Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) an der Universität Konstanz, Fachbereich Biolologie
vorgelegt von Stefan Schönert
Konstanz, im Februar 2004
Danke Michael
Diese Arbeit ist meinem Betreuer HD Dr. Dr. Michael K. Dahl in liebevollem Gedenken gewidmet.
Danksagung
Ich danke Professor Dr. Wolfgang Hillen und Professor Dr. Winfried Boos für die freundliche Aufnahme an ihren Lehrstühlen und die Ermöglichung dieser Arbeit.
Professor Dr. Winfried Boos und Professor Dr. Dieter Jahn danke ich dafür, daß sie sich als Gutachter dieser Arbeit zur Verfügung gestellt haben.
Dr. Alfons Rösch möchte ich dafür danken, daß ich meine Hoffnung auf eine nicht zu bürokratische Welt noch immer nicht verloren habe.
Nicht unerwähnt lassen möchte ich die enorme Arbeitserleichterung durch Waldrun Cimander, Inge Ingram, Heidemarie Prell, Kirsten Oliva, Uli Dahl, Renate Dippel, Erika Oberer - Bley und Gabriele Witz beim Ausfüllen von Formularen, Spülen von Reagenzgläsern, Stecken von Spitzenkästen oder ähnliche Gräueltaten.
Für die Erklärung von Apparaten oder Methoden, Hilfe bei Computer - Problemen und ihre stete Diskussionsbereitschaft möchte ich mich bei Steffi Bachem, Johanna Bogdanski - Urbaniak, Thomas Buder, Norbert Fuchsbauer, Holger Ludwig, Gerald Seidel, Peter Schubert, Oliver Wittenburg, Alexander Böhm und Christoph Mayer bedanken.
Für das Durchlesen dieser Arbeit auf Rechtschreibfehler und Verständnis möchte ich mich bei Tina Jaeger, Alexander Böhm und Gabriele Witz bedanken. Ich hoffe, die Werbekampagne des Landes Baden - Württemberg trifft nicht zu 100 Prozent zu.
Thomas Buder, Lili Rosana - Ani Mesak, Sabine Kastner, Annette Kamionka, Sabine Seitz, Stefan Lyer, Angelika Jahn, Holger Krafft, Magnus Bach, Markus Hinderhofer, Tobias Busch, Eva - Anne Feuerbaum, Gabriele Witz und Wilko Mattern möchte ich dafür danken, daß es einfach toll war, einer der Dahlis zu sein.
Harald "Harry" Nothaft möchte ich für alles, aber vorallem dafür danken, daß er mir während unseres gemeinsamen Studiums zu einem guten Freund geworden ist.
Letztlich möchte ich mich noch bei meinem Entchen dafür bedanken, daß ihr der Weg nach Konstanz nie zu weit war. Manchmal ist Leben einfach zu schön, um es biologisch erklären zu können.
1 Inhaltsverzeichnis
Danksagung...IV 1 Inhaltsverzeichnis ...V 2 Zusammenfassung ...X
3 Einleitung ... 11
3.1 Bacillus subtilis (111) ... 11
3.2 Maltose, Maltodextrine und Isomaltose ... 13
3.3 ABC (ATP binding cassette) - Transporter ... 14
3.4 Die CcpA vermittelte Kohlenstoff - Katabolitrepression ... 16
3.5 Maltose - Aufnahme in Bacillus subtilis... 19
3.6 ABC - Transporter in Bacillus subtilis... 22
3.7 Ziele dieser Arbeit... 23
4 Ergebnisse... 25
4.1 Charakterisierung des Maltodextrin - Bindeproteins MalE ... 25
4.1.1 Reinigung von His6xMalE ... 25
4.1.2 Untersuchungen der Sekundärstruktur von His6xMalE ... 26
4.1.3 Analyse von His6xMalE mittels Fluorimetrie... 27
4.1.4 Analyse von His6xMalE mittels BIAcoreX ... 28
4.1.5 Untersuchungen zum Oligomerisierungsverhalten von His6xMalE ... 33
4.1.5.1 Größenfraktionierung von His6xMalE... 33
4.1.5.2 Analyse von Iodoacetamid behandeltem His6xMalE... 34
4.2 Maltose - und Maltodextrin - Transport ... 35
4.2.1 Maltose - Transport ... 36
4.2.2 Maltotriose - Transport ... 37
4.2.3 Reinheitsgrad der Maltotriose... 38
4.2.4 Maltotriose - Titrationen... 39
4.2.5 Maltose - Titration... 40
4.2.6 Bestimmung der Maltose - und Maltotriose - Transport - Affinitäten.... 41
4.3 Wachstums - Analysen ... 43
4.3.1 Wachstums - Analysen auf Festmedien ... 43
4.3.2 Wachstums - Analysen in Flüssigmedien ... 45
4.3.2.1 Wachstum auf Maltose... 46
4.3.2.2 Wachstum auf Maltodextrinen ... 47
4.4 Das Maltodextrin - Operon... 49
4.4.1 Herstellung von Digoxigenin markierten RNA - Sonden ... 49
4.4.2 Analyse der Organisation des Gen - Clusters malR - pgcM... 51
4.4.3 Transkriptionelle Regulation des Maltodextrin - Operons ... 52
4.5 Promotor - Aktivitäten im Maltodextrin - Operon... 53
4.5.1 Induktionsversuche mit verschiedenen α - 1,4 - Glukosiden ... 56
4.5.2 Maltodextrin - Operon Promotor - Aktivitäten: Der Einfluß von MalR ... 57
4.5.3 Maltodextrin - Operon Promotor - Aktivitäten: Der Einfluß des Maltose - und Maltodextrin - Transports ... 60
4.6 Der Regulator des Maltodextrin - Operons: MalR (YvdE) ... 63
4.6.1 Synthese von MalR1750 in Escherichia coli... 63
4.6.2 Synthese von MalR1750 in Bacillus subtilis... 64
4.6.3 Komplementation von MalR minus Stämmen... 66
4.7 Die Maltose induzierbare α - Glukosidase MalL ... 69
4.8 Stammkonstruktionen ... 73
4.8.1 MalL - Aktivität in diversen Mutanten des Maltodextrinsystems... 77
4.8.2 Die extrazelluläre α - Amylase AmyE ... 80
4.9 Plasmidkonstruktionen... 81
5 Diskussion ... 85
5.1 Das Maltodextrin - Bindeprotein MalE ... 85
5.1.1 Reinigung und Strukturanalyse... 85
5.1.2 Untersuchung zur Substratspezifität von MalE ... 86
5.2 Transport - Untersuchungen... 88
5.2.1 Maltose - Transport ... 88
5.2.2 Maltotriose - Transport ... 91
5.3 Wachstum auf Maltose und Maltodextrinen... 93
5.4 Transkriptionelle Regulation ... 95
5.4.1 Northern Blot Analysen... 95
5.4.2 Identifizierung von Promotor - tragenden Fragmenten ... 97
5.4.3 Maltodextrin - Operon Promotor - Aktivitäten in malR Stämmen ... 98
5.4.4 Komplementation des MalR minus Phänotyps ... 99
5.4.5 Der Induktor des Maltodextrin - Operons... 100
5.5 Maltose induzierbare Enzymaktivitäten ... 102
5.6 Stärke - und Glykogen - Verwertung durch Bacillus subtilis... 103
6 Material und Methoden ... 105
6.1 Chemikalien... 105
6.2 Material, Geräte und Zubehör... 107
6.3 Enzyme, Antikörper und Proteine ... 108
6.4 Oligonukleotide... 108
6.5 Kits... 111
6.6 Bakterien und Plasmide... 111
6.6.1 Bacillus subtilis... 111
6.6.2 Escherichia coli... 114
6.6.3 Plasmide... 114
6.7 Medien, Lösungen und Puffer... 120
6.7.1 Bakteriennährmedien und fakultative Zusätze... 120
6.7.2 Antibiotika... 121
6.7.3 Puffer und Lösungen ... 121
6.7.3.1 Puffer für die DNA - Gelelektrophorese... 121
6.7.3.2 Puffer für die Protein - Gelelektrophorese ... 122
6.7.3.3 Allgemeine Puffer und Lösungen ... 123
6.7.3.4 Enzymlösungen... 124
6.7.3.5 Zuckerlösungen... 124
6.7.3.6 Sonstiges... 124
6.7.4 Größenstandards für die Gelelektrophorese... 124
6.7.4.1 Größenstandards für die DNA - Gelelektrophorese... 125
6.7.4.2 Größenstandards für die RNA - Gelelektrophorese... 125
6.7.4.3 Größenstandards für die Protein - Gelelektrophorese... 125
6.8 Methoden... 126
6.8.1 Allgemeine Methoden... 126
6.8.2 Anzucht von Bakterien... 126
6.8.3 Herstellung kompetenter Bacillus subtilis Zellen (84) ... 126
6.8.4 Transformation von Bacillus subtilis (84) ... 127
6.8.5 Nachweis der chromosomalen Integration von DNA - Konstrukten ... 128
6.8.5.1 Nachweis mittels PCR... 128
6.8.5.2 Nachweis in amyE mittels Stärkeplatten (in Anlehnung an Friedrich Stromeyer 1814 (182)) ... 128
6.8.5.3 Nachweis in bglC mittels Celluloseplatten (178)... 128
6.8.6 Dauerkulturen von Bacillus subtilis... 129
6.8.7 Herstellung von Gesamtprotein - Zellextrakten aus Bacillus subtilis.. 129
6.8.8 Herstellung von löslichen Zellextrakten aus Bacillus subtilis... 130
6.8.8.1 Zellextrakte für Western Blots und SDS - Page... 130
6.8.8.2 Zellextrakte für enzymatische Aktivitätsbestimmungen (in Anlehnung an Jeffrey H. Miller (94))... 131
6.8.9 Bestimmung von α - Glukosidase - oder β - Galaktosidase - Aktivität (in Anlehnung an Jeffrey H. Miller (94)) ... 131
6.8.10 Restriktion von DNA ... 132
6.8.11 Polymerasekettenreaktion (PCR) (98)... 133
6.8.12 Präparation chromosomaler DNA aus Bacillus subtilis... 134
6.8.13 Reinigung von Proteinen ... 135
6.8.13.1 Heterologe Gen - Expression in Escherichia coli... 135
6.8.13.2 Homologe Gen - Expression in Bacillus subtilis... 135
6.8.13.3 Säulen - Chromatographie ... 136
6.8.14 Schutz von Thiolgruppen nach Habeeb (60) ... 139
6.8.15 Western Blot Analyse ... 140
6.8.15.1 Transfer von Proteinen (113)... 140
6.8.15.2 Spezifische Detektion Proteinen (112, 113) ... 140
6.8.15.3 Lösungen für Western Blots (112, 113)... 141
6.8.16 Northern Blot Analyse (123, 170) ... 141
6.8.16.1 Herstellen von Digoxigenin markierten RNA - Sonden... 142
6.8.16.2 RNA - Gelelektrophorese ... 143
6.8.16.3 Transfer von RNA... 144
6.8.16.4 Spezifische Detektion von mRNA - Fragmenten ... 145
6.8.16.5 Lösungen für Northern Blots... 146
6.8.17 Transportassays ... 147
6.8.17.1 Zucker - Aufnahmemessungen ... 147
6.8.17.2 Puffer für Transportassays ... 148
6.8.17.3 Kompetitionsexperimente ... 148
6.8.17.4 Transport - Affinitätsbestimmungen... 148
6.8.18 Dünnschicht - Chromatographie (DC) ... 150
6.8.19 Fluorimetrie... 150
6.8.20 Circular Dichroismus ... 151
6.8.21 Oberflächen - Plasmon - Resonanz Spektroskopie (BIAcoreX)... 151
6.8.21.1 Lösungen für die BIAcoreX... 152
6.8.22 Computer - Programme... 152
7 Literaturverzeichnis... 153
8 Abkürzungsverzeichnis ... 161
9 Anhang ... 162
9.1 Nachweis der Substrat - His6xMalE Interaktion (Vergleich: Theorie und Praxis) ... 162
9.2 Der Integrationsort bglC... 163
9.3 Erstellung von para - bzw. ortho - Nitrophenol - Eichgeraden ... 165
9.3.1 Absorption von ortho - Nitrophenol bei 420 nm ... 166
9.3.2 Absorption von para - Nitrophenol bei 420 nm ... 166
9.4 Charakterisierung unterschiedlicher Bindeproteine ... 167
9.5 Vergleich von CD - Spektren ... 169
2 Zusammenfassung
In seinem natürlichen Habitat findet das Gram - positive Bodenbakterium Bacillus subtilis hauptsächlich polymere Zuckerformen als Kohlenstoffquelle vor, die aus den von anderen Organismen synthetisierten Speicherstoffen, z.B. Stärke und Glykogen, stammen. Jedoch müssen diese Polysaccharide zuerst extrazellulär zu Maltose und Maltodextrinen hydrolysiert werden, bevor sie aufgenommen werden können.
Im Gegensatz zu der sehr gut untersuchten Maltose - und Maltodextrin - Aufnahme in Escherichia coli ist die Aufnahme dieser Substrate in B. subtilis noch weitgehend unverstanden. In dieser Arbeit wird eindeutig gezeigt, daß Maltose über einen spezifischen, zu der Familie der Phosphotransferasesysteme gehörenden Transporter aufgenommen wird. Maltodextrine dagegen werden über einen eigenen, den ABC - Transportern zugehörigen Importer aufgenommen. Beide Systeme sind in separaten Operons organisiert. Bezüglich ihrer Substrate sind sie etwa gleich affin (niedriger µmolarer Bereich), jedoch wird Maltose erheblich schneller transportiert.
Damit unterscheidet sich die Aufnahme dieser Substrate von der in E. coli, das nur einen Transporter für beide Substrate besitzt.
Durch in vitro und in vivo Studien konnte gezeigt werden, daß der Maltodextrin - ABC - Transporter aus dem spezifischen Bindeprotein MalE, mit hoher Affinität für Maltodextrine und niedriger Affinität für Maltose, den Transmembranproteinen MalF und MalG sowie der potentiellen ATPase MsmX besteht. Anders als in E. coli scheinen sich in B. subtilis mehrere ABC - Transporter mit unterschiedlicher Substratspezifität eine ATPase zu teilen, worüber eine gezielte Regulation mehrerer unterschiedlicher Aufnahme - und Verwertungssysteme denkbar ist. MsmX, dessen Gen in einem monocistronischen Operon kodiert ist, könnte diese pleiotrope ATPase sein.
Das Maltodextrin - Operon, in dem malE, malF und malG lokalisiert sind, wird von mindestens zwei Promotoren aus transkribiert. Es unterliegt der Kontrolle von MalR, das trotz seiner Zugehörigkeit zu der LacI / GalR Repressoren Familie ein Aktivator ist und scheint einem bisher unbekannten Mechanismus der Kohlenstoff - Katabolitrepression zu unterliegen.
3 Einleitung
3.1 Bacillus subtilis (111)
Der heterogene Genus Bacillus wird in die Gruppe der niedrig GC - haltigen, Gram - positiven Bakterien eingeordnet, wobei der GC - Gehalt, der über 60 bis heute beschriebenen Spezies von 33 % GC-Gehalt bei Bacillus anthracis bis 69 % bei Bacillus thermocatenulatus variiert (111). Es handelt sich um endosporenbildende, primär aerob lebende Bakterien (111), die in der Biotechnologie zur Produktion von extrazellulären Enzymen (49), Insektiziden und Peptidantibiotika (106), aber auch zur biologischen Kontrolle pilzlicher Pathogene auf Pflanzen eingesetzt werden (10-12, 24, 70).
A B
Abbildung 3.1: Bacillus subtilis. A: Elektronenmikroskopische Aufnahme von B. subtilis Zellen (99);
B: B. subtilis Mutterzelle mit Endospore (129).
Aufgrund der hohen Heterogenität wurde der Genus Bacillus in sechs Untergruppen eingeteilt, die mehr dem in der Bakteriensystematik üblichen Genusbegriff (10 - 12 % Differenz im GC - Gehalt) entsprechen (111). Hierbei wurde B. subtilis in die Gruppe II eingeordnet (111). Dieser Gruppe gehören Bacilli an, die aus einer Vielzahl von Zuckern Säuren bilden und auch anaerob, insbesondere mit Nitrat als Elektronenakzeptor, wachsen können (100, 101). Die Mitglieder der Gruppe II können Sporen bilden, welche eine ellipsoide Form aufweisen und die Mutterzelle nicht anschwellen lassen (siehe Abbildung 3.1 B; (45, 46, 68).
Pathogene Angehörige des Genus Bacillus sind z.B. der Milzbranderreger Bacillus anthracis (95, 162) sowie Bacillus cereus, der für viele Lebensmittelvergiftungen die Ursache ist (160). Die meisten Vertreter zählen jedoch zu den apathogenen Bakterien. Sie sind einfach zu kultivieren und sekretieren Proteine und Metabolite
(61, 88, 110). Daher können sie neben ihrer industriellen Nutzbarkeit auch in der Nahrungsmittelproduktion eingesetzt werden. Bedingt durch ihre Nutzung wurden verschiedene Spezies dieser Gattung intensiver untersucht. Einer der dabei am besten erforschten Arten ist B. subtilis (111).
B. subtilis selbst zeichnet sich durch Amylasesekretion sowie Bildung einer subterminalen Spore aus und lebt im Boden oder auf Pflanzenteilen (Heu, Samen, Obst, Gemüse). Es kann leicht aus Heuaufgüssen isoliert werden und wird deshalb auch als "Heubacillus" bezeichnet. Zudem gilt die marine Flora als Lebensraum dieses universell vorkommenden Bakteriums (111).
Sporulation Germination Wachstum
Abbildung 3.2: Bacillus subtilis - Lebenszyklus. Der Lebenszyklus ist in das vegetative Wachstum (Wachstum), die Sporulation und die Germination unterteilt. Während des vegetativen Wachstums verlängert sich die Zelle und es werden Septen in der Zellmitte gebildet. Zuletzt teilen sich die Tochterzellen. Tritt die Zelle in die Sporulation über werden asymmetrische Septen gebildet. Um eine Kopie der replizierten DNA bildet sich die Endospore innerhalb der Mutterzelle. Dabei wird die Spore dehydratisiert und anschließend durch Lyse der Mutterzelle freigesetzt. Vor dem erneuten Auskeimen wird die Spore rehydratisiert. Zuletzt tritt die Zelle wieder in vegetatives Wachstum über. Der Übergang zwischen vegetativem Wachstum und Sporulation ist dabei von den Umweltbedingungen abhängig. (Quelle: (4))
Seine Fähigkeit zu sporulieren hat B. subtilis zu einem Modellorganismus der einfachen Zelldifferenzierung gemacht (45, 46, 68). Zudem bietet B. subtilis noch viele andere Eigenschaften, die es zu einem geeigneten Forschungsobjekt machen;
dazu zählt vorallem die Entwicklung der Kompetenz zur DNA - Aufnahme, der damit
verbundenen Transformierbarkeit und die Möglichkeit zur Manipulation der chromosomal kodierten Gene (1, 27, 37-41, 148).
Das B. subtilis Genom ist seit 1997 vollständig sequenziert (85) und hat einen GC - Gehalt von 43 % (111). Mit einer Länge von 4215 kbp ist es kleiner als das 4639 kbp große E. coli Genom (13, 74). Es trägt 4099 offene Leserahmen, welche mögliche Protein - kodierende Gene darstellen (85, 96). 3000 der von den offenen Leserahmen abgeleiteten Proteine weisen Homologien zu schon bekannten Proteinen anderer Organismen auf; 1300 können verschiedenen Superfamilien und 1700 funktionellen Kategorien zugeordnet werden (96).
Viele der bekannten Gene kodieren Proteine, die für die Kohlenstoffverwertung nötig sind. B. subtilis kann unterschiedlichste Zucker als alleinige Kohlenstoff - Quelle nutzen (43). Dazu zählen Hexosen (Monosaccharide), wie Glukose, Fruktose, Mannose (131), aber auch Disaccharide, wie Trehalose und Saccharose (64, 91, 92, 105).
Neben den beiden zuletzt genannten Zuckern gehört auch Maltose zu den von B.
subtilis als alleinige Kohlenstoffquelle nutzbaren Disacchariden (43, 159). Da Maltose wichtiger Bestandteil dieser Arbeit ist, soll im Folgenden kurz auf Maltose und ähnliche Glukoseoligomere eingegangen werden.
3.2 Maltose, Maltodextrine und Isomaltose
Maltose gehört neben Saccharose und Laktose zu den am häufigsten auftretenden Disacchariden in der Natur. Sie besteht aus zwei α - 1,4 - glykosidisch verbundenen Glukosemolekülen. Maltoseoligomere aus drei und mehr Glukosemolekülen bezeichnet man als Maltodextrine. Im Gegensatz dazu, besteht Isomaltose aus α - 1,6 - glykosidisch verknüpften Glukosemolekülen. Die polymeren Formen von Maltose und Isomaltose sind vor allem in den Makromolekülen Glykogen und Stärke zu finden (93).
Die Speicherstoffe Glykogen und Stärke kommen in Bakterien, Tieren bzw. Pflanzen vor. Die Stärke, das Nährstoffreservoir der Pflanzen, kann in zwei Formen eingeteilt werden. Zum einen, die aus α - 1,4 - glykosidisch verbundenen Glukosemolekülen bestehende, unverzweigte Amylose. Zum anderen das verzweigte Amylopektin, in dem eine α - 1,6 - glykosidische Bindung auf etwa 30 α - 1,4 - glykosidische
Bindungen kommt. Im Gegensatz zum Amylopektin treten die Verzweigungen im Glykogen alle zehn Glukoseeinheiten auf. Der höhere Verzweigungsgrad bewirkt u.a., daß Glykogen im Gegensatz zu Stärke gut wasserlöslich ist (93, 150).
Die durch den extrazellulären Abbau dieser Polysaccharide entstehenden Di - und Oligosaccharide sind Maltose, Isomaltose und lineare oder verzweigte Maltodextrine.
Abbildung 3.3 zeigt die Disaccharide Maltose und Isomaltose. Als lineare Maltodextrine bezeichnet man α - 1,4 - glykosidisch verbundene Glukoseoligomere, die aus mehr als zwei Glykosylresten bestehen. Sind diese jedoch über eine oder mehrere α - 1,6 - glykosidische Bindung verknüpft, so spricht man von verzweigten Maltodextrinen (73, 89).
Maltose (4 - O - α - D - Glukopyranosyl - D - Glukose)
Isomaltose (6 - O - α - D - Glukopyranosyl - D - Glukose)
Abbildung 3.3: Schematische Darstellung von Maltose und Isomaltose. Die Glukosemonomere sind in Sesselform abgebildet. Die freien reduzierenden Enden sind als sich schlängelnde Linien dargestellt. Neben den Trivialnamen sind die wissenschaftlichen Bezeichnungen in Klammern notiert.
3.3 ABC (ATP binding cassette) - Transporter
Alle Zellen und subzellulären Kompartimente sind von einer Membran aus Lipiden umgeben. Das Überleben der Zellen verlangt nach einer spezifischen und regulierten Passage von Nährstoffen und Abfallprodukten über diese Barriere (66). Die Wichtigkeit dieses Transports wird allein dadurch deutlich, daß fast 20 % des E. coli Genoms Transportsysteme kodieren (6). Diese Transportsysteme können in Familien
eingeteilt werden, deren Mitglieder untereinander Ähnlichkeiten aufweisen und wahrscheinlich einen gemeinsamen evolutionären Vorfahren haben. Dabei bilden die ABC - Transporter die wohl größte Superfamilie unter diesen Familien. Ihre Mitglieder sind sowohl in Prokaryoten als auch Eukaryoten zu finden. Die Tatsache, daß Krankheiten wie z.B. die cystische Fibrose durch Defekte in ABC - Transportern verursacht werden, rückt die Superfamilie der ABC - Transporter in den Focus der Wissenschaft (29, 66). Jedoch sind sie auch für Resistenzmechanismen von pathogenen Bakterien verantwortlich (103, 167). Unter den prokaryotischen ABC - Transportern können Importer von Exportern dadurch unterschieden werden, daß Importer ein Substrat spezifisches, extrazelluläres Bindeprotein besitzen (17, 114).
Einer der am besten untersuchten ABC - Transporter ist der durch malE, malF, malG und malK kodierte Importer von E. coli, der in die Maltose - und Maltodextrin - Aufnahme involviert ist (zusammengefasst in (16) und (44)). Beispielhaft soll an ihm das Prinzip des Transports durch ABC - Transporter erklärt werden.
MalG MalF
Innen - Membran
Maltose MalK
ATP ADP + Pi
MalK MalE MalE MalE
LamB Maltose
Außen - Membran
Abbildung 3.4: Das Escherichia coli Maltose - und Maltodextrin - Aufnahmesystem. Gezeigt ist der schematische Weg von Maltose über die Außenmembran durch das Maltoporin LamB, durch das Periplasma und schließlich über den Transportkomplex MalE, MalF, MalG und MalK in das Cytoplasma.
Das Maltose - und Maltodextrin - Aufnahmesystem von E. coli besteht aus mehreren Komponenten (16, 44). Zum Ersten, aus dem die äußere Membran durchziehenden Porin LamB (157), das spezifisch für Maltodextrine ist. Zudem ist es der Rezeptor des Phagen λ (117). Die zweite Komponente, das Maltose - Bindeprotein (MalE;
Synonym: MBP) (42), ist ein lösliches, periplasmatisches Protein, welches Maltose und Maltodextrine mit hoher Affinität zu binden vermag (78, 158) und seine Substrate an einen, die innere Membran durchspannenden Komplex überträgt (165). Dieser Komplex besteht aus zwei integralen Membranproteinen, MalF und MalG (146, 166) und aus zwei Einheiten des Proteins MalK, einer ATP-Hydrolase, die sowohl gebunden an MalF und MalG als auch löslich im Cytoplasma vorkommt (144).
Die Hydrolyse von ATP durch MalK stellt die Energie bereit, die für den Transport der Substrate aufgebracht werden muß (30-32, 104). Die auf diesem Weg ins Cytoplasma transportierten, unphosphorylierten Substrate werden anschließend durch Hydrolyse und Phosphorylyse zu Glukose - 6 - Phosphat abgebaut (16, 44).
3.4 Die CcpA vermittelte Kohlenstoff - Katabolitrepression
Bacillus subtilis ist in der Lage zwischen leichter zu verwertenden Monosacchariden, wie Glukose und Fruktose, und schwerer zu verwertenden Di -, Oligo - oder Polysacchariden zu unterscheiden (22, 34, 64, 71, 172).
Das System, das für die Aufnahme der Zucker Glukose und Fruktose verantwortlich ist, nennt man Phosphoenolpyruvat - abhängiges Phosphotransferasesystem (PTS).
Daneben werden aber auch andere Monosaccharide und Disaccharide mittels des PTS in das Cytoplasma transportiert (130). Das PTS besteht aus den cytoplasmatischen Proteinen Enzym I und HPr sowie einer Permease, die in bis zu vier Domänen unterteilt ist (55, 56, 90). Die Domänen werden je nach Typus als Enzym IIA, B, C oder D bezeichnet (132). Mittels dieser Enzyme wird eine Phosphorylgruppe von Phosphoenolpyruvat auf den, durch die Permease in die Zelle gelangten Zucker übertragen. Dabei bestimmt die entsprechende Permease die Spezifität des Transportsystems. Die Komponenten Enzym I und HPr sind generell für alle PTS - Transporter zuständig und transferieren die Phosphoryl - Gruppe auf verschiedene Enzym II.
HPr stellt zudem eine regulatorische Komponente in dem Mechanismus der Kohlenstoff - Katabolitrepression (CCR von carbon catabolite repression) Gram - negativer Bakterien dar. Es kann an zwei Stellen phosphoryliert werden; für die Phosphatübertragung an Position Histidin 15, für die Regulation an Position Serin 46 (120). Die regulatorische Phophorylierung wird dabei unter ATP - Verbrauch durch die HPr-Kinase katalysiert (119).
E IICBA
PEP E I HPr
Glukose
Glukose ∼ P
∼ P
His15∼ P
∼ P Membran
HPr
Ser46∼ P
∼ P
CcpA cre
HPr CcpA HPrK
ATP ADP
Abbildung 3.5: Schematische Darstellung des Glukose - Transports und der CcpA abhängigen Kohlenstoff - Katabolitrepression (CCR) in B. subtilis. Gezeigt sind die zentralen Komponenten des PTS, Enzym I (EI) und HPr sowie das Glukose - spezifische Enzym II (EIICBA) in der Cytoplasmamembran. Die durch das PTS transportierte Glukose wird während des Transports phosphoryliert. Nicht an Histidin 15 phosphoryliertes HPr kann durch die HPr - Kinase (HPrK) an Serin 46 phosphoryliert werden und agiert dann als Corepressor zusammen mit CcpA in der CCR.
An Serin 46 phosphoryliertes HPr kann mit CcpA (catabolite controlling protein), einer zentralen, in trans aktiven Komponente wechselwirken und somit Einfluß auf die Regulation nehmen. In Promotorregionen, deren Gene unter der Kontrolle der CCR stehen, konnten cis aktive DNA-Elemente identifiziert werden, mit denen CcpA interagiert. Diese als cre (catabolite responsive elements) bezeichneten, 14 Basenpaare (bp) lange, Palindrome können dabei 200 bp stromaufwärts oder
stromabwärts der Transkriptionsstartpunkte liegen (71, 173). Mit Hilfe von Antikörpern gegen gereinigtes CcpA aus B. megaterium konnte nachgewiesen werden, daß dieses Protein und somit wahrscheinlich auch dieser Mechanismus ubiquitär in der Familie Bacillaceae verbreitet ist (86).
Die funktionelle Rolle von CcpA und seine Interaktionen mit cre werden derzeit kontrovers diskutiert. Einerseits konnte gezeigt werden, daß gereinigtes CcpA alleine mit dem cre des amyE Gens von B. subtilis wechselwirkt (80) (amyE kodiert für die extrazelluläre α - Amylase (153)); andererseits wurde demonstriert, daß CcpA für seine Bindung an cre in anderen Operons Co - Faktoren benötigt (57, 116). Auch die Identifizierung dieser Co - Faktoren scheint vielschichtiger zu sein als vorher angenommen; möglicherweise sind unterschiedliche Interaktionspartner für CcpA an der Signalvermittlung beteiligt. Die Bindung von CcpA an das cre des gnt Operons, welches für die Verwertung von Glukonat in B. subtilis kodiert, benötigt zusätzlich die Anwesenheit von HPr, welches zuvor durch die ATP abhängige Kinase HprK am Serin an Position 46 phosphoryliert wird (36, 119). Die direkte Wechselwirkung von CcpA und HPr konnte in vitro und in vivo durch Mutationsanalysen nachgewiesen werden (35), wobei die Interaktion durch Fruktose - 1,6 - bisphosphat stimuliert wird (52, 75, 116). Die Funktion von HPr - Ser46 - P als Co - Repressor in der CcpA vermittelten CCR wurde auch durch in vitro Analysen am cre des xyl Operons von B. megaterium bestätigt, welches für die Xyloseaufnahme und - verwertung kodiert (126, 171). Hier konnte ein weiterer Co - Faktor, das Glukose - 6 - Phosphat, als möglicher Signalüberträger identifiziert werden, der eine HPr - Ser46 - P unabhängige Bindung an cre, zumindest bei niedrigem pH im in vitro Experiment, vermitteln kann (57).
Weiterhin wurde nachgewiesen, daß die Synthesen der Glycerol - Kinase, der Phospho - Trehalase und der durch Maltose induzierbaren α - Glukosidase aus B.
subtilis in Mutanten, in denen das Serin an Position 46 des HPr durch Alanin, eine nicht phosphorylierbare Aminosäure, ersetzt wurde, nach wie vor der CCR unterliegen (36, 64). Eine vergleichbare Beobachtung konnte man auch in einer Mutante, in der das ccpA deletiert worden war, machen (64). Dies bedeutet, daß sowohl die Glycerol - Kinase, die Phospho - Trehalase als auch die α - Glukosidase unter einer HPr und CcpA unabhängigen CCR stehen. Dabei beruht der Mechanismus der CCR im Falle der Phospho - Trehalase TreA (64) auf dem Prinzip
des Induktor - Ausschlusses. Anhand des Trehalosesystems von B. subtilis soll dieser Mechanismus kurz erläutert werden:
Das Aufnahmesystem für Trehalose gehört zu der Familie der PTS. TreP, die Permease des Systems, besteht aus den Domänen EIIBCTre. Es wird in die Gruppe der Saccharose Permeasen eingeteilt (118). Ähnlich wie das Enzym II für Saccharose erhält auch das Enzym II für Trehalose die Phosphorylgruppe durch die EIIA - Domäne des EIICBAGlc (26, 156). Letzteres besteht aus nur einer einzigen Polypeptidkette (156). Dabei beruht der Mechanismus des Induktor Ausschlusses darauf, daß während des Transports von Glukose keine Phosphorylgruppe auf das EIIBCTre übertragen wird und somit keine Trehalose in die Zelle transportiert wird.
Somit wird in der Zelle auch kein Trehalose - Phosphat akkumuliert, wodurch das Trehalose - Operon nicht transkribiert wird (25, 26).
3.5 Maltose - Aufnahme in Bacillus subtilis
Im Gegensatz zu der sehr gut untersuchten Maltose - Aufnahme in E. coli (siehe Kapitel 3.3), ist die Maltose - Aufnahme in B. subtilis noch weitgehend unerforscht.
Der Maltose - Transport von B. subtilis wird durch Entkoppler gehemmt und mit Zellextrakten von B. subtilis Kulturen, die auf Maltose - haltigem Medium gewachsen sind, kann keine Maltose - Phosphotransferasesystem - Aktivität nachgewiesen werden. Jedoch lassen sich Glukokinase und Glukose Phosphotransferasesystem Aktivität detektieren. Dies führte zu der Schlußfolgerung, daß das Maltose - Aufnahmesystem nicht zur PTS - Familie gehört, sondern durch die protonenmotorische Kraft angetrieben wird. Jedoch konnte ein regulatorischer Effekt des PTS auf den Maltose - Transport gezeigt werden. Eine Temperatur - sensitive ptsI (kodiert für das Enzym I) Mutante, die bei 37°C Maltose - Transport vergleichbar dem Wildtyp aufweist, zeigt im Gegensatz zum Wildtyp bei 42°C keinen Transport mehr. Dies bedeutet, daß das Enzym I und somit wahrscheinlich auch das PTS in den Maltose - Transport verwickelt sind (159).
Diese Ergebnisse konnten nach der Veröffentlichung des Bacillus subtilis - Genom - Sequenzierungsprojekts dahingehend ergänzt werden, daß ein Gen - Cluster identifiziert wurde, das für die Maltose - Verwertung zuständig sein könnte (85, 97, 153).
glvA glvR
glvC (malP)
Phospho - α - Glukosidase
Aktivator
EIICBMal
889.528 kb 893.301 kb
Abbildung 3.6: Das potentielle Maltose - Verwertungssystem aus Bacillus subtilis. Gezeigt ist das glv - Operon bestehend aus glvA, glvR und glvC, welches auch das Synonym malP trägt.
Angegeben sind die Position von Anfang und Ende des Operons auf dem B. subtilis Chromosom in kb. Das Transkriptionsende wird durch einen potentiellen Terminator angezeigt.
Tatsächlich stellt das Gen - Cluster (siehe Abbildung 3.6) ein Operon dar (180). Es besteht aus drei Genen. glvA kodiert für eine Phospho - α - Glukosidase (161), glvR für den Transkriptionsaktivator des Operons (180) und glvC für ein potentielles EIICB (153). Darauf deuten auch die Ergebnisse von Jonathan Reizer und seinen Mitarbeiter hin, die im Rahmen einer Untersuchung aller potentiellen Phosphotransferasesysteme von B. subtilis durch Mutationsstudien zeigen konnten, daß eine Insertion in glvC (Synonym: malP) zu einem langsameren Wachstum auf Minimalmedium Maltose führt (118). Studien bezüglich des Maltose -Transports in Abhängigkeit von glvC wurden jedoch bis heute noch nicht publiziert.
Den Ergebnissen des Bacillus subtilis - Genom - Sequenzierungsprojekts zu Folge konnten aber auch verschiedene Gene, die für ein mögliches Bindeprotein abhängiges Maltose - Aufnahmesystem kodieren könnten, identifiziert werden (85).
Hierbei handelt es sich um ein Gen - Cluster bestehend aus den Genen malR (yvdE) bis pgcM, das sich an Position 3545,7 kb bis 3558,0 kb der Genom - Karte befindet (siehe Abbildung 3.7 (85, 97)). Ein Vergleich der von den offenen Leserahmen abgeleiteten Aminosäuresequenzen mit Proteinen anderer Organismen, weist darauf hin, daß die im Gen - Cluster kodierten Proteine in die Verwertung von Maltose oder Maltodextrinen involviert sein könnten (153).
malR
yvdF
malE
malL pgcM malF
malG yvdJ
yvdK
3557.891 Kb 3545.896 Kb
yvdD clpP
Abbildung 3.7: Gen - Cluster : malR - pgcM. (Position: 3545,7 - 3558,0 kb auf dem Bacillus subtilis Genom). Flankiert wird das Gen - Cluster von y v d D und clpP sowie von zwei potentiellen Terminatoren (153).
Aufgrund der Sequenzähnlichkeiten der von den Genen abgeleiteten Proteine zu anderen Proteinen mit bekannter Funktion (153) und der in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse werden die Gene yvdE, yvdG, yvdH und yvdI sowie die abgeleiteten Proteine zum leichteren Verständnis von Beginn an umbenannt. Die alten Namen sind im folgenden Absatz noch in Klammer angegeben.
Das Gen malR (yvdE) kodiert wahrscheinlich für einen transkriptionellen Regulator.
Gemäß seiner Aminosäuresequenz ist er ein Mitglied der LacI / GalR - Familie (153, 172); einer Familie, die hauptsächlich aus Repressoren besteht (102, 172). YvdF ist zu 98 % identisch zu einer cytoplasmatischen Amylase aus Bacillus subtilis SUH4-2, einem aus koreanischem Boden isolierten Bacillus Stamm (23, 153). Die Gene malE (yvdG), malF (yvdH) und malG (yvdI) kodieren für einen möglichen Bindeprotein abhängigen ABC - Transporter, wobei malE für das potentielle Bindeprotein kodiert und MalF und MalG die Permease bilden (114, 153). YvdJ zeigt keine Homologien zu Proteinen mit bekannter Funktion, jedoch ergaben Computer gestützte Sequenzanalysen, daß es sich bei YvdJ um ein Transmembranprotein handeln könnte (siehe Abbildung 3.8; in Zusammenarbeit mit Holger Krafft (83)). YvdK zeigt Ähnlichkeiten zu Maltose - Phosphorylasen auf (153). Zusätzlich konnte Sabine Seitz zeigen, daß das Enzym Maltose - Phosphorylase Aktivität besitzt. Ob auch Maltodextrine als Substrat dienen, konnte nicht eindeutig gezeigt werden (140).
Neben der potentiellen Maltose - Phosphorylase YvdK birgt das Gen - Cluster auch ein α - Glukosidase. Das Enzym MalL erkennt Maltose, Maltodextrine, aber auch Isomaltose und Saccharose als Substrate und setzt diese in Glukose um (137, 138).
Das letzte Gen des in Abbildung 3.7 gezeigten Clusters ist pgcM. Hierbei handelt es sich um eine Phospho - Glukomutase, die die Umwandlung von Glukose - 1 -
Phosphat zu Glukose - 6 - Phosphat katalysiert. Dabei wird β - Glukose - 1 - Phosphat gegenüber α - Glukose - 1 - Phosphat bevorzugt. Zusätzlich birgt dieses Enzym auch noch die Aktivität einer Glukose - 1 - Phosphat - Dismutase; es wandelt also zwei Moleküle Glukose - 1 - Phosphat in Glukose und Glukose - 1,6 - Bisphophat um (125).
Abbildung 3.8: Hydrophobizitätsanalyse von YvdJ. Aufgetragen sind die Aminosäuresequenz von YvdJ (angegeben ist jeweils die Aminosäureposition der insgesamt 294 Aminosäuren) gegen die Wahrscheinlichkeit, daß sich Aminosäuren im Zellinneren (inside, blau), in der Membran (transmembrane; rot) oder im extrazellulären Raum (outside; rosa) befinden. Je höher der Wert auf der Ordinate ist, umso höher ist die Wahrscheinlichkeit, daß die Vorhersage zutrifft. Hergestellt in Zusammenarbeit mit Holger Krafft (83).
Somit könnte das Gen - Cluster für alle Proteine kodieren, die benötigt werden, um Maltose oder Maltodextrine aufzunehmen, in Glukose - 6 - Phosphat umzuwandeln und letztlich der Glykolyse zuzuführen. Jedoch fehlt dem Transportsystem die Energie - liefernde ATPase (siehe auch Kapitel 3.6; (153)).
3.6 ABC - Transporter in Bacillus subtilis
Neben dem in Kapitel 3.5 beschriebenen potentiellen ABC - Transporter besitzt B. subtilis noch eine Vielzahl an weiteren Importern, aber auch Exportern, die der Familie der ABC - Transporter (67, 72) zugeordnet werden (114, 153). Zu den 78 potentiellen ABC - Transportern zählen 38 Bindeprotein abhängige Importer sowie 40
Exporter, die wahrscheinlich ohne Bindeprotein funktionieren. Somit besitzt B. subtilis ca. zwanzig ABC - Transporter mehr als Escherichia coli, obwohl sein Genom etwa 400 kbp kleiner ist (13, 74, 85, 114).
Im Gegensatz zu den Bindeproteinen von Gram - negativen Bakterien sind die Bindeproteine von Gram - positiven Bakterien, wie B. subtilis, an der Zellmembran über Lipid - Modifizierungen fixiert (154). Direkt nach der Synthese besitzen Bindeproteine ein sogenanntes Signalpeptid. Dieses wird während der Translokation über die Membran durch die spezifische Signal Peptidase II abgespalten und die Lipid - Modifizierungen werden angebracht (63, 135, 164).
Überraschenderweise sind unter den 78 ABC - Transportern elf in potentiellen Operons organisiert, in denen keine ATPase - Einheit kodiert ist. Dagegen sind fünf Gene für potentielle ATPase zu finden, in deren chromosomaler Umgebung keine Permeasen oder Bindeproteine kodiert sind. Somit könnten mehrere ABC - Transporter durch eine ATPase energetisiert werden (114).
Zu den elf potentiellen Operons, in denen zwar Permeasen und Bindeproteine, jedoch keine ATPasen kodiert sind, zählt auch das in Kapitel 3.5 beschriebene potentielle Maltose - / Maltodextrin - Verwertungssystem sowie weitere, potentiell an der Aufnahme von Zuckern beteiligte Systeme. Manche der Bindeproteine davon könnten, basierend auf Ähnlichkeiten ihrer Aminosäuresequenz zu anderen Proteinen, ebenfalls Maltose als Substrat besitzen, z.B. MsmE, YesO, YurO oder YvfK (114, 153). Letzteres scheint aber an die Cyclodextrin - Verwertung beteiligt zu sein (76).
Von den fünf, potentiell in monocistronischen Operons kodierten, ATPasen sind drei, basierend auf ihrer Aminosäuresequenz, am Import beteiligt. Diese sind YlmA, YusV und MsmX (114). Dabei weißt YlmA Ähnlichkeiten zu ATPasen von Molybdän - Transportern auf und YusV scheint in den Eisen (III) - Transport involviert zu sein. Im Gegensatz dazu finden sich unter den ähnlichen Proteinen zu MsmX viele in den Zucker - Transport verwickelte ATPasen (153).
3.7 Ziele dieser Arbeit
Die Maltose - Aufnahme in B. subtilis ist noch weitgehend ungeklärt. Experimentelle Analysen bezüglich des Maltose - Katabolismus in B. subtilis zeigen Unklarheiten
auf. Aufgrund von Aminosäuresequenz - Vergleichen wurden mehrere potentiell für Maltose - und Maltodextrin - Transportsysteme kodierende Gen - Cluster auf dem Chromosom von B. subtilis gefunden (153). Diese gehören unterschiedlichen Transporter - Familien an (114, 118).
Zum einen scheint Maltose in B. subtilis durch ein, den Phosphotransferasesystemen zugehöriges Transportsystem aufgenommen und abgebaut zu werden. Darauf weisen das Vorkommen einer Phospho - α - Glukosidase (161) und Computer basierte Sequenzanalysen hin, die glvC als potentielles Maltose spezifisches EIICB ausweisen (118). Ebenfalls wurde gezeigt, daß eine Insertionsmutante in glvC (kodiert für das potentielle EIICBMal) ein signifikant langsameres Wachstum auf Maltose - Minimalmedium im Vergleich zum Wildtyp aufweist (118). Jedoch konnten in in vitro Phosphorylierungsstudien keine Phosphoenolpyruvat abhängigen Intermediate festgestellt werden, die auf ein Maltose - PTS hinweisen (159). Somit stellt sich die Frage, ob Maltose wirklich über das durch das glv - Operon kodierte System aufgenommen wird (180).
Zum anderen konnte gezeigt werden, daß B. subtilis eine Maltose induzierbare α - Glukosidase (MalL (137)) besitzt (36). Diese ist in einem Gen - Cluster kodiert, das vermeintlich auch für die Maltose - Aufnahme verantwortlich ist (114, 153).
Ein Ziel dieser Arbeit war es, den oder die Transporter für Maltose und Maltodextrine zu identifizieren. Daher sollte das für das potentielle Maltose - Bindeprotein kodierende Gen m a l E (yvdG) kloniert und das Genprodukt gereinigt und charakterisiert werden. Mittels Mutationsanalysen sollte zusätzlich der Einfluß der beschriebenen Systeme auf den Maltose - und Maltotriose - Transport getestet werden.
Zusätzlich sollte geprüft werden, auf welcher Ebene die α - Glukosidase MalL unter der Glukose vermittelten Kohlenstoff - Katabolitrepression steht (36, 137). Dazu sollte erstens die transkriptionelle Organisation des Gen - Clusters, dem malL angehört, analysiert und zweitens der Einfluß des potentiellen Regulators MalR (YvdE) auf die Transkription der im Gen - Cluster kodierten Gene festgestellt werden.
Diese Daten sollten die Grundlage für weiterführende Studien in der Netzwerkregulation der Kohlenstoff - Katabolitrepression darstellen.
4 Ergebnisse
4.1 Charakterisierung des Maltodextrin - Bindeproteins MalE
Um herauszufinden, welche Substratspezifität das durch das Gen - Cluster malR - pgcM kodierte System hat, wurde das potentielle Maltose - / Maltodextrin - Bindeprotein MalE (YvdG) gereinigt und seine Substratspezifität charakterisiert.
Dabei wurde eine Variante von malE exprimiert, in welcher die für das Signal - Peptid kodierende Sequenz gegen eine für ein Histidin - Affinitäts - Epitop kodierende Sequenz ausgetauscht ist. Das dazu verwendete Plasmid war pMBPHis6x (136). Auf diesem pQE-9 Derivat ist das für das Fusionsprotein kodierende Gen unter der Kontrolle des T 5 Promotors sowie der l a c Operatoren lokalisiert (112). Der verwendete Produktionsstamm war E. coli RB791. Im Weiteren wird das Fusionsprotein His6xMalE genannt.
4.1.1 Reinigung von His6xMalE
Die Induktion der Synthese von His6xMalE sowie die Herstellung des löslichen Proteinextrakts, erfolgte wie in Kapitel 6.8.13.3 beschrieben. Zuerst wurde der lösliche Proteinextrakt mittels Ni2+ - Affinitätschromatographie gereinigt. Abbildung 4.1 zeigt das Chromatogramm einer solchen Reinigung.
A280nm Imidazol
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 mAU
0 20 40 60 80
%B
0 50 100 150 200
Elutionsvolumen [ml]
P1
P2
P3 P4
Abbildung 4.1: Chromatogramm einer Ni2+ - Affinitätschromatographie. Aufgezeigt sind die gemessene A280nm in mAU sowie die Prozentigkeit an Imidazol im Elutionspuffer [%B] gegen das Elutionsvolumen in ml. P1: Durchfluß während des Beladens der Säule, P2 - P4: Peaks während des linearen Gradienten zwischen 0 und 500 mM Imidazol. Proteinextrakt von RB791 [pMBPHis6x] nach vierstündiger Induktion mit 1 mM IPTG. (Säule: 1 x 5 ml HiTrap Chelating, Kulturvolumen: 2 l)
Die Analyse von Fraktionen der Peaks P1 - P4 (siehe Abbildung 4.1) mittels 12 % SDS - Page (siehe Abbildung 4.2) zeigte, daß die Fraktionen der Absorptionsmaxima P3 und P4 Proteine mit einem Laufverhalten enthielten, welches dem erwarteten Molekulargewicht von His6xMalE (50 kDa) entspricht. Das Protein eluiert bei zwei unterschiedlichen Imidazolkonzentrationen. Dies liegt wahrscheinlich daran, daß das Protein dimerisiert und so anstelle eines Histidin - Hexamers ein Affinitäts - Epitop aus 12 Histidinen trägt (siehe auch Kapitel 4.1.5).
S
P3 P4
66 kDa 45 kDa
Abbildung 4.2: Analyse der Ni2+ - Affinitätschromatographie (siehe Abbildung 4.1) mittels 12 % SDS - Page. P3: Fraktionen des Peaks 3, P4: Fraktionen des Peaks 4, S: 70L Standard. Markiert sind die 66 kDa und 45 kDa Banden des Größenstandards.
Um das in der Proteinlösung enthaltene Imidazol zu entfernen, wurde die Proteinlösung mittels einer HiTrap Desalting Säule in die für die entsprechenden Versuche notwendigen Puffersysteme überführt. Auf diese Weise konnten durchschnittlich 8 mg His6xMalE aus einem Liter RB791 [pMBPHis6x] Kultur gereinigt werden.
4.1.2 Untersuchungen der Sekundärstruktur von His6xMalE
Um einen Eindruck davon zu bekommen, ob das gereinigte His6xMalE gefaltet und somit geeignet für in vitro Analysen war, wurde die Methode der Circular Dichroismus (CD) Spektroskopie gewählt (siehe Abbildung 4.3).
-1500000 -1000000 -500000 0 500000 1000000 1500000 2000000
190 210 230 250 270 290
Wellenlänge [nm]
molare Elliptizität Θ [grad*cm2 *dmol-1 ] His6xMalE [5µM]
10 mM HEPES pH 7
Abbildung 4.3: CD - Spektroskopie. CD - Spektren von His6xMalE in einer Konzentration von 5 µM (blaue Kurve) sowie der Referenz, 10 mM HEPES pH 7 (rosa Kurve). Aufgetragen sind die molare Elliptizität Θ [grad * cm2 * dmol-1] (Ordinate) gegen die Wellenlänge [nm] (Abszisse).
Anhand des CD - Spektrums kann gefolgert werden, daß His6xMalE nicht denaturiert vorlag. Somit wurde es für weitere in vitro Untersuchungen verwendet. Aufgrund des Maximums bei 190 nm und der beiden Minima bei 208 nm und 222 nm scheint es zu einem hohen Anteil aus α - helikalen Bereichen zu bestehen (siehe Anhang 9.5).
4.1.3 Analyse von His6xMalE mittels Fluorimetrie
Um Substrate von His6xMalE zu identifizieren wurde zunächst die Methode der Fluoreszenz Spektroskopie gewählt. Unterschiedliche Zucker in Konzentrationen von 10 µM und 200 µM wurden mit gereinigtem His6xMalE [1 µM] inkubiert und anschließend im Fluorimeter vermessen. Abbildung 4.4 zeigt beispielhaft die Ergebnisse, die mit Maltohexaose erhalten wurden.
0,0E+00 1,0E+07 2,0E+07 3,0E+07 4,0E+07 5,0E+07 6,0E+07
300 350 400 450 500
Emissions - Wellenlänge [nm]
Fluoreszenzintensität
Abbildung 4.4: Fluoreszenzmessung. Gezeigt sind die Ergebnisse der Fluorimetriemessungen, wenn 1 µM His6xMalE mit 10 µM (rosa Kurve) bzw. 200 µM (gelbe Kurve) Maltohexaose inkubiert wurden. Als Referenz wurde ein entsprechendes Volumen an Puffer (blaue Kurve) hinzu gegeben.
Die Zugabe von Maltohexaose führt zu einer Verschiebung des Emissionsmaximums um ca. 5 nm. Gleichzeitig erfolgt eine Verringerung der Fluoreszenzintensität des Emissionsmaximums um ca. 10 % (siehe Abbildung 4.4). Ähnliche Ergebnisse konnten mit Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose und Maltoheptaose, nicht aber mit Maltose, Isomaltose, Isomaltotriose, Isomaltotetraose, Palatinose, Raffinose, Melibiose, Trehalose, Panose, Saccharose, Cellobiose, Cellopentaose oder Laktose erzielt werden (Daten nicht gezeigt). Die auf diese Weise erhaltenen Werte waren eindeutig, schwankten jedoch derart, daß sie nicht für eine Berechnung der Substrat - Affinitäten herangezogen werden konnten. Daher wurde versucht die Dissoziationskonstanten der einzelnen Substrate mittels der Oberflächen - Plasmon - Resonanz - Spektroskopie (siehe Kapitel 4.1.4) zu ermitteln.
4.1.4 Analyse von His6xMalE mittels BIAcoreX
Nach den Hinweisen auf die potentiellen Substrate von His6xMalE, die aus den Untersuchungen mittels der Fluoreszenz - Spektroskopie erhalten wurden, sollten die Ergebnisse mit einer zweiten Methode bestätigt und die Bindekonstanten der
Substrate ermittelt werden. Dabei wurde die Methode der Oberflächen Plasmon - Resonanz - Spektroskopie (BIAcoreX) verwendet.
Zuerst wurden mehrere Zucker in einer Konzentration von 1 mM auf ihre Interaktion mit His6xMalE (gekoppelt in der Meßzelle) untersucht (Abbildung 4.5). Die injizierten Zucker waren: Maltose, Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose, Maltohexaose, Maltoheptaose, Isomaltose, Isomaltotriose, Isomaltotetraose, Palatinose, Raffinose, Melibiose, Trehalose, Panose, Saccharose, Cellobiose, Cellopentaose sowie Laktose.
-60 -40 -20 0 20 40 60 80 100
0 100 200 300 400 500
Zeit [s]
Response Differenz [RU]
M6 M7M5 M4M3
M2 Iso
SucIso3
Abbildung 4.5: Interaktionsanalyse mittels BIAcoreX. Überlagerung der Sensorgramme, die mit Maltose (M2), Maltotriose (M3), Maltotetraose (M4), Maltopentaose (M5), Maltohexaose (M6), Maltoheptaose (M7), Isomaltose (Iso), Isomaltotriose (Iso3) oder Saccharose (Suc) erhalten wurden.
Aufgezeigt sind die Differenzen zwischen Testzelle und Referenzzelle in Resonanz Units [RU] gegen die Dauer [s] der Injektion. Dabei entspricht 0 s dem Start der Injektion und 360 s dem Ende der Injektion.
Nur Maltose und die Maltodextrine Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose, Maltohexaose und Maltoheptaose bewirkten einen Anstieg der Response Differenz.
Alle anderen getesteten Zucker zeigten keinen Effekt. Als Beispiele für die Zucker, die keinen Response auslösen sind die Meßwerte für Isomaltose, Isomaltotriose und Saccharose gezeigt (siehe Abbildung 4.5). Die Zunahme der Response Differenz in den Fällen von Maltose und den verwendeten Maltodextrinen erfolgt sofort nach Start der Injektion der potentiellen Substrate (0 s) und fällt nach Beendigung der Injektion
sofort wieder auf den Ausgangswert ab. Das während der Injektion erreichte Plateau korreliert dabei mit den Molekulargewichten der Substrate.
Um die Bindekonstanten für Maltose und die Maltodextrine bestimmen zu können, wurden nun Substrat - Konzentrations - abhängige Messungen durchgeführt.
Abbildung 4.6 zeigt dabei exemplarisch die Ergebnisse für Maltohexaose.
0 20 40 60 80 100
0 100 200 300 400 500 Zeit [s]
1 µM 10 µM5 µM 50 µM 100 µM 500 µM1 mM
Response Differenz [RU]
Abbildung 4.6: Affinitätsbestimmung mittels BIAcoreX. Überlagerung der Sensorgramme, die mit unterschiedlichen Konzentrationen an Maltohexaose erhalten wurden. Gezeigt sind die Differenzen zwischen Testzelle und Referenzzelle in Resonanz Units [RU] gegen die Dauer [s] der Injektion. Dabei entspricht 0 s dem Start der Injektion und 360 s dem Ende der Injektion.
In Abhängigkeit der Konzentration nimmt die Response Differenz zuerst zu, bevor die Zunahme bei einer Konzentration von etwa 50 µM stagniert und in eine Sättigung übergeht. Ähnliche Konzentrations - abhängige Ergebnisse wurden für Maltose, Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose und Maltoheptaose beobachtet, wobei die erreichten Maxima von der Größe der eingesetzten Substrate abhängen (Daten nicht gezeigt).
Aus den durch die Konzentrations - abhängigen Messungen erhaltenen Daten wurden die Kd - Werte der Substrate errechnet. Auf Grund der schnellen Zu - bzw.
Abnahmen wurden nicht die Quotienten aus kdiss (Dissoziationsrate) und kass
(Assoziationsrate) gebildet, sondern Scatchard - Plots verwendet. Abbildung 4.7 zeigt exemplarisch die Auftragung der Werte aus den Interaktionsanalysen zwischen His6xMalE und Maltohexaose.
y = -0,296x + 25,196
0 5 10 15 20 25
0 20 40 60 80 100
B
B/[L]
Abbildung 4.7: Berechnung der Dissoziationskonstanten (Kd). Scatchard Plot basierend auf den Daten aus den Interaktionsanalysen zwischen His6xMalE und Maltohexaose. Aufgetragen wurde dabei der Quotient (B/[L]) aus der Zunahme der Response Differenz (B) zur eingesetzten Substratkonzentration ([L]) (Ordinate) gegen die Zunahme der Response Differenz (B) (Abszisse).
Zusätzlich ist die Geradengleichung aus der resultierenden Regressionsgeraden dargestellt.
Aus den so erhaltenen Geradengleichungen (siehe Abbildung 4.7) wurden folgende Dissoziationskonstanten berechnet (siehe Tabelle 4.1 und Kapitel 6.8.21).
Substrat Kd - Wert [M]
Maltose 1 x 10-3 Maltotriose 7 x 10-6 Maltotetraose 7 x 10-6 Maltopentaose 4 x 10-6 Maltohexaose 3 x 10-6 Maltoheptaose 5 x 10-6
Tabelle 4.1: Dissoziationskonstanten. Auflistung der Kd - Werte [M] unterschiedlicher potentieller Substrate zu His6xMalE.
Die Kd - Werte zeigen, daß His6xMalE eine hohe Affinität zu den getesteten Maltodextrinen besitzt, wohingegen die Affinität zu Maltose um bis zu 300 - fach geringer ist.
Da sich die mit Maltose erzielten Werte der Response Differenz mit steigender Konzentration auch einem, dem Molekulargewicht von Maltose entsprechenden
Maximum nähern (Daten nicht gezeigt), kann ausgeschlossen werden, daß die gemessenen Interaktionen auf Verunreinigungen der benutzten Maltose durch Maltodextrine beruhen. Gleiches läßt sich durch den Vergleich der maximal erreichten RU an Substrat pro RU an gebundenen His6xMalE mit den theoretischen Werten nachweisen (Tabelle 4.2; Erläuterung siehe Kapitel 9.1).
Substrat theoretischer Response [RU] gemessener Response [RU]
Maltoheptaose 0,026 0,022
Maltohexaose 0,022 0,020
Maltopentaose 0,018 0,017
Maltotetraose 0,015 0,014
Maltotriose 0,011 0,011
Maltose 0,008 0,007
Tabelle 4.2: Vergleich: Theorie und Praxis Teil 1. Vergleich der theoretisch maximal zu erhaltenden RU an Substrat pro RU His6xMalE, wenn pro Molekül His6xMalE ein Molekül Substrat gebunden wird, mit den gemessenen RU Substrat pro RU His6xMalE.
Die Berechnung der Quotienten aus gebundenen Molen Substrat (aus der Sättigungsphase) und gebundenen Molen His6xMalE zeigt, daß je Molekül His6xMalE wahrscheinlich nur ein Molekül Substrat gebunden wird (siehe Tabelle 4.3).
Substrat Mol Substrat / Mol Protein
Maltoheptaose 0,837
Maltohexaose 0,898
Maltopentaose 0,899
Maltotetraose 0,927
Maltotriose 1,000
Maltose 0,917
Tabelle 4.3: Vergleich: Theorie und Praxis Teil 2. Darstellung der Quotienten aus den gebundenen Molen Substrat (aus der Sättigungsphase) zu den gebundenen Molen His6xMalE.
4.1.5 Untersuchungen zum Oligomerisierungsverhalten von His6xMalE 4.1.5.1 Größenfraktionierung von His6xMalE
Bei einer weiteren Aufreinigung von His6xMalE mittels Größenfraktionierung zeigte sich, daß His6xMalE nach unterschiedlichen Elutionsvolumina eluierte (siehe Abbildung 4.8 und Abbildung 4.9).
280nm
0 50 100 150 200 250 300 350 mAU
0 50 100 150 ml
Elutionsvolumen [ml]
P1 P2
P3 P4
Abbildung 4.8: Chromatogramm einer Größenfraktionierung einer His6xMalE - Lösung.
Aufgezeigt sind die gemessene A280nm in mAU gegen das Elutionsvolumen in ml. P1 - P4: Peaks während der isokratischen Elution.
Die Analyse der Größenfraktionierung mittels 12 % SDS -Page zeigte, daß His6xMalE in den Fraktionen der Peaks P1 und P2 eluierte (Abbildung 4.9). Die Fraktionen der Peaks P3 und P4 enthielten kein Protein (Daten nicht gezeigt).
S P1 P2
66 kDa 45 kDa
Abbildung 4.9: Analyse der Größenfraktionierung (Abbildung 4.8) einer His6xMalE - Proteinlösung mittels 12 % SDS - Page. P1: Fraktionen des Peaks P1; P2: Fraktionen des Peaks P2; S: Standard 70L. Markiert sind die 45 kDa und 66 kDa Banden des Größenstandards.
Im Vergleich der Elutionsvolumina von His6xMalE mit den Elutionsvolumen von Standard - Proteinen zeigte sich, daß His6xMalE unter diesen Bedingungen sowohl als Dimer (ca. 100 kDa) als auch als Monomer (50 kDa) vorliegt.
Zusätzlich konnte gezeigt werden, daß sich das Laufverhalten von His6xMalE in der SDS - Page dahingehend verändert, daß zusätzlich zu der 50 kDa Bande eine 100 kDa Bande erschien, wenn der Auftragepuffer kein β - Mercaptoethanol enthielt (Daten nicht gezeigt). Dies deutet auf eine Dimerisierung über Disulfidbrücken hin.
4.1.5.2 Analyse von Iodoacetamid behandeltem His6xMalE
Um Erkenntnisse darüber zu bekommen, ob die in Kapitel 4.1.5.1 beobachtete Dimerisierung über Disulfidbrücken erfolgt, wurde His6xMalE wie in Kapitel 6.8.14 beschrieben mit Iodoacetamid im Aufschlußpuffer aufgereinigt. Als Kontrolle diente ein Ansatz ohne Iodoacetamid. Zusätzlich wurden mögliche freie SH - Gruppen mittels Ellmann Titration nachgewiesen. Dabei wurden keine freien SH - Gruppen im Ansatz des Iodoacetamid behandeltem His6xMalE sowie dem Kontrollansatz detektiert (Daten nicht gezeigt). Anschließend wurden die Proben mittels SDS - Page (siehe Abbildung 4.10) und Größenfraktionierung analysiert.
S L
- β - ME + β - ME
K IAA K IAA
66 kDa 45 kDa
Abbildung 4.10: Analyse der Iodoacetamid behandelten His6xMalE - Proben mittels 12 % SDS - Page. K: Kontrollansatz (Iodoacetamid unbehandelt), IAA: Iodoacetamid behandelt, + β - ME: β - Mercaptoethanol im Auftragepuffer, - β - ME: kein β - Mercaptoethanol im Auftragepuffer, S: Standard 70L, L: LMW Standard. Markiert sind die 45 kDa und 66 kDa Banden der Größenstandards.
Abbildung 4.10 zeigt eindeutig, daß die dimere Form von His6xMalE nur im Kontrollansatz unter nicht reduzierenden Bedingungen erscheint. In allen anderen Ansätzen ist nur noch das Monomer zu beobachten. Gleiches wurde mittels Größenfraktionierung beobachtet. Iodoacetamid behandeltes His6xMalE eluierte als
Monomer, wohingegen im Kontrollansatz sowohl Mono- als auch Dimer zu detektieren waren (Daten nicht gezeigt).
Die Dimerisierung erfolgt also über das (einzige) N - terminale Cystein des Proteins.
Da dieses Cystein im nativen Zustand aber mit dem Lipidanker des Proteins verestert ist (154), handelt es sich bei der Dimerisierung des Proteins wahrscheinlich um ein in vitro Artefakt.
Ein Vergleich des Iodoacetamid behandelten Proteins mit dem Kontrollansatz bezüglich seiner Affinität zu Maltopentaose mittels Oberflächen - Plasmon - Resonanz - Spektroskopie zeigte keine signifikanten Unterschiede.
Abschließend läßt sich folgern, daß MalE ein Maltodextrin - Bindeprotein mit schwacher Affinität zu Maltose ist. Dies ließ sich mit zwei unabhängigen Methoden eindeutig feststellen.
4.2 Maltose - und Maltodextrin - Transport
Nachdem gezeigt wurde, daß MalE Maltose und Maltodextrine bindet, sollte nun geklärt werden, ob das durch das Gen - Cluster malR - pgcM kodierte System auch für die Aufnahme von Maltose und Maltodextrinen verantwortlich ist und ob zusätzliche Genprodukte für den Transport der Zucker notwendig sind.
Dazu wurden unterschiedlichste Stämme für die Transport - Messungen verwendet:
Stamm relevanter Genotyp Bemerkung1)
wt168 - -
GP110 glvC potentielles Maltose spezifisches EIICB (EIICBMal) MD153 ptsG Glukose spezifisches EIICBA (EIICBAGlc) MD235 ΔmalE Maltodextrin - Bindeprotein (MalE)
MD247 ΔmalE glvC MalE, EIICBMal
MD274 malF-malG potentielle Maltodextrin ABC - Transporter Permeasen
MD275 yvdJ YvdJ (Funktion unbekannt)
MD278 malF-malG glvC MalF und MalG, EIICBMal
MD279 yvdJ glvC YvdJ, EIICBMal
MD285 msmX potentielle ABC - Transporter ATPase (MsmX)
MD286 msmX glvC MsmX, EIICBMal
Tabelle 4.4: Stamm - Erklärungen. Angegeben sind die Stammbezeichnungen und der jeweilige relevante Genotyp. Bemerkung1): Auflistung der Proteine, die in diesen Stämmen inaktiviert sind oder fehlen.
Die Ergebnisse mit den Stämmen, die Mutationen in malF, malG oder yvdJ tragen wurden in Zusammenarbeit mit Holger Krafft erzielt (83).
4.2.1 Maltose - Transport
In den Messungen bezüglich des Maltose - Transports sollte geklärt werden, ob Maltose trotz der geringen Affinität zu MalE über den potentiellen Maltose - ABC - Transporter (kodiert durch malE, malF und malG) aufgenommen wird.
Transport - Aktivität [pmol * min-1 * A600nm:1,0-1]
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
wt168
wt168 MG wt168 (-)
glvC ∆malE malF-malG
yvdJ glvC;
∆malE
glvC; malF-malG glvC; yvdJ
ptsG
Abbildung 4.11: Maltose - Transport in unterschiedlichen Stämmen. Alle Stämme wuchsen in LB - Medium, dem 1 % Maltose (blau) hinzugefügt war. Zusätzlich wurde der Wildtyp - Stamm noch in LB - Medium, dem zusätzlich zu Maltose noch 1 % Glukose hinzugefügt worden war (wt168 MG, rot) sowie in LB - Medium kultiviert ( wt168 (-), grün). Die gemessenen Transport - Aktivitäten sind in pmol Maltose, die von 1 ml Zellen mit einer A600nm: 1,0 in einer Minute aufgenommen werden [pmol * min-1 * A600nm:1,0-1], angegeben. Die relevanten Genotypen sind unter den entsprechenden Balken aufgeführt.
Aus den Ergebnissen geht eindeutig hervor, daß der Maltose - Transport in B. subtilis durch Maltose induzierbar ist. Dagegen ist der Maltose - Transport reduziert, wenn neben Maltose zusätzlich Glukose im Medium vorhanden ist. Maltose wird unter induzierenden Bedingungen durch GlvC und nicht durch das, durch malE, malF und malG kodierte, potentielle Maltose - und Maltodextrin - Aufnahmesystem
transportiert. Das Fehlen des Glukose spezifischen Enzym IICBA (MD153) hat auf die Maltose - Aufnahme keinen negativen Einfluß. Vielmehr ist die Aufnahmerate in diesem Stamm im Vergleich zum Wildtyp sogar leicht erhöht.
4.2.2 Maltotriose - Transport
Nachdem das durch malE, malF und malG kodierte Aufnahmesystem keinen Einfluß auf die Maltose - Aufnahme hat (siehe Kapitel 4.2.1), sollte geklärt werden, ob es für die Aufnahme von Maltodextrinen verantwortlich ist. Daher wurden unterschiedliche Stämme bezüglich ihrer Fähigkeit Maltotriose zu transportieren untersucht.
Transport - Aktivität [pmol * min-1 * A600nm:1,0-1]
0 20 40 60 80 100 120 140 160
wt168
wt168 MGwt168 (-)
glvC ∆malE malF-malG
msmX yvdJ
glvC;
∆malE
glvC; malF-malG
glvC; msmXglvC; yvdJ
Abbildung 4.12: Maltotriose - Transport in unterschiedlichen Stämmen. Alle Stämme wuchsen in LB - Medium, dem 1 % Maltose (blau) hinzugefügt war. Zusätzlich wurde der Wildtyp - Stamm noch in LB - Medium, dem zusätzlich zu Maltose noch 1 % Glukose hinzugefügt worden war (wt168 MG, rot) sowie in LB - Medium kultiviert ( wt168 (-), grün). Die gemessenen Transport - Aktivitäten sind in pmol Maltotriose, die von 1 ml Zellen mit einer A600nm: 1,0 in einer Minute aufgenommen werden [pmol * min-1 * A600nm:1,0-1], angegeben. Die relevanten Genotypen sind unter den entsprechenden Balken aufgeführt.
Ähnlich wie die Aufnahme von Maltose, so ist auch die Aufnahme von Maltotriose induziert, wenn Maltose dem Medium zugegeben wurde und es ist keine Aufnahme zu detektieren, wenn Maltose und Glukose im Medium vorhanden sind. Alle Stämme, die Mutationen in nur einem Gen tragen, zeigen keinen signifikanten Einfluß auf den
