Archiv "Experimentelle Inselzell-Transplantation" (06.04.1978)

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Experimentelle

Inselzell-Transplantation

Neue Entwicklungen

auf dem Gebiet des Diabetes mellitus

Konrad Federlin, Reinhard G. Bretzel, M. Slijepcevic, K. Helmke

Rechtzeitige Inseltransplanta- tion beim experimentellen Diabetes normalisiert nicht nur den Glukosestoffwechsel, sondern bildet außerdem — wie Tierversuche gezeigt haben — mikroangiopathische Veränderungen an Nieren und Augen zurück. Voraussetzung für diese Erfolge sind Inzucht- tiere, da andernfalls die transplantierten Inseln der immunologischen Abstoßungsreak- tion unterliegen, bei der sie nur durch massive Immunsup- pression geschützt werden können. Als besonders günsti- ger Implantationsort haben sich Leber und Milz erwiesen.

Die Zahl der erforderlichen In- seln liegt bei 5 bis 10 Prozent eines normalen Pankreas.

Hieraus kann geschlossen werden, daß auch bei einer späteren Anwendung dieser Technik beim Menschen unter Einsatz von Inselzellkulturen beziehungsweise einer Insel- bank das quantitative Problem nicht unlösbar sein dürfte.

Aus der Medizinischen Poliklinik,

Abteilung III des Zentrums für Innere Medizin (Leiter: Professor Dr. med. Konrad Federlin) der Universität Gießen")

Im Tierexperiment gelingt eine bio- logische Heilung des Diabetes durch die Verpflanzung isolierter Langer- hansscher Inseln. Rechtzeitige In- seltransplantation bildet außerdem mikroangiopathische Veränderun- gen an Nieren und Augen zurück.

Voraussetzung für diese Erfolge sind Inzuchttiere, andernfalls werden die Inseln immunologisch abge- stoßen, oder sie müssen davor durch massive lmmunsuppression geschützt werden. Bis zur Anwen- dung der Methode beim Menschen müssen weitere Voraussetzungen geschaffen werden. Der positive Transplantationseffekt auf die Mi- kroangiopathie, das heißt deren mögliche Reversibilität, ist bereits ein wichtiges Resultat dieser experimentellen Diabetesforschung.

Auch anscheinend gut eingestellte Diabetiker zeigen bei laufender Blut- zuckerkontrolle (zum Beispiel mit Hilfe des künstlichen Pankreas) ganz erhebliche Schwankungen des Blutzuckerspiegels innerhalb 24 Stunden. Eine der Blutzuckerhöhe adäquate Insulinzufuhr ist nach heu- tiger Erkenntnis der mit großer Wahrscheinlichkeit wichtigste Ga- rant zur Verhinderung der geschil- derten Spätkomplikationen des Dia-

betikers. Bis vor kurzem fehlten Be- obachtungen, ob tatsächlich durch den biologischen Ersatz der zerstör- ten Betazellen die diabetische Mi- kroangiopathie verhindert werden kann. Zwar war es möglich, durch die Transplantation eines gesamten Pankreas die diabetische Stoffwech- selsituation zu beseitigen, jedoch überlebten die Transplantations- empfänger nicht lange genug, um einen Einfluß auf die Mikroangiopa- thie erkennen zu lassen. Pankreas- transplantationen, von denen 1976 nach den Angaben der ACS-NIH-Or- gan Transplant Registry insgesamt 51 registriert wurden, stellen tech- nisch außerordentlich komplizierte Operationen dar, die von einer gro- ßen Zahl von Komplikationen beglei- tet sind, wobei die erforderliche im- munsuppressive Therapie wesent- lich dazu beiträgt (1). In dieser Situa- tion eröffneten sich neue Aspekte, als Moskalewski 1965 die Möglich- keit entdeckte, Langerhanssche In- seln mit Hilfe von Kollagenase relativ leicht aus dem Verband des exokrinen Pankreas zu isolieren. Es be-

*) Durchgeführt mit Unterstützung der Deut- schen Forschungsgemeinschaft, Bad Go- desberg, Sonderforschungsbereich 87, Pro- jekt D 7, Endokrinologie, Ulm, und der Farb- werke Hoechst AG, Frankfurt/Main-Höchst

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Inselzell

^-

Transplantation

gann nun eine Ära nicht nur von In- vitro-Untersuchungen über den Ein- fluß verschiedener physiologischer Stimulantien und von Pharmaka auf die Insulinsekretion, sondern zu Be- ginn der 70er Jahre auch der erste Versuch, isoliertes Inselgewebe zu transplantieren, um einen experimentellen Diabetes zu heilen. Als Modell diente meistens der durch Alloxan oder Streptozotocin (ein spezifisches Gift für die Betazellen) hervorgerufene Diabetes verschiedener Labortiere (Ratte, Maus, Ham- ster). Vereinzelt wurden auch Hun- de, Schweine und Affen für die Ex-

perimente benutzt. Am Beginn stand eine ganze Reihe von Unbekannten endokrinologischer und immunolo- gischer Art, zum Beispiel die Frage, ob das isolierte Gewebe an anderer Stelle im Organismus seine Funk- tion wiederaufnehmen würde, wel- che Zahl an Inseln erforderlich sei, wie groß die Immunogenität des isolierten endokrinen Gewebes sein würde usw. Von ihrer Beantwortung waren die wichtigsten Hinweise für eine eventuelle Anwendung der In- seltransplantation zur Behandlung des menschlichen Diabetes zu er- warten.

Experimentelle Ausgangssituation des Inselempfängers

Die Versuchstiere, denen Inseln eingepflanzt werden, sind vorher ent- weder pankreatektomiert oder durch Streptozotocin diabetisch

ge- macht

worden. Der erzeugte Diabe- tes gleicht dem des Menschen in seinen Auswirkungen weitestge- hend, das heißt, es kommt zur Hypo- insulinämie, Hyperglykämie, Glu- kosurie und bei längerem Bestehen zu diabetischen Sekundärkomplika- tionen wie Katarakt, glomeruläre Mi- kroangiopathie und Veränderungen

Abbildung 1 (links): Darstellung einer in die Leber transplantierten Langerhansschen Insel mit reaktionsloser Einheilung.

Fluoreszenzoptische Darstellung der insulinproduzierenden Betazellen mit Hilfe eines FITC-markierten Antikörpers.

Abbildung 2 (rechts): Oben: Diabetische Ratte nach viermonatiger Krankheitsdauer — Unten: Gleiches Tier vier Monate nach Transplantation Langerhansscher Inseln

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Abbildung 3a (oben links): Kapillarschädigung am Glomerulus einer diabetischen Ratte nach achtmonatiger Diabetesdauer (Einlagerung von PAS-positiver Substanz in das Mesoangium und Verdickung der Kapillarwand, insbesondere am Gefäßpol) — Abbildung 3b (oben rechts): Glomerulus einer diabetischen Ratte nach elfmonatiger Diabetesdauer mit besonders deutlicher Kapillarwandverdickung und Ablagerung PAS-positiver Substanz — Abbildung 3c (unten links): 9 Monate altes, zunächst diabetisches Tier, 4 Monate nach Transplantation von 500 Langerhansschen Inseln intraportal in die Leber. Normale glomeruläre Strukturen — Abbildung 3d (unten rechts): Glomerulus einer primär diabetischen Ratte 8 Monate nach Diabetesinduktion und 4 Monate nach Transplantation: Besserung des histologischen Befundes, aber noch Einlagerung von PAS-positiver Substanz im Mesoangium nachweisbar („Defektheilung")

an den Netzhautgefäßen des Auges.

Durch entsprechende Dosierung des Streptozotocins läßt sich der Grad des Diabetes variieren von schwersten ketotischen Formen mit Letalität ohne Therapie bis zu mil- den Formen, die ein weiteres Über- leben ohne Behandlung erlauben.

Zahl und Alter

der erforderlichen Inseln

Verschiedene Arbeitsgruppen fan- den unabhängig voneinander, daß bei dem am häufigsten benutzten Labortier, der Ratte, etwa 400 bis 600 isolierte Inseln ausreichen, um eine weitgehende Normalisierung des diabetischen Stoffwechsels zu erreichen. Diese Menge entspricht etwa 5 bis 8 Prozent der in einem normalen Rattenpankreas enthalte- nen Inseln. Je nach Implantationsort werden auch weniger Inseln benö-

tigt, die geringste Zahl, wenn die In- seln in die Leber verpflanzt werden.

Die Arbeitsgruppe von Lazarow in den USA (5) konnte zeigen, daß auch neonatales und fetales Inselgewebe zur Verpflanzung geeignet ist. In diesem Fall genügt es, das Pankre- asgewebe nur kurzfristig anzudau- en, und man kann auf eine komplet- te Isolierung der Inseln verzichten.

Das unreife Inselgewebe entwickelt sich im Empfängerorganismus zu voll funktionsfähigem endokrinem Gewebe und nimmt dann, wenn auch verspätet, verglichen mit erwachsenen Inseln, seine Funktion auf. Die notwendige Gewichtsmen- ge reduziert sich dabei beträchtlich (20 mg neonatales Inselgewebe ent- sprechen 3 mg fetalem Gewebe).

Besondere Bedeutung für die weitere Entwicklung der Inseltransplanta- tion kommt den Versuchen zu, In- seln oder Betazellen in der Gewebe-

kultur über längere Zeit am Leben zu erhalten, beziehungsweise durch Anregung von Zellteilungen sogar eine Vermehrung zu erreichen. Bis- her konnte gezeigt werden, daß In- seln verschiedener Spezies mehrere Monate ohne Funktionsverlust kulti- viert werden können. Desgleichen läßt sich Inselgewebe der Ratte bei

—196° über mehrere Wochen ein- frieren und anschließend ohne Ein- schränkung transplantieren.

Der optimale Transplantationsort Bei den ersten Versuchen wurde als Lokalisation das subkutane Gewebe (1, 3) beziehungsweise die freie Bauchhöhle (6) benutzt. Dabei zeigte sich, daß hier der exokrine Anteil des Pankreas zugrunde ging, wäh- rend sich das Inselgewebe als kleine Zelthaufen an den verschiedenen Stellen im parietalen Peritoneum an-

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Inselzell-Transplantation

gesiedelt hatte. Wenig später zeigte sich, daß bei einer Implantation der Inseln in die Leber nicht nur ein ra- scherer Erfolg der Transplantation zu erreichen war, sondern auch weniger Inseln zur Korrektur der diabetischen Stoffwechsellage erforderlich waren. In gewisser Weise war hierbei auch der ursprünglichen Anatomie und Physiologie Rech- nung getragen, indem die Insulinse- kretion „prähepatisch" erfolgte.

Auch eine intralienale Verpflanzung der Inseln führte zu einer rascheren Heilung des Diabetes als die intrape- ritoneale Transplantation. Histologi- sche Untersuchungen der Leber lie- ßen erkennen, daß sich die Inseln nach Einschwemmen über die Pfort- ader im gesamten Organ verteilen und in den peripheren interlobulä- ren Ästen hängenbleiben (Abbil- dung 1). Mit immunhistologischen Verfahren konnten Alpha-, Beta- und Deltazellen nachgewiesen werden. Innerhalb weniger Tage war auch das Einsprossen von arteriel- len und venösen Gefäßen aus dem Periportalfeld zu beobachten. Zwi- schen den peripheren Inselzellen und den angrenzenden Hepatozyten kam es zu engen Verbindungen (sogenannte Desmosomen), deren Be- deutung bisher jedoch ungeklärt ist.

Ferner wiesen die Leberzellen im di- rekten Kontakt mit den Inselzellen einen besonders hohen Glykogen- gehalt auf. Die im übrigen bisher noch kurz-mittelfristigen Beobach- tungszeiträume lassen noch keine Besonderheiten seitens des Emp- fängergewebes erkennen, zum Bei- spiel zeigten sich nach den bisherigen Untersuchungen sowohl die Le- berfunktion wie der Portalvenen- druck unverändert. Die Resultate von Langzeitexperimenten sind jedoch noch abzuwarten. Interessan- terweise ist nach ersten Untersu- chungen einige Wochen nach der Transplantation auch ein Einspros- sen von Nervenfasern aus dem Le- bergewebe in die transplantierten Inseln färberisch nachzuweisen.

Stoffwechseleffekte der transplantierten Inseln

Inseln, die zwischen genetisch iden- tischen Tieren (Inzuchttieren) ver-

pflanzt werden und daher nicht der immunologischen Abstoßungsreak- tion unterliegen, zeigen sehr rasch den biologischen Effekt des von ih- nen im Empfängerorganismus se- zernierten Insulins. Nach Implanta- tion von 400 bis 600 Inseln in die Leber wird spätestens nach zwei Ta- gen eine Normalisierung von Gluko- se- und Insulinspiegel festgestellt, nach Gabe von 1000 Inseln innerhalb von 24 Stunden (bei intraperito- nealer Verpflanzung einige Tage später). Die Symptome Polydipsie und Polyurie verschwinden völlig, allerdings erst nach 1 bis 2 Wochen.

Der Glucagonspiegel ist nach den bisherigen Untersuchungen sogar noch über 3 bis 4 Monate erhöht, wobei es wahrscheinlich zu einem additiven Effekt der Hormonabgabe aus den noch erhaltenen A-Zellen, im Empfängerorganismus und den durch die Transplantation neu hin- zugefügten A-Zellen der transplantierten Inseln kommt. Die Rückbil- dung diabetischer Symptome ist auch abhängig von der Schwere des Diabetes, weswegen Tiere mit einer Ketose und besonders starkem Ge- wichtsverlust die längste Zeit zur Er- holung erfordern. Trotz Normalisie- rung von Nüchternblutzucker und Nüchterninsulinwert, Rückgang beziehungsweise Verschwinden der Harnzuckerausscheidung und Ge- wichtsnormalisierung (siehe Tabelle und Abbildung 2) verbleibt vorläufig der K-Wert noch im pathologischen Bereich, so daß offensichtlich die Glukoseassimilation nach intrave- nöser Verabfolgung unter den neu- en Umständen noch nicht normalisiert wird. Ob dies mit der heteroto- pen Lokalisation der Inseln zusam- menhängt, bleibt abzuwarten. We- sentlich ist vor allem, daß Inselgewe- be aus dem Pankreas erwachsener Tiere oder aber als neonatales beziehungsweise fetales Gewebe au- ßerhalb seiner Ursprungslokalisa- tion funktionsfähig bleibt und über eine längere Periode eine diabetische Stoffwechsellage zu kompen- sieren vermag.

Es bleibt abzuklären, wie sich das Schicksal der so verpflanzten Inseln im Langzeitexperiment (zum Bei- spiel Jahre) verhält.

Von besonderem Interesse waren die Resultate der Inseltransplanta- tion bei diabetischen Tieren, die eine Mikroangiopathie der Niere ent- wickelten. Erstmals konnte durch die Arbeitsgruppe von Lazarow (5) durch die Verpflanzung von neona- talem Inselgewebe in die Bauchhöh- le und in eigenen Untersuchungen (3) durch die Transplantation von isolierten Inseln aus erwachsenen Pankreata in die Leber demonstriert werden, daß Kapillarveränderungen an den Nieren verhindert beziehungsweise zurückgebildet werden können (Abbildung 3). Bei bereits länger bestehendem Diabetes (mehr als sechs Monate) blieben Restver- änderungen zurück. Amerikanische Autoren konnten auch einen positi- ven Effekt auf die Augenhinter- grundgefäße feststellen. Ebenso wird die Bildung einer Katarakt verhindert, allerdings nicht mehr zu- rückgebildet, wenn sie ausgeprägt war. Die „Heilungsvorgänge" bestehen vorwiegend darin, daß die Ver- breiterung des Mesoangiums im Glomerulum zurückgeht, sich die verdickten Kapillarwände wieder verschmälern und die immunhisto- logisch nachweisbaren Ablagerun- gen von IgG und Komplementfakto- ren verschwinden.

Histokompatibilität — Immunologi- sche Abstoßungsreaktionen Histologische Untersuchungen der ersten beim Menschen transplantierten kompletten Pankreata schie- nen die bereits seit Jahrzehnten ver- mutete Ansicht zu bestätigen, daß endokrines Gewebe partiell immunologisch „privilegiert sei" und nur geringe Abstoßungsreaktionen her- vorriefe. Man fand nämlich die Langerhansschen Inseln im Gegen- satz zum exokrinen Anteil weitestge- hend unversehrt, eine Tatsache, die man heute mit der immunsuppressi- ven Wirkung der Urämie erklärt, an denen die Patienten ebenfalls litten.

Einige wenige Transplantationen bei nichturämischen Diabetikern zeigten jedoch, daß die Inseln in die Ab- stoßungsreaktionen miteinbezogen waren. Leider erwiesen sich auch die isolierten Inseln als außerordent- lich immunogen, wie die ersten Re-

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Normaltiere Diabetische. Transplantierte n = 9 keine Transpl. n = 16

n = 20

Glukosurie 0 >2% 0 n=11

(%) > 2% n=5

Urin-Volumen

(ml/24h) 10,7 ± 0,7 79,2± 2,3 14,3 ± 3,6 Nüchtern-BZ

(mg-%) 78,2±11,1 337,3 20,9 76,1 ± 6,3 Nüchtern-IRI

(4/m1) 39,7±6,3 13,6± 1,6 54,7±9,5

k-Wert (i.v.GTT) 1,51 ±0,10 0,35±0,04 1,17±0,05 Gewicht (g) 416,8±4,3 229,7±5,7 362,0±9,8

sultate von Allotransplantationen, das heißt Verpflanzungen von Inseln zwischen Tieren gleicher Spezies, aber verschiedener Stämme, erkennen ließen. Bereits nach wenigen Tagen geht die Funktion der Inseln zurück (2), so daß eine besonders starke Abstoßungsreaktion zu ver- muten ist. War die Histokompatibili- tätsbarriere zwischen Inselspender und -empfänger niedrig, so erfolgte auch die Abstoßungsreaktion verzö- gert. Durch eine kombinierte im- munsuppressive Therapie mit Anti- lymphozytenserum, Prednisolon und Azathioprin gelang es mehreren Untersuchern, die verpflanzten In- seln für Monate (bis zu 1 Jahr) funk- tionsfähig zu halten. Untersuchun- gen zur genauen Klärung der Absto- ßungsmechanismen sind derzeit im Gang. Weitere Versuche beschäfti- gen sich mit dem Schutz der Inseln durch sogenannte Millipore-Kam- mern, die bei einigen Labortieren mit Erfolg eingepflanzt werden konnten und das Gewebe zumindest vor den zellulären Abstoßungsreak- tionen schützen. Ein länger anhal- tender Erfolg konnte jedoch mit dieser Methode bisher nicht erreicht werden. Im übrigen bleibt abzuwarten, ob es gelingt, immunologische Toleranz gegenüber den kleinen Ge- websmengen zu erzielen oder aber die Immunogenität durch Vorbe- handlung (zum Beispiel Gewebskul- tur) abzuschwächen.

Inseltransplantation beim Menschen

Bisher sind nur wenige Versuche mit der Transplantation isolierter Inseln beim Menschen vorgenommen worden, über die kürzlich Najarian (8) berichtete. Man verpflanzte sowohl fetales Pankreasgewebe wie Inseln aus dem Pankreas von Erwachsenen in die freie Bauchhöhle beziehungsweise in die Leber. Die Patienten standen wegen vorausgegangener Nierentransplantationen unter im- munsuppressiver Therapie. Die Menge des verpflanzten Inselgewe- bes lag zwischen 0,4 und 14,5 Pro- zent der Inseln eines normalen Pan- kreas. Wie die Autoren mitteilten, konnte der Blutzucker im Durch- schnitt um 15 Prozent und die Glu- kosekonzentration im Urin um 24 Prozent gesenkt werden. Ein durch- schlagender Erfolg war diesen ersten Experimenten beim Menschen nicht beschieden. Trotz dieser von der Stoffwechselseite her nicht be- friedigenden ersten Resultate kann als positiv gewertet werden, daß die Versuche bei den diabetischen Pa- tienten keine negativen Effekte hat- ten, weder kam es zu einer Infektion in Leber oder Bauchhöhle noch zu einer Funktionsstörung der Leber beziehungsweise Erhöhung des in- traportalen Druckes. Inwieweit die ursprünglich den Diabetes auslö- senden Faktoren (Virusinfektion?,

genetische Mechanismen unbe- kannter Art?, Inselzellantikörper?) auch transplantierte Inseln beein- flussen, ist ebenfalls noch offen.

Schlußbetrachtung

Inwieweit diese tierexperimentell er- folgreichen Versuche einer Insel- transplantation zur Heilung eines Diabetes beim Menschen beitragen werden, ist gegenwärtig noch nicht zu entscheiden. Zahlreiche Hinder- nisse, darunter die bisher auch für andere Organe nicht überwundene Transplantationsbarriere, stehen im Wege. Dennoch haben sich neue Aspekte aufgetan, die der Diabetes- forschung starke Impulse gegeben haben. Die experimentelle Diabeto=

logie hat zum gegenwärtigen Zeit- punkt folgende wichtige Resultate erarbeitet:

• Inselgewebe kann auch außer- halb des Pankreas seine Funktion entfalten.

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Die Menge der für eine Korrektur eines experimentellen Diabetes erforderliche Inselzahl liegt bei etwa 5 bis 10 Prozent der Inseln einer normalen Bauchspeicheldrüse.

O Die Inseltransplantation ermög- licht „Reparaturvorgänge" an der durch die Grundkrankheit verur- sachten Kapillarschädigung von Niere und Augen.

Literatur

(1) Ballinger, W. F., Lacy, P. E.: Surgery 72 (1972) 175 — (2) Federlin, K., Helmke, H., Slijep- cevic, M., Pfeiffer, E. F.: Diabetologia 9 (1973) 66 — (3) Federlin, K., Bretzel, R. G., Schmidt- chen, U.: Horm. Metab. Res. 8 (1976) 404 — (4) Jonasson, 0., Reynolds, W. A., Snyder, G., Ho- versten, G.: Transpl. Proc. IX, Vol. 1 (1971) 1223

— (5) Lazarow, A., Wells, L. J., Carpenter, A. M., Hegre, 0. D., Leonard, R. J., McEvoy, R. C.:

Diabetes 22 (1973) 877 — (6) Leonard, R. J., Lazarow, A., Hegre, 0. D.: Diabetes 22 (1973) 413 — (7) Mauer, S. M., Steffes, M. W., Suther- land, D. E. R., Najarian, J. S., Michael, A. F., Brown, D. M.: Diabetes 24 (1975) 280 — (8) Naja- rian, J. S., Sutherland, D. E. R., Matäs, A. J., Steffes, M. W., Simons, R. L., Goetz, F. C.:

Transpl. Proc. IX, Vol. 2 (1977) 233 — Pfeiffer, E. F.: Dt. Ärztebi. 75 (1978) 547 ff.

Anschrift des Verfassers:

Prof. Dr. med. Konrad Federlin Medizinische Universitätsklinik Abteilung III des Zentrums für Innere Medizin

Rodthohl 6, 6300 Gießen