TARTU RIIKLIKU ÜLIKOOLI TOIMETISED УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ
ТАРТУСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА
A L U S T A T U D 1893. a. V f H I K 243 В Ы П У С К ОСНОВАНЫ в I W 3 Г
MIКROBIOLOOGIA-ALASEID TÖID ТРУДЫ ПО МИКРОБИОЛОГИИ
I
Р ARMIDE FÜSIOLOOGIA JA BIOKEEMIA KÜSIMUSI ВОПРОСЫ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ ДРОЖЖЕЙ
T A R T U R I I K L I K U Ü L I K O O L I T O I M E T I S E D
УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ
ТАРТУСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА
A L U S T A T U D 1893. a. VIHIK 243 ВЫПУСК О С Н О В А Н в 1893 г
M IKR0BI0L00GIA-ALASE1D ТОГО ТРУДЫ ПО МИКРОБИОЛОГИИ
I
PÄRMIDE FÜSIOLOOGIA JA BIOKEEMIA KÜSIMUSI ВОПРОСЫ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ ДРОЖЖЕЙ
TARTU 1970
Предисловие
Б настоящ ем сборнике излож ены результаты экспериментальных исследований сотрудников-микробиологов каф едры физиологии и био
хи м и и растений Тартуского государственного университета. Данные эксперименты по изучению влияния низких и средних, с биологиче
ской точки зрения, интенсивностей высокочастотного 880 кгц ультразву
ка на ф изиологию и биохимию пекарских др ож ж ей S. cerevisiae и кормо
вы х др о ж ж ей C. utilis проводились в 1966—1968 гг. Как видно из при
веденны х в настоящ ем сборнике данны х, результаты исследования привели к общ ем у выводу, что полоса стимуляции в спектре интен
сивностей ультразвука с данными параметрами очень узка и леж ит в границах очень низких интенсивностей. Часто эта полоса вообще не обнаруж ивается, т. е. стимуляционны е эф ф екты являются неустойчи
выми. Зато, начиная со средних интенсивностей (1,5—2,4 вт/см2), зако
номерно наблю дается отрицательное влияние ультразвука на различ
ные ф изиологические и биологические процессы испы танны х др ож ж ей.
Тем не м енее, изучение тонких изм енений в клеточных процессах под влиянием таких доз ультразвука, которые ещ е не вызывают м еханиче
ского разруш ения клеток, но причиняют «мягкие», легко-обратимые отрицательны е эф ф екты , представляет интерес, так как позволяет лучш е понимать ф изиолого-биохим ические м еханизм ы воздействия данного ф актора на микробную клетку. Если статьи, приведенные в' настоящ ем сборнике, кое-что прибавляют к пониманию этих м ехан и з
мов, то сборник в целом выполняет свои задачи.
В. Тохвер.
Заведую щ ий каф едрой физиологии и биологии растений ТГУ-
Ta r t u ü l i k o o l i
Ra a m a t u k o g u
<
О ВЛИЯНИИ УЛЬТРАЗВУКА НА НЕКОТОРЫЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ ДРОЖЖЕЙ
В. Тохвер, В. Лийас, Т. Крамм, Р. Рапдла.
Воздействие ул ьтразвука на биологические объекты изве
стно начиная с 20-х—30-тых годов нашего столетия [1, 2, 3].
В частности, в этот период вы ш ла в свет и первая работа по влиянию У З на дрож ж и [4], но обстоятельное исследование данного вопроса началось лиш ь в середине 40-вых годов, ког
да впервы е применялись специальные аппараты, позволяю щие точно установить и варьировать парам етры фактора.
В настоящ ее врем я в биологии применяю тся генераторы в широком диапазоне мощностей. По Б айеру и Дернеру [5] их можно разделить по выходной интенсивности У З на низко-, средне- и высокоинтенсивные (соответственно 0— 1,5, 1,5—3 и 3— 10 вт/см"). Следует отметить, однако, что в биологии невоз
можно применение интенсивностей около 10 вт/см 2 так как они обязательно воздействуют на клетки разруш ительно [6].
При интенсивностях около 10 вт/см 2 разруш аю тся в особен
ности клетки микроорганизмов [7]. При низких же дозах дей
ствие У З не сводится только к механическим разруш ениям [8]. Кроме м еханических эффектов наблюдаются тонкие фи- зико-химические, морфологические и цитологические измене
ния [9, 10, 11, 12]. Особый интерес представляю т данные, сви
детельствую щ ие о возможности получения под влиянием ум еренны х доз У З ф ункциональны х изменений обратимого характера, которые, следовательно, не обязательно приводят к гибели микробов [13, 14].
Сущ ествую щ ие в литературе данные показываю т, что эф ф ект от применения У З зависит не только от интенсивности ф актора, но и от частоты колебания У З и от продолж итель
ности экспозиции [15, 16, 17]. Можно, однако, считать уста
новленным, что повышение интенсивности У З является нам
3
ного более эф ф ективны м мероприятием, чем удлинение про
долж ительности экспозиции в потоке ■ фактора. Комолова, нап
ример, показы вает, что в пределах частоты 300— 1000 кгц мощности, л еж ащ и е ниж е границы кавитации, не оказы ваю т на дрож ж евы е клетки летального воздействия даж е при экспозиции выш е двух часов [16]. При использовании ж е ин
тенсивностей вы ш е 3 вт/см 2 отмечалось начало гибели дрож жей, несмотря на более короткое врем я воздействия.
Н ачиная с определенной интенсивности УЗ, все организмы подчиняю тся разруш ительном у воздействию фактора, но л е тал ьн ая доза у различны х микроорганизмов резко различа
ется [18, 19]. Относительно устойчивыми к влиянию У З я в л я ются дрожжи, в особенности сахаромицеты [10, 15, 20, 21, 22, 23]. Эта особенность позволяет использовать дрож ж и в каче
стве подходящ их объектов для изучения «физиологического»
воздействия УЗ.
В литературе имеются некоторые указания, свидетельст
вую щ ие о том, что в определенны х условиях можно при по
мощи У З стим улировать размнож ение дрож ж ей [24]. повы
ш ать продукцию биомассы [25] и усиливать процессы броже
ния [26, 27, 28]. Имеются, однако, и противополож ные у к аза
ния, отрицающие возможность стим уляции физиологических процессов дрож ж ей посредством У З [2. 29]. Дело, по-видимо
му. в различиях условий эксперимента, а вопрос в целом н ельзя считать обстоятельно изученным.
У читы вая все сказанное, для нас представляло интерес изучение влияни я низких и средних доз У З при высокой час
тоте колебания на некоторые физиологические процессы дрожжей, в частности на рост и размнож ение дрож ж евы х клеток. В связи с ростовыми процессами изучались, кроме то
го, способность клеток к утилизации источников углерода, расход энергетического м атериала на 1 г прироста биомассы и бродильная способность культур. Р езул ьтаты соответству
ющ их исследований излагаю тся в настоящ ей статье.
М атериал и методика
Объектами исследований служ или пекарские дрож ж и Saccharomyces cerevisiae, Томский ш тамм 107 и кормовые дрож ж и Candida utilis, ш тамм 4.
О пыты проводились в 5-литровы х сосудах с 3,8 л жидкой питательной среды, глубинным способом, при 27,5°С в ш ести- (S. cerevisiae) или семикратной (C. utilis). повторности. Сосуды, среды и принадлеж ности стерилизовались в автоклаве. За врем я инкубации (24 часа для S. cerevisiae и 36 часов для
4
C. utilis) культуры всех аэробных вариантов продувались сте
рильны м воздухом с интенсивностью 3 объема в минуту через ^ распы лители из стеклянного ф ильтра JY« 2. Анаэробные же кул ьту ры инкубировались без аэрации в 5-литровых плоско
донных колбах, наполненных средой до узкого горла и снаб
ж енны х стеклянны м и затворами для предотвращ ения доступа воздуха. П родолжительность инкубации анаэробных к у л ь
тур — 5 суток.
Использовались следующие среды, при составлении кото
ры х руководствовались литературны м и указаниям и для аэробных и анаэробных культур [30, 31, 32, 33, 34, 35]:
М е л а с с о в а я № 1 для аэробных культур Меласса сахарной промышленности, разбавленная до концентрации 1%
по содержанию сахаров —
Са3( Р 0 4)2 —
(NH4)2H P 0 4 —
Биотин —
П антотенат кальция —
Конц. серная кислота до
реакции pH —
М е л а с с о в а я № 2 для анаэробных культур По сравнению с преды дущ ей средой содержание сахаров повышено до концентрации 10%
С и н т е т и ч е с к а я № 3 Водопроводная вода Сахароза
(NH4)2H P 0 4 M g S 0 4
к н2р о4 СаС12
Смесь микроэлементов Биотин
Пантотенат кальция Конц. серная кислота до реакции pH
1000 мл 1.0 г 1.0 г 0,29 мг 0,50 мг 5.0
для аэробных культур
— 1000 мл
12 г или 25 г*) 1 г
0,3 г 1 г 0,1 г
1 мл 0,29 мг 0,50 мг 5,0
Смесь микроэлементов составлялась по рецепту М. В. Ф е
дорова (36).
Д ля получения инокулята проводились пересевы из м узей
ных культур на агаровую среду (мелассовая среда № 1 с при
бавлением 1,5% агара). После 24-часовой инкубации при
♦
*) Для S. cerevisiae — 12 г, для C. utilis — 25 г
5
27,5 С выросший м атериал собирали и суспензировали на качалке в стерильной водопроводной воде до титра 107 Д ля з а раж ения опы тны х сред брали в качестве инокулум а по 50 мл суспензии клеток на каж ды й сосуд. О звучивание проводилось в соответствии с планом опы тных вариантов в инокулум е при условии непосредственного контакта с датчиком (37). И споль
зовали генератор У З типа УТС-1, который позволял модуг- лировать интенсивность ф актора в пределах 0,2— 2,4 вт/см2, при частоте колебания 880 кгц.
П рименялись следую щ ие дозы УЗ:
В ы ходная ин
тенсивность УЗ, вт/см2
П родолж и
тельность экс
позиции, мин.
Общая доза УЗ, к дж /см 2
К валиф ика
ция доз
0,4 15 0,36
0,4 30 0,72
1,2 15 1,08
1,2 30 2,16
2,0 30 3,60
\
/ низкие средние
В опы тны х условиях вы ращ ивались параллельно неозву
ченная контрольная и озвученны е различны м и дозами УЗ к у л ьту р ы дрожжей. О пыты с одним и тем ж е составом вари
антов повторялись 6 раз для S. cerevisiae и 7 раз для С. utilis.
На основе полученны х данны х вы числялись средние. Такие серии проводились отдельно для обоих видов испытанных дрож ж ей в различны х условиях питательной среды и аэри- руемости (S. cerevisiae — на средах № 1 и 2, С. utilis. — на средах № 1 и 3). Кроме того, для установления динамики при
роста биомассы, титра клеток и содерж ания в среде сахаров у С. utilis проводились отдельные опыты в четырехкратной повторности как для неозвученного, так и озвученного 3,60 кдж /см 2 варианта.
В ходе опытов проводились следующ ие анализы:
а) Определение динамики и продукции биомассы. Д рож ж евы е клетки, после предусмотренного пром еж утка времени (24 часа для S. cerevisiae и 36 ч. для С. utilis), отцентрифУги- ровали и подвергали определению сырого и сухого веса.
При динамических анализах у С. utilis определения проводи
лись через 6, 12' 18, 28 и 36 часов с начала опыта.
б) О пределение динамики численности дрож ж евы х клеток Е к у л ьту рах проводили подсчетом клеток под микроскопом в кам ерах Горяева. На основе данных о титре и биомассе в ы числяли средний вес 106 клеток.
6
в) Определение содерж ания сахаров в культуральной ж ид
кости. И спользовалась надосадочная ж идкость после центри
ф угирования при 5000 X g. Данный супернатант профильтро
вы вался и в полученном растворе определялись по Бертрану восстанавливаю щ ие моносахариды, сахароза и олигосахариды мальтозного типа.
г) О пределение этанола проводилось по реакции окисления бихроматом калия в присутствии избыточной серной кислоты.
Пробы, взяты е для анализа, предварительно дваж ды перего
нялись, сначала из кислой, а затем из щ елочной среды для устранения органических кислот. Сернокислый раствор бих
ромата калия (бихром, калия — 20г/л + р а в н ы й объем серной кислоты, уд. вес 1,94) прибавлялся «в пробу при нагревании, вместе с маленькой порцией добавочной серной кислоты, до исчерпы вания восстанавливаю щ ей способности взятой пробы, т. е. до появления в смеси постоянного ж елто-оранж евого от
тенка. И нтенсивность ж е основной зеленой окраски, получен
ной в результате восстановления бихромата калия этанолом, определялась в спектрофотометре СФ-4 при л = 565 нм про
тив исходного раствора бихромата калия. Количество этило
вого спирта было найдено по эталонной кривой.
По данным отдельных повторностей вы числялись арифм е
тически средние показатели. Их уровень значимости, а такж е достоверность имею щ ихся разниц оценивались при помощи t -теста.
Р езультаты и обсуждение
В табл. 1 и 2 приведены данные о влиянии У З на процес
сы роста дрожжей. Видно, что примененные дозы УЗ, хотя и не являю тся сильнодействующ им фактором, все ж е оказы ва
ют заметное влияние на интенсивность разм нож ения и накоп
ления биомассы как у S. cerevisiae, так и у С. utilis. В частности, сказанное относится к максимальной из числа примененных доз У З (3,60 кдж /см 2, при интенсивности ф актора 2,0 вт/см).
Под влиянием такой дозы, в аэробных условиях, на мелассо- вой среде, продукция биомассы сниж алась на 22— 23% у обоих видов испы танны х дрожжей. Приблизительно такие ж е эф ф екты отмечались на мелассовой среде в анаэробных усло
виях (снижение продуктивности на 25%).
На синтетической среде (С. utilis) отрицательный эфф ект от средних доз УЗ (2,16—3,60 кдж /см 2) значительно сильнее (снижение интенсивности роста до 48%). Следовательно, повреждения, вы званны е такими дозами УЗ, проявляю тся более отчетливо на неполноценной питательной среде. Это свидетельствует о том, что происходили расстройства систем
Т а б л и ц а 1 Влияние ультразвука на рост
S acc h a ro m vc es cerevisiae
Реж им опыта
; Среда
Варианты по озвуче
нию, доза в к дж /см 2
П родукция биомассы, сухой вес,
г/л
I Сухой Титр клеток вес 10н х 10'3/мл клеток,
мкг
А эроб
ный
М елас
совая
№ 1
Неозвуч.
контроль 0,36 0,72 1,08 2,16 3,60
1,32 ±0,08 1,46 ±0,06 1,60±0,14 1,28 ±0,07 1Д0±0,07 1,02±0а06
104 ± 1 0 108 ± 8 122 ± 1 3 100 ± 8 83 ± 1 5 8 5 ± 14
12.7 13,5 13.1 12.8 13.2 11,4 А н аэ- М елассовая
робный № 2
Неозвуч.
контроль 0,72 2,16 3,60
0,66±0,12 0,66 ±0,07 0,49 ±0,07 0,49 ±0,04
51 ± 6 4 5 ± 12 43 ± 9 43 ± 9
12,9
• 14,7 11.4 11.4
Т а б л и ц а 2 Влияние ультразвука на рост
C andida utilis
Реж им — аэробный
Среда
1 Варианты
ПО озвучи- ; П родукция 1 1^ 1 грТитр клеток,
1 ванию, биомассы, 1rU),
, „ , ! х*10‘/мл
доза в сухой вес, г/л [
к дж /см 2 1 j
Сухой вес IO13 кле
ток, мкг
М елассовая Н еозвуч.
№ 1 контроль 1,79±0,17 115 ± 6 15,6
0,72 1,44 ±0,22 126 ± 7 12,7
2,16 1,49 ±0,05 103 ± 8 14,5
С интети
3,60 Неозвуч.
1,38±0,13 100 ± 8 13,8
ческая контроль 2,11 ±0,38 131±7 16,1
№ 3 2,18 ±0,20 148 ± 6 14,7
0,72 1,94 ±0,28 134 ± 7 14,5
2,16 3,60
1,08 ±0,24 106 ± 5 10,2
8
синтеза неких нуж ны х для ж изнедеятельности клеток соеди
нений, которыми клетки могут снабдиться за счет веществ, имею щ ихся в натуральной мелассовой среде.
Интересно отметить, что в результате озвучивания дрож ж ей средними дозами У З снижение титра клеток несколько меньше, чем снижение продукции биомассы (снижение титра клеток на 13— 19%, вместо 22—23% сниж ения биомассы). Это значит, что вес 106 клеток в озвученном варианте на 10— 12%
(на синтетической среде даж е на 37%) меньше, чем в конт
роле. Из этого следует, что одним эффектом средних доз УЗ, кроме вы ш еуказанны х, является деление клеток до достиже
ния «нормальных» размеров.
Выш е отмеченные эф ф екты не всегда достигают значений, которые на уровне значимости 0,95 по t-тесту можно при
знать достоверными. Следует однако отметить, что при дан
ны х (средних) дозах УЗ отрицательны й эф ф ект наблю дался во всех отдельны х случаях без исключения. Это позволяет, то тесту К ем ельрьика [38], отмеченное направление эффектов признать реальным, независимо от результатов t-теста.
Н изкие дозы У З в пределах 0,36— 1,08 кдж /см 2 (см. мето
дику) оказались неэфф ективны ми или же, в некоторых опы
тах, они вы звали небольшую стимуляцию процессов роста.
Такой полож ительны й эффект, однако, является очень нена
деж ны м и не вы зы вает практического интереса.
Р и с . 1. Динамика биомассы и сахаров в культуре С. utilis. Синтетическая среда с 1% сахарозы . I—
1а — сухой вес биомассы, г/л, в контроле и облу
ченном 3,60 к дж /см 2 варианте, II — сахароза, г/л, III — редуцирую щ ие моносахариды, г/л.
9
На рис. 1 кривой 1 указана динамика накопления биомас
сы в неозвученны х кул ьту р ах С. utilis. П олученная кривая свидетельствует о незначительной лаг-ф азе п родолж итель
ностью 1—2 часа. Значительное отставание от этого наблю да
ется в культуре, озвученной дозы У З в 3,60 кдж /см 2 Р азница меж ду неозвученной и озвученной культурам и значительно ум еньш ается уж е при первом, а практически исчезает при втором или третьем пересеве озвученны х культур. Следова
тельно, под влиянием примененных доз У З не происходило необратимых глубоких изменений в аппаратуре наследствен
ности. Н аблюдаемые повреждения, очевидно, носят характер временных расстройств «физиологических» механизмов.
В табл. 3 и 4 излож ены данные, характеризую щ ие способ
ность дрож ж ей к использованию сахаров, находящ ихся в пи
тательной среде. К ак видно по этому показателю, испытанные дрож ж и мало различаю тся меж ду собой. Почти одинаковой явл яется и реакция на различны е дозы УЗ. Н изкие по наш е
му квалифицированию дозы У З на указанную способность практически не оказы ваю т влияния. При дозе же 3,60 кдж /см 2 отмечается снижение уровня использования сахаров на 9— 17% (в суммарном выраж ении). Как правило, при этом сниж ается и экономность использования энергетического м а
териала, так как расходы на 1 г прироста биомассы увеличи
ваю тся на 8— 18%, в зависимости от состава среды.
На рис. 1 (кривые 2 и 3) видно, что в аэробных культурах С. utilis разлож ение сахарозы начинается довольно активно почти с самого начала культуры . Уже к 12-ому— 18-ому часу процесс идет почти до максимума — концентрация сахарозы приобретает определенное минимальное значение (около 1,5 г/л), при котором дальнейш ее разлож ение данного дисаха
рида в данной культуре становится невозможным.
В то же время, в первз^ю половину культивации, когда рост дрож ж ей еще довольно неактивен, продукты разлож ения са
харозы не полностью находят дальнейш ее использование. В результате этого, в культуральной ж идкости накапливаю тся редуцирую щие моносахариды. Их содержание начинает п а
дать лиш ь с 19-го— 20-го часа культивации и идет до зн а
чительно меньш ей концентрации, чем отмечено у сахарозы (остаточное содержание моносахаридов около 0,4—0,6 г/л).
Суммарно к 12-ому часу использовалось 0,41 ±0,10 г/л са
харов (начальное содержание 12 г/л), к 18-ому — 1,08 ± 0 22 г/л, к 28-ому — 7,92 ±0,10 г/л и к 36-ому часу — 10,2 ±0,11 г/л.
При этом, в соответствующ ие периоды для прироста 1 г био
массы израсходовалось соответственно 1,87, 1,93, 4,74 и 5,21 г сахаров. Следовательно, экономия использования сахаров в
10
Т а б л и ц а 3
Р е ж и м о п ы та
А эроб
н ы й
А н а э ро б н ы й
С реда
М е л а с
со в ая
№ 1
Влияние ультразвука на использование сахаров культурами S a cc h a ro m yc es cerevisiae
С р е д н я я п о гр еш н о сть п р и ве д е н н ы х д а н н ы х ±5,0%
В а р и а н т ы по о зв у ч и
ванию , доза в к д ж /с м 2
И зм ен ен и е со д е р ж а н и я са х ар о в з а в р е м я опы тов С а х а р о за и др.
о л и го сах а р и д ы д ан н ого ти п а
Д и са х ар и д ы м альтозн ого
ти п а
Р ед у ц и р у ю щ и е м о н о сах а р и д ы
С ум м а са х ар о в
г/л %
И зр а с - содовано
сах ар о в на 1 г п р и р о с
та био
м ассы , г
До опыта: 8,74 1,07 0,98 10,79
Неозвуч.
контроль —8,00 — 92 — 1,00 —93 —0,25 —26 —9,25 -86 7,00
0,72 —8,01 —92 — 1,00 - - 93 —0,42 —43 —9,43 —87 6,45
2,16 - 7,01 —г37 — 1,03 —96 —0,13 — 13 —<8,77 — 81 7,96
3,60 —7,55 —86 —0,93 —87 —0,13 — 13 —8,71 —81 8,53
М е л а с
со в ая
№ 2 До опыта: 76,8 3,84 9,86 90,50
Н еозвуч.
контроль —65,5 — 86 —3,(84 — 100 + 1,44 + 15 —67,90 —75 103
0,72 —65,1 —85 —3,84 — 100 —0,15 — 1,5 —69,09 — 76 104
2,16 —64,3 —85 —2,89 — 75 + 5,35 —54 —61,84 —68 113
3,60 — 65,2 —85 —2,89 — 75 + 6,54 —68 —61,54 —68 113
Т а б л и ц а 4
Среда
В лияние ультразвука на использование сахаров культурами C andida utilis
Средняя погреш ность при
веденны х данны х ±4,8%
Р еж им опыта — аэробный И зменение содерж ания сахаров за время опытов
Варианты по озвучива
нию, доза в к д ж /см 2
С ахароза и др.
олигосахариды данного типа
Дисахариды мальтозного
типа
Редуцирую щ ие моносахариды
Сумма сахаров
г/л
И зр асхо
довано са х а ров на 1 г
прироста биомассы,
г
М елас
совая
До опыта:
Н еозвуч.
6,80 0,72
контроль —6,27 - 92 0,11
0,72 6,49 —95 — 0,14
2.16 —6,61 97 0,07
3*60 —6,66 —98 + 1,16
Синтети
ческая
До опыта:
Н еозвуч.
12,0 0
контроль — 10,6 —88 0
0,72 —10,8 90 0
2.16 - 10,7 —89 0
З‘б0 — 10,7 - 89 0
с
- 1 5
3,08
—2,55 —83
10,60
—8,93 —84 5,00
- 1 9 —2,43 —79 —9,06 —85 6,30
- 1 0 —2,аз —68 —8,76 —83 5,88
161 — 1,92 —62 —7,42 —70 5,38
0 12,0
_ + 0,42 + ~ — 10,2 —85 4,83
— + 0,43 + ^ — 10,4 —87 4,77
— + 0,74 + ~ — 10,0 —83 5,15
— + 1,43 + - — 9,27 — 77 8,58
молодых кул ьту рах в 2—2,7 раза выше, чем в культурах, приближ аю щ ихся к концу ф азы экспоненциального роста.
В анаэробных культурах (S. cerevisiae) сахара использу
ются, как и следовало ожидать, с многократно меньш ей эко
номностью, чем в аэробиозе (табл. 3). У величиваю тся и не- достигаемые для использования количества сахаров.
Т а б л и ц а 5 В лияние ультразвука на продукцию этанола в культурах
Sacch. cerevisiae
Реж им опыта
' Варианты по
Среда озвучиванию,
доза в к дж /см 2
Накопление этанола, г/л
Аэробный М елассовая
№ 1
Неозвученный контроль
0,72 2,16 3,60
0,50±0,12 0,48 ±0,11 0,50 ±0,10 0,45 di 0,14 Анаэробный М елассовая Н еозвученны й
№ 2 Контроль 16,2 ±2,12
0,72 18,5 ±2,33
2,16 14,4±2,12
3,60 13,3 ± 1,77
Наконец, в табл. 5 излож ены данные о бродильной способ
ности S. cerevisiae. В аэробных условиях она незначительна, но все же сущ ествует. Это показывает, что «отрицательная индукция» филогенетически старой биохимической системы нелегкая вещь. Н аряду с общими с дыханием реакциями гли
колиза в аэробиозе постоянно продолж аю т некоторую работу и этапы, прямо приводящ ие к образованию этанола, т. е. ис
тинного алькогольного брожения. Такой вывод подтверж да
ется и некоторыми литературны м и данными [39].
В анаэробиозе продукция этанола в 30—40 раз выше, чем в аэробных условиях. П оказатели накопления этанола дости
гали в наш их опы тах за 120 часов 16— 19 г/л. Не получено статистически достоверного изменения данного показателя под влиянием примененных доз УЗ, отмечена лиш ь тенден
ция к повышению бродильной способности при низких и к снижению при средних дозах этого фактора.
13
В ы в о д ы
И зучалось влияние ул ьтразвука 880 кгц в дозах 0,36—3,60 кдж /см 2 при интенсивностях 0,4—2,0 вт/см 2 на некоторые ф и зиологические процессы Saccharomyces cerevisiae и Candida utilis. Выяснилось следующее:
1. Под влиянием У З в дозах 2,16—3,60 кдж /см 2 обнаруж ено снижение накопления биомассы и разм нож ения клеток дрож ж ей на 13— 48%. Дозы У З ниж е у казан ны х не вы зы вали з а метного эффекта, или ж е наблю далась небольш ая стим уляция процессов роста.
2. М инимальные дозы УЗ не вы зы вали сущ ественны х из
менений в коэффициенте утилизации сахаров дрож ж ам и. До
зы же 2,16—3,60 кдж /см 2 у S. cerevisiae и 3,60 кдж /см 2 у С. u ti
lis приводили к снижению данного коэффициента от 86 до 81% и от 85 до 70% соответственно.
3. К летки S. cerevisiae израсходовали в аэробных условиях около 7 г сахаров на 1 г прироста биомассы, а клетки С. u ti
lis в таких же условиях — около 5 г. Под влиянием У З рас
ход сахаров на 1 г прироста биомассы повы ш ался на 10— 80%, в зависимости от дозы фактора. В анаэробных условиях (S. ce
revisiae) экономность использования сахаров в 15— 18 раз ни
ж е данного показателя в аэробиозе.
4. Примененные дозы У З не вы зы вали статистически дос
товерных эффектов в накоплении этанола в анаэробных к ультурах S. cerevisiae. Отмечена, однако, тенденция к повы
шению данного показателя при низш их (0,72 кдж /см 2) и к сни
жению при высш их (2,16— 3,60 кдж /см 2) дозах УЗ.
5. Под влиянием примененных доз У З не обнаружено не
обратимых глубоких изменений в физиологических процессах дрожжей. В пределах мощностей, квалиф ицируем ы х по Б ай е
ру и Дернеру среднеинтенсивными (1,5—3 вт/см 2), наблю да
лись повреждения физиологических процессов, носящ ие х а
рактер врем енны х расстройств и легко исчезающ ие при пос
ледую щ их пересевах.
Л И ТЕРАТУРА
1. Е. N. Н а г V е у, A. L. L o o m i s . N ature, 1928, 121, 622.
2. М. P a i с, V D e u t s c h , L. В е г с i 11 е. Compt. г. Soc. Biol., 1935, 119, 1063.
3. Т. D. B e c k w i t h , С. Е. W e a v e r . J. B acteriology, 1936, 32, 361.
4. T. D. B e c k w i t h , A. R. O l s o n . Proc. Soc. Expt. Biol. Med., 1931, 29, 362.
5. В. Б а й е р , Э. Д е р н е р . У льтразвук в биологии и медицине. Л е
нинград, Гос. и зд-во мед. литературы, 1953, стр. 81.
6. L. Н е г f о г t h, H. Al. W i n t e r . Ultraschall. Leipzig. В. G. Treubner V erlagsgesellschaft, 1958, S. 138— 173.
14
7. И. Е. Э л ь п и н е р . Ж. технической физики, 1951, 21, 10, 1204 8 М. Н. М е й с е л ь , Р. Д. Г а л ь ц о в а , И. Е. Э л ь п и н е р . Ж. общ.
биологии, 1956, 17, 4, 317.
9. K. Z a p f . Zbl. Bakt., В, 1953, 159. 449.
10. Г А. М е д в е д е в а , И. Е. Э л ь п и н е р . Ж. общей биологии, 1955, 16, 4, 315.
И. А. С. Ш а р к о в а, И. Е. Э л ь п и н е р . Биоф изика, 1957, 2, 3, 351.
12. Н П. Ф а д е е в а , И. Е. Э л ь п и н е р , Я. И. Р а у т е и ш т е й н.
Микробиология, 1961, 30, 5, 849.
13. Н. П. Ф а д е е в а , И. Е Э л ь п и н е р . Микробиология, 1959, 28, 4, 488,
14. И. Е. Э л ь п и н е р . У спехи совр. биологии, I960, 61, 2, 213.
15. М. П. Г н у т е н к о, А. В. Ш т р о м б е р г е р, Л Г. Г у м и л е в с к а я . Микробиология, 1956, 25, 5, 556.
1& Г. С. К о м о л о в а. В сб. «О химическом и биологическом дейст
вии ультразвука». Красноярск, 1962, стр. 84—107.
17. R. О. P r u d h o m m e , Т. C o n s t a n t i n , Compt. г. Soc. Biol., 1963, 157, 489.
18. H. K. С о л о в ь е в а , И. E Э л ь п и н e p, H. П. Ф а д е е в а . Мик
робиология, 1956, 25, 6, 684.
19. И. Е Э л ь п и н е р . Ультразвук. Ф изико-хим ическое и биологи
ческое действие. М., Гос. и зд-во ф изико-м атем атической лит., 1963, стр. 279—340.
20. О. И. К р я ч к о в а. Умерщ вление дрож ж евой клетки ультразву
ком. М., «П ищ евая промыш ленность»,N1964, стр 3—4.
21. Р, С. К а ц н е л ь с о н, М. А. Х е к о х Доклады АН СССР 1951, 76, 1, 133.
22. Н. К i п s I о е, Е. A c k e r m a n , J. Bacteriology, 1954, 68, 3, 373.
23. Г С. К о м о л о в а, М. С. Л е в и н с о н . Сб. «Вопросы биофизики и м еханизм а действия ионизирую щ их радиаций». Киев, изд-во «Здо
ровье», 1964, стр. 139—142.
24. Г. С. К о м о л о-в а, Н. П. Г р а ч е в а . Изв. Сиб. отд. АН СССР, серия биол. мед. наук, 1964, 1, 4, 56
25. М. Г. Л е в и н с о н В сб. «О химическом и биологическом дей ст
вии ультразвука». Красноярск, 1962, стр. 3—83.
26. А. Г. Б е с ч а с т н о в , О. И. Г у л и с, Л. В. П е т р о в с к а я . Инф.
бюлл. хлебопекарной и конд. пром-сти, 1964, 8, 19.
27. А. Д. Б е з з у б о в, Е. К. Г а р л и н с к а я. Ультразвук и его при
менение в пищевой промыш ленности. М., П ищ епромиздат, 1964, стр. 137.
28. М. П. Г н у т е н к о, Л. В. Ш т р о м б е р г е р. Микробиология, 1956, 25, 5, 566.
29. H. F i n k , H. R ü c k e r , W Fi . nk. Bioch. Zeitschr. 1953, 234, 1, 36, 30. C. П e p с к о т, О Д э н . Т ехническая микробиология. Перевод с английского. М., И зд-во иностр. лит., 1952, стр 94—120.
31. 3. Н. Ш а п о ш н и к о в . Т ехническая микробиология. М., И зд-во
«Высшая школа», 1947, стр. 80.
32. М. Ф р о б и ш е р . Основы микробиологии. Перевод с английского.
М., И зд-во «Мир», 19G5, стр. 44—54.
33. М. Б е к е р , У В и е с т у р с. Изв. АН Латв. ССР, 1963, 5, 95.
34. Д ж . У а й т. Технология др ож ж ей. М., П ищ епромиздат, 1957, стр. 95—96.
35. М. В. Ф е д о р о в. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Третье издание. М., Госиздат. С.-х. лит., 1957, стр. 133.
15
36. H. H o m p e s c h . Über d. M echanism us d. bakteriziden W irkung v.
JItraschall. Kongr.-Ber. d. Erlanger Ultraschalltagung. 1949. Реф . по (6), стр. 160.
37 Л. V a n d e r W a a r d e п. Matematische Statistik. Berlin. 1957.
38. Ю. Г П о п о в . Изв. АН Арм. ССР, 1958, 11, 7.
ON THE INFLUENCE OF ULTRASONIC WAVES UPON THE PHYSIOLOGICAL ACTIVITIES IN YEASTS
V. Tohver, V. Liias, T. Kraam, R. Randla S u m m a r y
U ltrasonic waves in doses 0.36 — 1.08 kJ/cm2 (freq 880 kHz, int 0.4 — 1.2 W/cm2) show only a weak influence upon the physiolo- gial activities (the rate of m ultiplication, the ability for ferm enta
tion, the rate and effectiveness of the utilisation of sugars) in S. cerevisiae and C. utilis. The doses of UW of 2.16 — 3.60 kJ/cm2 {(int. 1.2 — 2.0 W/cm2), however, cause decline in the level of the above-mentioned processes by 10—80 per cent, respectively, the effect being more prom inent in the conditions of synthetic media.
The observed dam ages in the physiological processes were in all cases readily reversible in the course of 2—3 subsequent passages of the yeasts.
НЕКОТОРЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ О ВЛИЯНИИ НЕВЫСОКИХ ДОЗ УЛЬТРАЗВУКА НА СОДЕРЖАНИЕ И ПЕРЕВАРИМОСТЬ ДРОЖЖЕВЫХ БЕЛКОВ
В. Тохвер, А. Калде
Общеизвестно, что различны е дрож ж и являю тся хорошим источником белкового азота для человека (пекарские дрож жи) и ж ивотны х (кормовые дрожжи). Д рож ж и отличаю тся не только высоким содержанием белков, но и богатством неза
менимых аминокислот и хорош ей усвояемостью [1, 2]. В связи с этим дрож ж и находят широкое использование в народном хозяйстве. При этом предприняты различны е попытки для дальнейшего повыш ения количества и качества белковой про
дукции дрожжей. В качестве одной из попыток в литературе выдвинут у л ьтр азвук невы соких интенсивностей [3, 4]. И ме
ются, однако- и противоположные данные, указы ваю щ ие на подавление белкового синтеза под влиянием уж е ум еренны х доз УЗ [5]. Из такой противоречивости видно, что вопрос о влиянии небольш их доз У З на продукцию белка дрож ж ей нельзя считать реш енным. Исходя из этого, нами изучалось влияние ум еренны х доз У З на примере пекарских дрож ж ей Sacch. cerevisiae (Томский ш тамм 10^) и кормовых дрож ж ей C. utilis (штамм 4). Р езул ьтаты этих исследований излагаем в настоящ ем сообщении.
Методика
Д ля вы ращ ивания дрож ж ей использовали украинскую сахарно-свекловую мелассу М елассу разбавляли водой до концентрации 1,2% по сахару при вы ращ ивании Sacch. cerevi
siae и до 2,5% при вы ращ ивании С. utilis, исходя из литера
турны х данны х по обеспечению максимальной интенсивности ростовых процессов [6]. В разбавленную мелассовую среду добавляли СазР0 4 и (NH4)2H PÜ4 по 1 г/л, биотин — 0,29 мг/л и пантотенат кальци я -— 0,50 мг/л. Кислотность среды регу
лировали прибавлением конц. H2SO4 на pH 5,0. Д ля зараж е-
2 M i k r o b i o l o o g i a - a l a s e i d t ö i d 17
ния использовали 24-часовые маточные культуры , вы ращ ен
ные на агаре и суспендированные в физиологическом раст
воре до концентрации 0,2 * 108 клеток/мл, в количестве 50 мл суспензии на банке с 3,5 л среды. И нкубация проводилась при 27,5° в течение 24 часов (С. utilis) и 36 часов (Sacch. cere
visiae). За это врем я культуры продували стерильным возду
хом с интенсивностью 3 объема в минуту (см. рис. 1 о к у л ь тивационном устройстве).
Р и с . 1. Ш к а ф д л я в ы р а щ и в а н и я д р о ж ж е й (с о т к р ы т ы м и д в ер ям и ). 1 — тер м о р е гу л я то р с д а тч и ко м — к о н т а к т н ы м те рм ом етром , 2—со
суды д л я п одачи св еж ей среды , 3 — к у л ь т и в а ц и о н н ы е сосуды , 4 — м асл я н о й э л е к т р о р а
диатор, 5 — к ом п рессор и ф и л ь т р во зд у х а.
1У
После инкубации биомассу отделяли центрифугированием, пром ы вали и вы суш ивали до воздуш но-сухого состояния при 37— 40° после чего клетки разруш ались в мельнице и допол
нительно в ступке при добавлении стеклянного порош ка № 10.
Липиды у д аляли экстрагированием диэтиловым эфиром в ап
парате Сокслета. В остатке определяли т. н. сырой протеин, т. е. смесь истинных белков, пептидов, аминокислот и других азотсодерж ащ их веществ, по данным определения общего азота по модифицированному нами методу К ьельдаля (тит
рование заменено колориметрированием), чистый белок по Барнш тейну, т. е. после мягкого осаж дения при помощи C11SO4 5Н2О, из слабощелочного раствора. Переваримость белков определяли in vitro пепсином в солянокислой среде по Сьеллеме и Ведемейеру (все методы определения вы полня
лись по описанию, приведенному в руководстве О. Х аллика [7]. Контрольные определения белка проводили по Лоури [8].
Д ля воздействия ультразвуком прим енялся генератор УТС-1, дающий У З с частотой 880 кгц. О звучивание проводи
ли в суспензиях до зараж ения опы тны х сред (т. е. озвучи
вался инокулум) при интенсивностях ф актора 0,4, 1,2 и 2,0 кт/см2 в течение 30 минут. Это значит, что применялись об
щие дозы У З 0,72, 2,16 и 3,60 кдж/'см2 которые по классифи
кации Байера и Дернера [9] принадлеж ат к низкоинтенсив
ным (два первых) и среднеинтенсивным (последнее) воздей
ствиям данного фактора.
Повторность опытов по определению контрольного состоя
ния одиннадцати- (Sacch. cerevisiae) или десятикратна (C. uti- lis). Повторность же определения эффектов от различны х доз УЗ семикратна. На основе полученны х дачны х вычисляли арифметические средние, а такж е средние разницы меж ду от
дельны ми вариантами, вместе с их средними погрешностями.
При определении уровня значимости эффектов от воздействия УЗ применялись t -тест [10] и тест К ем ельрьика [11]. Послед
ний, как известно, позволяет установить достоверность наб
лю даемых тенденций при суммарном истолковании ряда ана
логичных случаев (повторностей опыта) даж е тогда, когда учиты ваем ы е случаи в отдельности не показываю т статисти
ческой сущ ественности эффекта.
Р езультаты
Данные, приведенные в табл. 1, свидетельствую т о высо
ком содержании белка в клетках Sacch. cerevisiae и C. utilis.
Особенно высоким значением данного показателя отличаю тся
19
