Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchung der Beteiligung des Histaminrezeptors H
4R in DSS-induzierter Colitis bei der Maus
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Thomas Sebastian Rezniczek Bremen
Hannover 2019
1. Prof. Dr. Manfred Kietzmann
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie,
Tierärztliche Hochschule Hannover
2. Prof. Dr. Detlef Neumann Institut für Pharmakologie,
Medizinische Hochschule Hannover Wissenschaftliche Betreuung:
1.Gutachter: Prof. Dr. Manfred Kietzmann
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie,
Tierärztliche Hochschule Hannover
2. Gutachter: Prof. Bettina Seeger, PhD
Institut für Lebensmitteltoxikologie, Tierärztliche Hochschule Hannover
Tag der mündlichen Prüfung: 8.11.2019
Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt von der
“Deutsche Forschungsgemeinschaft” (DFG, NE 647/8)
Teile dieser Dissertation wurden in folgendem Artikel publiziert:
Schirmer, B., Rezniczek, T., Seifert, R., & Neumann, D. (2015).
Proinflammatory role of the histamine H4 receptor in dextrane sodium sulfate- induced acute colitis.
Biochemical pharmacology, 98(1), 102-109.
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Inhalt
Einleitung ... 1
Chronisch entzündliche Darmerkrankungen des Menschen ... 1
Histamin und Histaminrezeptoren ... 3
Histamin ... 3
Histamin Rezeptoren ... 4
Histamin Rezeptor H1R ... 5
Histamin Rezeptor H2R ... 5
Histamin Rezeptor H3R ... 5
Histamin Rezeptor H4R ... 6
Tiermodelle für IBD ... 7
DSS-induzierte Colitis bei Mäusen ... 8
H4R in Colitis ... 9
Material und Methoden ... 10
Tiere ... 10
Versuchsdurchführung ... 10
Vorversuch Dosisfindung ... 10
Akutes Colitis Modell ... 11
Chronisches Colitis Modell ... 11
Behandlungsversuch ... 11
Probengewinnung ... 13
Datenermittlung ... 14
Gewichtsbestimmung ... 14
Ermittlung des disease activity index (DAI) ... 14
Ermittlung der Darmlängen ... 14
Histologische Auswertung der Darmschnitte nach dem TJL (The Jackson Laboratory) Scoring System ... 15
Statistik ... 16
Materialien ... 16
Chemikalien ... 16
Sonstige ... 17
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Geräte ... 18
Computerprogramme ... 18
Ergebnisse ... 19
Akute Colitis ... 19
2,5% DSS-Gabe bei weiblichen Tieren ... 19
3% DSS-Gabe bei weiblichen Tieren ... 23
3% DSS-Gabe bei männlichen Tieren ... 28
Behandlung von akuter Colitis induziert durch 2,5%iges DSS bei männlichen Tieren ... 34
Chronische Colitis Dosisfindung ... 40
Chronische Colitis induziert durch 2%iges DSS bei männlichen und weiblichen Tieren ... 42
Diskussion ... 49
Dosisfindung ... 52
Akute Colitis ... 52
Behandlungsversuch akute Colitis ... 54
Chronische Colitis ... 55
Zusammenfassung ... 58
Summary ... 59
Literatur ... 61
Anhang ... 72
Tabellen ... 72
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Einleitung
Chronisch entzündliche Darmerkrankungen des Menschen
Chronisch entzündliche Darmerkrankungen (inflammatory bowel disease, IBD) sind ein Symptomkomplex, bei dem die Patienten unter chronisch rezidivierenden oder kontinuierlichen Symptomen einer Enteritis leiden (BAUMGART u. SANDBORN 2007). Eine genaue Pathogenese konnte bisher noch nicht gezeigt werden (BAUMGART u. CARDING 2007). Es wird jedoch ein multifaktorielles Geschehen vermutet (BAUMGART u. SANDBORN 2007). Außer einer genetischen Prädisposition scheinen vermehrt Umwelteinflüsse und die Zusammensetzung der intestinalen Flora involviert zu sein (FAKHOURY et al. 2014).
Es wird diskutiert, dass eine Schädigung der epithelialen Grenze zwischen Darmlumen und Darmmukosa die Durchlässigkeit für luminale Antigene, wie z.B. mikrobielle Bestandteile, begünstigt (SWIDSINSKI et al. 2002). Das ermöglicht den Kontakt zwischen Antigenen und dem enteralen Immunsystem und führt zu einer Entzündungsreaktion (COBRIN u. ABREU 2005. Es werden vermehrt proinflammatorische Zytokine gebildet. Diese induzieren die Differenzierung von T- Zellen zu T-Helfer (Th)-Zellen Typ 1. Diese wiederum produzieren selbst proinflammatorische Zytokine wie Tumornekrosefaktor (TNF)-α, Interferon (IFN)-ɣ und Interleukin (IL)-2 (STROBER et al. 2007). Es kommt so zu einer teilweise hochgradigen inflammatorischen Reaktion mit Einwanderung von Leukozyten, Plasmazellen und teilweise Makrophagen (HOFFMANN et al. 2008).
Die beiden hauptsächlich vorkommenden Formen der IBD, Morbus Crohn (MC) und ulzerative Colitis (UC), unterscheiden sich in ihrer Verteilung im Darm sowie ihrem histologischen Erscheinungsbild (FAKHOURY et al. 2014). Während UC ausschließlich im Intestinum crassum vorkommt, kann MC im gesamten Gastrointestinaltrakt auftreten (BAUMGART u. SANDBORN 2007). Histologisch zeigen von UC betroffene Darmabschnitte eine neutrophile Infiltration der Mukosa und Submukosa sowie die Zerstörung der Kryptenarchitektur durch Kryptenabszesse. MC verursacht eine transmurale Infiltration mit neutrophilen Granulozyten und oft
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Makrophagen, sowie auch Kryptenabszesse bei meist erhaltener Kryptenarchitektur (Abbildung 1) (BAUMGART u. SANDBORN 2007).
Abbildung 1: Schematische Darstellung Querschnitt Darm
Bei Morbus Chron sind alle Schichten des Darmes mit Leukozyten infiltriert. Diese bilden zum Teil durch ihre Akkumulation in Darmkrypten Mikroabszesse.
Bei der ulcerativen Colitis sind nur die Laminae mukosa und submukosa von der Entzündung betroffen. Die Krypten werden durch die Abszesse zerstört. (Abbildung erstellt nach BAUMGART u. SANDBORN (2007)
Symptome bei Patienten mit IBD sind hauptsächlich gastrointestinaler Natur wie Diarrhoe, abdominale Schmerzen sowie blutiger Stuhl bei UC (HOFFMANN et al.
2008).
Therapieoptionen beschränken sich auf antiinflammatorische Pharmaka, wie Mesalazin (5-Aminosalicylsäure), ein nicht-steroidaler Entzündungshemmer, oder immunmodulatorische Medikamente, z.B. Azathioprin, was verstärkt die Th2-Antwort fördert, oder Infliximab, ein monoklonaler Antikörper gegen TNF-α (FAKHOURY et al.
2014). Die medikamentöse Therapie geht aber häufig mit Nebenwirkungen einher, die die Lebensqualität der Patienten stark einschränkt (z.B. Müdigkeit, Vomitus,
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opportunistische Infektionen) oder die Symptome nicht ausreichend lindert (FAKHOURY et al. 2014). In diesen Fällen wird bei hochgradigen Symptomen oft sogar eine Colotomie als letzte Therapieoption in Betracht gezogen (MCLEOD 2003).
Histamin und Histaminrezeptoren Histamin
Histamin (2-(4-Imidazolyl)ethylamin) ist ein biogenes Amin, das in fast allen Geweben zu finden ist (BEST et al. 1927; ZIMMERMANN et al. 2011). Unter anderem Mastzellen, basophile Granulozyten, Thrombozyten, histaminerge Neurone und enterochromaffine Zellen des Magen-Darm-Traktes produzieren und speichern Histamin, um es bei Bedarf zu sezernieren (MAINTZ u. NOVAK 2007). Im Organismus fungiert Histamin als Mediator für diverse Vorgänge und Neurotransmitter. Seine Wirkung ist abhängig davon, an welchen Rezeptor es bindet (JUTEL et al. 2009).
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Abbildung 2: Hauptwirkungen von Histamin, abhängig vom Rezeptortyp (in Klammern) (modifiziert nach ZAMPELI u. TILIGADA (2009).
Histamin Rezeptoren
Bisher sind vier Histaminrezeptor Subtypen (H1R, H2R, H3R, H4R) bekannt, die nach dem Zeitpunkt ihrer Entdeckung nummeriert wurden und zur Gruppe der sieben- transmembranären G-Protein gekoppelten Rezeptoren gehören (LIM et al. 2005).
Bindet Histamin an den transmembranäre Helix, so bindet das trimere G-Protein an den intrazellulär gelegenen C-Terminus. Gleichzeitig dissoziiert das Guanosindiphosphat (GDP) von der α-Untereinheit des G-Proteins und es koppelt Guanosintriphosphat (GTP) an diese Stelle. Dadurch löst sich der Komplex auf, die Affinität für Histamin sinkt und die G-Protein α-Untereinheit dissoziiert von der βɣ- Untereinheit. Die α- und βγ-Untereinheiten können jetzt als aktive Form die Aktivität von Effektormolekülen und die Konzentration von Second messenger wie z.B.
zyklisches Adenosinmonophoshat (cAMP) beeinflussen. Das an die α-Einheit
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gebundene GTP wird im Weiteren durch die intrinsische GTP-ase-Aktivität zu GDP und Phosphat gespalten, so dass die α-GDP Untereinheit wieder mit der βɣ- Untereinheit reassoziieren kann und das G-Protein, jetzt wieder inaktiv, wieder zur Verfügung steht (SCHNEIDER u. SEIFERT 2010).
Histamin Rezeptor H1R
Der H1R ist ubiquitär verbreitet und ist auf Nervenzellen, in den Atemwegen, in glatter Muskulatur, dem Herz, Hepatozyten, Endothelzellen, Epithelzellen und Immunzellen zu finden (SCHWARTZ et al. 1991; HILL et al. 1997). Eine Aktivierung des H1R bewirkt unter anderem erhöhte vaskuläre Permeabilität oder Bronchokonstriktion (LEURS et al. 2002; TOGIAS 2003).
Histamin Rezeptor H2R
Der H2R hat einen vorwiegend inhibitorischen Effekt auf z.B. die glatte Muskulatur der Blutgefäße, des Uterus oder der Atemwege, oder das Immunsystem, indem er über ein Negativfeedback die Histaminfreisetzung aus Mastzellen hemmt oder die Antikörper- und Zytokinproduktion verlangsamt (LICHTENSTEIN u. GILLESPIE 1975;
JUTEL et al. 2002; JUTEL et al. 2009).
Histamin Rezeptor H3R
Der H3R wird hauptsächlich präsynaptisch auf Neuronen des peripheren (PNS) und zentralen Nervensystems (ZNS) gefunden (LOVENBERG et al. 1999). Dort wirkt er inhibitorisch auf die Ausschüttung diverser Neurotransmitter wie Histamin, Dopamin, Serotonin, Noradrenalin, GABA und Acetylcholin (JUTEL et al. 2009). Die Signaltransduktion geschieht über die Aktivierung von Gi/0-Proteine und führt zu einer Hemmung der cAMP Produktion und einer Akkumulation von Calciumionen und der Aktivierung des MAP-Kinase–Wegs (engl. mitogen activated proteine, MAP) (JUTEL et al. 2009). Über diesen Weg hemmt H3R durch eine cholinerge Inhibition des parasympatischen Systems die Bildung von Magensäure (SOLDANI et al. 1993).
Weiterhin sind sensible Nervenfasern (C-Fasern) nach Reizung durch z.B. chemische
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Noxen über die Freisetzung von Substanz P und Calcitonin Gene-related Peptide (CGRP) an neurogenen Entzündungen beteiligt, indem sie unter anderem über eine Histaminfreisetzung für eine Vasodilatation und vermehrte Permeabilität der Gefäße sorgen (HERBERT u. HOLZER 2002). Der H3R verhindert die Ausschüttung dieser Neurotransmitter (OHKUBO et al. 1995; IMAMURA et al. 1996) und wirkt so antiinflammatorisch. Unter anderem wird diese Wirkung auch bei entzündlichen Darmerkrankungen diskutiert (HERBERT u. HOLZER 2002).
H3R Antagonisten sind unter anderem Thioperamid und Clobenpropit (JUTEL et al.
2009) und JNJ 5207852 (WALTER u. STARK 2012). JNJ 5207852 ist ein hochselektiver H3R Antagonist mit einer Halbwertszeit von 14,6-16,8 Stunden (BARBIER et al. 2004).
Histamin Rezeptor H4R
2000 gelang die Klonierung des H4R (ODA et al. 2000, LIU et al. 2001; MORSE et al.
2001; NGUYEN et al. 2001; ZHU et al. 2001). Beim Menschen wird er auf dem Locus 18q11.2 (COGE et al. 2001) und auf 18A1 bei der Maus codiert (NAKAMURA et al.
2000). Die Amminosäurehomologie zwischen dem H3R und H4R liegt speziesabhängig zwischen 37% und 43% (MORSE et al. 2001; NGUYEN et al. 2001; HOFSTRA et al.
2003). Der H4R ist unter anderem in den Geweben von Milz, Thymus, Herz, Lunge und Darm vertreten (ODA et al. 2000; JUTEL et al. 2009), aber hauptsächlich ist er auf Zellen des Immunsystems zu finden: auf Mastzellen, eosinophilen (HARTWIG et al.
2015; BASTIAN SCHIRMER et al. 2018) und basophilen Granulozyten, dendritischen Zellen (SCHENK et al. 2016) und T-Zellen (ODA et al. 2000; COGE et al. 2001;
MORSE et al. 2001).
Bindet Histamin an den H4R, so wird – ähnlich wie bei dem H3R - das Gi/0-Protein aktiviert und die Gβγ Untereinheit wird abgespalten. Dieses führt zur Aktivierung der Phospholipase C, welche wiederum die Hydrolyse von Phosphatidylinositol-4,5- bisphosphat (PIP2) zu Inositol-1,4,5-Trisphosphat (IP3) katalysiert und damit zu einer Erhöhung der intrazellulären Ca2+ Konzentration führt und zu einer Aktivierung des MAP-Kinase Wegs führen kann (ODA et al. 2000; MORSE et al. 2001; NGUYEN et al.
2001; HOFSTRA et al. 2003).
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Eine Aktivierung des H4R wirkt hauptsächlich proinflammatorisch. Es kommt zu vermehrter Migration von neutrophilen und eosinophilen Granulozyten, dendritischen Zellen, Mastzellen und T-Zellen (JUTEL et al. 2009). Letztere differenzieren unter dem Einfluss verschiedener Zytokine hauptsächlich zu Th1-Zellen (ZAMPELI u. TILIGADA 2009). Es wird postuliert, dass der H4R in allergischen und immunbedingten Erkrankungen eine große Rolle spielt (GSCHWANDTNER et al. 2011; GUTZMER et al. 2011; CORUZZI et al. 2012). So konnte gezeigt werden, dass eine Antagonisierung eine deutliche klinische Verbesserung der Entzündungssymptome in verschiedenen Tiermodellen zur Folge hat (ZAMPELI u. TILIGADA 2009). So spielt der H4R auch eine Rolle bei der atopischen Dermatitis (DUNFORD et al. 2007; MOMMERT et al. 2011).
BEERMANN et al. (2012) zeigten eine bedeutende Rolle des H4R neben dem H1R beim murinen experimentell induziertem Asthma. Bei der durch Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS)-induzierten Colitis bei Mäusen zeigten sich bei H4R- defizienten Mäusen ein kürzere Überlebenszeit und ausgeprägtere histopathologische Befunde, als bei Wildtyptieren (WUNSCHEL et al. 2017). H4R Antagonisten sind z.B.
OUP-16, Clozapin und JNJ 7777120 (WALTER u. STARK 2012). JNJ 7777120 ist ein hochselektiver H4R Antagonist und man konnte schon in vielen Tiermodellen seine Wirksamkeit bestätigen. Leider ist seine klinische Verwendung beschränkt, da er in vivo eine sehr kurze Halbwertszeit hat (t1/2 bei Ratten 3 Stunden) (WALTER u. STARK 2012).
Tiermodelle für IBD
Für die Erforschung von IBD und einer geeigneten Therapie stehen verschiedene Tiermodelle zu Verfügung. Es wurde bei verschiedenen Tierarten, z.B. bei Lisztaffen oder einem Mausstamm (C3H/HeJBir), beschreiben, dass diese ohne ein bekanntes Pathogen sporadisch entzündliche Veränderungen des Darmtraktes entwickeln (CHALIFOUX u. BRONSON 1981; SUNDBERG et al. 1994). Zuverlässiger können spontane Enteritiden bei Labortieren jedoch durch genetische Modifikationen, z.B.
einer T-Zell-Rezeptor-Defizienz, hervorgerufen werden (MOMBAERTS et al. 1993).
Die meisten Tiermodelle beruhen aber auf einer chemischen Reizung der epithelialen Darmbarriere. Das reizende Agens kann rektal als Klysma, wie bei dem TNBS-Modell,
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subkutan (sc) – z.B. Indomethazin- oder am einfachsten per os (po) über das Trinkwasser verabreicht werden, so wie bei der Natriumdextransulfat (Dextran Sulfate Sodium, DSS)-induzierten Colitis (ELSON et al. 1995).
DSS-induzierte Colitis bei Mäusen
DSS ist ein Dextranderivat mit durchschnittlich 17% Schwefelgehalt, der aber variieren kann. Das weiße Pulver ist sehr gut wasserlöslich (SOLOMON et al. 2010). Es kann in unterschiedlichen Molekulargewichten vorliegen, von 5 bis 1400 Kilodalton (kDa) (PERSE u. CERAR 2012).
Die DSS-induzierte Colitis bei Mäusen ist ein verlässliches Model für IBD. Seine Vorteile sind eine einfache und günstige Induktion der Colitis sowie eine steuerbare Darmentzündung mit homogenen Symptomen (SOLOMON et al. 2010).
Die Schwere der Symptome variiert je Stamm und Geschlecht der verwendeten Mäuse, aber unterscheidet sich auch je nach Konzentration, Dauer und Molekulargewicht von DSS, sowie dem Hersteller und der Charge (SOLOMON et al.
2010; BAMBA et al. 2012; PERSE u. CERAR 2012). Die stärkste Ausprägung der Entzündung wird bei der Verwendung von DSS mit 40 kDa erzielt, während ab 400 kDa gar keine Symptome mehr auftreten (KITAJIMA et al. 2000).
Über eine Woche kontinuierlich verabreicht, entwickelt sich eine akute Entzündung.
Eine chronische Inflammation etabliert sich durch eine DSS-Gabe im wöchentlichen Wechsel mit purem Wasser über mehrere Zyklen (OKAYASU et al. 1990).
Der genaue Pathomechanismus, wie DSS eine Colitis induziert, ist nicht ganz genau geklärt (PERSE u. CERAR 2012). Es konnte aber gezeigt werden, dass DSS tight- junction-Proteine des intestinalen Epitheliums zerstört (PORITZ et al. 2007) und so die Darmbarriere durchbricht (KITAJIMA et al. 1999). Eine Antibiotikagabe reduziert die Symptome, bringt aber keine vollständige Heilung (HANS et al. 2000). Dies impliziert, dass die Darmflora bei der Entwicklung einer Colitis eine sekundäre Rolle spielt.
Die darauf folgende Entzündung zeigt sich hauptsächlich im Colon mit epithelialen Nekrosen, Infiltration der Laminae propria und submukosa mit neutrophilen Granulozyten, Kryptitis und Kryptenabszessen (PERSE u. CERAR 2012). Chronische Reaktionen beinhalten fleckige Erosionen mit Zeichen der Regeneration, Fibrose und
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vergrößerten Lymphfollikeln (OKAYASU et al. 1990) mit erhöhten Konzentrationen von IFN-ɣ, TNF-α und IL-1, IL-4 und IL-12 (DIELEMAN et al. 1998; EGGER et al. 2000).
Klinisch zeigen sich blutige Diarrhoe mit zum Teil daraus resultierender Anämie, Gewichtsverlust und Verkürzung des Colons bis hin zum akuten Versterben (PERSE u. CERAR 2012).
Summa summarum mimt die DSS induzierte Colitis viele Charakteristika der humanen IBD.
H4R in Colitis
Genetisch modifizierte Mäuse, die nicht in der Lage sind, Histamin zu produzieren, zeigen geringere Colitisanzeichen (BENE et al. 2004) und bei humanen Patienten mit IBD korreliert der Gehalt an Histamin im Darm mit der Schwere der Erkrankung (NOLTE et al. 1990). Trotzdem zeigen sowohl selektive H1R- als H2R-Antagonist bei der Behandlung von IBD keine oder nur unzureichende Besserung der Symptome (RAITHEL et al. 2010; JUILLERAT et al. 2012). Da im Darm so gut wie keine H3R vorhanden sind (LOVENBERG et al. 1999), ist die Annahme naheliegend, dass H4R eine bedeutende Rolle bei der Pathogenese von IBD spielen. Aus diesem Grund soll hier die Bedeutung von H4R in der DSS- induzierten Colitis bei Mäusen untersucht werden.
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Material und Methoden
Tiere
Die für die Versuche verwendeten Mäuse waren acht bis zehn Wochen alte weibliche und männliche Wildtyp (WT) Balb/c Mäuse (Charles River) sowie Histamin H4-
Rezeptor defiziente (H4R-/-) Mäuse (Balb/c; C. 129Hrh4tm1Lex) aus eigener Zucht. Die Tiere wurden in Gruppenkäfigen im Zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover bei 12 Stunden Tag/Nacht Rhythmus nach der Empfehlung der Föderation der Europäischen wissenschaftlichen Labortier-Verbände gehalten. Futter und Wasser stand ad libitum zur Verfügung. Alle Tierversuche wurden durch das niedersächsische Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (Tierversuchsnummer 11/0588) genehmigt.
Versuchsdurchführung Vorversuch Dosisfindung
Um die optimale Dosierung der verfügbaren DSS-Charge für die jeweiligen Versuche zu ermitteln, wurden einzelnen Gruppen mit jeweils 3 (akut) bzw. 5 (chronisch) weiblichen WT-Tieren für die Dauer des Versuchs der akuten bzw. chronischen Colitis (s. unten) DSS in verschiedenen Konzentrationen verabreicht: Für die akute Colitis 2,5%, 3,5%, 4% und für die chronische Colitis 1%, 1,5% und 2%, sowie jeweils eine Kontrollgruppe, die kein DSS erhielt. Der Vorversuch für die akute Colitis war nicht Teil dieser Dissertation, sondern wurde vorab durchgeführt. Hierbei mussten die Tiere, die 3,5%iges oder 4%iges erhalten hatten, schon nach 7 bzw. 4 Tagen aufgrund der hochgradigen Erkrankungsanzeichen aus Tierschutzgründen getötet werden, weswegen für die Induktion für die akute Colitis DSS in einer 2,5%igen und 3%igen Konzentration gewählt wurde. Für den Vorversuch für die chronische Colitis wurden die Erkrankungsparameter wie unten beschrieben bestimmt.
11 Akutes Colitis Modell
Zur Induktion einer akuten Colitis wurde den Versuchstieren DSS über das Trinkwasser verabreicht. Dazu erhielten die weiblichen Versuchstiere (n=4) in einem ersten Versuch 2,5% DSS über sieben Tage und in einem zweiten und dritten Versuch weibliche (n=5) und männliche (n=5) Versuchstiere jeweils 3% DSS über sieben Tage.
Nach sieben Tagen DSS Gabe erhielten die Tiere bis zum nächsten Tag reines Trinkwasser. Die Tiere der Kontrollgruppe erhielten während der gesamten Versuchsdauer reines Trinkwasser. An Tag acht wurden die Mäuse mit CO2 getötet und durch Herzpunktion entblutet.
Chronisches Colitis Modell
Für das chronische Modell erhielten die Versuchstiere für sieben Tage 2% DSS im Trinkwasser, gefolgt von zehn Tagen mit reinem Wasser. Dieses wurde dreimal wiederholt. Nach dem letzten DSS Zyklus erhielten die Mäuse für einen Tag reines Wasser (Abbildung 3). Die Tiere der Kontrollgruppe erhielten während der gesamten Versuchsdauer reines Trinkwasser. An Tag 59 wurden die Mäuse mit CO2 getötet und durch Herzpunktion entblutet.
Abbildung 3: Zeitliche Abfolge der DSS- und Wassergeben sowie der Probennahmen im chronischen Versuch
Behandlungsversuch
In einem weiteren akuten Versuch mit männlichen Balb/c Mäusen und Histamin H4- Rezeptor defizienten Mäusen wurden den Tieren Mikroosmosepumpen (ALZET®) (Abbildung 4) in Ketamin®-Xylazin®-Kurznarkose subkutan implantiert. Das
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verwendete Modell 1007D hat eine Füllmenge von 90 Mikroliter (µl) und eine Pumprate von 0,5 µl pro Stunde. Die Pumpen wurden unter einer Sicherheitswerkbank mit den entsprechenden Substanzen steril befüllt und dann über Nacht in steriler 0,9%
Natriumchlorid (NaCl)- Lösung bei 37° C inkubiert, um eine sofortige Funktion nach der Implantation zu gewährleisten.
Für die Befüllung der Pumpen wurden jeweils 50 Millimol (mMol) Wirkstoff (JNJ 5207852 bzw. JNJ 7777120) in 1ml Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und mit derselben Menge Phosphat gepufferter Salzlösung (phosphate buffered saline, PBS) verdünnt, da die Pumpen nur für eine maximale DMSO-Konzentration von 50% ausgelegt sind.
Für die oben genannte Infusionsgeschwindigkeit von 0,5µl/Std ergibt sich somit eine Dosierung von 0,3 mMol/Tag/Tier.
Die Balb/c Wildtyp Mäuse wurden in vier Gruppen unterteilt. Eine Gruppe erhielt den H4R-selektiven Antagonisten JNJ7777120 (n=4), eine Gruppe den H3R-selektiven Antagonisten JNJ5207852 (n=4), eine weitere Gruppe JNJ7777120 und JNJ5207852 (n=4). Von den H4R defizienten Mäusen erhielt eine Gruppe den H3R-selektiven Antagonisten JNJ5207852 (n=4). Als Kontrollgruppen wurden jeweils 4 Tieren vom Wildtyp und von den Histamin H4-Rezeptor defizienten Mäusen Pumpen implantiert, die nur PBS und DMSO enthielten.
Implantation der Pumpen
Die Mäuse wurden mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin®- Xylazin® (0,5 ml Ketamin®+ 0,1 ml Xylazin+ 4,4 ml NaCl; davon 100 – 150 µl pro Tier) in Kurznarkose gelegt. Der Bereich zwischen den Schulterblättern wurde rasiert und desinfiziert. Mit einem Skalpell wurde die Haut 1 Zentimeter (cm) breit durchtrennt und die entsprechend gefüllte Pumpe mit einer Pinzette subkutan eingesetzt. Der Wundverschluss erfolgte mit Michel-Klammern. Die Pumpen und Klammern verblieben für die gesamte Versuchsdauer im Tier. Dieser Versuch erfolgte analog zu den übrigen akuten Colitisversuchen mit DSS in einer Konzentration von 2,5% (s.
oben).
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Abbildung 4: Mikrosomosepume im schematischen Querschnitt (www.alzet.com)
Probengewinnung Präparation Darm
Entnahme des Colons und des Caecums erfolgte an den entbluteten Tieren nach Eröffnung der Bauchhöhle in der Medianen. Das Colon und das Caecum wurden mit PBS gespült und als „swiss roll“ in einer Kassette in Formalin fixiert um Paraffinschnitte (Dicke 2-3 µm) anzufertigen. Die Schnitte wurden in der Arbeitsgemeinschaft (AG) für experimentelle Pathologie angefertigt und automatisch nach folgendem Protokoll mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt: Mit Xylol wurde das Paraffin entfernt und in einer absteigenden Alkoholreihe wurden die Schnitte rehydriert. Nachdem die Schnitte mit destilliertem Wasser (Aqua dest.) gewaschen worden waren, wurden sie für erst 5 Min in Hämalaun und nach Spülung mit Aqua dest. für 5 Min in Eosin gefärbt und in einer aufsteigenden Alkohlreihe wieder dehydriert und in Xylol fixiert. Nach der Färbung wurde das Präparat mit Hilfe von Cytoseal XYL Eindeckmedium und einem Deckglas luftdicht verschlossen, sodass eine Lagerung für lange Zeit möglich ist.
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Gewichtsbestimmung
Zur Ermittlung des Körpergewichts wurden die Tiere einzeln mittels einer Feinwaage gewogen und die jeweiligen Messergebnisse protokolliert. Im akuten Modell erfolgte die Gewichtsbestimmung täglich. Im chronischen Modell wurde in den DSS- Phasen das Gewicht täglich bestimmt. In den Pausen mit reiner Wassergabe wurden die Gewichte alle zwei Tage bestimmt. Das Gewicht an Tag 0, vor der Gabe von DSS wurde als Referenzgewicht benutzt. Die übrigen ermittelten Gewichte wurden in Prozent zum Körpergewicht an Tag 0 umgerechnet.
Ermittlung des disease activity index (DAI)
Jede Maus wurde im Versuch täglich anhand der drei Parameter (Gewichtsverlust, Stuhlkonsistenz, Blutung) beurteilt. Jedem Urteil wird ein Zahlenwert (Wert) zugeordnet (Tabelle 1). Die Summe der drei Werte jeder Maus (0-12) gibt ihren DAI an (adaptiert aus Alex at al., 2009).
Tabelle 1: DAI zur Ermittlung der Schwere der klinischen Symptomatik
Wert Gewichtsverlust Stuhlkonsistenz Blutung
0 Ohne normal ohne
1 1-5%
2 5-10% weich, ohne Form leicht blutiger Stuhl
3 10-15%
4 15% wässrige Diarrhö stark blutiger Stuhl
Ermittlung der Darmlängen
Am Versuchsende wurden Colon und Caecum der frisch getöteten Tiere entnommen.
Sowohl Colon, als auch Caecum wurden mit PBS gespült. Die beiden Organe wurden auf Papier ausgelegt. Die Länge des Colons wurde ohne Dehnung mit einem Lineal bestimmt.
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Histologische Auswertung der Darmschnitte nach dem TJL (The Jackson Laboratory) Scoring System
Die Hämatoxilin-Eosin gefärbten Schnitte wurden geblindet mikroskopisch begutachtet und mit dem Bewertungssystem aus dem Jackson Laboratory nach Schweregrad der Entzündung, Grad der Hyperplasie, Auftreten von Ulzerationen und der Größe des betroffenen Areales bewertet. Das Colon wurde hierzu in drei etwa gleich große Abschnitte (proximal, mittig, distal) von oral nach aboral unterteilt. Jeder dieser Abschnitte wurde nach dem TJL- score bewertet (Tabelle 2) und die Ergebnisse der drei Abschnitte zu einem Gesamtwert addiert. Das Caecum wurde nicht in Abschnitte unterteilt, sonst aber analog nach dem Score bewertet, sodass für das Colon ein Gesamtscore von 0 bis 36, für das Caecum ein Score von 0 bis 12 möglich ist (Bleich, Mahler et al. 2004).
Tabelle 2: TJL (The Jackson Laboratory) Scoring System
Wert Schweregrad der Entzündung
0 normal
1 Mild, kleine, fokale oder weit verstreute multifokale Entzündungen in der Lamina Propria
2 Moderat, multifokale oder lokale hochgradige Entzündungen bis zur Submukosa reichend
3 Schwerwiegend, Ulzerationen über mehr als 20 Krypten der Mukosa Grad der Hyperplasie
0 Normal
1 Mild, normales Epithel, aber 2-3 mal dicker als Vergleichskontrolle 2 Moderat, Epithel 2-3 mal dicker als normal, hyperchromatische Zellen,
verringerte Anzahl von Becherzellen
3 Schwerwiegend, hyperplastische Regionen mit 4-5-fach dickerem Epithel, keine bis wenig Becherzellen
Ulzeration
0 Keine Ulzera
1 1-2 Herde (bis 20 Krypten betroffen)
16 2 1-4 Herde (bis 40 Krypten betroffen) 3 Schwerwiegendere Ulzerationen
Betroffenes Areal
0 0%
1 10%- 30%
2 40%-70%
3 >70%
Statistik
Für die statistische Analyse der Gewichtsabnahmen wurde eine Two-way Analysis of Variance (ANOVA) benutzt und für die post-hoc Analyse wurde alle Gruppen mit dem Bonferroni post test miteinander verglichen. Für alle übrigen statistischen Analysen wurde eine One-way ANOVA benutzt und für die post- hoc Analyse wurden alle Gruppen einzeln mit dem Tukey post-hoc Test miteinander verglichen.
Aufgrund der Gruppengrößen kann eine Gauß’sche Normalverteilung nur angenommen werden. Daraus resultierende P-Werte werden im Ergebnissteil angegeben und in den Grafiken angezeigt (*** P ≤ 0,001, ** P ≤ 0,01, * P ≤ 0,05). Alle Daten sind als arithmetisches Mittel angegeben. Für die Erstellung der Statistik und der dazugehörigen Grafiken wurde GraphPad Prism 5 (GraphPad Software San Diego, CA, USA) verwendet.
Materialien Chemikalien
Bovines Serum Albumin Sigma-Aldrich GmbH, München
Formaldehyd Merk KgaA, Darmstadt
Natriumdextransulfat MP Biomedicals, Eschwege
Medikamente
0,9% Isotone Kochsalzlösung B. Braun AG, Melsungen
JNJ 5207852 Tocris Bioscience Bristol, UK
17
JNJ 7777120 A. Buschauer, Regensburg
Ketamin Albrecht GMBH, Aulendorf
Rompun® Bayer, Leverkusen
Sonstige
Combitips 1 ml; 5 ml; 10 ml Eppendorf
Deckgläser 20x20 Thermo Scientific
Einmal-Skalpell Aesculap AG, Tuttlingen
Einwegrasierer pfm medical mepro gmbh,
Nonnweiler
Improved Neubauer Zählkammer Marienfeld
Kanüle 20 G B. Braun AG, Melsungen
Kanüle 27 G B. Braun AG, Melsungen
Kunststoffröhrchen 15 ml Sarstedt AG und Co.,
Nürmbrecht
Kunststoffröhrchen 50 ml Sarstedt AG und Co.,
Nürmbrecht
Mikro- Osmose- Pumpen 1007D Alzet
Mikrotiterpatten, 96-well (Zellkultur) Nunc
Mikrotiterplatten 96-well Sarstedt AG und Co.,
Nürmbrecht
Omni Fix-F 1 ml Spritzen B. Braun AG, Melsungen
Pipettenspitzen 0,5-10 μl Eppendorf
Pipettenspitzen 10-200 μl; 100-1000 μl Sarstedt AG und Co., Nürmbrecht
Reaktionsgefäße 1,5 ml; 2 ml Sarstedt AG und Co.,
Nürmbrecht
Serologische Piptten 2 ml, 10 ml, 25 ml Sarstedt AG und Co., Nürmbrecht
Spritze 20 ml B.Braun AG, Melsungen
18
Spritze Omnifix 1ml B.Braun AG, Melsungen
Geräte
Lampe, Schott KL 2500 LED Schott
Mikroskop, Olympus IMT-2 Olympus
Mikroskop, Zeiss Axiovert 200M Zeiss
Multipette Eppendorf
Pipetten 0,5-10 μl; 10-100 μl; 100-1000 μl Eppendorf
Pipettierhilfe Pipetboy IBS Integra Bioscience
Sicherheitswerkbank Herasafe Heraeus
Wasserfiltrationsanlage Milli QUF Plus Millipore
Zentrifuge Alegra Beckmann Coulter
Zentrifuge BIofuge fresco Hereaus
Zentrifuge Sigma 6K10 Thermo Scientific
Computerprogramme
MS Office 2010 Microsoft
GraphPad Prism 5 Graphpad software inc., La
Jolla, CA 92037 USA
19
Ergebnisse
Akute Colitis
2,5% DSS-Gabe bei weiblichen Tieren
Gewicht
Während die Tiere der Kontrollgruppen und die H4R-/--Tiere nach DSS-Gabe leicht an Gewicht zugenommen haben, verlieren die WT-Tiere nach 7 Tagen DSS-Gabe Gewicht und unterscheiden sich damit signifikant von den übrigen Gruppen (Tabelle 3, Abbildung 5).
Gewichte (in % zu Tag 0) 2,5% DSS weiblich
0 2 3 4 5 6 7 8
90 95 100 105
Wildtyp DSS H4R-/- DSS
***
Wildtyp Kontrolle H4R-/- Kontrolle
Tag
Gewicht (in % zu Tag 0)
Abbildung 5:Gewichtsabnahme bei akuter Colitis induziert durch Gabe von Natriumdextransulfat (DSS) 2,5%ig bei weiblichen Wildtyptieren und bei H4R--defizienten Tieren (H4R-/-) im Vergleich zu unbehandelten Tieren (Kontrolle) (in % zu Tag 0). An Tag 1 wurden keine Gewichte erhoben. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM. *** P≤0,001
DAI
Der DAI ist bei WT-Tieren am siebten Tag der DSS-Gabe signifikant höher als bei der H4R-/--Gruppe, die kein DSS erhalten hatte. Die übrigen Gruppen unterscheiden sich nicht signifikant voneinander (Tabelle 4, Abbildung 6).
20 DAI
2,5% DSS weiblich
2 3 4 5 6 7 8
0.0 0.5 1.0 1.5
Wildtyp Kontrolle Wildtyp DSS
H4R-/- Kontrolle H4R-/- DSS
**
Tag
DAI
Abbildung 6: Disease activity index (DAI) bei akuter Colitis induziert durch Gabe von Natriumdextransulfat (DSS) 2,5%ig bei weiblichen Wildtyptieren und bei H4R-defizienten Tieren (H4R-/-) im Vergleich zu unbehandelten Tieren (Kontrolle). An Tag 1 wurden keine Gewichte und dadurch kein DAI erhoben. Mittelwert ± SEM. ** P ≤ 0,01
Darmlängen
Weder die Länge von Colon noch von Caecum unterscheiden sich zwischen den Gruppen nach 7 Tagen 2,5%ig-DSS-Gabe signifikant voneinander (Tabelle 5, Abbildung 7, Abbildung 8).
21
Colonlängen 2,5%DSS weiblich
Wildtyp Kontrolle
Wildtyp DSS
Kontrolle
-/- 4R H
DSS R-/-
H4
0 2 4 6 8 10 12 14
Länge Colon [cm]
Abbildung 7: Colonlängen bei akuter Colitis induziert durch Gabe von Natriumdextransulfat (DSS) 2,5%ig bei weiblichen Wildtyptieren und bei H4R- defizienten Tieren (H4R-/-) im Vergleich zu unbehandelten Tieren (Kontrolle). Mittelwert ± SEM.
Abbildung 8: Caecumlängen bei akuter Colitis induziert durch Gabe von Natriumdextransulfat (DSS) 2,5%ig bei weiblichen Wildtyptieren und bei H4R-defizienten Tieren (H4R-/-) im Vergleich zu unbehandelten Tieren (Kontrolle). Mittelwert ± SEM.
22 Histologischer Score
Der histologische Score ist bei den weiblichen Tieren nach 2,5%iger DSS Gabe sowohl im Colon als auch im Caecum deutlich höher als bei den Kontrollgruppen. Nur der Score im Caecum, nicht der im Colon, unterscheidet sich bei H4R-/--Tieren nach DSS- Gabe von der entsprechenden WT-Gruppe (Tabelle 6, Abbildung 9, Abbildung 10).
Histoscore Colon 2,5% DSS weiblich
Wildtyp
Kontrolle
Wildtyp DSS
Kontrolle
-/- 4R H
DSS
-/- 4R H 0
5 10 15
***
*** *** ***
Score
Abbildung 9: Histologischer Score (Histoscore) Colon bei akuter Colitis induziert durch Gabe von Natriumdextransulfat (DSS) 2,5%ig bei weiblichen Wildtyptieren und bei H4R- defizienten Tieren (H4R-/- ) im Vergleich zu unbehandelten Tieren (Kontrolle). Mittelwert ± SEM. ** P ≤ 0,01*** P≤0,0001
23 Histoscore Caecum
2,5% DSS weiblich
Wildtyp
Kontrolle
WIldtyp DSS
Kontrolle
-/- 4R H
DSS
-/- 4R H 0
2 4 6
8 *** * *
***
Score
Abbildung 10: Histologischer Score (Histoscore) Caecum bei akuter Colitis induziert durch Gabe von Natriumdextransulfat (DSS) 2,5%ig bei weiblichen Wildtyptieren und bei H4R-defizienten Tieren (H4R-/-) im Vergleich zu unbehandelten Tieren (Kontrolle). Mittelwert ± SEM. * P ≤0,05, *** P≤0,001
3% DSS-Gabe bei weiblichen Tieren
Gewicht
Nach Gabe von 3%ig DSS für 7 Tagen zeigen weibliche WT-Tiere einen deutlichen Gewichtsverlust im Vergleich zu anderen Gruppen. Es zeigt sich kein Unterschied zwischen WT-Tieren aus der Kontrollgruppe und H4R-/--Tieren, die DSS erhalten hatten (Tabelle 7, Abbildung 11).
24
Gewichte (in % zu Tag 0) 3% DSS weiblich
0 1 2 3 4 5 6 7
90 95 100 105
Wildtyp Kontrolle Wildtyp DSS
H4R-/- Kontrolle H4R-/- DSS
** ***
Tag
G e w ic h t (i n % z u T a g 0 )
Abbildung 11: Gewichtsabnahme bei akuter Colitis induziert durch Gabe von Natriumdextransulfat (DSS) 3%ig bei weiblichen Wildtyptieren und bei H4R-defizienten Tieren (H4R-/-) im Vergleich zu unbehandelten Tieren (Kontrolle) (in % zu Tag 0). Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM. *** P≤0,001
DAI
An Tag 1, 5 und 7 der DSS-Gabe zeigt sich bei den WT-Tieren im Vergleich zu den anderen Gruppen ein erhöhter DAI. Es zeigt sich beim DAI kein Unterschied zwischen WT-Tieren aus der Kontrollgruppe und H4R-/--Tieren, die DSS erhalten hatten (Tabelle 8, Abbildung 12).
25 DAI
3% DSS weiblich
Tag 1 Tag 2
Tag 3 Tag 4
Tag 5 Tag 6
Tag 7 0.0
0.5 1.0 1.5
Wildtyp Kontrolle H4R-/- Kontrolle Wildtyp DSS H4R-/- DSS
* *
*
DAI
Abbildung 12: Disease activity index (DAI) bei akuter Colitis induziert durch Gabe von Natriumdextransulfat (DSS) 3%ig bei weiblichen Wildtyptieren und bei H4R-defizienten Tieren (H4R-/-) im Vergleich zu unbehandelten Tieren (Kontrolle). Mittelwert ± SEM. * P ≤0,05
Darmlängen
WT-Tiere aus der Kontrollgruppe zeigen ein signifikant längeres Colon im Vergleich zu allen Gruppen, die DSS erhalten hatten. Zwischen den DSS-Gruppen besteht kein Unterschied in der Länge des Colons (Tabelle 9, Abbildung 13).
Die Länge des Caecums unterscheidet sich zwischen keiner der Gruppen signifikant (Tabelle 9, Abbildung 14).
26
Wildtyp Kontrolle
Wildtyp DSS
Kontrolle
-/- 4R H
DSS
-/- 4R H 0
2 4 6 8 10 12
14
*
Colonlänge 3% DSS weiblich
**
**
Länge Colon [cm]
Abbildung 13: Colonlängen bei akuter Colitis induziert durch Gabe von Natriumdextransulfat (DSS) 3%ig bei weiblichen Wildtyptieren und bei H4R- defizienten Tieren (H4R-/-) im Vergleich zu unbehandelten Tieren (Kontrolle). Mittelwert ± SEM. * P ≤ 0,05 ** P ≤ 0,01
Wildtyp
Kontrolle
Wildtyp DSS
Kontrolle
-/- 4R H
DSS
-/- 4R H 0
1 2 3 4 5
Caecumlänge 3% DSS weiblich
Länge Caecum [cm]
Abbildung 14: Caecumlängen bei akuter Colitis induziert durch Gabe von Natriumdextransulfat (DSS) 3%ig bei weiblichen Wildtyptieren und bei H4R-defizienten Tieren (H4R-/-) im Vergleich zu unbehandelten Tieren (Kontrolle). Mittelwert ± SEM.
27 Histologischer Score
Der histologische Score ist bei Tieren nach DSS Gabe sowohl im Colon als auch im Caecum deutlich höher als bei den Kontrollgruppen. Gleichzeitig ist der Score in Colon und Caecum bei H4R-/--Tieren nach DSS-Gabe geringer als bei der entsprechenden WT-Gruppe (Tabelle 10, Abbildung 15, Abbildung 16).
Histoscore Colon 3% DSS weiblich
Wildtyp
Kontrolle
Wildtyp DSS
Kontrolle
-/- 4R H
DSS
-/- 4R H 0
5 10 15 20
***
***
***
***
Histoscore Colon
Abbildung 15: Histologischer Score Colon bei akuter Colitis induziert durch Gabe von Natriumdextransulfat (DSS) 3%ig bei weiblichen Wildtyptieren und bei H4R- defizienten Tieren (H4R-/-) im Vergleich zu unbehandelten Tieren (Kontrolle). Mittelwert ± SEM. *** P≤0,0001
28 Histoscore Caecum
3% DSS weiblich
Wildtyp
Kontrolle
Wildtyp DSS
Kontrolle
-/- 4R H
DSS
-/- 4R H 0
2 4 6 8
***
***
***
***
Histoscore Caecum
Abbildung 16: Histologischer Score Caecum bei akuter Colitis induziert durch Gabe von Natriumdextransulfat (DSS) 3%ig bei weiblichen Wildtyptieren und bei H4R-defizienten Tieren (H4R-/-) im Vergleich zu unbehandelten Tieren (Kontrolle). Mittelwert ± SEM. *** P≤0,001
3% DSS-Gabe bei männlichen Tieren
Gewicht
Die WT-Gruppe mit den männlichen Tieren, die DSS erhalten hatte, zeigt eine deutliche Gewichtsabnahme im Vergleich zu allen anderen Gruppen. Dieser war so stark, dass die Tiere dieser Gruppe vorzeitig (Tag 6) aufgrund der Abbruchkriterien getötet wurden. H4R-/--Tiere zeigen ab dem 6. Tag auch eine signifikante Gewichtsreduktion (Tabelle 11, Abbildung 17).
29
Gewicht (in % zu Tag 0) 3% DSS männliche Tiere
0 1 2 3 4 5 6 7
75 80 85 90 95 100 105
Wildtyp Kontrolle Wildtyp DSS
H4R-/- Kontrolle H4R-/- DSS
Gewicht (in % zu Tag 0)
* ***
*
***
*
***
Abbildung 17: Gewichtsabnahme bei akuter Colitis induziert durch Gabe von Natriumdextransulfat (DSS) 3%i bei männlichen Wildtyptieren und bei H4R- defizienten Tieren (H4R-/-) im Vergleich zu unbehandelten Tieren (Kontrolle) (in % zu Tag 0). Dargestellt sind die Mittelwerte ±SEM. *** P≤0,001
DAI
Der DAI steigt in der WT-Gruppe am 5. Tag DSS-Gabe deutlich an im Vergleich zu den restlichen Gruppen. Aufgrund des schlechten Zustandes wurden die Wildtyp Versuchstiere vorzeitig an Tag 6 gemäß den Abbruchkriterien getötet. Die H4R-/-- Gruppe zeigt am 7. Tag des DSS-gabe eine signifikante Erhöhung des DAI im Vergleich zu den verbleibenden Kontroll-Gruppen (Tabelle 12, Abbildung 18).
30 DAI 3%
DSS männlich
Tag 1 Tag 2
Tag 3 Tag 4
Tag 5 Tag 6
Tag 7 0
2 4
6 Wildtyp Kontrolle
H4R-/- Kontrolle Wildtyp DSS H4R-/- DSS
***
***
***
Score
Abbildung 18: Disease activity index (DAI) bei akuter Colitis induziert durch Gabe von Natriumdextransulfat (DSS) 3%ig bei männlichen Wildtyptieren und bei H4R-defizienten Tieren (H4R-/-) im Vergleich zu unbehandelten Tieren (Kontrolle). Mittelwert ± SEM. *** P≤ 0,001
Darmlängen
WT-Tiere aus der Kontrollgruppe zeigen ein signifikant längeres Colon im Vergleich zu allen Gruppen, die DSS erhalten hatten. Zwischen den DSS-Gruppen besteht kein Unterschied in der Länge des Colons (Tabelle 13, Abbildung 19).
Das Caecum der WT-Gruppe nach DSS-Gabe ist signifikant kürzer als das der unbehandelten Tiere. Die Caecumlänge der H4R-/--Gruppe unterscheidet sich nicht signifikant von den der anderen Gruppen (Tabelle 13, Abbildung 20).
31 Colonlängen
3% DSS männlich
Wildtyp Kontrolle
Wildtyp DSS
Kontrolle R-/-
H4
DSS
-/- 4R H 0
5 10 15
*** **
**
***
Länge Colon [cm]
Abbildung 19: Colonlängen bei akuter Colitis induziert durch Gabe von Natriumdextransulfat (DSS) 3%ig bei männlichen Wildtyptieren und bei H4R- defizienten Tieren (H4R-/-) im Vergleich zu unbehandelten Tieren (Kontrolle). Mittelwert ± SEM, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001
Caecumlängen 3% DSS männlich
Wildtyp Kontrolle
Wildtyp DSS
Kontrolle
-/- 4R H
DSS
-/- 4R H 0
1 2 3 4 5
* *
Länge Caecum [cm]
Abbildung 20: Caecumlängen bei akuter Colitis induziert durch Gabe von Natriumdextransulfat (DSS) 3%ig bei männlichen Wildtyptieren und bei H4R- defizienten Tieren (H4R-/-) im Vergleich zu unbehandelten Tieren (Kontrolle). Mittelwert ± SEM, * P ≤ 0,05
Histologischer Score
Der histologische Score ist auch bei den männlichen Tieren nach 3%iger DSS Gabe sowohl im Colon als auch im Caecum deutlich höher als bei den Kontrollgruppen.
Gleichzeitig ist der Score in Colon und Caecum bei H4R-/--Tieren nach DSS-Gabe
32
geringer als bei der entsprechenden WT-Gruppe (Tabelle 14, Abbildung 21, Abbildung 22).
Histoscore Colon 3% DSS männlich
Wildtyp
Kontrolle
Wildtyp DSS
Kontrolle
-/- 4R H
DSS
-/- 4R H 0
5 10 15
20 ***
*** ***
*** ***
Score
Abbildung 21: Histologischer Score Colon bei akuter Colitis induziert durch Gabe von Natriumdextransulfat (DSS) 3%ig bei männlichen Wildtyptieren und bei H4R-defizienten Tieren (H4R-/-) im Vergleich zu unbehandelten Tieren (Kontrolle). Mittelwert ± SEM. *** P≤0,0001
33 Histoscore Caecum
3% DSS männlich
Wildtyp
Kontrolle
Wildtyp DSS
Kontrolle
-/- 4R H
DSS
-/- 4R H 0
2 4 6 8
10 ***
** ***
*** ***
Score
Abbildung 22: Histologischer Score Caecum bei akuter Colitis induziert durch Gabe von Natriumdextransulfat (DSS) 3%ig bei männlichen Wildtyptieren und bei H4R-defizienten Tieren (H4R-/-) im Vergleich zu unbehandelten Tieren (Kontrolle). Mittelwert ± SEM. *** P≤0,001
34
Behandlung von akuter Colitis induziert durch 2,5%iges DSS bei männlichen Tieren
Gewicht
WT-Tiere zeigten im Durchschnitt die stärkste Gewichtsabnahme, während die WT- Gruppen, die mit JNJ7777120 oder JNJ5207852 oder beiden Wirkstoffen zusammen behandelt wurden, im Mittelfeld lagen und sich nicht signifikant voneinander unterschieden. Die H4R-/--Gruppen zeigen die geringste Gewichtsabnahme, wobei es keinen Unterschied macht, ob diese mit JNJ5207852 behandelt werden oder nicht (Abbildung 17, Abbildung 23).
Gewicht (in % zu Tag 0) Behandlung
0 1 2 3 4 5 6 7 8
80 85 90 95 100
Wildtyp JNJ 5207852 Wildtyp PBS + DMSO Wildtyp JNJ 7777120
Wildtyp JNJ 7777120 + JNJ 520785
H4R-/- JNJ 5207852 H4R-/- PBS + DMSO
*
**
*** ***
*
**
Tag
Gewicht (in %zu Tag 0)
Abbildung 23: Gewichtsabnahme bei akuter Colitis induziert durch Gabe von Natriumdextransulfat (DSS) 2,5%ig Vergleich Wildtyptiere unbehandelt (PBS+ DMSO), mit JNJ 5207852 (H3-Rezeptor- Antagonist), JNJ 7777120 (H4-Rezeptor-Antagonist) und mit JNJ 5207852 + JNJ 7777120 behandelt und bei H4R-defizienten Tieren (H4R-/-) unbehandelt (PBS+ DMSO) und mit JNJ 527852 behandelten Tieren.. Mittelwert, Minimum (min) und Maximum (max) (in % zu Tag 0). Dargestellt sind die Mittelwerte
±SEM. *** P≤0,001, ** P≤0,01, * P≤0,05
DAI
Der DAI steigt in allen WT-Gruppen am 5. Tag DSS-Gabe deutlich an im Vergleich zu den H4R-/--Gruppen. Die WT-Gruppen unterscheiden sich aber selbst im DAI nicht
35
signifikant voneinander, ebenso wenig wie die unbehandelte von der mit JNJ5207852 behandelten H4R-/--Gruppe (Tabelle 16, Abbildung 24).
DAI Behandlung
Tag 1
Tag 2
Tag 3
Tag 4
Tag 5
Tag 6
Tag 7
Tag 8 0
1 2 3 4 5
H4R-/-PBS + DMSO H4R-/- JNJ 5207852 Wildtyp PBS + DMSO Wildtyp JNJ 5207852
WT JNJ 5207852+ JNJ 7777120
Wildtyp JNJ 7777120 ***
**
***
Disease Activity Index (DAI)
Abbildung 24: Disease activity index (DAI) bei akuter Colitis induziert durch Gabe von Natriumdextransulfat (DSS) 2,5%ig Vergleich Wildtyptiere unbehandelt (PBS + DMSO), mit JN J5207852 (H3-Rezeptor-Antagonist), JNJ 7777120 (H4-Rezeptor-Antagonist) und mit JNJ 5207852 + JNJ 7777120 behandelt und bei H4R-defizienten Tieren (H4R-/-) unbehandelt (PBS + DMSO) und mit JNJ 527852 behandelten Tieren. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM. *** P≤0,001
Darmlängen
Die Länge des Colon unterscheidet sich nur zwischen der WT-Gruppe, die sowohl JNJ5207852 als auch JNJ7777120, und der WT-Gruppe, die nur JNJ7777120 erhalten hatte, wobei die Gruppe mit der Monotherapie ein kürzeres Colon aufweist (Tabelle 17, Abbildung 25).
Das Caecum der unbehandelten Gruppe war im Vergleich zu dem der mit JNJ7777120 behandelten WT-Gruppe signifikant länger. Ansonsten unterscheidet sich die durchschnittliche Länge des Colons zwischen den Gruppen nicht signifikant (Tabelle 17, Abbildung 26).
36
-/- 4R
DMSO/ PBS H
-/- 4R
JNJ 5207852 H DMSO / PB
S WIldtyp
JNJ 5207852 Wildtyp
JNJ 7777120 Wildtyp
JNJ 7777120 + JNJ 5
207852 WT 0
2 4 6 8 10 12 14
*
Colonlänge Behandlung
Länge Colon [cm]
Abbildung 25: Colonlängen bei akuter Colitis induziert durch Gabe von Natriumdextransulfat (DSS) 2,5%ig Vergleich Wildtyptiere unbehandelt (PBS + DMSO), mit JNJ 5207852 (H3-Rezeptor-Antagonist), JNJ 7777120 (H4-Rezeptor-Antagonist) und mit JNJ 5207852 + JNJ 7777120 behandelt und bei H4R- defizienten Tieren (H4R-/-) unbehandelt (PBS + DMSO) und mit JNJ 527852 behandelten Tieren.
Mittelwert ± SEM, ** P ≤ 0,01, * P ≤ 0,05
