, Pyren.

Die PAKs lassen sich in mehrere Untergruppen unterteilen. Diese Untergruppen sollen in den nächsten Unterpunkten erläutert werden.

2.1.1 Alternierende und nicht-alternierende PAKs

Die PAKs lassen sich ebenfalls in alternierend und nicht-alternierend unterteilen. Wird das sogenannte „Alternanz-Prinzip“ auf PAKs angewendet, welche nur aus 6-Ringen bestehen, so wird dieses vollständig erfüllt. Bei diesem Prinzip werden die C-Atome des Moleküls alternierend „besternt“, so dass ein besterntes Atom nur mit unbesternten verbunden ist und umgekehrt. PAKs welche einen 5-Ring enthalten können nicht alternierend besternt werden. In Abbildung 2-7 ist ein Beispiel für ein alternierendes und für ein nicht-alternierendes Molekül angegeben. Diese Klassifizierung verdeutlicht nicht nur den topologischen Unterschied zwischen den beiden Typen, sondern auch die daraus resultierenden Unterschiede in der Elektronenstruktur [2].

Abbildung 2-6 Darstellung eines alternierenden (links im Bild) und eines nicht-alternierenden PAKs.

2.1.2 Kata- und peri-kondensierte PAKs

Mit wenigen Ausnahmen bestehen alle PAKs aus einer Mischung von tertiären und quartären C-Atomen. Tertiäre C-Atome finden sich nur außen am Molekül („Perimeter“). Bei den quartären C-Atomen kann zwischen jenen unterschieden werden, welche sich am Perimeter befinden (Cqa) und jenen, welche im Inneren der

PAKs liegen (Cqi). In Abbildung 2-8 sind die Strukturformeln von Anthracen und Pyren

angegeben. Die quartären C-Atome wurden in dieser Abbildung hervorgehoben [2].

Abbildung 2-7 Strukturformeln von Anthracen und Pyren mit hervorgehobenen quartären C-Atomen.

In der Abbildung 2-8 kann man erkennen, dass bei Anthracen nur Cqa vorkommen,

während Pyren aus einer Mischung von Cqa und Cqi besteht. PAKs, in welchen quartäre

C-Atome nur als Cqa vorkommen, werden als kata-kondensierte Kohlenwasserstoffe

bezeichnet. PAKs, in welchen hingegen sowohl Cqa- als auch Cqi-Atome vorkommen,

fallen in die Gruppe der peri-kondensierten Kohlenwasserstoffe [2].

Wie in den Abbildungen 2.1-2.5 zu sehen ist, sind alle 15 Verbindungen komplett unpolar, was eine Anreicherung im Fettgewebe ermöglichen würde. Zur Gruppe der PAKs gehören neben den in den Abbildungen 2.1-2.5 dargestellten etliche weitere Verbindungen, jedoch sind die angeführten jene Verbindungen, die am häufigsten auftreten, beziehungsweise welche als karzinogen und mutagen eingestuft werden.

2.2

Karzinogene Wirkung von PAKs

Lungenkrebs ist der im Moment häufigste Tumor weltweit und das Rauchen von Tabak der wichtigste Risikofaktor für diese Art von Tumor. Neben vielen anderen Stoffen enthalten Zigaretten auch PAKs. Der am besten erforschte Vertreter der PAKs in Zigaretten ist Benzo[a]pyren. Pro Zigarette sind etwa 20-40 ng enthalten und es ist einer der am meisten mutagenen und karzinogenen Stoffe. Um seine karzinogene Wirkung zu entfalten benötigt BaP metabolische Aktivierung zu (±)-anti-7β,8α-dihydroxy-9α,10α-epoxy-7,8,9,10-tetrahydro-benzo[a]pyren (BPDE). Dieser Metabolit bindet an die DNA und bildet überwiegend kovalente (+)-trans Addukte an der N2-Position von Guanin [3]. Abbildung 2-8 zeigt die metabolische Aktivierung von BaP zu BPDE in der menschlichen Lunge.

Abbildung 2-8 Verlauf der metabolischen Aktivierung von BaP zu den reaktiven Spezies (anti-BPDE und syn-BPDE), welche an die DNA binden; Cyp = Cytochrom P450 [4].

Die karzinogene und mutagene Wirkung wurde von der Internationalen Agentur für Krebsforschung (IARC) in mehrere Gruppen eingeteilt. Die Tabelle 2.1 zeigt die Einteilung der oben dargestellten PAKs.

Tabelle 2-1 Die häufigsten PAKs und ihre Einteilung in Gruppen nach karzinogener Wirkung [5].

Verbindung Gruppe Verbindung Gruppe

Acenaphthen 3 Dibenzo[a,h]anthracen 2A Acenaphthylen - Fluoranthen 3 Anthracen 3 Fluoren 3 Benz[a]anthracen 2B Indeno[1,2,3,cd]pyren 2B Benzo[b]fluoranthen 2B Naphthalin - Benzo[g,h,i]perylen 3 Phenanthren 3 Benzo[a]pyren 1 Pyren 3 Chrysen 2B

Die Beschreibung der Gruppen ist folgende: [6]

Gruppe 1: Die Verbindung ist krebserregend für den Menschen.

In diese Kategorie werden Stoffe eingeteilt, welche beim Menschen Krebs erzeugen und das Krebsrisiko um einen wesentlichen Beitrag erhöhen.

Gruppe 2A: Die Verbindung ist wahrscheinlich krebserregend.

Diese Kategorie wird verwendet, wenn limitierte Beweise für eine karzinogene Wirkung beim Menschen vorliegen, aber ausreichende Beweise für die karzinogene Wirkung bei Tieren. Vor allem wird diese Kategorie verwendet, wenn die Verbindung einen Mechanismus beeinflusst, der auch bei Menschen vorkommt.

Gruppe 2B: Die Verbindung ist möglicherweise krebserregend.

Diese Kategorie wird verwendet, wenn limitierte Beweise für eine karzinogene Wirkung beim Menschen vorliegen, aber weniger als ausreichende Beweise für die karzinogene Wirkung bei Tieren.

Gruppe 3: Der Verbindung kann keine karzinogene Wirkung zugeordnet werden. Es gibt weder bei Menschen noch bei Tieren Hinweise auf eine karzinogene Wirkung. Es werden auch Verbindungen dieser Gruppe zugeordnet, wenn es ausreichend Beweise für eine karzinogene Wirkung bei Tieren gibt, aber der betroffene Mechanismus nicht im Menschen vorkommt.

Gruppe 4: Die Verbindung hat wahrscheinlich keine karzinogene Wirkung bei Menschen.

Diese Kategorie wird für Verbindungen benutzt, bei welchen es Beweise für eine fehlende karzinogene Wirkung auf den Menschen und Versuchstiere gibt. In manchen Fällen wird diese Kategorie auch für Verbindungen verwendet, bei denen es unzureichende Beweise für eine karzinogene Wirkung am Menschen gibt, aber es Beweise für eine fehlende karzinogene Wirkung bei Labortieren gibt und diese Beweise regelmäßig von anderen relevanten Daten unterstützt werden.

2.3

Vorkommen und Aufnahme [7]

PAKs sind wohl die am weitesten verbreitete Stoffklasse, welcher eine karzinogene Wirkung zugeschrieben wird.

PAKs entstehen bei der Pyrolyse von organischen Stoffen (z.B.: Kohle, Heizöl, Kraftstoffe, Holz, Tabak). Die Verbrennung dieser Stoffe ist die hauptsächliche Quelle für PAKs in der Atmosphäre und verantwortlich für etwa 50 % der jährlichen Emissionen an Benzo[a]pyren (BaP). Der überwiegende Anteil stammt deswegen auch aus anthropogenen Prozessen. PAKs können aber auch bei einem natürlichen Prozess wie einem Waldbrand entstehen.

Der Mensch kann PAKs auf verschiedene Weisen aufnehmen, zum einen über die Luft (Abgase, Rauchen von Zigaretten), zum anderen aber auch über die Nahrung. Die PAKs können sich beim Räuchern, Grillen oder Braten von Fleisch in diesem anreichern. Auch beim Verzehr von Fisch können PAKs aufgenommen werden, da die Fische die schädlichen Stoffe eventuell bereits zu Lebzeiten über das Wasser aufnehmen, welches durch Schiffe mit Dieselantrieb kontaminiert wurde.

PAKs können auch aufgenommen werden, wenn es zu langen Hautkontakten mit kontaminierten Produkten kommt.

2.4

PAKs in Lebensmitteln

In Österreich obliegt die Analyse von Lebensmitteln auf PAKs der Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit (AGES). Diese ist dafür verantwortlich zu kontrollieren, ob die einzelnen von der EU festgelegten Grenzwerte für PAKs auch tatsächlich eingehalten werden. Die Tabelle 2.2 fasst einige Grenzwerte von PAKs in Lebensmitteln zusammen.

Tabelle 2-2 Grenzwerte von PAKs in Lebensmitteln [10]. Erzeugnis Höchstgehalt für

Benzo[a]pyren / μg kg-1

Höchstgehalt für die Σ aus BaP, BbF, BaA

und Chr / μg kg-1 Öle/Fette 2 10 geräuchertes Fleisch 2 12 Fische/Muscheln 5 30 Säuglingsnahrung 1 1 getrocknete Kräuter 10 50 getrocknete Gewürze 10 50

Als Stellvertreter für die Belastung mit PAKs wurde seit Jahren aus praktischen Gründen die Konzentration von Benzo[a]pyren gemessen. Das Auftreten von potenteren Kanzerogenen wie zum Beispiel Dibenzo[a,l]pyren [11] stellt die Tauglichkeit von Benzo[a]pyren als Indikator allerdings in Frage.

2.5

Analyse von PAKs

Die Analyse von PAKs ist sehr von der jeweiligen Probenmatrix abhängig. Deshalb wurden in Tabelle 2.3 einige der gängigen Methoden zusammengefasst. Für die Analyse von PAKs in Fettgewebe wurde an der Johannes-Kepler-Universität (JKU) bereits eine Methode entwickelt. Diese ist in Abbildung 2-10 gezeigt.

Tabelle 2-3 Methoden zur Analyse von PAKs in verschiedenen Probenmaterialien.

Matrix Literatur Probenvorbereitung Clean up Analyse

Pflanzliches Material [12] Verseifung mit methanolischer KOH; Extraktion mit Cyclohexan 2 x Festphasenextraktion (SPE) HPLC-FLD/Dioden Array Detector (DAD) Boden, Komposte,

Körner [13] Extraktion mit Dichlormethan (DCM) 2 x SPE HPLC-FLD/DAD Fisch [14] Extraktion mit Acetonitril

(ACN) Efficient matrix removal-Lipid Cleanup GC-MS [15] Gefriertrocknen und

mahlen mit anschließender

Gelpermeationschromato graphie und SPE über Al2O3/SiO2

HPLC-FLD/DAD

Geräuchertes Fleisch,

Rauch-Kondensat [16] Beschleunigte Lösungsmittelextraktion mit n-Hexan

Gelpermeationschromato graphie, SPE über Kieselgel

GC-MS

Trinkwasser/

Abwasser [17] Extraktion mit n-Hexan - GC-MS

Staub [17] Extraktion mit

Cyclohexan - GC-MS

Menschliches

Fettgewebe [18] Extraktion mit DCM und n-Hexan Gelpermeationschromatographie GC-MS [19] Verseifung mit

Kalilauge/Ethanol, Extraktion mit n-Hexan

SPE über Al2O3/SiO2 LC-FLD

Menschliches

Lungengewebe [20] Beschleunigte Lösungsmittelextraktion mit DCM/ACN (1:1 v/v)

SPE über Al2O3/SiO2 HPLC-FLD

[21] Verseifung mit

methanolischer Kalilauge; Extraktion mit iso-Octan

Extraktion mit N,N-Dimethylformamid/ H2O (9:1 v:v) HPLC-FLD [19] Verseifung mit Kalilauge/Ethanol, Extraktion mit n-Hexan

SPE über Al2O3/SiO2 LC-FLD

[22,23] Verseifung mit Kalilauge/Ethanol, Extraktion mit n-Hexan

SPE über Al2O3/Na2SO4 GC-MS

Tauben [24] Gefriertrocknen und anschließende Extraktion mit Hexan/Aceton/DCM (2:2:1 v:v:v)

Gelpermeationschromato

Abbildung 2-9 Methode zur Analyse von PAKs in Fettgewebe, welche bereits an der JKU entwickelt wurde.

2.6

Analyse von PAK – Metaboliten

Wie in Abbildung 2-9 bereits gezeigt wurde, durchlaufen PAKs im Körper eine Reihe an Phase – I – Biotransformationen bei welchen auch monohydroxylierte PAKs (OH-PAKs) entstehen. Diese Metaboliten konnten bereits mehrfach in menschlichem Urin nachgewiesen werden [25–30]. Sie dienen daher immer häufiger als Biomarker, um die Exposition von Lebewesen gegenüber PAKs zu bestimmen. Ein Nachteil der Analyse von OH-PAKs ist die aufwendige Aufbereitung der Proben. Hierfür ist eine enzymatische Aufspaltung über mehrere Stunden notwendig [1], da 80-100 % [31] der OH-PAKs als Glucuronide vorliegen. Diese entstehen durch die Phase – II – Biotransformation. Daher wird auch die direkte Bestimmung der PAK-Glucuronide erforscht [32–36]. Auch die erhöhten fluoreszierenden Eigenschaften machen aus den

PAK-Glucuroniden attraktive Alternativen als Biomarker. Allerdings sind sie wegen ihrer polaren Eigenschaften nur schwer von anderen fluoreszierenden Matrixbestandteilen im Urin zu trennen [32].

2.7

Broncho-Alveolären-Lavage (BAL)

Die bronchoalveoläre Lavage (BAL) wird in der Medizin verwendet, um aus den peripheren Atemwegen Zellproben zu gewinnen. Für die Durchführung einer BAL gibt es keine standardisierte Technik, allerdings eine Vielzahl an Richtlinien. Sie wird unter Lokalanästhesie durchgeführt. Normalerweise werden über ein Fiberglasbronchoskop 100-300 mL einer körperwarmen, sterilen, ungepufferten Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) in die Lunge eingeträufelt. Anschließend wird die Flüssigkeit wieder herausgesaugt. Hierbei darf kein zu hoher negativer Druck entstehen, da dies sonst einen Kollaps der peripheren Atemwege oder ein Trauma der Bronchialschleimhaut zur Folge haben könnte. Da die BAL ein gering invasiver Eingriff ist, wird sie oft für die Diagnose von Lungen- und Infektionskrankheiten verwendet. Die BAL kann die invasive Biopsie bis heute nicht gänzlich ersetzen, aber in vielen Fällen ist eine Präzisierung der Differenzialdiagnosen möglich. Weiters lassen sich mit ihr bei manchen Krankheitsbildern wie Alveolarproteinose oder der Langerhans-Zell-Histiozytose spezifische Diagnosen erzielen[37].

In der Vergangenheit wurden unter anderem auch diverse Studien ([38–40]) darüber durchgeführt, ob mit Hilfe von BAL das Verständnis von Asthma verbessert werden könnte. Der Grund dafür ist, dass durch die Lavage Eosinophile, Neutrophile und Lymphozyten gewonnen werden können, welche die Auslöser für Asthma sein können. Im Bereich der PAKs lag der Fokus in der Vergangenheit auf der Analyse der Addukte in BAL. Dabei wurde festgestellt, dass die Konzentration an DNA-Addukten ein Indikator für den kürzlichen Konsum von Zigaretten sein kann, aber keiner für das langfristige Rauchverhalten ist. So korrelierte die Konzentration von DNA-Addukten zwar mit der Anzahl der gerauchten Zigaretten pro Tag bei Rauchern, es konnte allerdings kein Unterschied zwischen Nichtrauchern und Exrauchern festgestellt werden [41].

3

Experimenteller Teil

3.1

Chemikalien

Tabelle 3.1 zeigt die verwendeten Chemikalien.

Tabelle 3-1 Chemikalien.

Chemikalien M / g mol-1 _{Hersteller Reinheit}

Kieselgel - Merck -

Florisil - Supelco -

Natriumsulfat 142,0 Merck p.a.

n-Hexan 86,2 VWR HPLC grade Acetonitril 41,1 VWR HPLC grade Dichlormethan 84,93 Merck 99,8 % 2,6-Diethylnaphthalin 156,22 Sigma Aldrich 97 % 3-Hydroxybenzo[a]pyren 268,3 Neochema 10 µg·mL -1 _in Methanol β-Glucuronidase, Helix pomatia Sigma Aldrich ≥100.000 units·mL -1 9-Phenanthrol 194,23 Sigma

Aldrich Technical grade

1-Hydroxypyren 218,25 Sigma

Aldrich 98 %

2-Naphthol 144,17 Sigma

Aldrich 99 %

PAH QTM-Mix Sigma

Aldrich

2000 µg·mL-1 _in

Methanol

3.2

Geräte

3.2.1 GC-MS

GC: Agilent Technologies 6890N Network

MS: Agilent Technologies 5975C Inert XL MSD (EI) Injektor: Gerstel Multi-Purpose Sampler MSD 2XL

Säule: Agilent J&W GC-column: Select PAH (30 m; 0,25 mm; 0,15 µm Filmdicke) Trägergas: Helium 5.0; 1,2 mL min-1

Software: MSD Chemstation Version E01.00.237

Temperaturprogramm, Injektionsparameter und m/z –Werte sind in den Tabellen 3.2 – 3.4 zusammengefasst.

Tabelle 3-2 Temperaturprogramm der GC-MS-Analyse Zeit / min Start-Temp / °C Rate / °C·min-1 _{End-Temp / °C}

0 70 - - 2 70 15 130 6 130 20 250 12 250 10 320 19-29 320 - - Tabelle 3-3 Injektionsparameter Gerätedaten

Injektions Volumen 2 μl Pulse Pressure 25.0 psi Front-Inlet Mode Pulsed Splitless

Tabelle 3-4 MS-SIM-Zeitfenster

Substanz m/z 1 m/z 2 Fensterstart / min

Naphthalin 128,1 127,1 6,00 Acenaphthylen 152,1 151,1 8,50 Acenaphthen 153,1 154,1 Fluoren 166,1 165,1 10,85 Phenanthren 178,1 176,1 11,50 Anthracen 178,1 176,1 Fluoranthen 202,1 200,1 13,80 Pyren 202,1 200,1 Benzo[a]anthracen 228,1 226,1 16,50 Chrysen 228,1 226,1 Benzo[b]fluoranthen 252,1 250,1 19,43 Benzo[a]pyren 252,1 250,1 Indeno[1,2,3,cd]pyren 276,1 274,1 22,00 Dibenzo[a,h]anthracen 278,1 276,1 Benzo[g,h,i]perylen 276,1 274,1

3.2.2 HPLC-FLD

HPLC: Agilent Technologies 1200 Series HPLC DAD: G1315 DAD-Detektor

FLD: G1321A FLD-Detektor

Säule: Kinetex 3,5 µm PAH-Säule (100 x 4,6 mm; 3,5 µm Partikelgröße) Vorsäule: Security Guard Ultra Cartridge

Säulentemperatur: 35 °C

Injektionsvolumen: 10 µL Fett- und Lungenproben 100 µL BAL-Proben

Als Laufmittel wurde eine Mischung aus Acetonitril und 18 MΩ Wasser verwendet. Der genaue Laufmittelgradient ist in Tabelle 3-5 dargestellt.

Tabelle 3-5 Laufmittelgradient für die HPLC-Analyse Zeit / min Acetonitril / % Wasser / %

0 40 60 1,5 50 50 4,5 50 50 11,5 100 0 12 100 0 12,5 40 60 Flussrate 1,2 mL min-1

In Tabelle 3-6 sind die Anregungs- und Emissionswellenlängen dargestellt. Da bei dieser Methode die Peaks von Benzo[g,h,i]perylen und Indeno[1,2,3,cd]pyren eng beieinander lagen konnte nicht für jede Substanz eine optimale Wellenlänge eingestellt werden. Daher wurde für die Messung von Indeno[1,2,3,cd]pyren eine eigene Spur angelegt. Jede Probe wurde also zweimal gemessen. Einmal mit der richtigen Wellenlänge für Benzo[g,h,i]perylen und dann nochmals für Indeno[1,2,3,cd]pyren. Da Acenaphthylen keine fluoreszierenden Eigenschaften besitzt wurde dieser Analyt mittels DAD bei 227 nm detektiert.

Tabelle 3-6 Auflistung der Anregungs- und Emissionswellenlängen Substanz Anregungs- wellenlänge / nm Emissions- wellenlänge / nm Naphthalin 270 330 Acenaphthen, Fluoren 250 370 Phenanthren, Anthracen 237 440 Fluoranthen, Pyren 270 390 Interner Standard 226 393 Benzo(a)anthracen, Chrysen 270 390 Benzo(b)fluoranthen 260 450 Dibenzo(a,h)anthracen, Benzo(a)pyren 260 410 Benzo(g,h,i)perylen 290 420 Indeno(1,2,3-c,d)pyren 250 485

3.3

Methodenentwicklung für die Analyse von Lungengewebe

3.3.1 Aufarbeitung des Lungengewebes nach der Methode in Abbildung 2-10

Um eine Methode für die Aufarbeitung von Lungengewebe zu entwickeln wurde als Probematrix Schweinelunge verwendet. Tabelle 3-7 zeigt die Einwaagen für die Aufarbeitung.

Tabelle 3-7: Einwaagen für die Aufarbeitung von Lungengewebe nach der Methode aus Abbildung 2-10

Probennummer Lunge / mg Na2SO4 / mg

1 1127,8 1004,4

2 1096,2 1000,4

Als erster Versuch wurde das Lungengewebe gleich dem Fettgewebe aufgearbeitet. Hierzu wurde 1 g Lungengewebe mit 1 g Natriumsulfat verrieben und 10 mL n-Hexan hinzugegeben. Anschließend wurde die Probe für 30 min bei 130 °C in den Trockenschrank gegeben. Nach diesem Schritt war eine wässrige Phase in der Probe zu erkennen wodurch eine korrekte Extraktion nicht gewährleistet werden konnte. Da auch erhöhte Mengen an Natriumsulfat die Bildung einer wässrigen Phase nicht

verhindern konnten wurde eine Trocknung der Probe in Betracht gezogen. Weiters ging im Gegensatz zur Aufarbeitung von Fettgewebe kaum Probe in Lösung.

3.3.2 Lyophilisierung des Lungengewebes

Da PAKs leicht flüchtig sind und bei hohen Temperaturen verloren gehen musste eine schonende Methode zur Trocknung gefunden werden. Zu diesem Zweck wurden die Proben bei -50 °C und 0,38 mbar für 20 h lyophilisiert. In Abbildung 3-1 sind Bilder von lyophilisierten und dem fertig verriebenen Lungengewebe dargestellt.

Abbildung 3-1 Lyophilisiertes Lungengewebe (links) und verriebenes Lungengewebe (rechts).

Die lyophilisierten Proben wurden mit Natriumsulfat verrieben. Die verriebene Probe wurde mit 10 mL n-Hexan im Trockenschrank bei 130 °C für 30 min erhitzt. Nach dieser Prozedur war keine wässrige Phase mehr zu erkennen. In Abbildung 3-2 ist der Vergleich von lyophilisierten und nicht getrockneten Proben nach der Extraktion zu sehen. Zu erkennen ist eine deutliche Gelbfärbung der flüssigen Phase bei den lyophilisierten Proben. Dies lässt auf mehr gelöstes Gewebe (Fett) schließen.

Abbildung 3-2 Vergleich von lyophilisierten (links und mitte-links) und ungetrockneten Proben (rechts und mitte-rechts).

Weiters wurde die gelöste Menge an Gewebe von lyophilisierten und nicht lyophilisierten Proben verglichen. Hierzu wurde jeweils der Extrakt von zwei lyophilisierten bzw. nicht lyophilisierten Proben durch Zentrifugieren und Dekantieren

abgetrennt. Anschließend wurde das Lösungsmittel unter einem Stickstoffstrom abgeblasen und der Rückstand getrocknet und ausgewogen. In Tabelle 3-8 sind die Einwaagen, die Trockenmasse des Lungengewebes, sowie die Menge an Rückstand in mg und Prozent bezogen auf die Einwaage angegeben.

Tabelle 3-8 Vergleich der gelösten Menge an Gewebe bei der Extraktion von lyophilisierten und ungetrockneten Proben

Lunge / mg Lunge trocken / mg Rückstand / mg Rückstand / % lyophilisiert 1 1054,1 209,7 27,4 2,6 2 1087,0 206,4 27,2 2,5 ungetrocknet 1 1005,4 - 15,6 1,5 2 1070,3 - 12,9 1,2

Da durch das Erhitzen im Trockenschrank mit n-Hexan kaum Gewebe gelöst werden konnte kann davon ausgegangen werden, dass es hierbei zu einem reinen Extraktionsschritt kommt. Deswegen wurde überprüft, ob sich Acetonitril als Extraktionsmittel eignet. Durch die Verwendung von Acetonitril als Extraktionsmittel und den geringen Fettanteil des Lungengewebes würde die Flüssig/Flüssig-Extraktion von n-Hexan mit Acetonitril überflüssig werden. Somit würde die Aufarbeitung verkürzt und der Lösungsmittelverbrauch eingeschränkt werden.

3.3.3 Solid Phase Extraction (SPE)

Bei der SPE wurde als stationäre Phase eine Mischung aus 1 g Florisil und 1 g Kieselgel verwendet. Florisil und Kieselgel wurden im Trockenschrank aufbewahrt, um etwaige Verunreinigungen mit PAKs zu entfernen. Da durch ACN als Eluenten vermehrt PAKs im Blindwert auftauchten wurde hier versucht ACN durch andere Eluenten wie Hexan oder Hexan/DCM-Gemische zu ersetzen. Diese wurden im Anschluss durch die Messung der Wiederfindung am GC-MS verglichen.

3.3.4 HPLC-FLD

Als Alternative zur Analyse mit GC-MS wurden die Proben auch mit HPLC-FLD analysiert. Ziel war es durch Änderung der Trennmethode und der Detektion einen Einblick in die auftretenden Matrixeffekte zu bekommen. Hierbei muss erwähnt werden, dass Acenaphthylen nicht mittels FLD gemessen werden kann. Hierzu wird ein DA-Detektor verwendet. Das „Limit of Detection“ (LOD) von Acenaphthylen liegt bei dieser

realen Probe zu erwartenden Konzentrationen liegt, wurde Acenaphthylen bei den weiteren Messungen nicht mehr berücksichtigt.

Für die Analyse einer Probe mittels HPLC-FLD eignet sich nur ACN als Extraktionsmittel und Eluent bei der SPE.

1 g Lungengewebe wurde für ca. 20 h lyophilisiert. Die getrocknete Probe wurde mit 1 g Natriumsulfat verrieben, um eventuell verbliebenes Restwasser zu entfernen. 25 µL einer Diethylnaphthalin-Lösung mit einer Konzentration von 1 ppm wurde als interner Standard (ISTD) zugegeben. Anschließend wurden 10 mL ACN zugegeben und die Probe für 30 min bei 130 °C im Trockenschrank extrahiert. Der abgekühlte Extrakt wurde durch Zentrifugieren und Dekantieren abgetrennt und der Rückstand nochmals mit 5 mL ACN gewaschen. Die vereinten ACN-Phasen wurden am Rotovapor auf ein Volumen <5 mL eingedampft. Daraufhin wurde die Probe mittels SPE aufgereinigt. Als stationäre Phase wurde 1 g Florisil und 1 g Kieselgel verwendet. Die stationäre Phase wurde mit 5 mL ACN konditioniert. Nach dem die Probe aufgetragen wurde, wurde die Säule mit weiteren 5 mL ACN nachgewaschen. Die aufgereinigte Probe wurde am Rotovapor auf etwa 1 mL einrotiert und mittels HPLC-FLD und GC-MS analysiert.

3.4

Broncho-Alveolären Lavage

Die BAL-Proben wurden in Plastik-Vials mit einem Volumen von ca. 2 mL geliefert.

3.4.1 BAL-Matrix

Für die Vorversuche wurde eine Probematrix selbst hergestellt, welche in den Punkten Protein- und Salzkonzentration den realen Proben möglichst nahekommen sollte. In der Literatur wird eine Proteinkonzentration von 1-2 mg mL-1 _{[43] angegeben. Als}

Salzkonzentration wurde die ursprüngliche Konzentration in der Lavage-Flüssigkeit angenommen (1 % NaCl) [37].

Für die Herstellung der Probematrix wurde Blutserum als Proteinquelle und Natriumchlorid verwendet. In diesem Serum sind ca. 70 g L-1 _{Proteine enthalten. 0,5 g}

Natriumchlorid und 1,43 mL Blutserum wurden mit destilliertem Wasser in einem Maßkolben auf 50 mL aufgefüllt.

3.4.2 Aufbereitung von BAL-Proben

Für die Vorversuche zur Aufbereitung der BAL-Proben wurden 0,5 mL Matrix mit 0,5 mL ACN verdünnt. Durch die Zugabe von ACN wurden die Proteine ausgefällt und konnten so abzentrifugiert werden (4000 rpm, 5 min). Weiters konnte durch die Verdünnung das Injektionsvolumen auf 100 µL erhöht werden [42].

Für die Probenvorbereitung wurden die BAL aus dem Plastik-Vial in ein Glas-Vial überführt. Da PAKs, wenn sie in wässrigem Medium vorliegen, an unpolaren Oberflächen haften können, wurde das Plastik-Vial mit 0,45 mL ACN ausgespült. Anschließend wurden 50 µL ISTD (50 ppb) und 500 µL der Probe zur Spülflüssigkeit gegeben. Die Probe wurde bei 4000 rpm für 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einer Pipette vorsichtig abgehoben und in ein Vial überführt. Die Probe wurde am HPLC mit den Parametern aus Punkt 3.2.2 analysiert.

3.5

Analyse von hydroxylierten PAKs in Lungengewebe vom

Schwein

Für die Analyse von hydroxylierten PAKs wurden 2-Hydroxy-Naphthalin (2-OH-Nap), 9-Hydroxy-Phenanthren (9-OH-Phe), 1-Hydroxy-Pyren (1-OH-Pyr) und 3-Hydroxy-Benz[a]pyren (3-OH-B[a]p) als Standards ausgesucht. Diese vertreten die am häufigsten analysierten OH-PAKs und decken außerdem ein breites Spektrum in der Anzahl der aromatischen Ringe ab.

Es wurde die gleiche Säule wie für die Analyse der PAKs verwendet. Als mobile Phase wurde ein Gemisch aus (A) 5 % ACN in 0,05 N Ammoniumacetatpuffer und (B) 90 % ACN mit 0,05 N Ammoniumacetatpuffer verwendet.

Tabelle 3-9 zeigt den Laufmittelgradienten für die Analyse mittel HPLC-FLD.

Tabelle 3-9 Laufmittelgradient für die Analyse von OH-PAKs in einer Schweinelunge mittels HPLC-FLD Zeit / min A / % B / % 0 70 30 1 70 30 30 0 100 32 0 100 Flussrate 0,45 mL min-1

Tabelle 3-10 zeigt die Anregungs- und Emissionswellenlängen für die Analyse von OH-PAKs.

Tabelle 3-10 Auflistung der Anregungs- bzw. Emissionswellenlängen und der Retentionszeiten für die Analyse von OH-PAKs

Substanz Anregungs- wellenlänge / nm Emissions- wellenlänge / nm 2-Hydroxynaphthalin 274 356 9-Hydroxyphenanthren 248 383 1-Hydroxypyren 240 286 3-Hydroxybenzo[a]pyren 380 430

Für die Probenvorbereitung wurde 1 g der Schweinelunge mit 0,5 g Natriumsulfat verrieben. Anschließend wurden 10 mL ACN hinzugefügt und die Probe für 30 min bei 130 °C in den Trockenschrank gegeben. Der Überstand wurde von den restlichen festen Bestandteilen durch Abzentrifugieren getrennt. 20 mL 0,1 N Natriumacetatpuffer und 20 µL β-Glucuronidase wurden hinzugefügt und die Probe bei 37 °C über Nacht gerührt. Die Proben wurden mittels SPE gereinigt. Als stationäre Phase wurde 1 g Silica verwendet. Bevor die Probe aufgetragen wurde, wurde die stationäre Phase mit 5 mL Wasser und 10 mL ACN konditioniert. Nach dem Auftragen wurde die Probe mit 6 mL Wasser gewaschen und anschließend mit 10 mL ACN eluiert. Die Probe wurde auf 0,5 mL eingedampft und mit 0,5 mL Wasser verdünnt. Die Analyse der Probe erfolgte mittels HPLC-FLD.

4

Ergebnisse und Diskussion

4.1

Einfluss unterschiedlicher Laufmittel bei der SPE auf die

Wiederfindung der Analyten

Die Ergebnisse für die Wiederfindung sind in Abbildung 4-1 zu sehen. In Tabelle 4-1 sind die genauen Werte angegeben. Bei der Eluierung mit ACN wurde die Extraktion zuvor mit ACN durchgeführt. Bei allen anderen Eluenten wurde Hexan als Extraktionsmittel verwendet.

Tabelle 4-1 Ergebnisse für die Wiederfindung bei verschiedenen Eluenten für die SPE.

Eluent Analyt Hexan Hexan /

DCM 7:3 Hexan / DCM 1:1 ACN Naphthalin 25,8 82,9 87,8 101,5 Acenaphthylen 20,6 74,3 86,4 106,7 Acenaphthen 21,7 82,1 90,0 104,9 Fluoren 34,2 69,8 89,4 113,6 Phenanthren 55,0 114,8 91,0 147,2 Anthracen 17,9 67,7 84,0 92,7 Fluoranthen 11,1 64,5 89,2 106,0 Pyren 16,7 61,3 96,3 99,5 Benz[a]anthracen 0,8 53,1 92,1 94,4 Chrysen 0,4 50,0 88,1 94,0 Benzo[b]fluoranthen - 43,7 112,7 124,0 Benzo[a]pyren - 24,3 134,6 143,2 Indeno[1,2,3-cd]pyren - 20,2 190,1 245,8 Dibenzo[a,h]anthracen - 20,6 197,0 195,9 Benzo[g,h,i]perylen - 26,5 204,9 216,5 Ø 13,6 57,1 115,6 132,4

Abbildung 4-1 Ergebnisse für die Wiederfindung bei verschiedenen Eluenten für die SPE. Die Analyten sind aufsteigend nach Retentionszeit geordnet.

Die Verwendung von Hexan bzw. Hexan/DCM-Gemisch (7:3) führte vor allem bei Analyten mit höheren Retentionszeiten zu einer geringeren Wiederfindung. Die Wiederfindungen für ACN und Hexan/DCM (1:1) sind vergleichbar. Beide Lösungsmittel sind für die Elution bei der SPE geeignet. Weiters zeigt der Versuch, dass sowohl Hexan als auch ACN als Extraktionsmittel geeignet sind. Allerdings steigen die Werte für Analyten mit höheren Retentionszeiten auch bis zu 245 % was auf eine Signalverstärkung durch die Matrix in diesem Bereich hindeutet.

4.2

Vergleich der Wiederfindung bei der Analyse mittels GC-MS

und HPLC-FLD

Tabelle 4-2 zeigt die Wiederfindung am HPLC-FLD im Vergleich zur Wiederfindung am GC-MS für eine idente Probenvorbereitung. Die Wiederfindung bei der Messung mittels GC-MS liegt bei mehreren Analyten über 100 %. Dies wird durch die bestehenden Blindwertprobleme bei der Messung mittels Massenspektroskopie ausgelöst. Bei der Messung mittels HPLC-FLD treten diese Probleme nicht auf. Deswegen wurden weitere Analysen mittels HPLC-FLD durchgeführt.

0 50 100 150 200 250 %

Wiederfindung

Tabelle 4-2 Vergleich der Wiederfindung bei GC-MS- und HPLC-FLD-Messung bei identer Probenvorbereitung. Analyt GC-MS / % HPLC-FLD / % Naphthalin _{101,5 71,4} Acenaphthylen _{106,7 -} Acenaphthen _{104,9 76,3} Fluoren 113,6 _80,7 Phenanthren _{147,2 79,1} Anthracen _{92,7 85,0} Fluoranthen _{106,0 80,8} Pyren _{99,5 72,2} Benz[a]anthracen _{94,4 82,7} Chrysen _{94,0 82,7} Benzo[b]fluoranthen _{124,0 80,2} Benzo[a]pyren _{143,2 84,1} Indeno[1,2,3-cd]pyren _{245,8 80,6} Dibenzo[a,h]anthracen _{195,9 80,5} Benzo[g,h,i]perylen _{216,5 74,9} Ø _{132,4 79.3}

4.3

Ergebnisse für die Analyse von PAKs in Schweinelunge

In Tabelle 4-3 ist ein Vergleich der verschiedenen Methoden zu sehen. Die Ergebnisse sind als ng pro g trockenes Lungengewebe ± Standardabweichung dargestellt. Für die Berechnung der Standardabweichung wurden jeweils drei Proben analysiert. Die Wiederfindung aus Punkt 4.2 wurde bei diesen Ergebnissen bereits berücksichtigt.

Tabelle 4-3 Zusammenfassung der Ergebnisse für die Analyse von Schweinelunge mittels unterschiedlicher Methoden

Detektion GC-MS HPLC-FLD Extraktion Hexan ACN ACN

Elution Hexan Hexan:DCM 7:3 Hexan:DCM 1:1 ACN ACN Wiederfindungsbereich [%] 0-55 20-114 86-204 93-244 72-85 Wiederfindung-Durchschnitt [%] 14 57 115 130 79 Analyten ng/g trockenes Gewebe

Naphthalin _{- - 5.28 ± 2,15 22,6 ± 5,42 4,63 ± 1,16} Acenaphthen _{- - - - 1,61 ± 0,25} Fluoren _{- - 4,22 ± 0,51 16,2 ± 4,12 5,72 ± 2,55} Phenanthren _{- - 11,1 ± 5,74 43,8 ± 9,06 29,2 ± 6,58} Fluoranthen _{- - 3,00 ± 0,89 16,6 ± 3,21 9,77 ± 4,98} Pyren _{- - 16,5 ± 10,2 27,0 ± 14,1 24,7 ± 16,6} ∑ _{40,1 126,2 75,63}

4.4

Ergebnisse der Analyse von PAKs in menschlichem

Lungengewebe

Für die Analyse von PAKs in menschlichem Lungengewebe standen vier Proben von einem Patienten zur Verfügung. Aufgrund der geringeren Blindwertprobleme und niedrigeren Nachweisgrenzen, wurden das menschliche Gewebe nur mittels HPLC-FLD analysiert.

Tabelle 4-4 zeigt die Ergebnisse für die Analyse von PAKs in menschlichem Lungengewebe. Anders als in der Schweinelunge konnten hier nur die PAKs Naphthalin und Pyren gefunden werden. Diese sind dafür in weit höheren Konzentrationen vorhanden als in der Lunge vom Schwein. Die Summe der gefundenen PAKs ist dadurch höher. Weiters ist eine erhöhte Standardabweichung in menschlichem Gewebe zu beobachten. Dies lässt darauf schließen, dass sich zwar im gesamten Gewebe die gleichen PAKs anlagern, aber es zu Clustern in der Konzentration kommen kann.

Tabelle 4-4 Ergebnisse der Analyse von PAKs in menschlichem Lungengewebe Analyten ng·g -1 _trockenes Gewebe Naphthalin _{150,1 ± 32,5} Pyren _{237,6 ± 31,8} ∑ _387,7

4.5

Vergleich der Konzentration an PAKs in gesundem Fettgewebe

und Tumorgewebe

Um zu ermitteln welche Unterschiede es zwischen gesundem Gewebe und pathogenem Gewebe gibt, wurden mehrere Proben an Fettgewebe analysiert. Diese Proben wurden mittels der Methode aus Abbildung 2-10 aufgearbeitet. Die Messung erfolgte mittels HPLC-FLD anstatt mittels GC-MS. Besonderes Augenmerk wurde dabei daraufgelegt, ob sich in pathogenem Gewebe eine höhere Konzentration an PAKs feststellen lässt, oder ob sich karzinogene PAKs wie z.B. Benz[a]anthracen nachweisen lassen.

Von einem Patienten mit Tumor wurden jeweils drei Proben an gesunden Stellen im Gewebe und aus dem Tumorgewebe entnommen. Somit konnte eine genauere Aussage über die Konzentration an PAKs in pathogenem Gewebe getroffen werden. Anhang 1 zeigt die Ergebnisse für diese Analyse. Es konnten in beiden Gewebearten Naphthalin, Fluoren, Phenanthren, Fluoranthen und Pyren nachgewiesen werden. Die Gesamtkonzentration an PAKs im pathogenen Gewebe lag im Mittel bei 118,46 ng·g-1

und somit unter der Gesamtkonzentration an PAKs im gesunden Gewebe, welche bei 227,54 ng·g-1 _{lag. Dadurch lässt sich darauf schließen, dass die Konzentration an}

PAKs in pathogenem Gewebe nicht erhöht ist.

Um zu ermitteln, ob sich in Tumorgewebe karzinogene PAKs nachweisen lassen, welche in gesundem Gewebe nicht zu finden sind wurden weitere Proben der beiden Gewebearten von verschiedenen Patienten verglichen. Anhang 2 zeigt die Ergebnisse dieser Analysen.

In allen Proben konnten Naphthalin, Fluoren und Phenanthren nachgewiesen werden. Die Gesamtkonzentration der PAKs lag für gesundes Fettgewebe zwischen 76,6 ng·g-1

und 404,6 ng·g-1_{, während die Gesamtkonzentration in pathogenem Gewebe zwischen}

138 ng·g-1 _{und 742 ng·g}-1 _{liegt. Zu erkennen ist, dass die Gesamtkonzentration an}

PAKs bei Patienten, für welche sowohl eine gesunde Probe als auch eine pathogene Probe vorlag, deutlich erhöht ist. Der höchste Wert für einen Patienten ohne pathogenes Gewebe liegt bei 126,3 ng·g-1_{. Im Vergleich dazu liegt der niedrigste Wert}

eines Patienten mit pathogenem Gewebe bei 138,5 ng·g-1_{. Dadurch lässt sich ein}

4.6

Ergebnisse der Analyse von PAKs in BAL mittels HPLC-FLD

Tabelle 4-5 zeigt die Ergebnisse der Analyse von PAKs in BAL. Die Konzentration der PAKs in BAL liegt weit unter der des Lungengewebes. Dies lässt sich durch die apolaren Eigenschaften von PAKs erklären, wodurch sich diese nicht in die polare BAL verteilen. Dennoch konnte Naphthalin, Acenaphthen, Fluoren, Anthracen und Anthracen in manchen Proben nachgewiesen werden. Während Naphthalin bereits in menschlichem Lungengewebe nachgewiesen werden konnte, waren die anderen PAKs dort nicht zu finden. Auffällig ist auch, dass Acenaphthen in nahezu jeder Probe nachgewiesen werden konnte.

Tabelle 4-5 Ergebnisse der Analyse von PAKs in BAL mittels HPLC-FLD Probe 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ng·mL-1_BAL Naphthalin - - - 2.71 - - - <0.50 Acenaphthen 0.24 <0.20 0.49 - 0.26 - <0.20 - - 0.83 Fluoren - - - 0.57 Anthracen - <0.10 - 0.26 - - - -

4.7

Ergebnisse der Analyse von OH-PAKs in einer Schweinelunge

Abbildung 4-2 zeigt das Chromatogramm der Analyse einer Schweinelunge auf OH-PAKs. Die Probe wurde mit einem Mischstandard auf 100 ppb aufgestockt.

Abbildung 4-2 Chromatogramm: Analyse von OH-PAKs in einer Schweinelunge aufgestockt mit 100 ng pro g Gewebe Mischstandard.

Abbildung 4-3 zeigt das Chromatogramm der Analyse einer Schweinelunge auf OH-PAKs. In dieser nicht aufgestockten Probe konnte keiner der Analyten quantifiziert werden. Es zeigen sich kleine Peaks für 2-OH-Nap und 9-OH-Phe diese konnten allerdings von der Software nicht mehr integriert werden.

Abbildung 4-3 Chromatogramm: Analyse von OH-PAKs in einer Schweinelunge mittels HPLC-FLD ohne Aufstockung.

Weiters wurden die Chromatogramme einer Probe, bei welcher keine Hydrolyse durchgeführt wurde und einer Probe mit Hydrolyse verglichen. Diese Chromatogramme wurden in Abbildung 4-4 übereinandergelegt. In dieser Abbildung lässt sich erkennen, dass die Peaks beider OH-PAKs durch die Hydrolyse größer wurden. Um zu überprüfen, ob es sich bei den beiden Peaks wirklich um 2-OH-Nap und 9-OH-Phe handelt wurden die Proben am HPLC-Q-TOF nochmals analysiert. Dabei wurde sowohl gezielt nach den Ausgangsprodukten der Hydrolyse (2-Hydroxynaphthalenglucuronid und 9-Hydroxyphenanthrenglucuronid) als auch nach 2-OH-Nap und 9-OH-Phe gesucht. Allerdings konnte keiner der Analyten bei der Analyse mittels HPLC-Q-TOF nachgewiesen werden.

Abbildung 4-4 Analyse von OH-PAKs in einer Schweinelunge. Vergleich einer Probe mit Hydrolyse und einer Probe ohne Hydrolyse.

5

Zusammenfassung

Es wurde eine Methode zur Analyse von polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAKs) in menschlichem Lungengewebe entwickelt. Als Testmaterial wurde hierbei auf die Lunge eines Schweines zurückgegriffen. Für die Probenvorbereitung wurde das Gewebe lyophilisiert und anschließend gemahlen. Dadurch ergab sich eine große Oberfläche der Probe, wodurch ein effizienter Extraktionsschritt gewährleistet werden konnte. Die Hexanphase wurde mit Acetonitril ausgeschüttelt und die vereinigten Aetonitrilphasen anschließend mittels Solid Phase Extraction gereinigt. Für die Solid Phase Extraction wurden verschiedene Elutionsmittel getestet, um bestehende Blindwertprobleme zu verbessern. Eine Mischung aus einem Teil Hexan und einem Teil Dichlormethan zeigte dabei gute Ergebnisse. Da eine anschließende Analyse mittels HPLC-FLD einer Analyse Mittels GC-MS wegen niedrigerer Nachweisgrenzen bevorzugt wurde, wurde trotzdem Acetonitril weiterhin als Elutionsmittel verwendet.

Es standen vier Proben menschlichen Lungengewebes zur Verfügung. Hierbei handelte es sich um einen Patienten, bei welchem vier Proben an unterschiedlichen Stellen entnommen wurden. In allen Proben konnten Naphthalin und Pyren nachgewiesen werden. Starke Abweichungen in den einzelnen Ergebnissen lassen darauf schließen, dass sich zwar im ganzen Gewebe die gleichen PAKs anlagern, es aber zu „Hot Spots“ bei der Konzentration kommt. In der Lunge des Schweines konnten neben Naphthalin und Pyren auch noch Acenaphthen, Fluoren, Phenanthren und Anthracen nachgewiesen werden. Trotz der höheren Anzahl an unterschiedlichen PAKs lag die Gesamtkonzentration der PAKs in der Lunge des Schweines weit unter jener im menschlichem Lungengewebe.

Bei der Analyse von menschlichem Fettgewebe wurde besonderes Augenmerk daraufgelegt, inwieweit sich gesundes Gewebe von pathogenem Gewebe unterscheidet. Dabei wurden sowohl die Gesamtkonzentration als auch die karzinogene Aktivität der nachgewiesenen PAKs verglichen. Hierfür wurden bei einem Patienten mit Tumorgewebe mehrere Proben an gesundem und pathogenem Gewebe entnommen. In den beiden Probenarten wurden dieselben PAKs gefunden. Die Gesamtkonzentration an PAKs war im gesunden Gewebe höher. Auch bei einem Vergleich von Proben unterschiedlicher Patienten konnten in pathogenem Gewebe keine als karzinogen eingestuften PAKs gefunden werden. Allerdings zeichnete sich ein Trend ab wonach die Gesamtkonzentration an PAKs in Patienten mit Tumor erhöht ist.

Es wurden mehrere Proben Broncho-Alveolär Lavage auf PAKs untersucht. Dabei konnten Naphthalin, Acenaphthen, Fluoren und Anthracen in sehr geringen Konzentrationen nachgewiesen werden. Aufgrund der polaren Eigenschaften von BAL ist eine Anreicherung von PAKs unwahrscheinlich, weswegen diese für die Analyse von PAKs ungeeignet ist.

Eine Lunge vom Schwein wurde auf die Phase-I und Phase-II Metaboliten von PAKs untersucht. Für die Analyse von hydroxylierten PAKs wurde die Probe mittels β-Glucuronidase hydrolysiert, da 80-100 % der PAKs als Glucuronide vorliegen. Die Ergebnisse zeigten kleine Peaks für 2-Hydroxynaphthalin und 9-Hydroxyphenanthren, welche allerdings nicht quantifizierbar waren. Bei einem Vergleich einer Probe, welche nicht hydrolysiert wurde, konnte festgestellt werden, dass die Peaks beider OH-PAKs anstiegen. Dies deutete auf eine Anwesenheit von PAK-Glucuroniden hin. Für einen Nachweis dieser Glucuronide wurde die Probe mittels HPLC-Q-TOF analysiert. Hierbei konnten allerdings keine Phase-II Metaboliten der PAKs detektiert werden.

Anhänge

Anhang 1 Vergleich der Konzentration von PAKs in gesundem Fettgewebe und Tumorgewebe

P

AK

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1

2

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Anhang 2 Ergebnisse der Analyse von PAKs in menschlichem Fettgewebe. Vergleich von gesundem Gewebe (MG) und pathogenem Gewebe (MP).

P at ien ten n r. 2 3 4 5 6 7 8 P ro b en b ez ei ch n u n g MG MG MG MP MG MG MG MG MP MG MP MG MP N ap h th al in 3 1 ,5 4 9 ,5 4 6 ,3 5 2 ,6 2 5 ,7 3 7 ,0 2 9 ,5 6 2 ,0 7 4 ,6 3 0 0 ,9 8 7 ,3 1 2 4 ,5 5 8 8 ,9 Fl u o ren 1 4 ,9 1 1 ,0 9 ,5 2 6 ,0 2 6 ,5 2 1 ,3 1 4 ,6 3 5 ,3 2 6 ,7 2 0 ,6 1 7 ,5 3 1 ,3 3 6 ,5 P h en an th ren 7 9 ,9 3 0 ,4 2 0 ,8 1 7 9 ,2 6 9 ,4 5 5 ,5 4 6 ,9 4 2 ,6 3 7 ,2 8 3 ,2 7 9 ,5 1 5 3 ,3 1 1 6 ,7 Su m m e 1 2 6 ,3 9 0 ,9 7 6 ,6 2 5 7 ,8 1 2 1 ,6 1 1 3 ,7 9 1 ,0 1 3 9 ,8 1 3 8 ,5 4 0 4 ,6 1 8 4 ,2 3 0 9 ,1 7 4 2 ,0 ng ·g -1 F et tg ew eb e 9 10 11

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