die Struktur und die Funktion
des Tumorsuppressorproteins p53
vorgelegt von Diplom-LebensmittelchemikerinChristina Thuy
aus SpeyerVon der Fakultät III - Prozesswissenschaften der Technischen Universität Berlin (TU) zur Erlangung des akademischen Grades DOKTOR DER NATURWISSENSCHAFTEN
-Dr. rer. nat.- genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dr. rer. nat. L.Kroh Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. A. Hartwig Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. M. Metzler
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 23.06.06
Berlin 2006 D 83
Inhaltsverzeichnis
1
Zusammenfassung ... 1
2
Einleitung ... 3
2.1 Thematische Einführung ... 3
2.2 Cadmium... 4
2.2.1 Chemische und physikalische Eigenschaften... 4
2.2.2 Vorkommen und Verwendung ... 4
2.2.3 Toxikokinetik ... 5
2.2.4 Kanzerogenität... 6
2.2.4.1 Direkte genotoxische Effekte... 6
2.2.4.2 Indirekte genotoxische Effekte ... 7
2.3 DNA-Reparatursyteme ... 8
2.3.1 Nukleotidexzisionsreparatur... 9
2.3.2 Rolle von p48 in der NER von UV-induzierten DNA-Schäden... 11
2.4 Das Tumorsuppressorprotein p53 ... 13
2.4.1 Eigenschaften des p53 Proteins... 13
2.4.2 Regulation und Modulation des p53 Proteins ... 14
2.4.3 Struktur des p53 Proteins... 15
2.4.4 Auswirkungen von Mutationen in p53... 17
2.4.5 Rolle von p53 in der NER ... 17
2.4.6 Rolle von p53 in der Zellzykluskontrolle... 19
3
Fragestellung...21
4
Material und Methoden ...22
4.1 Zellkultur ... 22
4.1.1 Zellen... 22
4.1.2 Koloniebildungsfähigkeit ... 22
4.2.1 Inkubation... 23
4.2.2 UVC-Bestrahlung... 23
4.3 Zellzyklusmessung am Durchflusszytometer... 24
4.3.1 Geräteaufbau und Messprinzip... 24
4.3.2 Fluoreszenzfärbung ... 25
4.3.3 Zellzyklusmessung ... 26
4.4 Bestimmung des p53 Proteingehaltes ... 27
4.4.1 Zelllyse ... 27
4.4.2 Proteinbestimmung nach Bradford... 27
4.4.3 Elektrophorese und Westernblot ... 27
4.4.4 Detektion durch Chemilumineszenz... 28
4.4.5 Immunpräzipitation zur Konformationsbestimmung von p53 ... 28
4.4.5.1 Zelllyse und Vorklärung ... 28
4.4.5.2 Immunopräzipitation... 29
4.5 Bestimmung der relativen Genexpression ... 30
4.5.1 Probenvorbereitung ... 30
4.5.1.1 RNA-Isolierung... 30
4.5.1.2 Photometrische Konzentrationsbestimmung... 31
4.5.1.3 RNA Gelelektrophorese... 31
4.5.1.4 cDNA-Synthese ... 31
4.5.2 Quantitative Real Time PCR... 32
4.5.2.1 Prinzip... 32 4.5.2.2 Geräteaufbau ... 36 4.5.2.3 Effizienzbestimmung ... 36 4.5.2.4 PCR-Protokoll... 38 4.5.2.5 Schmelzkurvenanalyse... 39 4.5.2.6 Relative Quantifizierung ... 40
5
Ergebnisse und Diskussion ...42
5.1 Messungen mit der Real Time PCR ... 42
5.1.1 Schmelzkurvenanalyse ... 42
5.1.2 Effizienzbestimmung... 44
5.2 UVC-Bestrahlung ... 45
5.2.1 Koloniebildung... 45
5.2.3 Genexpression von p21, p48 und XPC... 48 5.2.3.1 p21 ... 48 5.2.3.2 p48 ... 49 5.2.3.3 XPC... 50 5.2.4 Zellzyklusphasenverteilung... 51 5.3 Cadmium... 53 5.3.1 Koloniebildung... 53 5.3.2 Induktion von p53... 55 5.3.3 Immunpräzipitation ... 56
5.3.4 Genexpression von p21, p48 und XPC... 58
5.3.4.1 p21 ... 58
5.3.4.2 p48 ... 60
5.3.4.3 XPC... 61
5.4 Kombinationsuntersuchungen ... 63
5.4.1 Einfluss von Cadmium auf die UVC-induzierte Zytotoxizität... 63
5.4.2 Einfluss von Cadmium auf die UVC-induzierte p53 Induktion... 64
5.4.3 Genexpression von p21, p48 und XPC... 65
5.4.3.1 p21 ... 65
5.4.3.2 p48 ... 67
5.4.3.3 XPC... 68
5.4.4 Zellzyklusphasenverteilung... 69
6
Zusammenfassende Diskussion und Ausblick ...71
7
Literatur ...80
A
Anhang...89
A.1 Abkürzungsverzeichnis... 89
A.2 Liste der verwendeten Chemikalien ... 91
A.3 Liste der verwendeten Geräte und Verbrauchs-materialen ... 93
A.4 Verwendete Lösungen und Puffer ... 95
A.4.1 Zellkultur ... 95
A.4.2 Präparation der Proteinextrakte, Proteinbestimmung, Elektrophorese und Westernblot... 96
A.4.3 RNA-Isolierung und Elektrophorese... 98
A.5 Primersequenzen ... 99
A.6 Darstellung eines RNA-Gels nach der RNA-Isolation... 99
A.7 Histogramme der Zellzyklusanalyse... 100
A.8 Dosis-Abstands-Kurve ... 100
A.9 cDNA-Verdünnungreihen ... 101
Publikationsliste...103
Lebenslauf ...107
1
Zusammenfassung
Cadmiumverbindungen sind sowohl beim Mensch als auch im Tierversuch kanzerogen und tragen aufgrund ihrer weiten Verbreitung in der Umwelt und am Arbeitsplatz erheblich zum Krebsrisiko durch Schadstoffe bei. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind jedoch nach wie vor ungeklärt, zumal ihre Mutagenität nur schwach ausgeprägt ist. Diskutiert werden u.a. die Induktion von oxidativem Stress sowie der Einfluss auf DNA-Reparaturprozesse der Zelle.
Bei der Aufrechterhaltung der genetischen Stabilität spielt das Tumorsuppressorprotein p53 eine große Rolle. Durch seine Funktion als Transkriptionsfaktor reguliert es die Expression einer Vielzahl von Genen, die in verschiedenen Prozessen zum Schutz der Zelle involviert sind, wie z.B. der Apoptose, der Zellzykluskontrolle und der DNA-Reparatur. Für diese Eigenschaft ist eine gefaltete Proteindomäne essenziell, die durch die Koordination von einem Zink-Ion durch drei Cystein- und einem Histidinrest stabilisiert wird.
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von löslichem CdCl2 und partikulärem CdO
auf die Struktur und damit auch auf die Funktion des Tumorsuppressorproteins p53 untersucht. Beide Verbindungen verursachten eine Umfaltung der Wildtyp-Form des Tumorsuppressorproteins p53 in die ungefaltete „mutante“ Form. Dies hatte auch eine Hemmung von nachgeschalteten Signalwegen wie die Transkription der DNA-Reparaturgene p48 und XPC zur Folge. Um den Einfluss der Verbindungen auf die p53-Stabilisierung infolge der Wirkung DNA-schädigender Agenzien zu untersuchen, wurden Untersuchungen in Kombination mit UVC-Strahlung durchgeführt. Während UVC-Strahlung zu einer Induktion der Wildtyp-Form führte, zeigten beide Cadmiumverbindungen in Kombinations-versuchen eine Hemmung der UVC-induzierten p53-Stabilisierung, wenn auch bei CdCl2
stärker ausgeprägt als bei CdO. Gleichzeitig resultierte eine Co-Inkubation in einer verstärkten Bildung der „mutanten“ Konformation. Im Einklang damit zeigten beide Verbindungen eine Hemmung der UVC-induzierten Genexpression der Zielgene p48 und XPC. Da diese Proteine eine große Rolle bei der Reparatur von sperrigen DNA-Addukten, wie sie z.B. durch UV-Strahlung oder polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) entstehen, spielen, könnte eine Beeinträchtigung der Expression in einer Beeinflussung von DNA-Reparaturprozessen resultieren.
Um zu untersuchen, ob Cadmiumverbindungen auch andere Kontrollmechanismen stören, wurde der Einfluss auf die Zellzykluskontrolle in Kombination mit UVC-Strahlung untersucht. Während UVC-Strahlung 10 Stunden nach der Bestrahlung mit 5 J/m2 zu einem
S-Phasenarrest führte, zeigte eine Vorinkubation mit den jeweiligen Cadmiumverbindungen und anschließender Bestrahlung eine Zellzyklusphasenverteilung, die nahezu der von unbestrahlten Zellen entspricht. Dagegen resultierte eine alleinige Behandlung mit den jeweiligen Cadmiumverbindungen in einem leichten G1-Phasenarrest. Die Genexpression von p21, einem Protein, dem sowohl im G1-Phasenarrest als auch im S-Phasenarrest eine Rolle zugesprochen wird, wurde sowohl durch die jeweiligen Cadmiumverbindungen als auch durch UVC-Strahlung erhöht, während die UVC-induzierte p21-Expression infolge einer Co-Inkubation mit Cadmium und UVC-Strahlung inhibiert wurde.
Da p53 als Transkriptionsfaktor eine Vielzahl von Genen reguliert, die in verschiedenen Prozessen zur Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität eine Rolle spielen, könnte eine Beeinflussung seiner Struktur und damit auch seiner Funktion einen Mechanismus darstellen, der zur krebserzeugenden Wirkung von Cadmiumverbindungen beiträgt
2
Einleitung
2.1
Thematische Einführung
Die kanzerogene Eigenschaft von Cadmiumverbindungen ist bekannt, dennoch sind die zu Grunde liegenden Mechanismen noch weitestgehend unklar, zumal das mutagene Potenzial nur schwach ausgeprägt ist.
Vor allem in der Metallindustrie sind Arbeiter chronisch gegenüber hohen Dosen partikulärer und löslicher Cadmiumverbindungen exponiert. Allerdings haben Cadmiumverbindungen aufgrund ihrer Persistenz in biologischen Systemen, sowie ihrer Akkumulation in verschiedenen Geweben des Menschen auch für beruflich nicht exponierte Personen eine große Bedeutung.
Für das in der vorliegenden Arbeit untersuchte Metall Cadmium konnte in früheren Studien gezeigt werden, dass es die genotoxische Wirkung von DNA-schädigenden Agenzien erhöht. So verstärkt Cadmium(II) die durch B[a]P (Benzo[a]pyren) verursachte Zelltransformation syrischer Hamsterembryonalzellen (Rivedal und Sanner, 1981) und erhöht in V79 Zellen die durch UVC-Strahlung induzierte Mutationsrate (Hartwig und Beyersmann, 1989). Es scheinen sich also vielmehr indirekte genotoxische Eigenschaften hinter dem kanzerogenen Potenzial zu verbergen als eine direkte DNA-Schädigung, in dem es z.B. in zelluläre Reparaturmechanismen eingreift (Hartwig et al., 1998).
Zellen unterliegen einer permanenten Schädigung durch endogene und exogene Einwirkungen. Zur Beseitigung von auftretenden DNA-Schäden, bevor sie durch unkorrekte Replikation und als Folge davon zur Manifestierung von Mutationen führen, hat die Zelle verschiedene Mechanismen entwickelt. Die wichtigsten Reparaturprozesse sind die NER (Nukleotidexzisionsreparatur), die BER (Basenexzisionsreparatur) und die MMR (Mismatchreparatur). Die NER beseitigt helixverzerrende DNA-Addukte, die z.B. durch UV-Strahlung oder polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) gebildet werden, während über die BER Basenmodifikationen wie sie z.B. durch reaktive Sauerstoffspezies entstehen, repariert werden. Die MMR beseitigt Basenfehlpaarungen, die als Folge von Replikationsfehlern auftreten. Eine Reparatur der DNA-Schäden ist häufig mit einer Arretierung des Zellzyklus verbunden, um die notwenige Zeit zur Reparatur der Schäden zu gewährleisten. Ist das Ausmaß der Schädigung zu groß, wird der programmierte Zelltod, die
Apoptose, eingeleitet. Ein zentrales Protein, welches diese drei Mechanismen koordiniert, ist das Tumorsuppressorprotein p53. Das Protein p53 besitzt ein Zink-bindendes Proteinmotiv, in dem ein Zink-Ion von drei Cysteinresten und einem Histidinrest koordiniert wird. Ergebnisse der letzten Jahre haben gezeigt, dass „Zinkfingerstrukturen“ empfindliche Angriffspunkte für toxische Metallverbindungen sind. Die Sequenzierung des menschlichen Genoms hat inzwischen ergeben, dass ca. 3 % aller Gene für Proteine mit Zinkfingerstrukturen kodieren (Maret, 2003). Das Tumorsuppressorprotein p53 wird zwar nicht zu den Zinkfingerproteinen gezählt, da es keine fingerähnliche Struktur ausbildet (Hainaut und Mann, 2001), könnte aber dennoch durch Wechselwirkung von Metall-Ionen mit der Zink-bindenden Domäne in seiner Funktion beeinträchtigt werden.
Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind Untersuchungen zum Einfluss sowohl partikulärer als auch löslicher Cadmiumverbindungen auf die Struktur und die damit verbundene Funktion des Tumorsuppressorproteins p53. Damit soll ein möglicher Einfluss auf DNA-Reparaturprozesse sowie auf die Zellzykluskontrolle aufgeklärt werden.
2.2
Cadmium
2.2.1 Chemische und physikalische Eigenschaften
Das Element Cadmium ist ein Metall der 2. Nebengruppe des Periodensystems mit einem Atomgewicht von 112,41 und der Ordnungszahl 48. Es sind acht natürlich vorkommende Isoptope bekannt (114Cd, 112Cd, 111Cd, 110Cd, 113Cd, 116Cd, 106Cd und 108Cd). Es handelt sich um ein silberweißes, glänzendes, sehr weiches und plastisch verformbares Metall. In seinen Verbindungen hat es die Oxidationsstufe +2. Lösliche Verbindungen sind z.B. Cadmiumchlorid, Cadmiumsulfat und Cadmiumacetat, wasserunlösliche z.B. Cadmiumsulfid, Cadmiumcarbonat und Cadmiumoxid (Riedel, 1999).
2.2.2 Vorkommen und Verwendung
Cadmium wurde 1817 von F. Strohmeyer als Metall in Zinkcarbonat entdeckt (griech.: cadmeia = Zinkerz (Galmei)). In der Erdrinde ist das Metall nur in sehr geringen Mengen vertreten. Reine Cadmiumminerale sind der Greenockit (hexagonales CdS), Hawleyit (kubisches CdS), Ovatit (CdCO3), Monteponit (CdO) und der Cadmoselit (CdSe). Cadmium
ist in Zinkmineralen wie der Zinkblende zu 0,1 bis 0,5 % und im Zinkspat bis zu 5 % enthalten (Riedel, 1999).
Das Metall gelangt über Emission aus Industrieanlagen, vor allem Zinkhütten, Eisen- und Stahlwerken, Müllverbrennungsanlagen und Braunkohlekraftwerken sowie durch Verbrennung fossiler Brennstoffe und Einsatz von Phosphatdüngemitteln in der Landwirtschaft in die Umwelt. Industriell wird Cadmium zur Herstellung von Nickel-Cadmium-Batterien eingesetzt. Des Weiteren findet es für Korrosionsschutzüberzüge von Metallen sowie als Stabilisator in der Kunststoffindustrie Verwendung (zusammengefasst in Stöppler, 1991; Pinot et al., 2000).
2.2.3 Toxikokinetik
Cadmium ist ein toxisches, biologisch nicht essenzielles Schwermetall. Für einen beruflich nicht exponierten Menschen ist die Hauptaufnahmequelle die Nahrung, hier vorwiegend pflanzliche Lebensmittel und Innereien, einen geringen Anteil liefert das Trinkwasser (10 %). Die durchschnittliche tägliche Aufnahme über Nahrung und Trinkwasser beträgt zwischen 10 und 30 µg, während die inhalative Aufnahme mit 0,02 µg bei Gehalten der Außenluft von 1 bis 5 ng/m3 nur unwesentlich zur Gesamtbelastung beiträgt. Einen großen Beitrag zur täglichen Cadmiumaufnahme leistet allerdings Tabak, so dass Raucher erhöhte Cadmiumgehalte im Körper aufweisen. Eine Zigarette enthält etwa 1-2 µg Cadmium. Davon werden etwa 10 % inhaliert und hiervon wiederum 50 % resorbiert, so dass das Rauchen von einer Schachtel Zigaretten pro Tag in einer zusätzlichen Aufnahme von etwa 1-2 µg resultiert. Somit ist der Eintrag höher als über die Nahrung, da aus dem Gastrointestinaltrakt nur etwa 5 % des aufgenommenen Cadmiums resorbiert werden. Nach Aufnahme in den Körper akkumuliert es an Metallothionein gebunden, vor allem in der Niere und der Leber und weist Halbwertszeiten von bis zu 30 Jahren auf. Die totale Körperbelastung eines beruflich nicht exponierten 50 Jahre alten Menschen beträgt etwa 15 mg (Oberdörster, 1989; Stöppler, 1991). Die einzelnen Beiträge der Organe sind in Tabelle 1 aufgelistet.
Tabelle 1: Cadmiumgehalte im Körper (zusammengefasst in IARC, 1993, 1997).
Gewebe bzw. Körperflüssigkeiten Gehalt
Niere 15-50 mg/kg Nassgewicht
Leber 1-3 mg/kg Nassgewicht
Lunge ca. 1,3 mg/kg Trockengewicht
Urin 0,4 - 4 µg/l
Blut 0,2 - 4 µg/l
2.2.4 Kanzerogenität
Cadmium wurde von der IARC (International Agency for Research on Cancer) als kanzerogen für den Menschen eingestuft (IARC, 1993, 1997). Epidemiologische Studien zeigen eine deutliche Korrelation zwischen Cadmiumexposition und einem erhöhten Auftreten von Tumoren vor allem der Lunge, aber auch der Prostata, der Niere und des Magens. Auch im Versuchstier zeigt sich die kanzerogene Wirkung aller untersuchten Cadmiumverbindungen (CdCl2, CdSO4, CdS, CdO). Das kanzerogene Potenzial kann
allerdings nur teilweise durch seine direkte genotoxische Eigenschaft erklärt werden, da es sich als nicht mutagen in bakteriellen Testsystemen und als nur schwach mutagen in verhältnismäßig hohen Konzentrationen in Säugerzellen erwiesen hat (Hartwig et al., 1998).
2.2.4.1 Direkte genotoxische Effekte
Cadmium induziert Chromosomenabberationen (Ochi und Ohsawa, 1985) und DNA-Strangbrüche (Ochi und Ohsawa, 1983; Snyder, 1988; Dally und Hartwig, 1997) in kultivierten Zellen. Als ein möglicher Mechanismus für die genotoxische Wirkung wird die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) aufgrund einer Störung der zellulären Verteidigungsmechanismen diskutiert. Eine vermehrte Bildung von ROS wurde in verschiedenen Zelllinien gezeigt (Yang et al., 1997; Szuster-Ciesielska et al., 2000; Filipic und Hei, 2004). Ochi et al. (1987) untersuchten in V79-Zellen den Einfluss von CdCl2 auf die
Aktivität von Enzymen, die an der Metabolisierung von ROS direkt oder indirekt beteiligt sind, wie z.B. Superoxiddismutase, Katalase, GSH-Peroxidase und GSSG-Reduktase (Glutathiondisulfid-Reduktase). Die Funktionsweise dieser Enzyme ist in Abbildung 1 dargestellt. Es konnte allerdings keine Beeinflussung der untersuchten Enzymaktivitäten
festgestellt werden, wohingegen der Gehalt an GSH signifikant abnahm. Als Gründe dafür wurden verschiedene Punkte diskutiert. Einerseits könnte Cadmium in die Synthese des GSH eingreifen, indem wichtige Enzyme für dessen Synthese (γ-Glutamyl-Cystein-Synthase, Glutathionsynthase) beeinflusst werden. Andererseits könnte durch Induktion von Cystein-reichem Metallothionein, welches durch Schwermetalle wie Cadmium induziert wird, die Verfügbarkeit von Cystein in der Zelle deutlich gesenkt werden, wodurch weniger GSH synthetisiert werden kann. Einen Zusammenhang zwischen GSH-Gehalt und Cadmiumzytotoxizität zeigten auch die Ergebnisse von Kang et al. (1989) sowie von Kang und Enger (1990), bei denen von einer Korrelation zwischen wachstumsbedingtem GSH-Gehalt bzw. GSH-Depletion durch Hemmung der γ-Glutamyl-Cystein-Synthase mittels Buthionin Sulfoximin (BSO) und Cadmiumzytotoxizität berichtet wurde. Des Weiteren zeigte eine Studie an einer cadmiumresistenten A549 Subpopulation, dass die im Gegensatz zur sensitiven A549 Subpopulation erhöhte Resistenz auf einen etwa 2-fach höheren GSH-Gehalt zurückzuführen ist (Hatcher et al., 1995).
Abbildung 1: Metabolismus von ROS (Marquardt und Schäfer, 1997).
2.2.4.2 Indirekte genotoxische Effekte
Größere Relevanz wird allerdings den indirekten genotoxischen Effekten zugeschrieben, da Cadmium die Mutagenität von anderen DNA-schädigenden Agenzien verstärkt. So beobachteten Rivedal und Sanner (1981) eine Komutagenität von Cadmium(II) mit B[a]P in syrischen Hamsterembryonalzellen und Hartwig und Beyersmann (1989) berichteten von einer Erhöhung der, durch UVC-Strahlung induzierten Mutationsrate in V79 Zellen. Nocentini (1987) zeigte bereits sehr früh eine Beeinflussung der DNA-Replikation und Reparatur UV-geschädigter DNA in menschlichen Zellen. Snyder et al. (1989) sowie Hartmann und Hartwig (1998) zeigten eine Hemmung der Schadenserkennung nach
UV-Bestrahlung in HeLa S3 Zellen. Dieser Befund sowie die Ergebnisse von Fatur et al. (2003) die eine Hemmung der Exzision UV-induzierter CPDs in chinesischen Hamsterzellen zeigten, weisen darauf hin, dass die komutagene Wirkung von Cadmium auf eine Störung zellulärer Reparaturmechanismen zurückzuführen ist
Auf molekularer Ebene zeigten Asmuss et al. (2000), dass bei Verwendung von gereinigtem XPA, einem Protein, das an der NER beteiligt ist, dessen Bindung an ein UVC-geschädigtes Oligonukleotid durch CdCl2 vollständig gehemmt wird. Dieser Effekt wird durch eine
equimolare Konzentration an Zink aufgehoben, was auf eine Verdrängung von Zink in der DNA-bindenden Zinkfingerdomäne des XPA-Proteins schließen lässt. Untersuchungen an einem synthetisierten Peptid, das die Zinkfingerstruktur des humanen XPA-Proteins repräsentiert, konnten eine quantitative Substitution von Zn(II) durch Cd(II) zeigen. Darüber hinaus erwiesen sich die Cadmium-gebundenen Thiole durch die hohe Bindungskonstante von Cd(II) als oxidationsunempfindlich gegen H2O2 (Kopera et al., 2004).
Eine Hemmung der Reparatur von DNA-Schäden hat zur Folge, dass die Schäden infolge stattfindender DNA-Replikation zu Mutationen führen können. Besonders kritisch sind Mutationen in Onkogenen, die zu einem unkontrollierten Wachstum der Zelle führen können, sowie Mutationen in Tumorsuppressorgenen, deren Genprodukte u.a. an der Zellzykluskontrolle beteiligt sind.
2.3
DNA-Reparatursyteme
Die DNA unterliegt einer permanenten Schädigung sowohl durch endogene Stoffwechselprozesse und durch exogene Quellen wie UV-Strahlung, ionisierende Strahlung als auch durch eine Reihe von chemischen Kanzerogenen. Das entstehende Schadensspektrum reicht von oxidativen Basenschäden bis zu DNA-Einzel- und DNA-Doppelstrangbrüchen, DNA-Alkylierungsschäden und DNA-Addukten.
Um die Integrität des Genoms zu gewährleisten, hat die Zelle verschiedene DNA-Reparaturmechanismen entwickelt, bevor die Schäden infolge einer fehlerhaften Replikation zu Mutationen führen können. Die so genannte MMR (Mismatchreparatur) ist für die Reparatur von Basenfehlpaarungen, wie sie durch Replikationsfehler entstehen, verantwortlich. Für oxidative Basenmodifikationen, die durch reaktive Sauerstoffspezies gebildet werden, ist die BER (Basenexzisionsreparatur) spezifisch. Für Umweltmutagene ist das bedeutendste Reparatursystem die NER (Nukleotidexzisionsreparatur). Sie erkennt und
repariert großräumige DNA-Addukte, die zu einer Verzerrung der Helixstruktur der DNA führen. Hierzu zählen z.B. UV-induzierte Schäden, sowie Benzo[a]pyren- und Aflatoxin-induzierte DNA-Addukte.
2.3.1 Nukleotidexzisionsreparatur
Da in der vorliegenden Arbeit als DNA-schädigendes Agens UVC-Strahlung eingesetzt wurde, wird im Folgenden näher auf den Mechanismus der NER eingegangen.
Es kann grundsätzlich zwischen sechs Schritten unterschieden werden: • Schadenserkennung
• Entwindung der Doppelhelix am DNA-Schaden • Einzelstrang-Inzision an beiden Seiten des Schadens
• Exzision des Schadens in Form eines 24 bis 30 Nukleotide langen Oligonukleotids • DNA-Neusynthese des zuvor ausgeschnittenen Oligonukleotids
• Ligation
Für die NER ist ein koordiniertes Zusammenwirken von mindestens 30 verschiedenen Proteinen erforderlich. Mutationen in NER-Genen verursachen die seltene Erbkrankheit Xeroderma pigmentosum, bei der die Patienten extrem lichtempfindlich und anfällig für die Entstehung von Hautkrebs sind. Es existieren acht Komplementationsgruppen (XPA bis XPG und XPV), die auf jeweils verschiedene Gendefekte von an der NER beteiligten Proteinen zurückzuführen sind und letztendlich in allen Fällen (mit Ausnahme von XPV) zu einer Beeinträchtigung der Inzision führen.
Je nachdem in welchem Bereich der DNA sich der Schaden ereignet, kann die NER in zwei Untergruppen eingeteilt werden. Schäden, die sich im transkribierten Strang aktiv transkribierter Gene ereignen, werden über die TCR (transkriptionsgekoppelte Reparatur) repariert, während Schäden im restlichen Genom über die GGR (globale genomische Reparatur) beseitigt werden. Diese beiden Prozesse unterscheiden sich nur im ersten Schritt der NER. Nach der Schadenserkennung verlaufen die beiden Wege analog. In der TCR scheint die RNA Polymerase II das eigentliche Schadenserkennnungssignal für die Rekrutierung der NER-Proteine darzustellen. Nach erfolgter Schadenserkennung kommt es in Folge einer Konformationsänderung der DNA zur Anlagerung von NER-Proteinen. In der GGR ist ein Protein-Komplex bestehend aus XPC und hHR23B für die Schadenserkennung
zuständig. Volker et al. (2001) konnten durch die Anwendung einer lokalen UV-Bestrahlung und dem Einsatz von fluoreszenzmarkierten Antikörpern die Reihenfolge der Anlagerung der NER-Proteine zeigen (Abbildung 2). Nach Anlagerung des XPC-Genproduktes im Komplex mit hHR23B bindet der Transkriptionsfaktor TFIIH. Dieser besteht aus mehreren Untereinheiten und beinhaltet als größte Untereinheiten die beiden Helikasen XPB und XPD (Egly, 2001). Im Anschluss an die lokale Entwindung der DNA kommt es zur Anlagerung der 3´-Nuklease XPG, von XPA, RPA und letztendlich zur Rekrutierung des 5´-Nuklease-Komplexes bestehend aus ERCC1 und XPF. Während die Anlagerung der Helikase XPG unabhängig von XPA erfolgt, kann der Komplex aus ERCC1 und XPF erst nach erfolgter Bindung des XPA erfolgen. Dennoch ist die Aktivität des Enzyms XPG abhängig von XPA.
Abbildung 2: Modell für den Aufbau des menschlichen NER-Exzisions-Komplexes. (Volker et al., 2001).
Nach erfolgter Exzision des Schadens in Form eines 24 bis 30 Nukleotide langen Oligonukleotids wird die entstandene Lücke durch eine DNA-Neusynthese durch die Polymerasen δ und ε mit Hilfe von PCNA, RPA und RFC aufgefüllt. Die Ligation durch die Ligase I schließt letztendlich den Reparaturprozess ab (zusammengefasst in Friedberg, 2001).
TFIIH
XPG
XPA-RPA
ERCC1-XPF
2.3.2 Rolle von p48 in der NER von UV-induzierten DNA-Schäden
UV-Strahlung kann in drei Wellenlängenbereiche eingeteilt werden. UVA umfasst die Wellenlängen von 400 bis 320 nm, UVB die von 320 bis 290 nm und UVC schließt den Bereich zwischen 290 und 100 nm ein. Als umweltrelevante, DNA-schädigende UV-Strahlung spielen nur UVA und UVB eine Rolle, da Wellenlängen kleiner 320 nm fast vollständig von der Ozonschicht absorbiert werden. Dabei handelt es sich bei den durch UVA-Strahlung induzierten Schäden hautsächlich um oxidative Basenschäden, während UVB-Strahlung, analog zu UVC-Strahlung, DNA-Photoprodukte induziert. Da allerdings das Absorptionsmaximum der Basen innerhalb der DNA bei 260 nm liegt und somit durch Bestrahlung mit UVC eine effiziente photochemische Reaktion stattfindet, wird in den meisten Studien UVC-Strahlung angewendet. UVB- und UVC-Strahlung führen hauptsächlich durch eine [2+2]-Cycloaddition benachbarter Pyrimidine zur Bildung von zwei Produkten, zum einen von Cyclobutan-Pyrimidin-Dimeren (CPD), die mit ca. 75 % den Hauptteil der Photoprodukte einnehmen und zum anderen von (6-4)-Photoprodukten (Abbildung 3) (van Steeg und Kraemer, 1999).
Abbildung 3: Entstehung von DNA-Schäden nach UVC-Bestrahlung.
Cyclobutan-Pyrimidin-Dimer
(6-4)-Photoprodukt
UVC-Strahlung
Nach heutigem Kenntnisstand wird zusätzlich zum XPC einem weiteren Protein, dem DDB-Komplex bestehend aus dem XPE-Genprodukt p48 (DDB2) und p127 (DDB1) eine Rolle im ersten Schritt der Schadenserkennung zugeschrieben. Dieser Komplex scheint vor allem bei der Schadenserkennung von CPDs von Bedeutung zu sein, indem er die Anlagerung von XPC an CPDs vermittelt (Fitch et al., 2003b; Wang et al., 2004). XPC erkennt eine spezifische DNA-Struktur, die aufgrund einer Störung der Basenpaarung infolge des DNA-Adduktes einzelsträngige Bereiche innerhalb der DNA-Doppelhelix beinhaltet. (6-4)-Photoprodukte führen zu einer stärkeren Helixverzerrung als CPDs und können somit vermutlich direkt durch XPC erkannt werden. CPDs werden nicht komplett von XPC erkannt und benötigen zunächst die Bindung des DDB-Komplexes (Sugasawa et al., 2002). Ein weiterer Grund für die unterschiedliche Schadenserkennung der beiden Photoprodukte besteht in der Tatsache, dass sich (6-4)-Photoprodukte weniger häufig in Nukleosomen gebundener DNA ereignen als CPDs (Fitch et al., 2003a; Thoma, 1999). Für die Reparatur im Kontext mit Chromatin ist zunächst ein DNA-Remodeling von Nöten, um die Zugänglichkeit der DNA für die NER-Proteine zu gewährleisten. Hwang et al. (1998) erkannten ein Tryptophan-Asparaginsäure-Motiv (WD-Tryptophan-Asparaginsäure-Motiv) im p48 Protein, das eine Ähnlichkeit zu den WD-Tryptophan-Asparaginsäure-Motiven in Proteinen besitzt, die in der Re-Organisation von Chromatin involviert sind. So z.B. in einer Untereinheit des „chromatin assembly factors“ CAF-1, dessen Bezug zur Reparatur von UV-induzierten Schäden bereits von Gaillard et al. (1996) gezeigt wurde. Des Weiteren konnte eine Interaktion zwischen DDB und der CBP/p300 Histon-Acetyl-Transferase gezeigt werden, die als Folge einer Acetylierung von Histonen zur Relaxation des Chromatins führt (Datta et al., 2001; Moser et al., 2005; Rapic-Otrin et al., 2002). Im Anschluss an die Anlagerung des DDB-Komplexes an die DNA kommt es zu einer Ubiquitinierung von DDB2. Dies hat den proteasomalen Abbau von DDB2 zur Folge, wodurch dann XPC an das DNA-Addukt binden kann (Chen et al., 2001; Matsuda et al., 2005; Rapic-Otrin et al., 2002; Sugasawa et al., 2005).
Abbildung 4: Model für die Schadenserkennung von UV-induzierten Photoprodukten (Adimoolam und Ford, 2003; Ford, 2005).
6-4PP CPD DDB2 DDB1 XPC hHR23 Ubiquitin DDB2 XPC hHR23
2.4
Das Tumorsuppressorprotein p53
2.4.1 Eigenschaften des p53 Proteins
Bei der Aufrechterhaltung der genetischen Stabilität hat das Tumorsuppressorprotein p53 eine große Bedeutung. Seine tumorsuppressive Eigenschaft zeigt sich schon allein durch die Tatsache, dass das Gen, welches für p53 kodiert, in ca. 50 % aller menschlichen Tumoren mutiert ist. Die meisten Mutationen ereignen sich in Bereichen des Gens, die für die DNA-Bindungsdomäne des Proteins kodieren. Dabei handelt es sich oftmals um Punktmutationen (Martin et al., 2002). p53 ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von 53 kDa. Seine Sequenz lässt sich in eine N-terminale Transaktivierungsdomäne, eine DNA-Bindungsdomäne und eine C-terminale regulatorische Region einteilen. Die C-terminale Domäne beinhaltet drei funktionelle Motive, zum einen drei Kernlokalisierungssignale und ein Kernexportsignale, die die subzelluläre Lokalisation regulieren sowie eine Oligomerisierungsdomäne (Abbildung 5) (Stewart und Pietenpol, 2001; Michael und Oren, 2003).
Abbildung 5: verschiedene Domänen des p53 Proteins (Michael und Oren, 2003).
NLS: Kernlokalisierungssignal; NES: Kernexportsignal.
Die Eigenschaft, als Tumorsuppressorprotein zu fungieren, lässt sich auf seine Funktion als Transkriptionsfaktor zurückführen. Wie Cho et al. (1994) sowie Clore et al. (1994) zeigten, bindet p53 in seiner aktiven Form als Tetramer bestehend aus vier identischen Untereinheiten an DNA, die vier Wiederholungen der Pentamersequenz 5´-Pu-Pu-Pu-C-A/T-3´ enthält und steuert so die Expression einer Vielzahl von Genen. Reguliert werden u.a. Gene, die in die Zellzykluskontrolle, in die Apoptose aber auch direkt in die DNA-Reparatur involviert sind.
2.4.2 Regulation und Modulation des p53 Proteins
In normalen ungestressten Zellen unterliegt das Protein einem ständigen Ubiquitin-vermittelten mdm2 abhängigen Abbau und wird somit auf einem niedrigen Level in der Zelle gehalten (Halbwertszeit von 15 bis 20 Minuten). Das Protein mdm2 bindet hierzu an die Transaktivierungsdomäne im N-teminalen Bereich des p53 Proteins (siehe Abbildung 5) und überträgt dann als E3-Ligase Ubiquitinreste auf p53, wodurch der Abbau durch das 26S-Proteasom eingeleitet wird (Abbildung 6).
Abbildung 6: Ubiquitin-vermittelter Proteinabbau (Ciechanover, 1998).
(A) Konjugation von Ubiquitin an das zu degradierende Protein. (B) Abbau des Proteins
durch das 26S-Proteasom. (1) Aktivierung von Ubiquitin durch E1. (2) Transfer des aktivierten Ubiquitins von E1 auf ein Mitglied der E2-Familie. (3) Transfer des aktivierten Ubiquitins von E2 auf eine substratspezifische E3-Ligase. (4) Ausbildung einer mit dem Substrat kovalent verknüpften Polyubiquitin-Seitenkette. (5) Bindung des polyubiquitinierten Substrats an den Ubiquitin-Rezeptor in der 19S-Unterheinheit des 26S-Proteasoms und proteolytische Spaltung des Substrats zu kurzen Peptiden durch die 20S-Untereinheit. (6) Recycling von Ubiquitin durch Isopeptidasen.
Infolge von DNA-Schäden kommt es zu verschiedenen Modifikationen, wie Acetylierung und Phosphorylierung am Protein. Phosphorylierungen haben zur Folge, dass die Bindung von mdm2 verhindert wird und somit kein Abbau des Proteins mehr stattfinden kann. Dies führt somit zu seiner Stabilisierung und Erhöhung der Halbwertszeit. Acetylierungen erhöhen die Sequenz-spezifische DNA-Bindung an so genannte p53 responsive Elemente in der Promotorregion bzw. in intronischen Segmenten seiner Zielgene und führen somit zu deren Transkription (zusammengefasst in Hainaut und Hollstein, 2000; Stewart und Pietenpol, 2001).
2.4.3 Struktur des p53 Proteins
Die Bindung von p53 an spezifische DNA Sequenzen wird durch seine konformationsspezifische Struktur in der zentralen Bindungsdomäne (Aminosäuren 102-292) vermittelt. Die Struktur besitzt ein Sandwich von 2 Faltblättern, bestehend aus 4 bzw. 5 ß-Strängen, des Weiteren ein Loop-β-Faltbatt-Helix-Motiv, das mit der großen Furche der DNA interagiert sowie ein Loop-Helix-Motiv (L2/L3), das mit der kleinen Furche der DNA interagiert. Das Motiv L2/L3 wird durch die Koordinierung eines Zink-Ions mittels dreier Cysteine (Cys176, Cys238, Cys242) und eines Histidins (His179) stabilisiert (Abbildung 7 und Abbildung 8).
Im Gegensatz zu so genannten Zinkfingerproteinen, in denen sich durch die Koordination eines Zink-Ions eine fingerähnliche Struktur ausbildet, die sich in die große Furche der DNA einlagert, ist im p53 die Zink-bindende Domäne nicht direkt an der DNA-Bindung beteiligt. Der Hauptkontakt zwischen DNA und p53 wird stattdessen über Arg248 innerhalb des L3-Loop vermittelt und erfolgt über die kleine Furche der DNA. Das Vorhandensein des Zink-Ions ist aber dennoch essenziell für seine Struktur und Funktion als Transkriptionsfaktor. Eine Behandlung mit Metallchelatoren führt zu einer Herauslösung des Zink-Ions aus der Struktur, wodurch es durch Auffaltung des Proteins zum Verlust der Tertiärstruktur und damit auch zu einem Verlust der DNA-Bindungsfähigkeit kommt (Hainaut und Milner, 1993b; Verhaegh et al., 1998; Meplan et al., 2000). Ebenso führte eine Oxidation der Cysteine mittels Diamid zu einer Konformationsänderung und damit zu einer Hemmung der DNA-Bindung (Hainaut und Milner, 1993a). Darüber hinaus resultierte eine Substitution der Zink-bindenden Cysteine gegen Lysin in einer verminderten DNA-Bindung von p53 (Rainwater et al., 1995).
Abbildung 7: Topologisches Diagramm der Sekundärstruktur von p53 (Cho et al., 1994).
Abbildung 8: DNA-Bindungsdomäne von p53 (modifiziert nach Wang et al., 2001).
2.4.4 Auswirkungen von Mutationen in p53
Als Folge von Mutationen im Gen, das für das p53 Protein codiert, kann es zu einem Funktionsverlust als Tumorsuppressorprotein kommen. Die meisten Mutationen führen zu einer Beeinträchtigung der sequenzspezifischen Transaktivierungs-Aktivität, wodurch die Expression von Genen, die z.B. in der Zellzykluskontrolle und der Apoptose involviert sind, beeinträchtigt wird. Dennoch zeigten verschiedene Studien, dass bestimmte Arten von Mutationen, so genannte gain-of-function-Mutante zu einem Funktionsgewinn des Proteins führen, die dem Protein eine onkogene Eigenschaft verleihen. Eine der zusätzlichen Funktionen ist die Hochregulierung von Genen, die für die Steuerung der Zellproliferation zuständig sind (z.B. c-myc, c-fos, PCNA, EGFR). Ein weiterer Mechanismus, durch den Mutationen in p53 heterozygoten Zellen zur Tumorprogression beitragen könnten, ist die dominant-negative Inhibierung der Wildtyp-Form durch mutantes p53. Die infolge einer Aktivierung von wildtyp p53 erfolgten Tetramerisierung und somit die sequenzspezifische DNA-Bindung kann durch die Bildung von Hetero-Oligomeren aus Wildtyp- und „mutanter“ Form inhibiert werden (Chan et al., 2004; Sigal und Rotter, 2000; van Oijen und Slootweg, 2000).
2.4.5 Rolle von p53 in der NER
Erste Hinweise darauf, dass p53 eine Rolle in der NER spielt, kommen von Beobachtungen von Wang et al. (1995) die zeigten, dass p53 mit den Helikasen XPB und XPD wechselwirkt. Allerdings zeigen in vitro Versuche keine Notwendigkeit von p53 für den Ablauf der NER, so dass p53 eine Rolle in der NER im Kontext mit Chromatin zu spielen scheint. Des Weiteren zeigten Versuche an Hautfibroblasten, die homozygote Mutationen des p53-Gens tragen, dass p53 für die globale genomische Reparatur von UV-induzierten CPDs benötigt wird, während die transkriptionsgekoppelte Reparatur unbeeinflusst ist (Ford und Hanawalt, 1995). Die Reparatur wurde mit Hilfe der T4-Endonuklease, die spezifisch CPDs erkennt, gemessen. Ford und Hanawalt (1997) konnten mittels eines Immunoassays mit spezifischen Antikörpern gegen CPDs und auch gegen (6-4)-Photoprodukte zeigen, dass der Effekt von p53 auf die Reparatur von (6-4)-Photoprodukte, die sich im Gegensatz zu CPDs weniger häufig in Nukleosomen gebundener DNA ereignen, geringer ist als auf CPDs. Hwang et al. (1999) sowie Adimoolam und Ford (2002) konnten zeigen, dass p53 als Transkriptionsfaktor die
NER-Proteine p48 und XPC induziert und somit eine indirekte Rolle in der NER einnimmt. Für eine Anlagerung des Schadenserkennungsprotein XPC an CPDs ist p53 essenziell. Dies ist vermutlich auf die Induktion von p48 infolge von DNA-Schäden zurückzuführen (Wang et al., 2003). Die Beteiligung von p48 in der NER und seine Rolle beim DNA-Remodeling wurde schon in Kapitel 2.3.2 vorgestellt. Allerdings zeigen Arbeiten von Rubbi und Milner (2003), dass XPE-Zellen eine normale UV-induzierte Chromatin-Relaxation aufweisen, so dass die p53 vermittelte Relaxation unabhängig von p48 ist. Ebenso wie p48 ist auch p53 in der Lage, die Histon-Acetyltransferase p300 an Chromatin zu rekrutieren und so eine Histon Acetylierung auszulösen. Es scheint von Bedeutung zu sein, zwischen Chromatin-Relaxation, für die p48 entbehrlich ist und Chromatin-Remodeling, das durch p48 eingeleitet wird, zu unterscheiden (Allison und Milner, 2004).
Abbildung 9: Auslösung der Transkription von DDB2 und XPC durch Bindung von p53 an p53 responsive Elemente (p53RE) (modifiziert nach Adimoolam und Ford, 2003).
DDB2 p53RE p53 XPC p53RE p53 p53
2.4.6 Rolle von p53 in der Zellzykluskontrolle
Eine Zelle durchläuft von einer Teilung bis zur nächsten vier Phasen im Zellzyklus (Abbildung 10).
Abbildung 10: Übersicht über die einzelnen Phasen des Zellzyklus (Eisenbrand und Metzler, 1994).
Nach der Zellteilung (M-Phase) geht die Zelle in die so genannte G1-Phase über. Hier wird die Zellmasse verdoppelt und Nukleotide für die nächste Phase, die S-Phase (Synthesephase) synthetisiert. In der S-Phase wird die DNA repliziert bis dann nach einer zweiten Ruhephase (G2-Phase) die Zellteilung stattfindet und so an deren Ende zwei identische Zellen vorliegen. In einer typischen, sich teilenden eukaryotischen Zelle verbleibt die Zelle etwa 12 Stunden in der G1-Phase, sechs bis acht Stunden in der S-Phase, bis sie dann nach einer Ruhephase (G2-Phase) von ca. drei bis sechs Stunden in die etwa 30 Minuten anhaltende Mitose übergeht. Die exakte Länge der einzelnen Phasen variiert allerdings zwischen Zelltyp und Wachstumsbedingungen (Shackelford et al., 1999).
Um zu gewährleisten, dass sich auftretende DNA-Schäden durch fehlerhafte Replikation nicht in Mutationen manifestieren, besitzt eine Zelle mehrere Kontrollpunkte im Zellzyklus. Die Zelle kann hier den Zellzyklus vorübergehend arretieren, um Zeit zur Reparatur der Schäden zu gewährleisten. An der Kontrolle des Zellzyklus ist ein komplexes, interargierendes Netzwerk verschiedener regulatorischer Faktoren involviert. Im Zentrum der Regulation stehen zunächst einmal die CDKs (cyclin dependent kinase) mit ihren regulatorischen Untereinheiten, den Cyclinen. Die Assoziation der Cycline mit den CDKs bildet den ersten Schritt ihrer Aktivierung. Im zweiten Schritt muss der Cyclin-CDK-Komplex durch eine
CAK (CDK activating kinase) phosphoryliert werden. Ein wichtiges Substrat, welches durch CDKs phosphoryliert wird, ist das Tumorsuppressorprotein pRB, das Produkt des Retinoblastom-Gens. Dieses Protein hat eine wichtige Funktion im G1-Kontrollpunkt. Der G1-Kontrollpunkt, auch Restriktionspunkt genannt, ist der am besten untersuchte Kontrollpunkt. Die Rolle von p53 wird hier gut verstanden. p53 wird infolge von auftretenden DNA-Schäden phosphoryliert und kann dann als Transkriptionsfaktor die Expression des CDK-Inhibitors p21 induzieren. In normalen menschlichen Fibroblasten liegt p21 in einem quartären Komplex zusammen mit Cyclin, CDK und PCNA vor. Durch Bindung eines weiteren p21 Proteins, infolge einer verstärkten Expression, wird die Phosphorylierung und somit die Aktivierung des Cyclin-CDK-Komplexes durch die CAK verhindert (Gartel et al., 1996). Dies hat zur Folge, dass pRB nicht mehr phosphoryliert werden kann. In der hypophosphorylierten Form bindet pRB den Transkriptionsfaktor E2F. Erst durch die Phosphoryierung des pRB durch die Cyclin-CDK-Komplexe wird seine Affinität zum E2F reduziert und so der Trankriptionsfaktor freigesetzt. Dieser induziert die Transkription wichtiger Gene, deren Produkte für den Fortgang durch die S-Phase essenziell sind (Bartek und Lukas, 2001) so z.B. Dihydrofolatreduktase, DNA-Polymerase α, Cyclin A und E, Thymidinkinase, sowie E2F selbst (zusammengefasst in Pucci und Giordano, 1999).
Die Induktion von p21 kann allerdings auch in einem S-Phasenarrest resultieren. Durch seine Bindung an PCNA, eine Untereinheit, die von der Polymerase δ benötigt wird, verhindert p21 den Elongationschritt der DNA-Replikation (Waga und Stillman, 1998). Da allerdings PCNA allgemein ein für die Synthese essenzieller Faktor ist, und somit auch für eine DNA-Neusynthese infolge stattfindender Reparatur benötigt wird, wurde die Hemmung von PCNA durch p21 zunächst kontrovers diskutiert. Während Li et al. (1994) keinen inhibierenden Effekt von p21 auf die DNA-Reparatur feststellen konnten, zeigten Studien von Cooper et al. (1999), sowie von Pan et al. (1995) eine Hemmung der Reparatur. Allerdings zeigte sich hier, dass die NER im Gegensatz zu der in der S-Phase stattfindenden DNA-Replikation, weniger sensitiv gegenüber einer Hemmung durch p21 ist.
Wie bereits Rhind und Russell (2000) darstellten scheint die Reihenfolge, dass zunächst die Replikation gestoppt bis anschließend durch die Reparatur der Schäden der Zellzyklus fortgesetzt wird, ein veraltetetes Modell zu sein. Vielmehr scheint der S-Phasenkontrollpunkt eine Modifikation der DNA-Replikation zur Folge zu haben, indem eine rekombinationsabhängige Reparatur aktiviert wird. Infolge von UV-Schäden kann es auch zur sogenannten PPR (post-replication repair) durch eine spezielle Polymerase η, dem Genprodukt von XPV kommen.
3
Fragestellung
Die kanzerogene Eigenschaft von Cadmiumverbindungen ist bekannt, dennoch sind die zu Grunde liegenden Mechanismen noch weitestgehend unklar, zumal das mutagene Potenzial nur schwach ausgeprägt ist. Empfindliche Zielstrukturen für Metallverbindungen sind Zink-bindende Domänen in so genannten Zinkfingerproteinen. Drei Prozent der Gene codieren für Zinkfingerstrukturen. Das Strukturelement ist häufig in Transkriptionsfaktoren beinhaltet. Ein wichtiger Transkriptionsfaktor mit einer Zink-bindenden Struktur ist das Tumorsuppressor-protein p53. Das Protein ist in einer Vielzahl von Mechanismen zum Schutz der Zelle beteiligt, so z.B. in der Zellzykluskontrolle, in der Apoptose, aber auch in der DNA-Reparatur.
Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind Untersuchungen zum Einfluss sowohl löslicher als auch partikulärer Cadmiumverbindung auf die Struktur und die damit verbundene Funktion des Tumorsuppressorproteins p53. Ein möglicher Einfluss auf DNA-Reparaturprozesse sowie auf die Zellzykluskontrolle soll aufgeklärt werden. Da Cadmium in der Umwelt meist in partikulärer Form als CdO vorkommt ist die Abklärung der Frage, ob das Wirkspektrum von löslichem CdCl2 dem des partikulären CdO entspricht von zentraler Bedeutung für die
Risikobewertung von umweltrelevanten Cadmiumverbindungen. Ausgehend von einer Hemmung der Reparatur UV-induzierter und BPDE-induzierter DNA-Schäden, soll in Kombinationsuntersuchungen die Genexpression zweier Zielgene von p53, p48 und XPC, untersucht werden. Die Genprodukte sind in die Schadenserkennung der Nukleotidexzisionsreparatur involviert. Hierzu muss zunächst die Real Time RT-PCR-Methode etabliert werden, mit der die Amplifikation eines Oligonukleotids in Echtzeit verfolgt werden kann und quantitative Aussagen getroffen werden können. Ein weiterer wichtiger Mechanismus zur Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität ist die Zellzykluskontrolle. Treten DNA-Schäden auf, muss der Zellzyklus vorübergehend angehalten werden bis die Schäden repariert sind, damit sie sich nicht infolge stattfindender DNA-Replikation in Mutationen manifestieren können. Das Genprodukt von p21 besitzt hier eine große Bedeutung und wird ebenfalls über p53 reguliert. Somit soll des Weiteren die Genexpression von p21 untersucht werden. Versuche zur Zellzyklusphasenverteilung am Durchflusszytometer in Kombinationsuntersuchungen mit UVC-Strahlung sollen letztendlich zeigen, ob Cadmiumverbindungen in die Zellzykluskontrolle eingreifen.
4
Material und Methoden
Eine Auflistung von allen eingesetzten Chemikalien und Lösungen, deren Konzentrationen sowie eine Liste der verwendeten Geräte ist im Anhang zu finden.
4.1
Zellkultur
Medien, Puffer, Lösungen und alle verwendeten Verbrauchsmaterialien für die Zellkultur wurden sterilfiltriert oder autoklaviert bzw. hitzesterilisiert.
4.1.1 Zellen
In der vorliegenden Arbeit wurde die humane Zelllinie A549 (Lungenadenokarzinomzellen) eingesetzt. Die Zellen werden in einem Einfriermedium bestehend aus 90 % FKS (fötales Kälberserum) und 10 % DMSO bei -196°C in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Kultiviert werden sie in DMEM-Medium mit 10 % FKS, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin bei 37°C, 5 % CO2-Atmosphäre und 100 % Luftfeuchtigkeit. Die Zellen
wachsen als Monolayer mit einer Generationszeit von etwa 24 Stunden. Bei etwas 70 % Konfluenz werden die Zellen abtrypsiniert, in neue Schalen ausgesät und mit frischem Medium versetzt. Die Zellen werden mittels PCR auf Kontamination mit Mykoplasmen getestet.
4.1.2 Koloniebildungsfähigkeit
Mit Hilfe der Koloniebildungsfähigkeit von Zellen kann die Zytotoxizität der zu untersuchenden Verbindung ermittelt werden. Hierfür wird die Zellzahl nach Ablauf der Inkubationszeit bestimmt, eine definierte Anzahl von Zellen weitergesetzt und diese unter normalen Wachstumsbedingungen mehrere Tage kultiviert. Anhand der, im Vergleich zu unbehandelten Zellen, Anzahl gebildeter Kolonien lässt sich feststellen ob und in welchen Konzentrationen das getestete Agens zu Langzeitschäden, die die Reproduktionsfähigkeit der Zellen beeinflussen, führt.
Zur Untersuchung der Koloniebildungsfähigkeit werden jeweils 1 x 106 Zellen in eine
Zellkulturschale (100 x 20 mm) mit 10 ml Kulturmedium ausgestreut. Nach einem Teilungszyklus (24 Stunden) erfolgt die Inkubation mit der zu untersuchenden Verbindung, indem die entsprechende Menge an jeweiliger Stammlösung in das Kulturmedium zupipettiert wird. Nach Ablauf der Inkubationszeit wird das Medium abgenommen und die Schalen werden mit je 5 ml Medium gewaschen. Die Zellen werden abtrypsiniert, die Zellzahl wird bestimmt und jeweils 300 Zellen werden in eine Zellkulturschale (60 x 15 mm) mit 5 ml frischem Kulturmedium überführt. Nach etwa 7 Tagen im Brutschrank sind die Kolonien mit bloßem Auge sichtbar. Das Medium wird abgenommen, die Zellen werden mit PBS gewaschen und mit 2-3 ml 100 %igem Ethanol fixiert. Durch eine Blaufärbung der Kolonien mit Giemsa-Farbstoff können die Kolonien ausgezählt werden.
4.2
Behandlung der Zellen
4.2.1 Inkubation
Für die Inkubation mit dem wasserlöslichen CdCl2 wird eine Stammlösung (10 mM) in
bidestillierten Wasser angesetzt, sterilfiltriert und bei 4°C gelagert. Je nach gewünschter Endkonzentration im Kulturmedium wird nach Bestimmung des Kulturmediumvolumens die entsprechende Menge der Stammlösung zupipettiert.
Die Stammsuspension des schlecht löslichen, partikulären CdO wird unmittelbar vor Versuchsbeginn hergestellt. Hierfür werden die Partikel für 30 min bei 110°C sterilisiert und anschließend die Stammsuspension (0,5 mg/ml) in bidestilliertem autoklaviertem Wasser hergestellt. Um die Teilchen nahezu vollständig und fein verteilt in Suspension zu bekommen, wird die Suspension 15 min im Ultraschallbad behandelt und im Anschluss 5 min auf dem Vibrationsmischer geschüttelt.
4.2.2 UVC-Bestrahlung
Für die Kombinationsuntersuchungen wird als DNA-schädigendes Agens UVC-Strahlung (254 nm) verwendet. Vor der Bestrahlung der Probe wird mit einem Dosimeter eine Dosis-Abstands-Kurve aufgenommen, aus der dann die Bestrahlungsparameter (Entfernung der Lampe zur Zellkulturschale, Zeit der Bestrahlung) entnommen werden.
Zur Bestrahlung der Zellen wird nach Beendigung der Vorinkubation bzw. nach Ablauf der Anwachsphase das Kulturmedium abgenommen und gesammelt. Um Reste des Mediums zu entfernen wird die Zellkulturschale mit PBS gespült. Zur Bestrahlung werden die Schalen ohne Deckel unter die UVC-Lampe gestellt und für 5 sec im Abstand von 30 cm bestrahlt (entsprechend einer Dosis von 5 J/m2). Im Anschluss werden die Zellen mit dem jeweiligen
Ursprungsmedium versetzt und im Brutschrank gelagert.
4.3
Zellzyklusmessung am Durchflusszytometer
In der vorliegenden Arbeit wird die Verteilung der Zellen im Zellzyklus mit einem Durchflusszytometer bestimmt. Daher wird im Folgenden auf den Aufbau und das Messprinzip eingegangen.
Ein Durchflusszytometer ist ein optisches Messsystem, mit dem Fluoreszenz- und Streulichtsignale von Zellen, die sich in Suspension befinden, analysiert werden können.
4.3.1 Geräteaufbau und Messprinzip
Die sich in Suspension befindlichen Zellen werden durch einen Flüssigkeitsstrom in einer konisch zulaufenden Kapillare fokussiert (Abbildung 11). Die Abstände der Zellen voneinander vergrößern sich dadurch auf dem Weg durch die Kapillare, so dass gewährleistet ist, dass die Zellen nacheinander die Messstelle durchlaufen.
Abbildung 11: Aufbau der Messküvette eines Durchflusszytometers und Prinzip der hydrodynamischen Fokussierung (Dickinson, 2000).
Passiert eine Zelle die Messstelle, wird sie von einem Laser bestrahlt, wodurch es zu mehreren Effekten kommt. Zum einen wird das Licht gestreut, wobei es je nach Zellgröße nach vorne (Vorwärtsstreulicht), und je nach Oberflächenbeschaffenheit zur Seite (Seitwärtsstreulicht) gestreut wird. Zum anderen kommt es durch eine vorangehende Färbung von Zellbestandteilen wie z.B. der DNA mittels eines fluoreszierenden Farbstoffes zu einem Fluoreszenzsignal. Die Intensitäten der auftretenden Emissionen werden mit Hilfe eines optischen Detektionssystems quantifiziert (Abbildung 12) (Schmitz und Rothe, 1994).
Abbildung 12: Aufbau des optischen Systems eines Durchflusszytometers (Schmitz und Rothe, 1994).
4.3.2 Fluoreszenzfärbung
Für die Zellzyklusmessungen wird der DNA-Gehalt einer Zelle mittels DAPI (4’, 6’- Diamidino-2-phenylindol), einem spezifischen DNA-Farbstoff, bestimmt. Hierfür werden die Zellen nach Ablauf der Inkubationszeit abtrypsiniert, gezählt und 1 x 106 Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen überführt. Nach Zentrifugation bei 1200 rpm wird der Überstand entfernt und das Zellpellet in 1 ml PBS aufgenommen. Durch Zugabe von 3 ml 100 %igem Ethanol (-20°C) unter Schütteln auf dem Vibrationsmischer werden die Zellen fixiert und bis zur Fluoreszenzfärbung bei -20°C aufbewahrt.
Am Tag vor der Messung wird erneut bei 1200 rpm abzentrifugiert, der Überstand abgenommen und das Zellpellet in 1 ml DAPI-Fertiglösung durch mischen suspendiert. Bis zur Messung am Durchflusszytometer werden die Proben bei 4°C aufbewahrt.
4.3.3 Zellzyklusmessung
Die Intensität des erhaltenen Fluoreszenzsignals ist abhängig vom DNA-Gehalt der Zelle. Dieser ist wiederum abhängig davon, in welcher Phase des Zellzyklus sich die Zelle befindet. Während der G1-Phase besitzt die Zelle einen einfachen DNA-Gehalt. Im Verlauf der S-Phase kommt es auf Grund der Replikation der DNA zu einem Anstieg des DNA-Gehalts, bis am Ende der doppelte Gehalt vorliegt. Die Zelle besitzt also während der G2- und M-Phase einen doppelten DNA-Gehalt, bis sie sich teilt und somit am Ende der M-Phase zwei Zellen mit jeweils einfachem DNA-Gehalt entstehen (Abbildung 13).
Abbildung 13: Änderung des DNA-Gehalts während des Zellzyklusses (Dickinson, 2000).
Für die Auswertung der durchflusszyotometrischen Analyse werden die Intensitätssignale jeder Zelle, die dem DNA-Gehalt proportional sind, aufsummiert, wodurch eine Häufigkeitsverteilung erhalten wird. Mittels eines Algorithmus ermittelt die Software schließlich die einzelnen Flächen des Histogramms, die den jeweiligen Phasen des Zellzyklusses entsprechen (Abbildung 14).
4.4
Bestimmung des p53 Proteingehaltes
Zur Bestimmung des p53 Proteingehaltes werden die Proteine aus den Zellen isoliert. Nach Ermittlung der Proteinkonzentration nach Bradford (Bradford, 1976) wird ein Aliquot des Zellextraktes denaturiert, auf ein SDS-Polyacrylamidgel (12 %) aufgetragen und die Proteine bei einer Spannung von 100 V aufgetrennt. Im Anschluss erfolgt der Transfer der Proteine auf eine PVDF-Membran. Auf jedem Gel wird ein Molekulargewichtsmarker mitgeführt der gleichzeitig auch als Kontrolle des erfolgten Proteintransfers nach dem Westernblot dient.
4.4.1 Zelllyse
Zur Zelllyse werden 5 Millionen Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen überführt und bei 1200 rpm 3 min abzentrifugiert. Das Pellet wird mit 100 µl RIPA-Puffer versetzt, in ein Eppendorfreaktionsgefäß überführt und im Ultraschall sonifiziert (5 x pulse). Nach Abzentrifugieren der Zelltrümmer (15.000 rpm, 15 min) kann der Proteingehalt im Überstand bestimmt werden.
4.4.2 Proteinbestimmung nach Bradford
Zur Proteinbestimmung nach Bradford werden jeweils 2 µl Proteinextrakt mit 98 µl Wasser in einer 24-Mikrotiterlochplatte vermischt (Dreifachbestimmung) und dazu 900 µl Bradfordlösung (Bio-Rad Reagenz) gegeben. Fünf Minuten nach Reagenzzugabe wird die Absorption bei 595 nm in einem Mikrotiterplattenlesegerät (TECAN SpektraFluor) bestimmt. Durch die Bindung des in der Bradfordlösung enthaltenen Farbstoffs Coomasie Brillantblau G 250 an Proteine verschiebt sich in saurer Lösung die Absorption von 465 nm nach 595 nm. Zur Berechnung der Proteinkonzentration wird auf jeder Lochplatte eine Kalibriergerade mit Rinderserumalbumin im Bereich von 1- 15 µg/ml mitgeführt.
4.4.3 Elektrophorese und Westernblot
20 µg Gesamtprotein wird mit 5 µl Lämmli-Ladepuffer (4x) versetzt, mit H2O auf 20 µl
aufgefüllt und bei 95°C für 5 min denaturiert. Im Anschluss werden die Proben auf ein denaturierendes Popyacylamidgel (5 %iges Sammelgel, 12 %iges Trenngel) aufgetragen. Die
Elektrophorese erfolgt bei 80 V im Sammelgel und zur Trennung der Proteine im Trenngel bei 100 V. Als Molekulargewichtsmarker wird auf jedem Gel ein Rainbow-Molekulargewichtsmarker mitgeführt, anhand dessen Farben die 53 kD-Bande des p53-Proteins zugeordnet werden kann. Zur Übertragung der Proteine auf eine PVDF-Membran werden die Proteine nach erfolgter Trennung in einer Semidry-Blot-Apparatur bei 0,8 A/cm2
Membran für 1 h auf eine PVDF-Membran geblottet.
4.4.4 Detektion durch Chemilumineszenz
Um aktive Bindungsstellen der Membran zu blockieren, wird die Membran nach dem Westernblot für 30 min in Magermilchpulver (5 % in PBS) geschwenkt. Anschließend wird die Membran für eine Stunde bei Raumtemperatur (oder bei 4°C über Nacht) mit dem Anti-p53-Antikörper DO-7 (Mausserum) inkubiert. Hierzu wird die Membran mit einer Lösung bestehend aus 3 µl des Antikörpers und 3 ml Blockierlösung luftblasenfrei eingeschweißt. Im Anschluss erfolgt nach jeweils dreiminütigem, viermaligem Waschen der Membran in PBS (0,3 % Tween 20) die Inkubation mit dem an Peroxidase gekoppelten Anti-Maus IgG-Antikörper. Dazu werden 1,2 µl des Antikörpers in 3 ml Blockierlösung gegeben und dies zusammen mit der Memran eingeschweißt. Nach Ablauf von einer Stunde erfolgt nach vier Waschschritten mit PBS (0,3 % Tween 20) für jeweils drei Minuten die Detektion mittels Chemilumineszenz. Hierzu wird die Membran für eine Minute mit etwa 1 ml der ECL-Lösung von Amersham (1:1 Mischung) inkubiert und im Anschluss die Reaktion der Peroxidase mit dem Substrat anhand der Chemilumineszenz detektiert.
4.4.5 Immunpräzipitation zur Konformationsbestimmung von p53
Um zwischen Wildtyp- und „mutanter“-Konformation von p53 unterscheiden zu können, wird eine Immunopräzipitation mit konformationsspezifischen Antikörpern durchgeführt.
4.4.5.1 Zelllyse und Vorklärung
Die Zellen werden mit 500 µl Immunpräzipitationspuffer (4°C) lysiert, mittels Zellschaber von der Zellkulturschale abgelöst und in 2,2 ml Eppendorfreaktionsgefäße überführt. Alle nachfolgenden Arbeiten werden auf Eis durchgeführt. Die Zelltrümmer werden bei 15.000 g für 5 min abzentrifugiert und der Überstand in neue Reaktionsgefäße überführt. Um unspezifische Bindungsreaktionen zu minimieren werden die Proben vorgeklärt. Hierzu wird
pro Ansatz 1 µg Pab 416 zugegeben, ein Antikörper gegen das nicht in Lösung befindliche SV40T-Antigen. Um das gebildete Präzipitat aus der Lösung zu entfernen, wird 20 µl Protein A/G-Agarose-Lösung zugegeben und nach 45 min im Rotator bei 10.000 g für 1 min abzentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen und der Proteingehalt nach Bradford (siehe Kapitel 4.4.2) bestimmt.
4.4.5.2 Immunopräzipitation
Abbildung 15: Schematische Darstellung einer Immunpräzipitation.
Für die Unterscheidung zwischen Wildtyp- und „mutanter“-p53-Konformation wird der Zellextrakt nach Proteinbestimmung durch Verdünnung mit Immunpräzipitationspuffer auf gleiche Proteinmenge und Volumina eingestellt. Jede Probe wird auf verschiedene Ansätze aufgeteilt und anschließend die Immunpräzipitation mit konformationsspezifischen Antikörpern durchgeführt. Hiezu werden die entsprechenden Ansätze jeweils mit 1 µg monoklonalem Antikörper (PAb 1620 = Wildtyp, PAb 240 = „mutante“ Konformation) und 15 µl Protein A/G-Agarose-Lösung versetzt. Nach 18 h im Rotor wird das gebildete Präzipitat bei 10.000 g für 1 min abzentrifugiert (Abbildung 15). Das Pellet wird dreimal mit eiskaltem Immunpräzipitationspuffer und zuletzt einmal mit eiskaltem PBS gewaschen. Der Rückstand bestehend aus einem p53-Protein-anti-p53-Antikörper und Protein A/G-Agarose-Komplex wird mit Lämmli-Ladepuffer versetzt und für 10 min bei 95 °C aufgekocht, wodurch der Antikörper denaturiert, das p53-Protein in Lösung geht und nach erfolgter Elektrophorese mittels Westernblot und Chemilumineszensdetektion quantifiziert wird. Hierzu wird wie unter Kapitel 4.4.3 beschrieben vorgegangen. Da der für die Immunpräzipitation verwendete, konformationsspezifische Antikörper aus der Maus stammt, wird als anti-p53-Antikörper für den Westernblot ein Antikörper einer anderen Spezies (CM1 (Kaninchenserum)) eingesetzt, da sonst ein gegen Maus IgG gerichteter sekundärer Antikörper, zusätzlich die schwere Kette
Zugabe von Antikörper Zugabe von Protein A/G gekoppelt an Agarose
Zentrifugation Überstand
des denaturierten, zur konformationsspezifischen Fällung verwendeten Antikörpers erkennen würde und dies in einer Bande in Höhe des p53-Proteins resultieren würde. Als sekundärer Antikörper wird somit ein mit Peroxidase gekoppelter anti-Kaninchen IgG-Antikörper eingesetzt.
4.5
Bestimmung der relativen Genexpression
Um Unterschiede im Expressionslevel bestimmter Gene nach Inkubation mit einer Testverbindung zu untersuchen wird eine RT-PCR durchgeführt. Hierzu wird die Gesamt-RNA aus den Zellen isoliert, in cDNA umgeschrieben und die Expression des zu untersuchenden Gens mittels spezifischen Primern mit Hilfe der PCR untersucht.
4.5.1 Probenvorbereitung
4.5.1.1 RNA-Isolierung
Die Isolation der RNA erfolgt mittels Säulenisolationskit von BD Bioscience. Das Prinzip beruht auf einem Silikat-Filter, der Nukleinsäuren bindet und somit die RNA von Proteinen und Zellbestandteilen abtrennt. Nach DNase-Verdau und verschiedenen Waschschritten kann die RNA von der Säule eluiert werden.
Es werden jeweils 1 x 106 Zellen in eine Zellkulturschale (100 x 20 mm) mit 10 ml Kulturmedium ausgestreut. Nach einem Teilungszyklus (24 Stunden) erfolgt die Inkubation mit der zu untersuchenden Verbindung. Nach Ablauf der Inkubationszeit werden die Zellen abtrypsiniert, die Zellzahl bestimmt und 2 x 106 Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen überführt, bei 1200 rpm abzentrifugiert und der Überstand abgenommen. Das Zellpellet wird in 1 ml PBS resuspendiert, in ein 1,5 ml Eppendorfreaktionsgefäß überführt und erneut bei 1200 rpm abzentrifugiert. Nach Abnehmen des Überstandes wird das Pellet mit 350 µl Lysepuffer (R1-Puffer) und 3,5 µl Mercaptoethanol versetzt und durch fünfmaliges Aufziehen durch eine Kanüle (∅ 0,4 mm) geschert. Im Anschluss wird das gleiche Volumen 70 %iges Ethanol zugegeben, gemischt, die gesamte Lösung auf ein Reaktionsgefäß mit Filtereinsatz überführt und bei 9000 g für 30 sec abzentrifugiert. Der Durchlauf wird verworfen und die Säule mit 350 µl MDB-Puffer (membrane desalting buffer) versetzt. Nach Abzentrifugieren bei 11 000 rpm für 1 min wird der Durchlauf erneut verworfen und ein DNase-Verdau auf der Säule durchgeführt. Hierzu werden 95 µl DNase Reaktionsgemisch (10 µl DNase + 90 µl
DNase Reaktionspuffer) 15 min bei Raumtemperatur auf die Säule gegeben. Daraufhin werden zum Abstoppen 200 µl RA2-Puffer auf den Filter gegeben und 30 sec bei 9.000 rpm zentrifugiert. Die Säule wird im Anschluss auf ein neues 2 ml Reaktionsgefäß überführt und mit 600 µl RA3-Puffer gewaschen. Nach Zentrifugieren für 30 sec bei 9.000 rpm wird der Durchlauf verworfen und die Säule ein zweites Mal mit RA3-Puffer (250 µl) gewaschen. Nach Zentrifugation für 2 min bei 13.000 rpm wird die RNA durch zweimaliges zentrifugieren mit je 50 µl RNase freiem Wasser bei 13.000 rpm von der Säule eluiert. Die Lagerung erfolgt bei -80°C.
4.5.1.2 Photometrische Konzentrationsbestimmung
Zur Konzentrationsbestimmung der isolierten RNA wird zunächst eine 1:50 Verdünnung hergestellt. Hierfür werden 98 µl Wasser mit 2 µl der RNA-Lösung versetzt und im Anschluss die Extinktion der verdünnten Lösung bei 260 nm bestimmt.
1 OD260nm = 40 µg RNA
4.5.1.3 RNA Gelelektrophorese
Zur Überprüfung der Integrität der isolierten RNA wird eine denaturierende RNA Gelelektrophorese durchgeführt.
Hierzu wird ein 1,2 %iges formaldehydhaltiges Agarosegel hergestellt. Es werden 1,2 g Agarose mit 83 µl Wasser und 5 ml 20 x MOPS-Puffer aufgekocht und nach Abkühlung auf ca. 65°C mit 12 ml Formaldehydlösung (37 %) versetzt.
1 µg der isolierten Gesamt-RNA wird mit FDP (Formamid-Denaturierungs-Puffer) auf 15 µl Gesamtvolumen gebracht und 10 min bei 65°C auf dem Heizblock denaturiert, so dass die RNA einzelsträngig vorliegt. Nach Zugabe von ca. 1,5 µl Lämmli-Ladepuffer erfolgt die Eletrophorese mit MOPS (1x) bei 60 V für ca. 2 h. Zur Detektion wird das Gel bei 520 nm abfotografiert.
4.5.1.4 cDNA-Synthese
Die Synthese der cDNA erfolgt mittels cDNA-Synthesekit von Bio-Rad, welches auf einer modifizierten MMLV reversen Transkriptase mit RNAse H+-Aktivität sowie einem Gemisch aus Oligo(dT)- und random hexamer Primern basiert (Abbildung 16).
Abbildung 16: Schema der cDNA-Synthese.
Der Reaktionsansatz wird bei 4°C im Eisblock nach folgendem Pipettierschema pipettiert: 15 – x µl RNase freies Wasser
x µl (entsprechend 1 µg) RNA-Probe 4 µl 5 x iScript Reaktiongemisch 1 µl iScript Reverse Transkriptase
Dieser Ansatz wird bei 25°C für 5 min inkubiert, damit sich die Primer an die einzelsträngige RNA anlagern. Im Anschluss erfolgt bei 42°C die reverse Transkrition für 30 min. Durch eine Erhitzung auf 85°C für 5 min wird die Reaktion letztendlich beendet und die synthetisierte cDNA kann für die PCR eingesetzt werden.
4.5.2 Quantitative Real Time PCR
4.5.2.1 Prinzip
Die PCR (Polymerase Chain Reaction) wurde 1985 von K. B. Mullis entwickelt und dient zur in vitro Vervielfältigung von Nukleinsäuren. Das Reaktionsprinzip ist die enzymatische Amplifizierung eines DNA-Abschnittes zwischen zwei Oligonukleotidprimern, die gegenläufig an komplementären DNA-Strängen gebunden sind und den zu amplifizierenden DNA-Abschnitt begrenzen. Die Reaktion basiert auf einer zyklischen Wiederholung von drei Schritten: Denaturierung, Annealing und Elongation (Abbildung 17).
5´---aaaaa-3´ mRNA Oligo-dT 5´---aaaaa-3´ ttttt-5´ Reverse Transkriptase 5´---aaaaa-3´ cDNA 3´---ttttt-5´
Abbildung 17: Schema einer Polymerasekettenkeaktion (PCR).
Während der Denaturierungsphase wird der DNA-Doppelstrang aufgrund der Aufspaltung der Wasserstoffbrücken durch hohe Temperatur zwischen den gegenüberliegenden Basenpaaren aufgetrennt, so dass sich im nächsten Schritt, der Annealingsphase, die Primer an komplementäre Sequenzen anlagern können. Im letzten Schritt kommt es bei 72°C, dem Temperaturoptimum der Polymerase, zur Elongation d.h. zur Auffüllung der Stränge mit Nukleotiden. In jedem Zyklus kommt es so zu einer Verdopplung der eingesetzten DNA-Menge. Diese exponentielle Zunahme lässt sich mit folgender Gleichung beschreiben:
5´---tgcaccaccaactgcttagc---3´ 3´---acgtggtggttgacgaatcg---5´ Denaturierung 5´---tgcaccaccaactgcttagc---3´ + 3´---acgtggtggttgacgaatcg---5´ Annealing 5´---tgcaccaccaactgcttagc---3´ cgaatcg-5´ + 5´-tgcacca x 3´---acgtggtggttgacgaatcg---5´ Elongation 5´---tgcaccaccaactgcttagc---3´ 3´---acgtggtggttgacgaatcg-5´ X + X 5´-tgcaccaccaactgcttagc---3´ 3´---acgtggtggttgacgaatcg---5´
N = N0 x (1 + E)n
Aufgrund einer Konkurrenzreaktion zwischen Strang-Reannealing und Primer-Annealing bei höheren Zyklenzahlen, sowie aufgrund einer Inaktivierung der Polymerase durch thermische Belastung sowie durch Akkumulation von Pyrophosphat, das sich während der Reaktion bildet, kommt es bei fortlaufender Reaktion zu einer Plateaubildung (Köhler, 1995; Mülhardt, 2003). Für eine Quantifizierung ist es entscheidend, den Zyklenbereich festzulegen, in dem ein linearer Zusammenhang zwischen Ampifikatbildung und Zyklenzahl besteht. Der Vorteil der Real Time PCR gegenüber der herkömmlichen PCR ist die Möglichkeit, den gesamten Amplifikationsvorgang online zu verfolgen (Abbildung 18).
Abbildung 18: Vergleich densitometrische Auswertung konventioneller PCR (A) mit online-Auswertung bei der Real Time PCR (B).
Hierzu wurden in den letzten Jahren verschiedene Methoden entwickelt, die auf dem Einsatz unterschiedlicher Fluorophore beruhen. Gemessen wird dabei die direkt oder indirekt mit der DNA-Amplifikation verbundene Fluoreszenz, während bei der konventionellen PCR die Proben nach einer definierten Zyklenzahl densitometrisch nach erfolgter Elektrophorese vermessen werden (Bustin, 2000). In der hier vorliegenden Arbeit wird die DNA-Amplifikation durch den Einsatz des Fluoreszensfarbstoff SYBR Green ermittelt. Hierbei handelt es sich um einen Fluoreszenzfarbstoff, der unspezifisch in doppelsträngige DNA
A
B
N0 – Anfangsmenge der DNA
N – Menge an Amplifikat nach n Zyklen n – Anzahl der Zyklen