RIASON ® hPTH
Radioimmunassay für die quantitative in vitro Bestimmung von humanem Parathormon (PTH) in Serum und Plasma (EDTA und Heparin)
Gebrauchsanweisung
Nur für in-vitro-Diagnostik Gebrauch
Produkt von
IASON GmbH Feldkirchner Straße 4 A – 8054 Graz-Seiersberg
Tel.: +43 (0)316 28 43 00 Fax: +43 (0)316 28 43 00-113
Email: office@iason.eu www.iason.eu
REF R04-034-96Q
Verwendete IFU-Symbole
Symbol Deutsch Symbol Deutsch
In vitro Diagnostikum radioactive Radioaktive Komponente
Bestellnummer TRAC Tracer
Hergestellt von WASH Waschpuffer Konzentrat
Lagerung bei CAL 0-CAL 6 Standards
Verwendbar bis CO1, CO2 Kontrollsera
Europäische Konformität
CT Beschichtete Röhrchen
Chargenbezeichnung RECSOL Rekonstitution Lösung
INCBU Inkubationspuffer
Verwendungszweck
Nur für in-vitro-Diagnostik Gebrauch.
The RIASON® hPTH Kit ist ein Radio-Immunoassay für die quantitative in vitro Bestimmung von humanem Parathormon (PTH) in Serum und Plasma (EDTA, Heparin).
Klinischer Hintergrund Biologische Aktivität
Humanes Parathormon (hPTH) ist ein wichtiger physiologischer Regulator des Phosphor- und Calciumstoffwechsels. hPTH erhöht die Serumcalcium-konzen- trationen durch seine Wirkung auf Niere (Verstärkung der turbularen Ca++
Reabsorption und der Phosphatexkretion) und Knochen (Stimulierung der
osteoklastischen Aktivität und Knochenresorption). Durch die Stimulierung der 1 α Hydroxylation von 25 Hydroxyvitamin D wirkt es indirekt auf die Ca++ Absorption im Darm. Die Freigabe von PTH wird in einer negativen Rückkopplung durch die Serumkonzentration von Ca++ kontrolliert.
PTH wird in den Nebenschilddrüsen synthetisiert und als ein 84 Aminosäuremolekül namens, intaktes PTH sezerniert, was das wichtigste bioaktive Produkt ist. Dieses Molekül wird durch proteolytische Spaltung zwischen Aminosäuren 33-37 an peripheren Stellen gespalten, wodurch biologisch aktive aminoterminale Fragmente auch metabolisch in Leber und anderen Geweben abgebaut werden. Die Halbwertszeit der carboxyl-terminalen Fragmente steigt bei Patienten mit Nierenversagen dramatisch an. Daher korreliert die Messung von intaktem PTH am besten mit der Produktion und biologischen Aktivität des Hormons.
Messprinzip
Der RIASON® hPTH ist ein Zwei-Schritt immunradiometrischer Assay in beschichteten Röhrchen. Er ermöglicht die Bestimmung von intaktem humanem PTH (hPTH) in Serum und Plasma. Ziegen-Antikörper, die für das 1-34 hPTH Fragment (N-terminales Fragrement) spezifisch sind, werden unten und innen an den Kunststoffröhrchen angebracht. Kalibratoren oder Proben werden in die Röhrchen zupipettiert. Nach einer Inkubation von 1 Stunde werden eventuelle Überschüsse von Antigen, mittelregionalen und C-terminalen Fragmenten abgewaschen.
125I markierte monoklonale Antikörper, die für das 44-68 hPTH Fragment spezifisch sind, werden zugegeben. Nach einer Inkubation von 1 Stunde und Abwaschen reflektiert die verbleibende Radioaktivität , die an die Röhrchen gebunden ist, die Konzentration an intaktem hPTH. Dieser Zwei-Schritt IRMA ist hochspezifisch für das intakte hPTH und weist keine Kreuzreaktionen, wie sie durch HACKENG et al.
angeführt werden.
Klinische Anwendung
Die Messung von intaktem hPTH durch den vorliegenden RIASON® hPTH Kit wird zur Diagnostizierung eines primären Hyperparathyreoidismus eingesetzt indem erhöhte Serumwerte von bioaktiven PTH nachgewiesen werden. Sie ermöglicht den Nachweis des Vorliegens eines sekundären Hyperparathyreoidismus bei Patienten mit Vitamin D Mangel, intestinaler Malabsorption oder Nierenversagen. In diesem letzten Fall ist vor allem das Fehlen einer Interferenz mit den inaktiven carboxylterminalen Fragmenten wertvoll. Die Spezifität und hohe Sensibilität des Assay erlaubt auch eine deutliche Unterscheidung zwieschen niedrigen Serumwerten von PTH bei Hyperparathyreoidismus oder bei tumorindizierter Hypercalcämie.
Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen
Der RIASON hPTH Kit ist nur zur in-vitro Diagnostik und nicht zur Anwendung bei Mensch und Tier geeignet. Dieses Produkt darf nur exakt wie in der mitgelieferten Anleitung beschrieben, eingesetzt werden. IASON GmbH kann nicht für einen eventuellen Verlust oder Schaden, (sofern nicht gesetzlich etwas anderes festgelegt ist), haftbar gemacht werden, der durch Nichtbeachtung der Instruktionen entsteht.
VORSICHT: Dieser Kit enthält Material menschlichen und/oder tierischen Ursprungs.
Die Kitreagenzien sind so zu handhaben, als ob eine Übertragung einer Infektionskrankheit möglich sei. Unser Produzent prüft humanes Rohmaterial, dass in
diesem Kit zum Einsatz kommt, auf HBsAg, HCV und HIV-Antikörper. Da es kein diagnostisches Verfahren gibt, welches derartige Erreger mit 100%iger Sicherheit ausschließt, sind die entsprechenden Komponenten wie potentiell infektiöse Proben handzuhaben.
Angemessene Vorsichtsmaßnahmen und die Regeln der guten Laborpraxis, sollten beim Gebrauch und der Entsorgung angewendet werden. Die Entsorgung der Kitreagenzien hat nach den örtlichen Vorschriften zu erfolgen.
Beschädigte Testkits
Im Falle einer starken Beschädigung des Testkits oder der Komponenten muss die Firma IASON GmbH in schriftlicher Form spätestens eine Woche nach Erhalt des Kits informiert werden. Stark beschädigte Einzelkomponenten sollten nicht für den Testlauf verwendet werden. Sie müssen gelagert werden, bis eine endgültige Lösung gefunden wurde. Danach sollten Sie gemäß den offiziellen Richtlinien entsorgt werden.
Haltbarkeit und Lagerung der Reagenzien
Vor dem Öffnen oder der Rekonstitution sind die Reagenzien des Kits bis zum Ablaufdatum (Angabe auf den Etiketten) bei Lagerung bei 2 – 8°C stabil.
Die Kalibratoren und Kontrollen sind sehr instabil, sie sind sofort nach Rekonstitution zu verwenden und der Rest sofort aliquot einzufrieren und bei -20°C höchstens 3 Monate zu lagern. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen.
Frisch zubereitete Waschlösung sollte am selben Tag benutzt werden.
Nach der ersten Benutzung ist der Tracer bei Aufbewahrung im Originalgefäß und bei 2°C und 8°C bis zum Ablaufdatum stabil.
Veränderungen im Aussehen der Kitkomponenten können ein Anzeichen für Instabilität oder Zerfall sein.
Lagerung und Vorbereitung der Patientenproben
Serum and Plasma müssen bei 2 – 8°C gelagert werden
Falls der Test nicht innerhalb von 8 Std. durchgeführt wird, ist die Aufbewahrung bei -20°C erforderlich.
Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen.
Serum- und Plasmaproben (EDTA und Heparin) liefern ähnliche Ergebnisse.
Y(Serum) = 1,01 x (EDTA Plasma) – 21,54 r=0,91 n=6 Y(Serum) = 0,99 x (Heparin Plasma) – 6,14 r=0,94 n=10
Kitbestandteile
1. CT: Mit anti PTH beschichtete Röhrchen (Ziegen Antikörper) 2x48 Stück; gebrauchsfertig.
2. CAL 0: Standard 0 in humanem Plasma mit Thymol und Benzamidin; 1 Fläschchen; lyophilisiert; rekonstituieren Sie mit 3 mL RECSOL. Verwenden Sie CAL0 zum Probenverdünnen deren Konzentration höher ist als der höchste Standard.
3. CAL 1-CAL 6: 6 Standards in humanem Plasma mit Thymol und Benzamidin lyophilisiert; Rekonstituieren Sie mit 2 mL RECSOL; Konzentrationen: siehe QC Zertifikat und / oder auf den Fläschchen.
1 pg der Kalibratorzubereitung ist äquivalent zu 1 pg NIBSC 95/646.
4. CO 1, CO 2: 2 Kontrollen in humanem Plasma mit Thymol; lyophilisiert;
Rekonstituieren Sie mit 2 mL RECSOL; Konzentration: siehe QC Zertifikat und / oder auf den Fläschchen.
5. TRAC: I125 anti-PTH Tracer; monoklonale Antikörper in Boratpuffer mit bovinem Kasein, EDTA, Natriumazid (< 0,1%);1 x 10,5 mL; 680 kBq; radioactive ; gebrauchsfertig.
6. INCBU: Inkubationspuffer; Boratpuffer mit Schafserum, EDTA and Azide (<0.1%); 1 x 10,5 mL; gebrauchsfertig.
7. WASH: konzentrierte Waschlösung; Tween 20-NaCl; 1 x 50 mL; zu verdünnen 28x mit destillierten Wasser = 27 Teile dest. Wasser zu 1 Teil WASH (verwenden Sie einen Magnetrührer). Verwerfen Sie die nicht benutzte Waschlösung am Ende des Tages.
8. RECSOL: Rekonstitutionslösung mit EDTA und Natriumazid (< 0,1%); 1 x 26 mL;
gebrauchsfertig.
Erforderliches Zubehör
Dest. Wasser
Präzisionspipetten mit Wegwerfplastikspitzen 100 µL, 300 µL, 1 mL, 2 mL und 3 mL.
Multipipette
Absaugsystem (optional)
Röhrchenschüttler (700rpm)
Vortex Mixer
Magnetrührer
Gamma Counter 125I (minimal Yield 70%)
Testdurchführung Allgemeine Hinweise
1. Alle Reagenzien und Proben müssen vor Gebrauch auf Raumtemperatur gebracht und gut durchmischt werden. Dabei sollte Schaumbildung vermieden werden.
2. Wenn die Testdurchführung einmal begonnen wurde, muss sie ohne Unterbrechung zu Ende geführt werden.
3. Für jeden Standard, jede Kontrolle oder Probe eine neue Plastikspitze verwenden, um Verschleppungen zu vermeiden.
4. Jeder Lauf muss eine Standardkurve und die Kontrollproben beinhalten.
Testdurchführung
Alle Reagenzien vor Gebrauch auf Raumtemperatur (18 - 25°C) bringen.
Alle CAL, Proben und CO sollten in zweifacher Ausfertigung gleichzeitig ausgeführt werden, so dass die Bedingungen für alle gleich sind.
1. Beschriften Sie je 2 beschichtete Röhrchen für jeden CAL, jede CO und jede Probe. Zur Bestimmung der Gesamtaktivität beschriften Sie 2 normale Röhrchen.
2. Vortexen Sie CAL 0-CAL 6, CO 1-CO 2 und Proben und geben Sie jeweils 300 µL in die beschrifteten Röhrchen.
3. Pipettieren Sie 100 µL INCBU in jedes Röhrchen (außer Gesamaktivität).
4. Die Röhrchen kurz vortexen, dannach 1 Stunde bei Raumtemperatur (18 - 25°C) unter Schütteln (700 rpm) inkubieren.
5. Dekantieren oder saugen Sie den Inhalt der Röhrchen ab (außer Gesamaktivität).
6. Pipettieren Sie 2 mL verdünntes WASH in jedes Röhrchen (außer Gesamaktivität) und saugen Sia ab (oder dekantieren Sie). Wiederholen Sie das Ganze (2 x Waschen) und lassen Sie nach dem letzten Waschschritt die Röhrchen 2 Minuten aufrecht stehen und saugen Sie den letzten Flüssigkeitstropfen ab.
7. Pipettieren Sie 100 µL TRAC in jedes Röhrchen (einschließlich der unbeschichteten Röhrchen für die Gesamtaktivität)
8. Inkubieren Sie unter Schütteln (700 rpm) für 1 Stunde bei Raumtemperatur (18 - 25°C).
9. Dekantieren oder saugen Sie den Inhalt der Röhrchen ab. Pipettieren Sie 2 mL WASH in jedes Röhrchen (abgesehen jene für Gesamtaktivität). Wiederholen Sie das Ganze (2 x waschen) und lassen Sie nach dem letzten Waschschritt die Röhrchen 2 Minuten aufrecht stehen und saugen Sie den letzten Flüssigkeitstropfen ab.
10. Die Röhrchen werden in einem Gammacounter 60 Sekunden gemessen.
Ergebnisberechnung
1. Berechnen Sie den Durchschnitt aus der Doppelbestimmung.
2. Tragen Sie auf semilogarithmischem oder linearem Millimeterpapier den c.p.m.
für jeden Kalibrator gegen die entsprechende Konzentration PTH und zeichnen Sie eine Kalibrationskurve durch die Kalibrationspunkte, schließen Sie offensichtliche Ausreißer aus.
3. Berechnen Sie die Konzentration für jede Kontrolle und Probe durch Interpolation aus der Kalibrationskurve.
4. Falls Sie eine computergestützte Methode zur Auswertung verwenden, empfehlen wir eine "4-Parameter" Kurvenfunktion.
Assay Beispieldaten
Die folgenden Daten dienen zu Demonstrationszwecken und können nicht als Ersatz für die Echtzeitkalibrationskurve verwendet werden.
RIASON® hPTH cpm B/T (%)
Gesamtaktivität 237132 100
CAL 0 pg/mL 365 0,12
13,3 pg/mL 1402 0,46
35,8 pg/mL 4314 1,42
126,0 pg/mL 13688 4,50
447,0 pg/mL 37113 12,21
1007,0 pg/mL 71156 23,42
1562,0 pg/mL 95464 31,41
Erwartete Werte
2,5 – 97,5% Perzentilen pg/mL
Gesunde Patienten (Serum) 6,2 – 29,0
Es wird empfohlen, dass jedes Labor seine eigenen normalen und abnormalen Werte ermittelt. Eine klinische Diagnose sollte nicht allein mit Hilfe der Ergebnisse einer einzelnen diagnostischen Methode erhoben werden. Die Ergebnisse sollten mit anderen klinischen Befunden und Observationen korrelieren.
Qualitätskontrolle
Es wird empfohlen, die Kontrollproben gemäß den nationalen gesetzlichen Bestimmungen einzusetzen.
Durch die Verwendung von Kontrollproben wird eine Tag-zu-Tag Überprüfung der Ergebnisse erzielt. Es sollten Kontrollen sowohl mit normalem als auch pathologischem Level eingesetzt werden.
Die Kontrollen mit den entsprechenden Ergebnissen des QC-Labors sind im QC- Zertifikat, das dem Kit beiliegt, aufgeführt. Die im QC-Blatt angegebenen Werte und Bereiche beziehen sich stets auf die aktuelle Kitcharge und sollten zum direkten Vergleich der Ergebnisse verwendet werden.
Es wird ebenfalls empfohlen, an nationalen oder internationalen Qualitätssicherungs- Programmen teilzunehmen, um die Genauigkeit der Ergebnisse zu sichern.
Es sollten geeignete statistische Methoden zur Analyse von Kontroll-Werten und Trends angewendet werden. Wenn die Ergebnisse des Assays nicht mit den
angegebenen Akzeptanzbereichen des Kontrollmaterials übereinstimmen, sollten die Patientenergebnisse als ungültig eingestuft werden.
In diesem Fall überprüfen Sie bitte die folgenden Bereiche: Pipetten und Zeitnehmer, Gamma Counter, Verfallsdatum der Reagenzien, Lagerungs- und Inkubationsbedingungen, Absaug- und Waschmethode.
Sollten Sie nach Überprüfung der vorgenannten Bereiche keinen Fehler erkannt haben, setzen Sie sich bitte mit Ihrem Lieferanten oder direkt mit der Firma IASON GmbH in Verbindung.
Test Charakteristika Nachweisgrenze
Die Leerwertgrenze (LoB) und die Nachweisgrenze (LoD) wurden in Übereinstimmung mit der CLSI- Richtlinie EP17-A bestimmt.
Die LoB wurde durch mehrfache Messung des Leerwertes und durch Kalkulation von 95 Prozen der Verteilung der Testwerte ermittelt. Die LoB wurde mit 1,7 ng/mL bestimmt.
Die LoD wurde, wie in der Richtlinie beschreiben kalkuliert. Die LoD wurde mit 3,8 ng/mL bestimmt.
Spezifität
Möglicherweise interferierende Peptide wurden einem Serum mit niedrigem und hohem PTH-Wert zugesetzt. Das scheinbare PTH Ergebnis wurde gemessen.
Analytzugabe zu Serum mit niedrigem PTH-Wert
Geme- ssener
PTH- Wert (pg/mL)
Analytzugabe zu Serum mit hohem PTH-Wert
Geme- ssener
PTH- Wert (pg/mL)
Nichts 43 Nichts 444
hPTH 1-34 Fragment 2000 pg/mL 42 hPTH 1-34 Fragment 2000 pg/mL 443 hPTH 44-68 Fragment 100000 pg/mL 44 hPTH 44-68 Fragment 100000 pg/mL 448 hPTH 73-84 Fragment 100000 pg/ mL
hPTH-bezogenes Protein
45 hPTH 73-84 Fragment 100000 pg/ mL hPTH-bezogenes Protein
453 1-34 Fragment 100000 pg/ mL 42 1-34 Fragment 100000 pg/ mL 436
Nichts 11 Nichts 880
hPTH 53-84 Fragment 100000 pg/ mL 18,4 hPTH 53-84 Fragment 100000 pg/ mL 841
Das beweist, dass der RIASON® hPTH keine Kreuzreaktion mit hPTH Fragmenten und hPTH bezogenem Protein aufweist.
Die Assayleistung wird nicht durch Hämolyse beeinträchtigt (2,5 und 5 g/L Hämoglobin-getestet) und durch Bilirubinämie (0,5 und 1g/L Bilirubin-getestet).
Bilirubinkonjugat (0,5 g/L) und Triglyzeride (0,5, 1,0 und 2,5 g/L) interferieren nicht mit diesem Assay.
Präzision
Intra-Assay Präzision (n=10) Inter-Assay Präzision (n=20) Serum N <X> ± SD
(pg/mL)
VK (%) Serum N <X> ± SD (pg/mL)
VK (%)
A 10 50,7 ± 2,1 4,2 C 20 95,9 ± 6,3 6,6
B 10 233 ± 7 2,8 D 20 342 ± 11 3,2
Zeitverzögerung zwischen letzter Kalibrator- und Probenzugabe
Es wird im Folgenden gezeigt, dass die Genauigkeit der Tests selbst dann erhalten bleibt, wenn die Probe 30 Minuten nach Zugabe des Kalibrators in die beschichtete Röhrchen zugeführt wird.
0´ 10´ 15´ 20´ 30´
C1 105,5 109 95,5 109,5 108,4
C2 264,7 266,6 273,2 257,9 258,7
Genauigkeit
Wiederfindungstest Probe Zugeg. PTH
[pg/ mL]
Wiedergef. PTH [pg/ mL] Wiederfindung Total [pg/ mL] Theoretisch [pg/ mL] [%]
1 0 17,9 - -
31 47,3 48,9 97%
100 110,5 117,9 94%
200 212,0 217,9 97%
2 0 146,6 - -
31 162,8 177,6 92%
100 227,9 246,6 92%
200 317,8 346,6 92%
Verdünnungstest Probe Verdünnung Theoret. Konzent.
[pg/ mL]
Gemess. Konzent.
(pg/ mL)
Wiederfindung [%]
1 1/1 - 711,9 -
1/2 356,0 363,5 102%
1/4 178,0 185,0 104%
1/8 89,0 86,7 97%
1/16 44,5 39,9 90%
1/32 22,2 20,2 91%
1/64 11,1 9,8 88%
2 1/1 - 532,7 -
1/2 266,4 270,9 90%
1/4 133,2 137,4 103%
1/8 66,6 72,6 109%
1/16 33,3 32,6 98%
1/32 16,6 18,4 111%
1/64 8,3 9,4 113%
Proben wurden mit CAL 0 verdünnt.
Grenzen des Tests
Proben von Patienten, die Zubereitungen von monoklonalen Maus- Antikörpern zur Diagnose oder Therapie erhalten haben, können humane Anti-Maus Antikörper (HAMA) enthalten. Solche Proben können entweder falsch erhöhte oder zu niedrige Werte ergeben, wenn sie mit Testsystemen getestet werden, die monoklonale Maus Antikörper enthalten.
Heterophile Antikörper im humanen Serum können mit Immunoglobulinen der Reagenzien reagieren und so mit in vitro Immunoassays interferieren.
Patienten die routinemäßigen Umgang mit Tieren oder Tierseren haben, können zu dieser Interferenz neigen und so können anormale Werte in Gegenwart von heterophilen Antikörpern beobachtet werden. Ergebnisse von Patienten, bei denen diese Antikörper vermutet werden, müssen sorgfältig evaluiert werden.
Wenn die Ergebnisse nicht mit anderen klinischen Beobachtungen übereinstimmen, sollten weitere Informationen vor der Diagnoseerstellung ermittelt werden.
High-Dose-Hook-Effekt
Bei einer hPTH-Konzentration von bis zu 10 000pg/mL wurde kein High- Dose- Hook-Effekt beobachtet. Eine mit bis zu 10 000 pg/mL hPTH angereicherte Probe führt zu höheren cpm-Werten al der letzte Kalibrierpunkt.
Rechtliche Grundlagen
Zuverlässigkeit der Ergebnisse
Der Test muss exakt gemäß der Testanleitung des Herstellers abgearbeitet werden.
Darüber hinaus muss der Benutzer sich strikt an die Regeln der GLP (Good Laboratory Practice) oder andere eventuell anzuwendende Regeln oder nationale gesetzliche Vorgaben halten. Dies betrifft besonders den Gebrauch der Kontrollreagenzien. Es ist sehr wichtig, bei der Testdurchführung stets eine ausreichende Anzahl Kontrollen zur Überprüfung der Genauigkeit und Präzision mitlaufen zu lassen. Die Testergebnisse sind nur gültig, wenn alle Kontrollen in den vorgegebenen Bereichen liegen, und wenn alle anderen Testparameter die vorgegebenen Spezifikationen für diesen Assay erfüllen. Wenn Sie bezüglich eines Ergebnisses Zweifel oder Bedenken haben, setzen Sie sich bitte mit der Firma IASON GmbH in Verbindung.
Therapeutische Konsequenzen
Therapeutische Konsequenzen sollten keinesfalls nur aufgrund von Laborergebnissen erfolgen, selbst dann nicht, wenn alle Testergebnisse mit den in
„Zuverlässigkeit der Ergebnisse“ genannten Voraussetzungen übereinstimmen.
Jedes Laborergebnis ist nur ein Teil des klinischen Gesamtbildes eines Patienten.
Nur in Fällen, in denen die Laborergebnisse in akzeptabler Übereinstimmung mit dem allgemeinen klinischen Bild des Patienten stehen, sollten therapeutische Konsequenzen eingeleitet werden. Das Testergebnis allein sollte niemals als alleinige Grundlage für die Einleitung therapeutischer Konsequenzen dienen.
Haftung
Jegliche Veränderungen des Testkits und/oder Austausch oder Vermischung von Komponenten unterschiedlicher Chargen von einem Testkit zu einem anderen, können die gewünschten Ergebnisse und die Gültigkeit des gesamten Tests negativ beeinflussen. Solche Veränderungen und/oder Austausch haben den Ausschluss jeglicher Ersatzansprüche zur Folge. Reklamationen, die aufgrund von Falschinterpretation von Laborergebnissen durch den Kunden gemäß Punkt
„Therapeutische Konsequenzen“ erfolgen, sind ebenfalls abzuweisen. Im Falle jeglicher Reklamation ist die Haftung des Herstellers maximal auf den Wert des Testkits beschränkt. Jegliche Schäden, die während des Transports am Kit entstanden sind, unterliegen nicht der Haftung des Herstellers.
Literatur
1. HABENER J.F., and POTTE J.T., Jr. (1978) "Biosynthesis of parathyroid hormone". New Engl. J. Med., 299, 11:580 and 299, 12:635.
2. MARTIN K.J., HRUSKA K.A., FREITAG J.J., KLAH S. and SLOTOPOLSKY E.
(1979) "The peripheral metabolism of parathyroid hormone". New Engl. J.
Med., 301, 20:1092.
3. GOLTZMAN D., HENDERSON B. and LOVERIDGE N. "Cytochemical bioassay of PTH. (1980) Characteristics of the assay and analysis of circulating hormone forms". J. Clin. Invest., 65:1309.
4. POTTS J.T. Jr., KRONENBERG H.M., ROSENBLATT M. (1982) "Parathyroid hormone : Chemistry, biosynthesis and mode of action". Adv. Protein Chem., 323.
5. HACKENG W.H.L., LIPS P., NETELENBOS J.C. and LIPS C.J.M. (1986)
"Clinical implication of estimation of intact parathyroid hormone (PTH) versus total immunoreactive PTH in normal subjects and hyperparathyroid patients".
J. Clin. Endocrinol. Metab., 63:447.
5. BOUILLON R., COOPMANS W., DE GROOTE D.E.H., RADOUX D., ELIARD P.H. (1990). "Immunoradiometric assay of Parathyrin with polyclonal and monoclonal region specific antibodies". Clin. Chem., 36/2:271-276.
Arbeitsschema
Alle Reagenzien vor Gebrauch auf Raumtemperatur (18 - 25°C) bringen
Beschriften Sie je 2 beschichtete Röhrchen für jeden CAL, jede CO und jede Probe. Zur Bestimmung der Gesamtaktivität beschriften Sie 2 normale Röhrchen
1. Pipettieren CAL 0 – CAL 6 300 µL
CO 1, CO 2 300 µL
Probe 300 µL
2. Pipettieren INCBU (ausg.. Gesamtaktivität) 100 µL 3. Vortexen Blasenbildung vermeiden
4. Inkubieren 1 Stunde bei Raumtemperatur (18 - 25°C) unter Schütteln (700 rpm)
5. Waschen Den Inhalt der CT absugen
2 mL verdünnten WASH pipettieren; erneut absaugen;
einmal wiederholen. (2 x Waschen insgesamt) Röhrchen 2 Minuten aufrecht stehen lassen und
wieder absaugen
6. Pipettieren TRAC 100 µL
7. vortexen Blasenbildung vermeiden
8. Inkubieren 1 Stunder bei Raumtemperatur (18 - 25°C) unter Schütteln (700 rpm)
9. Waschen Den Inhalt der CTabsugen 2 mL verdünnten WASH pipettieren;
erneut absaugen;
einmal wiederholen. (2 x waschen insgesamt) Röhrchen 2 Minuten aufrecht stehen lassen und
wieder absaugen
10. Messung Messung der Röhrchen 1 – 2 Minuten in einem Gammacounter I125;
Erwartete Werte
2,5 – 97,5% Perzentilen pg/ mL
Gesunde Patienten (Serum)
6,2 – 29,0
RIASON ® hPTH
Immunoradiometric assay kit for the in vitro quantitative measurement of human Parathyroid Hormone (PTH) in serum and plasma (EDTA, heparin)
Instruction for use
For in-vitro-diagnostic use only
Product of IASON GmbH Feldkirchner Straße 4 A – 8054 Graz-Seiersberg Tel.: +43 (0)316 28 43 00 Fax: +43 (0)316 28 43 00-113
e-mail: order@iason.eu www.iason.eu
REF R04-034-96Q
Used IFU-Symbols
Symbol English Symbol English
In vitro diagnostic device
radioactive Radioactive
component
Order number TRAC Tracer
Product of WASH Wash buffer
concentrate
Storage CAL0-CAL6 Calibrators
European Conformity CO1, CO2 Control sera
Expiry date CT Coated tubes
Batch code RECSOL Reconstitution
Solution
INCBU Incubation buffer
Intended use
For in-vitro-diagnostic use only.
The RIASON® hPTH kit is an Immunoradiometric assay kit for the in vitro quantitative measurement of human Parathyroid Hormone (PTH) in serum and plasma (EDTA, heparin).
Summary
Biological activity
Human parathyroid hormone (hPTH) is a major physiological regulator of phosphocalcic metabolism.
hPTH increases serum calcium concentrations by its actions on kidney (enhancing tubular Ca++ reabsorption and phosphate excretion) and bone (stimulating osteoclastic activity and bone resorption). It indirectly affects intestinal absorption of Ca++ by stimulating renal 1α-hydroxylation of 25 hydroxyvitamin D. The release of PTH is controlled in a negative feedback loop by the serum concentration of Ca++. PTH is synthesized in the chief cells of the parathyroid glands and secreted as an 84 amino acid molecule called "intact PTH", which is the main bioactive product. This molecule is degraded by proteolytic cleavage between amino acids 33-37 at peripheral sites to form biologically active amino-terminal fragments and biologically inactive carboxyl-terminal fragments. The carboxyl-terminal fragments are cleared only by glomerular filtration, while the bioactive intact PTH and amino-terminal fragments are also metabolically degraded in the liver and other tissues. The half-life of the carboxyl-terminal fragments increases dramatically in patients with renal failure. Thus, the measurement of intact PTH correlates best with the hormone production and biological activity.
Clinical application
The measurement of intact hPTH by the RIASON® hPTH kit is used to establish the diagnosis of primary hyperparathyroidism by demonstrating elevated serum levels of bioactive PTH. It allows documenting the occurrence of secondary hyperparathyroidism in patients with Vitamin D deficiency, intestinal malabsorption, or renal failure. In this last situation, the absence of interference with the inactive carboxyl-terminal fragments is especially valuable. The specificity and high sensitivity of the assay also allows differentiating clearly low serum PTH levels in hypoparathyroidism or in tumor-induced hypercalcaemia.
Assay principle
The RIASON® hPTH kit is a two-step immunoradiometric assay based on coated- tube separation. It allows the determination of intact human PTH (hPTH) in serum and plasma. Goat antibodies specific to the 1-34 hPTH fragment (N-terminal fragment) are attached to the lower and inner surface of the plastic tubes.
Calibrators or samples are added to the tubes. After 1 hour incubation, washing removes the occasional excess of antigen, mid-regional and C-terminal fragments.
125I labelled monoclonal antibodies specific to the 44-68 hPTH fragment are added.
After 1 hour incubation and washing the remaining radioactivity bound to the tube reflects the intact h-PTH concentration. This two-step RIASON® hPTH kit is highly specific of the intact h-PTH and does not cross react with active and inactive fragments even at high concentrations as suggested by HACKENG and al.
Warnings and precautions
The RIASON® hPTH kit is for in vitro diagnostic use only and is not for internal use in humans or animals. This product must be used strictly in accordance with the instructions set out in the Package Insert. IASON GmbH will not be held responsible for any loss or damage (except as required by statute) caused, arising out of non- compliance with the instructions provided.
CAUTION: this kit contains material of human and/or animal origin. Handle kit reagents as if capable of transmitting an infectious agent.
Source material from Human origin which is used in this kit was tested and found negative for HbsAG and HIV as well as for HCV antibodies. However, since there is
no diagnostic procedure that excludes these agents with 100 percent certainty all components should be handled as potentially hazardous material.
Appropriate precautions and good laboratory practices must be used in the storage, handling and disposal of the kit reagents. Disposal of kit reagents should be in accordance with local regulations.
Damaged test kit
In case of serious damage to the test kit or components, the company IASON GmbH must be notified in writing at least one week after receiving the kit. Severely damaged single components should not be used for the test run. They must be stored until a final solution has been found. After that they should be disposed in accordance with official regulations.
Shelf life and storage of reagents
Before opening or reconstitution, all kit components are stable until the expiry date, indicated on the label, if kept at 2 to 8°C.
The calibrators and controls are very unstable, use them immediately after reconstitution, freeze immediately in aliquots and keep them at – 20°C for maximally 3 months. Avoid subsequent freeze-thaw cycles.
Freshly prepared working wash solution should be used on the same day.
After its first use, tracer is stable until expiry date, if kept in the original well- closed vial at 2 to 8°C.
Alterations in physical appearance of kit reagents may indicate instability or deterioration.
Storage and preparation of serum samples
Serum and plasma must be kept at 2 – 8°C.
If the test is not run within 8 hours, storage at –20°C is recommended.
Avoid subsequent freeze-thaw cycles.
Plasma (heparin and EDTA) provides higher results than serum.
Y(serum) = 1.01 x (EDTA plasma) – 21.54 r=0.91 n=6 Y(serum) = 0.99 x (heparin plasma) – 6.14 r=0.94 n=10 Materials provided
1. CT: Tubes coated with anti PTH (goat antibodies); 2 x 48 pieces; ready for use.
2. CAL 0: Zero Calibrator in human plasma with thymol and benzamidin; 1 vial lyophilised; add 3 mL of RECSOL. Use CAL0 for dilution of samples with values above the highest calibrator.
3. CAL 1-CAL 6: 6 Calibrators in human plasma with thymol and benzamidin lyophilized; reconstitution with 2 mL RECSOL; concentration see vials. 1 pg of the Calibrator preparation is equivalent to 1 pg of NIBSC 95/646.
4. CO 1; CO 2: 2 vials Controls in human serum with thymol; lyophilized;
reconstitution with 2 mL RECSOL; concentration see QC certificate.
5. TRAC: I125 anti-PTH Tracer; monoclonal antibodies in Borate buffer with bovine casein, EDTA, sodium azide (< 0.1%); 1 vial; 10.5 mL; 680 kBq;
radioactive ; ready to use.
6. INCBU: Incubation buffer; Borate Buffer with sheep serum, EDTA and azide (<0.1%); 1 vial; 10.5 mL; ready to use.
7. WASH: Wash solution; Tween 20-NaCl; 1 vial; 50 mL; dilute 28x with aqua dest. (27 volumes of aqua dest. to 1 volume of WASH (use a magnetic stirrer). Discard unused working wash solution at the end of the day.
8. RECSOL: Reconstitution solution with EDTA and sodium azide (< 0.1%); blue coloured; 26 mL; ready to use.
Materials required but not provided in the kit
aqua dest.
Pipettes for delivery of: 100 μl, 300 μl, 1 mL, 2 mL and 3 mL. (the use of accurate pipettes with disposable plastic tips is recommended)
Vortex mixer
Magnetic stirrer
Tube shaker (700 rpm)
5 mL automatic syringe (Cornwall type) for washing
Aspiration system (optional).
Any gamma counter capable of measuring 125I may be used (minimal yield 70%).
Assay procedure General remarks
1. All reagents and specimens must be allowed to come to room temperature before use. All reagents must be mixed without foaming.
2. Once the test has been started, all steps should be completed without interruption.
3. Use new disposal plastic pipette tips for each standard, control or sample in order to avoid cross contamination
4. Each assay run should must include a standard curve and control samples.
Test procedure
Allow all reagents to reach room temperature (18 – 25°C) before use.
All CAL, CO and samples should be run in duplicate and should be run concurrently so that all conditions of testing are the same.
1. Label coated tubes in duplicate for each CAL, CO and sample. For determination of total counts, label 2 normal tubes.
2. Briefly vortex CAL, CO and samples and dispense 300 μL of each into the respective tubes.
3. Dispense 100 μL INCBU in each tube except those for total counts.
4. Shake the rack containing the tubes gently by hand to liberate any trapped air bubbles, then incubate for 1 hour at room temperature on a tube shaker (700 rpm).
5. Aspirate (or decant) the content of each tube (except total counts). Be sure that the plastic tip of the aspirator reaches the bottom of the coated tube in order to remove all the liquid. Wash the tubes with 2 mL of diluted WASH (except total counts). Avoid foaming during the addition of the WASH. Aspirate (or decant) the content of each tube (except total counts). Wash again the tubes with 2 mL of diluted WASH (except total counts) and aspirate (or decant). After the last washing, let the tubes standing upright for two minutes and aspirate the remaining drop of liquid.
6. Dispense 100 μL of TRAC into each tube, including the uncoated tubes for total counts.
7. Shake the rack containing the tubes gently by hand to liberate any trapped air bubbles and incubate for 1 hour at room temperature on a tube shaker (700 rpm).
8. Aspirate (or decant) the content of each tube (except total counts). Be sure that the plastic tip of the aspirator reaches the bottom of the coated-tube in order to remove all the liquid. Wash the tubes with 2 mL of diluted WASH (except total counts). Avoid foaming during the addition of the WASH. Aspirate (or decant) the content of each tube (except total counts). Wash again the tubes with 2 mL of diluted WASH (except total counts) and aspirate (or decant). After the last washing, let the tubes standing upright for two minutes and aspirate the remaining drop of liquid.
9. Count the tubes in a gamma counter for 60 seconds.
Calculation of results
1. Calculate the mean of duplicate determinations.
2. On semi-logarithmic or linear graph paper plot the c.p.m. (ordinate) for each calibrator against the corresponding concentration of PTH (abscissa) and draw a calibration curve through the calibrator points, reject the obvious outliers.
3. Read the concentration for each control and sample by interpolation on the calibration curve.
4. Computer assisted data reduction will simplify these calculations. If automatic result processing is used, a 4-parameter logistic function curve fitting is recommended.
Sample assay data
The following data are for illustration only and should never be used instead of the real time calibration curve.
RIASON hPTH cpm B/T (%)
Total Count 237132 100
CAL 0 pg/mL 365 0.12
13.3 pg/mL 1402 0.46
35.8 pg/mL 4314 1.42
126.0 pg/mL 13688 4.50
447.0 pg/mL 37113 12.21
1007.0 pg/mL 71156 23.42
1562.0 pg/mL 95464 31.41
Expected Values
2.5 - 97.5% percentiles pg/mL
healthy patients (serum)
6.2 – 29.0
Each laboratory is recommended to determine ranges for their local population. The results alone should not be the only reason for any therapeutic consequences. The results should be correlated to other clinical observations and diagnostic tests.
Quality control
The regular use of control samples at several analyte levels is advised to ensure day- to-day validity of results. Controls should be tested as unknowns. Quality Control charts should be maintained to follow the assay performance.
Good laboratory practice requires that controls be run with each calibration curve. A statistically significant number of controls should be assayed to establish mean values and acceptable ranges to assure proper performance.
It is recommended to use control samples according to state and federal regulations.
The use of control samples is advised to assure the day to day validity of results. Use controls at both normal and pathological levels.
The controls and the corresponding results of the QC-Laboratory are stated in the QC certificate added to the kit. The values and ranges stated on the QC sheet always refer to the current kit lot and should be used for direct comparison of the results.
It is also recommended to make use of national or international Quality Assessment programs in order to ensure the accuracy of the results.
Employ appropriate statistical methods for analysing control values and trends. If the results of the assay do not fit to the established acceptable ranges of control materials patient results should be considered invalid. In this case, please check the following technical areas: Pipetting and timing devices; gamma counter, expiration dates of reagents, storage and incubation conditions, aspiration and washing methods.
After checking the above mentioned items without finding any error contact your distributor or IASON GmbH directly.
Test characteristics Detection limit
The limit of Blak (LoB) and Limit of Detection (LoD) were determined in accordance with the CLSI guidline EP17-A.
The LoB wa calculated by measuring the blank several times and calculationg the 95th percentile of the distribution of the tests values. The LoB was calculated to be 1.7 pg/mL.
The LoD was calculated as described in the guideline. The LoD was calculated to be 3.8 pg/mL.
Specificity
Possible interfering peptides were added to a low and to a high PTH level serum.
The apparent PTH response was measured.
Added analyte to a low PTH level serum
Observed PTH level (pg/mL)
Added analyte to a high PTH level serum
Observed PTH level (pg/ mL)
Nothing 43 Nothing 444
hPTH 1-34 fragment 2000 pg/mL 42 hPTH 1-34 fragment 2000 pg/mL 443 hPTH 44-68 fragment 100000 pg/mL 44 hPTH 44-68 fragment 100000 pg/mL 448 hPTH 73-84 fragment 100000 pg/mL
hPTH-related protein
45 hPTH 73-84 fragment 100000 pg/ mL hPTH-related protein
453
1-34 fragment 100000 pg/mL 42 1-34 fragment 100000 pg/mL 436
Nothing 11 Nothing 880
hPTH 53-84 fragment 100000 pg/mL 18.4 hPTH 53-84 fragment 100000 pg/mL 841
This demonstrates that the RIASON® hPTH kit does not cross react with hPTH fragments and hPTH-related protein.
The assay performance is not affected by hemolysis (2.5 and 5 g/L haemoglobin tested) and by bilirubinemia (0.5 and 1g/L bilirubin tested). Bilirubin conjugate (0.5 g/L) and triglycerides (0.5; 1.0 and 2.5 g/L) don’t interfere with this assay.
Precision
Intra-Assay Precision (n=10) Inter-Assay Precision (n=20) Serum N <X> ± SD
(pg/mL) CV (%) Serum N <X> ± SD
(pg/mL) CV (%)
A 10 50.7 ± 2.1 4.2 C 20 95.9 ± 6.3 6.6
B 10 233 ± 7 2.8 D 20 342 ± 11 3.2
Time delay
As shown hereafter, assay results remain accurate even when a sample is dispensed 30 minutes after the calibrator has been added to coated tubes.
0´ 10´ 15´ 20´ 30´
C1 105.5 109 95.5 109.5 108.4
C2 264.7 266.6 273.2 257.9 258.7
Accuracy Recovery test
Sample Added PTH [pg/ mL]
Recovery PTH [pg/ mL] Recovery [%]
Total [pg/mL] Theoretical [pg/mL]
1 0 17.9 - -
31 47.3 48.9 97%
100 110.5 117.9 94%
200 212.0 217.9 97%
2 0 146.6 - -
31 162.8 177.6 92%
100 227.9 246.6 92%
200 317.8 346.6 92%
Dilution test
Sample Dilution Theoretical conc. [pg/mL]
Measured conc. [pg/mL]
Recovery [%]
1 1/1 - 711.9 -
1/2 356.0 363.5 102%
1/4 178.0 185.0 104%
1/8 89.0 86.7 97%
1/16 44.5 39.9 90%
1/32 22.2 20.2 91%
1/64 11.1 9.8 88%
2 1/1 - 532.7 -
1/2 266.4 270.9 90%
1/4 133.2 137.4 103%
1/8 66.6 72.6 109%
1/16 33.3 32.6 98%
1/32 16.6 18.4 111%
1/64 8.3 9.4 113%
Samples were diluted with CAL 0.
Limitation of use
Specimens from patients who have received preparations of mouse monoclonal antibodies for diagnosis or therapy may contain human anti- mouse antibodies (HAMA). Such specimens may show either falsely elevated or depressed values when tested with assay kits which employ mouse monoclonal antibodies.
Heterophilic antibodies in human serum can react with reagent immunoglobulins, interfering with in vitro immunoassays.
Patients routinely exposed to animals or animal serum products can be prone to this interference and anomalous values may be observed in case of the presence of heterophelic antibodies. Carefully evaluate the results of
patients suspected of having these antibodies.
If results are not consistent with other clinical observations, additional information should be required before diagnosis.
High-Dose-Hook Effect
No high dose Hook effect was observed with hPTH concentration up to 10 000 pg/mL. A sample spiked with hPTH up to 10 000 pg/mL gives higher cpm’s than the last calibrator point.
Legal aspects Reliability of results
The test must be performed exactly as per the manufacturer’s instructions for use.
Moreover the user must strictly adhere to the rules of GLP (Good Laboratory Practice) or other applicable national standards and/or laws. This is especially relevant for the use of control reagents. It is important to always include, within the test procedure, a sufficient number of controls for validating the accuracy and precision of the test.
The test results are valid only if all controls are within the specified ranges and if all other test parameters are also within the given assay specifications. In case of any doubt or concern please contact IASON GmbH.
Therapeutic consequences
Therapeutic consequences should never be based on laboratory results alone even if all test results are in agreement with the items as stated under Reliability of Results.
Any laboratory result is only a part of the total clinical picture of a patient.
Only in cases where the laboratory results are in acceptable agreement with the overall clinical picture of the patient should therapeutic consequences be derived.
The test result itself should never be the sole determinant for deriving any therapeutic consequences.
Liability
Any modification of the test kit and/or exchange or mixture of any components of different lots from one test kit to another could negatively affect the intended results and validity of the overall test. Such modification and/or exchanges invalidate any claim for replacement.
Claims submitted due to customer misinterpretation of laboratory results subject to point Therapeutic Consequences are also invalid. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer’s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the test kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer.
Literature
1. HABENER J.F., and POTTE J.T., Jr. (1978) "Biosynthesis of parathyroid hormone". New Engl. J. Med., 299, 11:580 and 299, 12:635.
2. MARTIN K.J., HRUSKA K.A., FREITAG J.J., KLAH S. and SLOTOPOLSKY E.
(1979) "The peripheral metabolism of parathyroid hormone". New Engl. J.
Med., 301, 20:1092.
3. GOLTZMAN D., HENDERSON B. and LOVERIDGE N. "Cytochemical bioassay of PTH. (1980) Characteristics of the assay and analysis of circulating hormone forms". J. Clin. Invest., 65:1309.
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5. HACKENG W.H.L., LIPS P., NETELENBOS J.C. and LIPS C.J.M. (1986)
"Clinical implication of estimation of intact parathyroid hormone (PTH) versus total immunoreactive PTH in normal subjects and hyperparathyroid patients".
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6. BOUILLON R., COOPMANS W., DE GROOTE D.E.H., RADOUX D., ELIARD P.H. (1990). "Immunoradiometric assay of Parathyrin with polyclonal and monoclonal region specific antibodies". Clin. Chem., 36/2:271-276.
Pipetting scheme
Bring all the reagents to room temperature (18 -25°C) prior to use.
Label coated tubes in duplicate for each CAL, CO and sample. For the determination of total counts, label 2 normal tubes.
1. Pipetting CAL 0 – CAL 6 300 µL
CO 1 CO 2 300 µL
Sample 300 µL
2. Pipetting INCBU except total counts 100 µL 3. Shaking Shake carefully to avoid bubbles 4. Incubation 1 hour at room temperature (18 -25°C) on a
shaker (700 rpm) 5. Washing Aspirate the content of CT;
Pipette 2 mL of diluted WASH; aspirate;
repeat one more time
Let the tubes stand upright for two minutes and aspirate the remaining drop of liquid 6. Pipetting TRAC 100 µL
Including total counts 7. Shaking Shake carefully to avoid bubbles 8. Incubation 1 hour at room temperature (18 -25°C) on a
shaker (700 rpm) 9. Washing Aspirate the content of CT;
Pipette 2 mL of diluted WASH; aspirate;
repeat one more time
Let the tubes stand upright for two minutes and aspirate the remaining drop of liquid 10. Reading Count tubes 1 – 2 minutes I125; Don´t forget
the total counts
Expected Values
2.5 - 97.5% percentiles pg/ mL
normal patients (serum)
6.2 – 29.0
