die ieÿbettchromatographische Aufreinigung
eines Proteins aus Säugetierzellkulturen
Von der Technischen Fakultät
der Universität Bielefeld
zur Erlangung des Grades
Doktorin der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
genehmigte
D I S S E R T A T I O N
von
Dipl.-Biol. Nicole Melanie Ameskamp
aus Bielefeld
Technische Fakultät, Universität Bielefeld
2. Gutachter: Prof. Dr. Norbert Sewald
Arbeitsgruppe Organische und Bioorganische Chemie,
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Oktober 1997 bis Dezember 2001
am Lehrstuhl für Zellkulturtechnik der Technischen Fakultät an der Universität
Bielefeld unter der Leitung von Herrn Prof. Dr.Ing.J. Lehmann angefertigt.
Herrn Prof. Dr.Ing. J.Lehmann danke ich für die Möglichkeit der Dissertation,
für die interessante Themenstellung und die vielfältige Unterstützung sowie die
hervorragenden Arbeitsbedingungen, die er am Lehrstuhl für Zellkulturtechnik
etablierthat.
Herrn Prof. Dr. N. Sewald (Fakultät für Chemie, Abteilung Organische Chemie
III) danke ich für die Übernahme des Zweitgutachtens, die Bereitschaft zur
fach-spezi schen Diskussion und dieMöglichkeit, inZusammenarbeitmitihmund
sei-nen MitarbeiterInnen die Herstellung der durch Festphasensynthese gewonnenen
Peptidezu realisieren.
Herrn Prof. Dr. E.Flaschel möchte ich für die Übernahme des Prüfungsvorsitzes
und die Referenzen danken, die mir eine Konferenzteilnahme und die Zusage für
einAbschluÿstipendiumermöglichten.
Herrn Dr. D. Lütkemeyer dankeichfür dielangjährigeBetreuung, dieproduktive
Zusammenarbeitsowiedievielen anregendenAuseinandersetzungen unddas
stän-dig entgegengebrachte Interesse anmeiner Arbeit.
MeinbesondererDankgiltHerrn Dr.R. Frank(AbteilungMolekulareErkennung,
Gesellschaft für biotechnologische Forschung mbH, GBF, Braunschweig) für die
hervorragende Zusammenarbeit bei der Suche geeigneter Peptidliganden. Die in
seiner Arbeitsgruppe durchgeführten Spot-Synthesen sowie seine permanente
Be-reitschaft zur Diskussion und Planung von Versuchen gaben mirdie
Herrn Dr. W.Tegge(AbteilungMolekulareErkennung,GBFGesellschaftfür
bio-technologische Forschung,Braunschweig) dankeichfürdiehilfreichefachliche
Un-terstützung bei der direkten Synthese des Peptidliganden an das
Chromatogra-phiematerialund fürdieVermessung derMatrixproben inder Sequenz-und
Ami-nosäureanalytik.
Bei Herrn Dipl.-Chem. D. Bächle (Fakultät für Chemie, Abteilung Organische
Chemie III) möchte ich mich für die ergiebige Zusammenarbeit bei der
Entwick-lung der Kupplungsstrategie unter Verwendung geschützter Peptidliganden, die
Herstellung der notwendigen Sequenzen sowie die unermüdliche Bereitschaft zur
fachspezi schen Diskussion bedanken.
Frau Dipl.-Chem. E. M. Bartsch und Herrn Dipl.-Biol. C. Priesner giltmein
be-sonderer Dank für die exzellente Zusammenarbeit und die gewissenhafte
Durch-führung der dieser Dissertationassoziierten Diplomarbeiten.
AllenMitarbeiterInnenamLehrstuhl fürZellkulturtechnikmöchteichfürdas
aus-gezeichnete Arbeitsklima, die hervorragende Zusammenarbeit und die vielfältige
Hilfsbereitschaftdanken.
Der Firma Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Schweden) und ihren
Mit-arbeiterInnen, darunter insbesondere Herrn Dr. L.-J.Larsson, danke ich für die
fachlicheund nanzielleUnterstützungmeinerArbeitsowiedieBereitstellung des
ieÿbettchromatographischen Prototypmaterials.
Der Weidmüller Stiftung und ihren MitarbeiterInnen danke ich für das
entgegen-gebrachteInteresseanmeinemPromotionsvorhaben, dassiedurchdieGewährung
eines Stipendiums nanziellunterstützt haben.
Der Bayer AG (Wuppertal) und insbesondere Herrn Dr. U.Gottschalk möchte
ich für das Interesse an meiner Arbeit, der Möglichkeit Ergebnisse vorstellen und
diskutieren zu können sowie dem Einverständnis zur Verwendung ihrer
Produkt-zellliniedanken.
Mein besonderer Dank gilt zu guter letzt meinen Eltern und Geschwistern, die
michwährend der gesamten Zeit der Promotioninjeglicher Form unterstützt
ha-ben. Meiner Schwester Simonedankeichdabeiinsbesondere fürdiehilfreiche und
Publikationen
Ameskamp N., PriesnerC., Lehmann J., LütkemeyerD. (1999):PilotScale
Re-covery of Monoclonal Antibodies by Expanded Bed Ion Exchange Adsorption;
Bioseparation 8 (1-5): 169-188, 1999
Lütkemeyer D., Ameskamp N., Tebbe H., Wittler J., Lehmann J. (1999):
Esti-mationofCellDamageinBench-andPilot-ScaleA nityExpanded-Bed
Chroma-tography forthe Puri cationof MonoclonalAntibodies.Biotechnology &
Bioengi-neering 65(1) Oct. 5: 114-119, 1999
Feuser J., Halfar M., Lütkemeyer D., Ameskamp N., Kula M.R., Thömmes J.
(1999): Interaction of Mammalian Cell Culture Broth with Adsorbents in
Ex-panded Bed Adsorption of Monoclonal Antibodies; Process Biochemistry 34 (2):
159-165, 1999
Lütkemeyer D., Ameskamp N., Priesner C., Bartsch E.M., Lehmann J. (2000):
Capture ofProteins fromMammalianCells inPilotScale UsingDierent
Stream-line TM
Adsorbents; Bioseparation, in press
Kongreÿvorträge
Ameskamp N., PriesnerC., Lehmann J., LütkemeyerD. (1998):PilotScale
Re-coveryofMonoclonalAntibodiesbyExpandedBedIonExchangeAdsorption;2nd
International Conference on Expanded Bed Adsorption, Napa Valley, CA, USA,
Juni 1998
Ameskamp N., Frank R., Sewald N., Lehmann J., Lütkemeyer D. (2001):
Ent-wicklung und Einsatz eines Peptid-A nitätsliganden für die chromatographische
AufreinigungeinesmonoklonalenAntikörpersausMaus/Maus-Hybridomkulturen;
Posterpräsentationen & sonstige Veröentlichungen
LütkemeyerD., Ameskamp N., Tebbe H.,BrachtK., Lehmann J.(1996):Direct
Capture of Monoclonal Antibodies Using High Capacity Membrane Ion
Exchan-gers in PilotScale; 14th ESACT-Meeting ,Vilamoura, Portugal, 1996
AmeskampN., LütkemeyerD.,TebbeH.,WittlerJ.,LehmannJ.(1996):
Puri -cationofMurineIgG
1
fromCellCultureBrothbyExpandedBedChromatography
UsingStreamline TM
rProteinA;PharmaciaBiotech,Downstream,22, 24-26,1996
LütkemeyerD., Ameskamp N., Tebbe H.,WittlerJ.,Lehmann J.(1996):Direct
Capture ofMAbs Usinga New rProteinAMatrixinFluidized Bed
Chromatogra-phy under Lysis-Free Conditions; Engineering Foundation Conference: Recovery
of BiologicalProducts VIII, Tucson, USA, 1996
Lütkemeyer D., Ameskamp N., Tebbe H., Wittler J., Lehmann J. (1996):
Inve-stigationof Cell Damage inPilotScaleFluidized Bed Chromatography for Direct
CaptureofMonoclonalAntibodies;1st InternationalConferenceonExpandedBed
Adsorption, Queens' College, Cambridge, UK, 1996
AmeskampN.,LütkemeyerD.,TebbeH.,WittlerJ.,LehmannJ.(1996):
Optimi-zingDirectCaptureofMAbsfromCellCutureBrothUsingrProteinAinFluidized
Bed Chromatography under Lysis-Free Conditions; 1st International Conference
on Expanded Bed adsorption, Queens' College,Cambridge, UK, 1996
AmeskampN., LütkemeyerD.,TebbeH.,LehmannJ.(1997):Downstream
Pro-cessing im Pilotmaÿstab: Direkte a nitätschromatographische Aufreinigung
mo-noklonaler Antikörper aus Hybridomkulturen im stabilen Flieÿbett; Bioscope 5:
14-22, 1997
AmeskampN.,LütkemeyerD.(1997):Puri cationofMurineIgG
1
fromCell
Cul-ture Broth by Expanded Bed Adsorption at LabScale; Application Note
Stream-line TM
rProtein A, Pharmacia Biotech, 1997
AmeskampN., LütkemeyerD.,TebbeH.,WittlerJ.,LehmannJ.(1997):
Puri -cationof Murine IgG
1
fromSpentCulture Mediumby ExpandedBed Adsorption
bettchromatographie für die direkte Reinigungvon Antikörpern aus zell-haltigen
KulturbrühenimPilotmaÿstab;15.DECHEMA-Jahrestagungder Biotechnologen,
Münster, 1997
PriesnerC., Ameskamp N., LütkemeyerD., LehmannJ. (1997):DirectCapture
of Monoclonal Antibodies with a New High Capacity Streamline TM
SP_XL Ion
Exchanger; 15th ESACT-Meeting, Tours, Frankreich,1997
Priesner C., Ameskamp N., Lütkemeyer D., Lehmann J. (1997): From Bench
to Pilot Scale: Recovery of Monoclonal Antibodies from Unclari ed Cell Culture
Broth by Expanded Bed Ion Exchange Chromatography; Downstream Processing
Conference,Amsterdam, Niederlande, 1997
Ameskamp N., PriesnerC., Lehmann J., LütkemeyerD. (1998):PilotScale
Re-coveryofMonoclonalAntibodiesbyExpandedBedIonExchangeAdsorption;2nd
International Conference on Expanded Bed Adsorption, Napa Valley, CA, USA,
1998
Ameskamp N., Bartsch E.M., Shi H., Lehmann J., Lütkemeyer D. (2000):
Op-timization and Scale Up of anIMAC Expanded Bed Process for the Recovery of
RecombinantProthrombin ExpressedinCHO Cells;3rd International Conference
on Expanded Bed Adsorption, Garmisch-Partenkirchen,Deutschland, 2000
Lütkemeyer D., Ameskamp N., Priesner C., Bartsch E.M., Lehmann J. (2000):
Capture ofProteins fromMammalianCells inPilotScale UsingDierent
Stream-line TM
Adsorbents; 3rd International Conference on Expanded Bed Adsorption,
Garmisch-Partenkirchen, Deutschland, 2000
Ameskamp N., Frank R., Lehmann J., Lütkemeyer D. (2001): Expanded Bed
AdsorptionofaMonoclonalAntibodyUsingaSmallPeptideLigandinComparison
1 Einleitung 1
1.1 Einführung . . . 1
1.2 Problemstellungund Zielsetzung. . . 3
1.3 Theoretische Grundlagen . . . 7
1.3.1 Flieÿbettchromatographie . . . 7
1.3.2 Peptidchemie . . . 22
2 Material und Methoden 39 2.1 Herstellung der Peptid-A nitätsmatrix . . . 39
2.1.1 Suche eines geeigneten Peptidliganden . . . 39
2.1.2 Peptidkupplung andie Basalmatrix . . . 44
2.2 Produktgewinnung . . . 52
2.2.1 Produkt, Zellinie und Kulturmedium . . . 53
2.2.2 Kultivierungssystem und Prozeÿführung . . . 53
2.3 Chromatographie . . . 54
2.3.1 Chromatographieanlagen . . . 55
2.3.2 Prozeÿführung inder Chromatographie . . . 57
2.3.3 Charakterisierung der Matrices . . . 62
2.4 Analytik . . . 66
2.4.1 Produktquanti zierung mittelsELISA . . . 66
2.4.2 Analytische Gel ltration . . . 69
2.4.3 SDS-PAGE und Silberfärbung . . . 70
2.4.4 Western-BlotAnalyse. . . 72
2.4.5 Casy1: Aufnahme vonPartikelgröÿenverteilungen . . . 75
2.4.6 QuantitativeDNA-Bestimmung . . . 76
2.4.7 Bestimmung der LDH-Aktivität . . . 78
3 Ergebnisse und Diskussion 83
3.1 Selektioneines geeigneten Peptidliganden. . . 84
3.1.1 Erster Selektionszyklus . . . 85
3.1.2 Zweiter Selektionszyklus . . . 87
3.1.3 Dritter Selektionszyklus . . . 89
3.1.4 Untersuchung vonSequenzmutationen . . . 92
3.1.5 Theoretische Charakterisierung der Peptidliganden . . . 96
3.1.6 Zusammenfassung . . . 99
3.2 Peptidkupplung andieBasalmatrix . . . 101
3.2.1 Kupplung Fmoc-geschützter Peptide . . . 101
3.2.2 Peptidkupplung übereinen Disul d-Austausch . . . 107
3.2.3 Direkte Synthese anNHS-Sepharose TM . . . 110
3.2.4 N-terminaleKupplung anNHS-Sepharose TM . . . 116
3.2.5 Zusammenfassung . . . 118
3.3 Festbettchromatographie . . . 120
3.3.1 Aufarbeitung von Kulturüberstand . . . 120
3.3.2 AbreicherungvonFremdproteinen . . . 124
3.3.3 AbreicherungvonDNA. . . 126
3.3.4 Abreicherungniedermolekularer Substanzen . . . 128
3.3.5 Untersuchung der Bindungsspezi tät . . . 130
3.3.6 Untersuchung der Bindungskapazität . . . 132
3.3.7 Untersuchung des Verweilzeitverhaltens . . . 143
3.3.8 Optimierungder Regeneration . . . 150
3.3.9 Stabilitätstest . . . 153
3.3.10 Zusammenfassung . . . 156
3.4 Flieÿbettchromatographie . . . 159
3.4.1 Festlegung der Betriebsparameter . . . 159
3.4.2 Aufreinigungaus Kultursuspensionen . . . 162
3.4.3 Abreicherungder Biomasse . . . 170
3.4.4 Zellschädigung . . . 174
3.4.5 Biomasse/MatrixInteraktionen . . . 180
3.4.6 Zusammenfassung . . . 187
4 Zusammenfassung und Ausblick 191
A Abkürzungsverzeichnis I
Einleitung
1.1 Einführung
Die Biotechnologiehat in den vergangenen Jahrzehnten eine rasanteEntwicklung
gemachtund bildet heute eine wichtige Grundlage für diegroÿtechnische
Herstel-lung einer Vielzahl von Produkten. Eines der bedeutendsten Anwendungsgebiete
ist die Medizin. War die Gewinnung therapeutischer und diagnostischer
Phar-mazeutika früher nur durch die komplizierte und kostenintensive Isolierung aus
lebenden Organismenoder durcheine aufwendigechemische Synthese möglich,so
bietet die Biotechnologieauf dem derzeitigen Stand der Forschung und der T
ech-nik einewertvolleAlternative,dieimLaufeder letztenJahre zahlreiche klassische
Verfahren erfolgreichabgelöst hat.
Für die medizinische Diagnostik waren die Arbeiten vonKöhler und Milstein
von besonderer Bedeutung [Köhler & Milstein, 1975]. Ihnen gelang es, durch die
FusionvonMyelomzellenmitB-LymphozytenimmortalisierteHybridomzellen
her-zustellen, dienach SelektionierungzurProduktion monoklonalerAntikörperfähig
waren. Diese kommen heute in vielen medizinischen Routinetests, aber auch als
A nitätsliganden oder sogar zur therapeutischen Behandlung vonKrebs und
an-deren Erkrankungen zum Einsatz [Miller & Levy, 1981; Nowinski et al., 1983;
Olsson &Kaplan,1980; Peters &Baumgarten, 1990].
Ein entscheidender Fortschritt der Biotechnologie wurde mit der Entdeckung der
DNA-Doppelhelix und des genetischen Codes gemacht [Watson & Crick, 1953;
Crick, 1966],aufder diespätereEntwicklung derGentechnikberuhte, dieseitdem
dieDarstellungverschiedenster rekombinanter Proteinemitgewünschter Struktur
und Funktion ermöglichthat.
Produktion komplexer Proteine bietet sich die Kultivierung von
Eukaryontenzel-len an,danursiekorrekte posttranslationaleModi kationenwie Glykosilierungen
und AusbildungenvonDisul dbrücken gewährleisten kann, dieeinen
entscheiden-den Ein uÿ auf die biologische Aktivität der Moleküle haben [Liu, 1992]. Eine
besondere Bedeutung hat dieser Aspekt bei der Herstellung rekombinanter
Pro-teine für die therapeutische Anwendung, da diese eine präzise humanidentische
Wirksamkeit aufweisen müssen [Werner &Hoffmann, 1989].
Durch die Entwicklung geeigneter Fermentationssysteme ist es gelungen,
wich-tige biotechnische Herstellungsverfahren bis in den Industriemaÿstab zu
etablie-ren [Werner, 1990;Breuker & Drees, 1984;Pullen et al.,1985]. Auf diese Weise
kann heuteeinGroÿteildesweltweitenBedarfsantherapeutischenProdukten wie
beispielsweise das Erythropoieten oder der Blutgerinnungsfaktor VIII weitgehend
durchdie Gewinnung aus Zellkulturen gedeckt werden.
AuÿervonderEignungderExpressions-undKultivierungssystemehängtdie
Qua-lität eines biotechnisch gewonnenen Produkts im wesentlichen von der E zienz
der anschlieÿenden Aufarbeitungsstrategie ab. Die Reinheit ist eines der
wichtig-sten Kriterien fürden EinsatzvonProteinen inder Medizin [Berthold&Walter,
1994].Währendinder invitroDiagnostik häu geine Reinheitvon95%ausreicht,
dürfen die Kontaminationen in therapeutischen Produkten nur 1-2 ppm
betra-gen, was einem Reinheitsgrad von 99,9998 % entspricht [Wheelwright, 1989]. Da
das Zielmolekül in der Regel aus einem sehr komplexen Gemisch von Biomasse,
Fremdproteinen, niedermolekularen Substanzen, DNA und sonstigen
Medienbe-standteilen isoliert werdenmuÿ, stellt dieAufarbeitung häu g den aufwendigsten
Prozeÿabschnittdar undkann einenKostenanteilvonbiszu80%ausmachen
[Da-taret al.,1993].
Über den Erfolg eines Aufreinigungsprozesses entscheiden neben dem erzielten
Reinheitsgrad die Gewährleistung der Stabilitätdes Zielmoleküls sowie
ökonomi-sche Aspekte wieetwader methodischbedingteProduktverlust und der
Material-und Zeitaufwand des Verfahrens.
Der Aufarbeitungsprozeÿ für die Reingewinnung extrazellulärer Proteine gliedert
sichindieaufeinanderfolgendenSchrittederBiomasseabtrennung,der
Konzentrie-rung, der Fraktionierung, der Subfraktionierung und der Formulierung des
Pro-dukts. Sämtliche dazu eingesetzten Verfahren müssen optimal aufeinander
abge-stimmtwerden [Harrison, 1994;Sadana& Beelaram,1994].
Die Klärung erfolgt üblicherweise in Sedimentations-, Zentrifugations- oder
Mi-kro ltrationsverfahren[Gölker,1994;)],diedieZellintegritätzumSchutzdes
der Extraktion mit wäÿrigen 2-Phasen-Systemen und Fällungsreaktionen durch
ZugabevonSalzen,organischenLösungsmittelnoderPolymerenhäu g
Membran- ltrationsprozessewiedieUltra ltrationeingesetzt[Naveh&Siegel,1991].Fürdie
Fraktionierung von Proteinen haben sich chromatographische Methoden
durchge-setzt, die aufgrund der groÿen Auswahl an verfügbaren Matrices und der
Varia-bilität der Bindungsbedingungen für nahezu jedes Zielmolekül optimierbar sind
[Anspachet al.,1996]. Inder klassischen Säulenchromatographiewerden gepackte
Matrices aus kugelförmigen synthetischen oder natürlichen Polymeren [Arshady,
1991]eingesetzt,dieinAbhängigkeitvonihremjeweiligenLigandennach
verschie-denen Adsorptionsprinzipienarbeiten [Robertson &Kennedy, 1996;Scopes, 1996].
Aufgrund des hohen Kostenaufwands der herkömmlichen vielstu gen
Aufarbei-tungsprozesse genieÿen derzeit alternative integrative Verfahren das wachsende
Interesse der industriellen Anwender. Dabei versucht man, die Produktverluste
und den Material- und Zeitaufwand durch die Zusammenführung mehrerer
Pro-zeÿschritte e zient zu reduzieren. In den letzten Jahren hat sich die
Entwick-lung verstärkt auf die Anpassung adsorptiver Verfahren für den Einsatz in der
Primäraufarbeitungkonzentriert. Darausging dieMethode der
Flieÿbettadsorpti-on hervor,beider dieKlärung, Konzentrierung und erste Grobfraktionierung des
Zielmolekülsin einemSchritt erfolgen [Battet al.,1995; Chase,1994; Hanssonet
al., 1994; Hjorth, 1997; Thömmes, 1997]. Die heute erhältlichen Matrices sind in
ihrer strukturellen Beschaenheit dem Flieÿbettverfahren angepaÿt, so daÿ hohe
Durchsätzeerreichtwerdenkönnen.Diegrundlegendenchromatographischen
Cha-rakteristikaundBindungsprinzipien sind dabeimitdenenklassischer F
estbettma-terialienvergleichbar. Da durch den Kontakt mitder Biomasse jedoch intensivere
Regenerationsprozesse erforderlich sind, und insbesondere bei den weniger
spezi- schbindenden MatricesInteraktionen mitden Zellenauftretenkönnen,stellt die
FlieÿbettadsorptionneueAnforderungenandieStabilitätundSelektivitätder
ver-wendeten Liganden.
1.2 Problemstellung und Zielsetzung
InderklassischenSäulenchromatographiewerdeninderRegelMatricesmit
gruppen-oderbioa nitätsspezi schbindendenLigandeneingesetzt,diesichnurbedingtfür
ei-Die ladungs- oder gruppenspezi sch wechselwirkenden Matrices wie die
Ionen-austauscher oder HIC-Materialien (Hydrophobe Interaktions-Chromatographie)
zeichnen sich durch eine hohe Stabilität sowie niedrige Anschaffungs- und
Be-triebskosten aus. Aufgrund mangelnder Selektivität ist mit ihnen jedoch meist
keine einschrittige Isolierung des Produkts möglich.
EineoptimaleAbreicherungvonKontaminationenkannhäu gnurdurchden
Ein-satz hochspezi scher A nitätsmatrices erreicht werden [Jones 1991; Loweet al.,
1992; Narayanan, 1994], der allerdings mit einem relativ hohen Kostenaufwand
verbunden ist. Die verwendeten Proteinliganden weisen eine hohe Sensibilität
ge-genüberDenaturierungsprozessenauf,wasinsbesonderedieRegenerationsehr
auf-wendig machen kann [Burgoyneet al.,1993; Girot et al., 1990], und die
Stand-zeiten meist vergleichsweise kurz werdenläÿt.
DieNachteilederherkömmlichenLigandenführeninderFlieÿbettchromatographie
zu noch gravierenderen Problemen. Da das Bindungsprinzip der kleinen
funktio-nellenLigandender ladungs-undgruppenspezi schen Matricesaufeinfachen
phy-sikochemischenWechselwirkungen beruht,wird unter bestimmten
Aufarbeitungs-bedingungenauchdieBiomasseandemChromatographiematerialzurückgehalten.
Dieser Eekt tritt besonders massiv bei dem Einsatz von Ionenaustauschern auf
[Ameskampetal.,1999;Feuseretal.,1998].DieoptimaleBindungdesZielproteins
erfordert häu g sehr unphysiologische pH-Werte und Salzkonzentrationen, unter
denen auch die Biomasse mit den Liganden interagieren kann. Das Ausmaÿ der
Zellrückhaltungund die Auswirkungen auf die Stabilität der Prozeÿführung sind
fürdieEinzelexperimentenicht kalkulierbar[Fernández-Lahoreetal.,1999].W
e-gendermangelndenReproduzierbarkeitderAufarbeitungsergebnisse,derteilweise
sehr ausgeprägten Produktverluste und der Schwierigkeiten bei der Regeneration
der verklebten Matrices isteinzuverlässiger standardisierter Einsatz dieser
Flieÿ-bettmethode für viele Zellkulturproduktenicht möglich.
Das Problem der Biomasseadsorption besteht bei der Verwendung von
hochse-lektiven A nitätsmatrices nicht. Allerdings ist hier die Instabilität der Liganden
der limitierende Faktor, da der Kontakt mitder Biomasse höhere Anforderungen
andieRegenerationsprozessestellt.DievollständigeBeseitigungvorhandener
Zell-rückständekannnurdurchdieBehandlungmitspeziellenReagenziengewährleistet
werden, diesich jedoch häu g nichtmit dem proteinogenen Charakter der
Ligan-den vereinbaren lassen[Hale etal.,1994]. Infolgedessen müssen äuÿerst
material-und zeitaufwendige Reinigungsprozesse entwickelt werden , die sich zusätzlich zu
den hohen Anschaungskosten nachteiligauf dieProzeÿökonomie auswirken.
Um die E zienz der ieÿbettchromatographischen Verfahren zu steigern, müÿte
Bin- schen Materialien vereinen lassen. Auf diese Weise lieÿen sich Biomasse/Matrix
Interaktionen und die daraus resultierenden Prozeÿinstabilitäten verhindern und
gleichzeitig einfache standardisierte Regenerationsprotokolle realisieren, die die
Standzeiten der Flieÿbettsäulen verlängern und die Kostenintensität des
Gesamt-prozesses verringern könnten. An dieser Stelle setzt die grundlegende Idee der
vorliegendenArbeitein,inder dieVorteileder beidenMatrixtypen durchdie
Ver-wendung von Peptidliganden kombiniert werden sollten.
BisherliegennurwenigePublikationenüberdieEntwicklung undden Einsatzvon
Peptidliganden vor. Dabei handelt es sich in erster Linie um Strukturen, die aus
bekannten Bindungsdomänen eines Zielproteins abgeleitet und ausschlieÿlich in
der Festbettchromatographie getestet wurden [Ferris atal.,1992; Fischer et al.,
1996; Huanget al.,1996; Makriyannis&Clonis, 1997].
Die Selektionierung geeigneter Bindungspartner kann auf unterschiedliche Weise
erfolgen. Die Arbeit mit löslichen Peptidgemischen, in denen das Zielprotein an
einerMatrix xiert oderübersemipermeableMembranenräumlichvonder
Ligan-denlösung getrennt wird und als molekulare Falle für a ne Sequenzen fungiert,
hat bereits zu einigen Erfolgen geführt [Huang et al., 1999; López-Fandiño, 1993;
Swannetal.,1996].AllerdingsistdieseMethodeinsbesonderebeiderVerwendung
vonsehrkomplexenGemischenaufgrunddeshohenAufwandsfürdieAbtrennung,
Reinigungund Identi zierung der Bindungspartner zu kompliziertfüreinen
stan-dardisierten Einsatz.
HeutekonzentriertsichdieSelektionierungvonA nitätsligandenfürdie
Chroma-tographie in den wenigen bisher publizierten Anwendungen auf die Verwendung
von Peptidbibliotheken, die biologisch durch das Phage-Display [Hammond,1998;
Patwardhan etal.,1997] oder chemischdurchdiemultiplePeptidsynthese
[Amat-scheket al.,2000; Necina etal.,1998] gewonnen wurden.
Mit dem Phage-Display läÿt sich mit relativ geringem Aufwand eine groÿe
An-zahl von randomisierten Peptidsequenzen einer spezi schen Länge auf der
Ober- äche vonPhagenpartikelnherstellen, diedann in sogenannten High-Thr
oughput-Screening Tests verwendet werden können. Die Methode wird imallgemeinen für
biochemischund medizinischrelevanteStudien zur Aufklärung von
Molekülwech-selwirkungenundzurAu ndungpharmazeutischwirksamerStruktureneingesetzt
[Cesareni et al., 1999; Hoogenboom et al., 1998; Jefferies, 1998; Lowman, 1997;
McGregor,1996; Marks &Sharp,2000; Wilson& Finlay,1998].
Durch geeignete kombinatorische Strategien können auch mit der multiplen
Pep-tidsynthese Bibliotheken erstellt werden, die eine hohe Sequenzdiversität
[Frank, 1995; Geysen et al., 1984; Gordon et al., 1994; Houghten, 1985; Jung &
Beck-Sickinger, 1992;Kenan et al.,1994; Paviaet al.,1993].
Für die unspezi sche Suche nach einem A nitätsliganden eignet sich besonders
das Verfahren der Spot-Synthese aufCellulosemembranen[Frank, 1992; 1994].Es
bietetdieMöglichkeit,kombinatorischePeptidbibliothekenherzustellen,mitdenen
Bindungsstudien durchgeführt werden können, in denen sich die späteren
Bedin-gungen in der Chromatographie hervorragend simulieren lassen. Dies betrit
au-ÿerdenfreiwählbarenpH-undSalzbedingungenauchdieZugänglichkeitzwischen
den Reaktionspartnern. Wie in der Chromatographie liegen die Peptidsequenzen
in den Bindungsnachweisen mit den Spotmembranen xiert am Trägermaterial
und das Zielprotein in gelöster Form vor. Dies verspricht einen Vorteil gegenüber
dem Phage-Display, bei dem das Zielprotein an eine feste Phase gekuppelt wird,
und sich die Phagenpartikel mit den auf der Ober äche exponierten Peptiden in
Lösung be nden.
Vergleichende Interaktionsstudien, in denen Choulier et al. beide
Selektions-methodeneinandergegenüberstellten, ergaben tatsächlichUnterschiede inden
Er-gebnissen, dieauf die unterschiedliche Präsentation der Reaktionspartner
zurück-geführtwurden[Choulieretal.,2001].ZudemscheintdiePhage-DisplayMethode
insbesondere für dieUntersuchung von kleinen Oligopeptidenungeeignet zu sein,
dadas ErgebnisdurchdieInteraktionen seitensder Phagenhüllproteineverfälscht
werden kann, wie die Arbeiten von Gaskin et al. zeigten. Dort erwies sich ein
imPhage-Display selektioniertes Heptapeptidals chromatographischer
A nitäts-ligand unbrauchbar, während an dem immobilisiertenkompletten Phagenpartikel
eine signi kante Bindung des Zielproteins erzielt werden konnte [Gaskin et al.,
2001].
Das Zielder vorliegendenArbeit besteht darin, einHerstellungsverfahrenfür eine
Peptid-A nitätsmatrix zu etablieren, das auf beliebige Produkte der
Zellkultur-technik übertragbar ist. Die Methodenentwicklung erfolgt exemplarisch anhand
eines Modellproteins, bei dem es sich um einen aus Maus/Maus
Hybridomkultu-ren gewonnenen monoklonalen Antikörperhandelt.
Um ein möglichst stabiles Chromatographiematerialzu erhalten, sollsich die
Su-che nach dem Peptidkandidaten auf kurze, einfache Oligosequenzenbeschränken,
die jedoch gleichzeitig eine ausreichend hohe Bindungsa nitätund -intensität zu
dem Zielmolekül aufweisen müssen. Die Verwendung kombinatorischer
Peptidbi-bliotheken auf Basis der Spot-Synthese erscheint aus den besagten Gründen für
einen zuverlässigen Bindungsnachweis am besten geeignet und entspricht zudem
defürdessenFixierungandasChromatographiematerialentwickeltwerden.Dabei
sollendiePeptideindergleichenAusrichtungwieaufdenSpotmembranenmitder
Matrix verknüpft werden, da nur unter diesen Bedingungen ähnliche
Bindungsei-genschaften wie in den zugrundeliegenden Bindungsstudien zu erwarten sind. Die
ArbeitenvonAmatscheketal.zeigtenzudem,daÿeinevölligungerichtete
Ori-entierung an der Matrix aufgrund der schlechten Ligandenzugänglichkeit in sehr
geringen Bindungskapazitäten resultieren kann, was hier vermieden werden soll
[Amatschek et al.,1999].
Sämtliche Methoden zur Fixierungder Peptide an die Basalmatrix müssen
eben-falls auch für andereZielproteine bzw. derenspezi sche Liganden einsetzbar oder
zumindest durch geringfügige Modi kationen übertragbar sein. Für die
Entwick-lung der Kupplungsstrategien sind Versuche mit 1 ml Fertigsäulen vorgesehen.
NachausführlichenCharakterisierungenundVergleicheninderF
estbettchromato-graphiesolldieerfolgreichsteKupplungsmethodefürdieAnfertigungeiner
Flieÿbett-Prototypmatrix übernommenwerden.
Neben den üblichenchromatographischenKriterien wieder Reinheitund der
Bin-dungskapazitätsind hinreichendeUntersuchungen zurStabilitätund zu den
even-tuellauftretendenBiomasse/MatrixInteraktionengeplant.DerVergleichmitzwei
herkömmlichen Flieÿbettmatrices, bei denen es sich um einen Ionenaustauscher
und ein rekombinantes Protein A Gel handelt, soll abschlieÿend die Beurteilung
der Peptid-A nitätschromatographie für den Einsatz in der Flieÿbettadsorption
ermöglichen und dieFrage klären, ob es mitden neuartigen Ligandentatsächlich
gelingt, die Vorteile der gruppen- und bioa nitätsspezi schen Matrixtypen
mit-einander zu verknüpfen.
1.3 Theoretische Grundlagen
1.3.1 Flieÿbettchromatographie
Die Flieÿbettchromatographie (EBA) ist ein integratives
säulenchromatographi-sches Aufreinigungsverfahren, mit dem Biomoleküle direkt aus ungeklärten
Kul-tursuspensionen aufgearbeitet werden können. Wieaus der inAbbildung 1.1
dar-gestellten Einordnung des EBA-Verfahrens in das konventionelle
Aufarbeitungs-schema hervorgeht, vereint die Flieÿbettchromatographie die Arbeitsschritte der
Abbildung 1.1: EinordnungdesEBA-VerfahrensindaskonventionelleAufarbeitungsschema
DasPrinzipderFlieÿbettchromatographieberuhtaufderVergröÿerungdes
Lücken-gradsinder Adsorberschüttung,wodurchdieBeladungmitfeststobelasteten
Lö-sungen ermöglicht wird, ohne daÿ die Matrix verblockt. Während der Passage
wird das Zielmoleküladsorptiv aus der Suspension anden funktionellenGruppen
des Gels zurückgehalten und in einem anschlieÿenden Elutionsschritt analog zur
Festbettchromatographiewieder abgelöst.
1.3.1.1 Historische Entwicklung der Flieÿbettchromatographie
DieEntwicklung zurheutigen Flieÿbettchromatographie(Expanded Bed
Adsorpti-on,EBA)begannindenfünfzigerJahrenmiteinfachendiskontinuierlichen
Verfah-ren,indeneneinAdsorbermaterialdirektineinabgeschlossenes, gerührtesSystem
gegeben wurde,unddieProduktbindungsatzweiseunter vollständiger
Rückvermi-schung erfolgte. Solche Methoden boten sich an, wenn die Zielsubstanz aus einer
groÿvolumigen,partikelhaltigenVorlageisoliert werden muÿte, und die
notwendi-gen Klärungs- und Applikationsprozesse für die Festbettchromatographie zu
auf-wendig undverlustträchtigerschienen. Aufdiese Weise wurdebeispielsweise lange
Zeit unter EinsatzvonDEAE Sephadex der BlutgerinnungsfaktorIX kommerziell
aus Plasma gewonnen [Brummelhuis,1980].Weitereindustrielle Anwendungen
be-standenimBereichderAntibiotikaherstellungwiederIsolierungvonStreptomycin,
Novobiocinoder der AufreinigungvonImmunomycin aus ungeklärten
Streptomy-ces Kulturen [Barthelset al.,1958;Belteret al.,1973; Gailliotet al.,1990].
AuchwenneinigederVerfahrensemi-kontinuierlichverliefen,hattensiekaum
urbulenz-ringer E zienz und Produktivität führte [Somers,1989].
EswurdenzahlreicheVersucheunternommen,dieDispersiondesAdsorberszu
ver-ringern, um eine ähnliche Separationscharakteristik wie in der F
estbettchromato-graphiezu erreichen. Abbildung1.2gibteinigeder Ansätzewieder,dieausgehend
von der Festbettchromatographie zur Entwicklung der heutigen
Flieÿbettadsorp-tion im expandierten Gelbett führten.
Abbildung1.2: EntwicklungsansätzezurRealisierungderFlieÿbettchromatographie
Buijs und Wesselingh beschrieben eine Reduzierung des Problems durch das
Einbringen mehrerer horizontaler, perforierter Trennböden, die den Freiheitsgrad
der Gelpartikellimitierten[Buijs,Wesselingh,1980].Das Prinzipdieser
Flieÿbett-kolonnewurdespäternochvonAgostoet al.zur Aufarbeitungvon
Aminosäu-ren aus biomassehaltigen Suspensionen aufgegrien [Agosto et al., 1993], jedoch
lieÿsich eine optimaleTrennung nurübereine entsprechend groÿeAnzahl solcher
Böden realisieren, was miteinem hohenapparativen Aufwand verbunden war.
Ein weiterer Ansatz bestand in dem Versuch, das Flieÿbett magnetisch zu
sta-bilisieren [Burns, Graves, 1985]. Dabei wurde der uidisierte Zustand der Matrix
unter Einsatz ferromagnetischer Partikel über ein angelegtes Magnetfeld xiert
Expan-desFlüssigkeitsstromsist,erönetedieseMethodeeinweitesSpektrumvon
Durch-satzratenbeikonstanterBetthöhe[Nixonetal.,1991].DerNachteildieserTechnik
war allerdings neben der Wärmeentwicklung beimAufbau des magnetischen F
el-des wieder ein sehr hoher apparativer Aufwand, der das Verfahren insbesondere
unter dem Aspektder Maÿstabvergröÿerung unrentabelmachte.
ErstzuBeginndesletztenJahrzehntsgelangesDraegerundChase,einstabiles
expandiertes Gelbett auf der Basis von konventionellen Agarosemedien zu
reali-sieren [Draeger, Chase, 1990]. Durch die Entwicklung einer speziellen
Verteiler-konstruktionfürden FlüssigkeitseinlaÿkonnteinderSäuleeine Pfropfenströmung
aufgebaut werden, die ohne weitere Maÿnahmen eine ähnliche
chromatographi-sche Charakteristik wie im gepackten Gel ermöglichte. Zahlreiche Anwendungen
bewiesen das Potentialdieser Technik fürdiedirekte Aufarbeitung von Proteinen
aus partikelhaltigen Suspensionen [Draeger, Chase, 1991; Chase, Draeger, 1992;
1992a]. Jedocherwiesen sichdieherkömmlichen Adsorbermaterialiensowie später
entwickelteModi kationenaufSilicabasis[Dasarietal.,1993]fürdieVerwendung
im Flieÿbett als ungeeignet, da ihre geringe Dichte bzw. Partikelgröÿe nur sehr
niedrigeAnströmgeschwindigkeiten erlaubte.
EinüberzeugenderDurchbruchder Flieÿbett-Technologiegelangerstmitder
Wei-terentwicklungderBasalmatrices,dieweitgehenddurchdiephysikalischenund
hy-drodynamischen Untersuchungen von Draeger und Chase forciert wurde. Die
spezi sche Beschwerung der Agarosepartikel ermöglichte höhere
Flieÿgeschwin-digkeiten und verbesserte die Prozeÿleistung. Gleichzeitig führte ein de nierter
Gröÿen- und Dichtegradient bei gegebener Anströmung zu einer geordneten
Ma-trixverteilungineinemklassierendenFlieÿbettsmitreduzierter
Partikelbeweglich-keitundminimalerRückvermischung. AufdiesemPrinzipbasierendsetztesichein
neues Adsorbermaterial durch, das unter dem Namen Streamline TM
(Amersham
Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) kommerziellerhältlichist und mit einer
weit gefächertenAuswahl von Ligandenangeboten wird [Gilchrist et al.,1994].
Der Einsatz der Streamline TM
Matrices und der dazugehörigen, speziell auf den
Flieÿbettmodus abgestimmten Säulen und Chromatographiesysteme bietet
heu-te eine wertvolle Alternative zum klassischen mehrstu gen Aufarbeitungsschema.
AufgrundihrerBedeutung fürdievorliegende Arbeitwerden inden folgenden
Ab-schnitten die allgemeine Prozeÿführung, die verfügbaren Ligandenausstattungen
sowie diephysikalischen Grundlagen der Fluidisierungdetaillierterläutert.
1.3.1.2 Prozeÿschritte der Flieÿbettchromatographie
Chro-abschlieÿendenRegenerationderMatrixfüreinenneuenAufarbeitungslauf
zusam-mensetzen.Abbildung1.3veranschaulichtdieVorgehensweisebeiderVerwendung
des Streamline TM
Systems der FirmaAmersham Pharmacia Biotech.
Abbildung1.3: EBA-Prozeÿschrittemit demStreamline TM
System
WährendderEquilibrierung werdendieGelpartikelmitdermobilenPhase
uidi-siertund dieZwischenräumeinnerhalb derSchüttungvergröÿert. DieAnströmung
verläuft über eine Verteilerplatte mit kreisförmig angeordneten Bohrungen, die
dem Aufbau einer Pfropfenströmung dienen. Ein au iegendes feinporiges
Draht-netz unterstützt den gleichmäÿigen Flüssigkeitseintrag. Durch den Gröÿen- und
Dichtegradienten der Partikel baut sich ein klassierendes Flieÿbett auf, in dem
sich die gröÿeren, schwereren Kügelchen im unteren und die kleineren, leichteren
imoberenBereichderSäuleanordnen.AufdieseWeiseentstehteinestabile
Expan-sion, die sich durch geringe Rückvermischungen und Verwirbelungenauszeichnet.
Die Flieÿgeschwindigkeit wird in einem durch Anströmungsexperimente
DieanschlieÿendeBeladung mitderProbeerfolgtebenfallsimexpandierten
Mo-dus. Durch dieAufschwemmung wird derAuftragpartikelhaltigerLösungen
mög-lich, ohne daÿ das Chromatographiematerialverblockt. Somit können ungeklärte
Kultursuspensionen direkt verarbeitet werden. Während die Zellen und andere
Feststoe dieSäule ungehindertpassieren, wird das Zielprodukt amAdsorber
zu-rückgehalten. Gleichzeitiglassen sich vorhandene Fremdproteine sowie DNA und
sonstige Kontaminationen, die nicht mit den Liganden interagieren, abreichern.
Die Güte der Produktisolation hängt dabei wesentlich von der Selektivität der
eingesetzten Matrixund der Einstellung der Bindungsbedingungen ab.
Da der Wechsel vomEquilibrierungspuer auf dieKultursuspension meistmit
ei-ner VeränderungderViskositätund DichtederFlüssigphaseverbundenist,treten
häu gleichteUnterschiedeinderExpansionshöheauf.UmKomplikationenzu
ver-hindern, wird der hydraulisch bewegliche Säulenadapter deshalb vor Beginn eines
Aufarbeitungslaufsaufeine Höhe von2bis5 cmoberhalbder uidisierten Matrix
arretiertoder dieFlieÿgeschwindigkeitin Anpassung aneinen konstanten
Expan-sionsgrad variiert.
ImAnschluÿandieBeladungerfolgteinWaschschritt mitEquilibrierungspuer,
in dem ungebundene Substanzensowie die restliche Biomasse ausgespült werden.
Der Wechsel ndet auch hier zunächst ohne eine Unterbrechung der aufwärts
ge-richteten Anströmung statt. Nach Beendigung der Austragung schaltet man den
Fluÿ jedoch ab und läÿt die Matrix sedimentieren. Zur Vorbereitung des letzten
Chromatographieschritts wird der obere Säulenadapter anschlieÿend bis auf die
Ober äche des Gels abgesenkt, so daÿ man eine mit den klassischen F
estbettsäu-len vergleichbare Adsorberpackung erhält.
Für die Elution des gebundenen Produkts können sämtliche Betriebsparameter
aus der Festbettchromatographie übernommenwerden. Sieerfolgtimallgemeinen
bei niedrigerer Strömungsgeschwindigkeit und in umgekehrter Fluÿrichtung. Auf
dieseWeiseläÿtsichdasElutionsvolumenminimierenunddasZielmoleküloptimal
ankonzentrieren.
Nach jedem Aufarbeitungslauf sollte vor der Wiederverwendung eine gründliche
Regeneration der Matrix erfolgen. Da das Adsorbermaterial in der
Flieÿbett-chromatographie mitder rohen Kultursuspension inKontakt kommt, unterliegen
dieRegenerationsprotokolle(Cleaning-In-Place,CIP)höherenAnforderungen als
in den meisten Festbettverfahren. Die Regeneration muÿ die vollständige
Besei-tigung von zellulären Rückständen und Kontaminationen mit Zellinhaltsstoen
wie Nukleinsäuren und Lipiden gewährleisten. Je nach Stabilität und
Bindungs-eigenschaften der Ligandensind dazu unterschiedliche angepaÿteCIP-Prozeduren
Seit 1993 bietet die Firma Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Schweden)
unter dem Produktnamen Streamline TM
diverse Matrices an, die speziell für den
Einsatz in der Flieÿbettchromatographie modi ziert wurden. Das Basalmaterial
besteht aus einem stark quervernetzten 4 oder 6 %igen Agarosederivat, das sich
durch eine hohe physikochemische Stabilität und niedrige unspezi sche
Adsorp-tionseigenschaften auszeichnet. Im Unterschied zu den gängigen Festbettmedien
weisen diekugelförmigenGelpartikel der EBA-Matrices einen gröÿeren und
hete-rogeneren Durchmesser auf. Zusätzlich sind sie durch inerte Kerne beschwert, so
daÿ auchbei höheren Flieÿgeschwindigkeiten eine stabileExpansiongewährleistet
werden kann. DieStreamline TM
Matrices werdenmitunterschiedlichen
Liganden-ausstattungen angeboten.Abbildung1.4gibteinenÜberblick überdiewichtigsten
Vertreter.
Aufgrund der Bedeutung für die vorliegende Arbeit werden im folgenden zwei
der dargestellten Matrixtypen und ihre Bindungsprinzipien nähervorgestellt.
Da-bei handeltessichum den Kationenaustauscher SP_XL und dieA nitätsmatrix
rProtein A.
Streamline TM
SP_XL[Thömmeset al.,2001;Trinhet al.,2000]gehörtwie SP,
DEAE und Q_XL zu der Gruppe der Ionenaustauscher. Bei den XL-Varianten
(extreme load) handelt es sich um hochkapazitäre Matrices, bei denen die
Ligan-denüberlangeDextrankettenandemBasalmaterialaus6%igerAgaroseverankert
sind,wasdas Interaktionsvolumenunddiesterische Zugänglichkeitgegenüberden
anderen Vertretern erhöht. Streamline TM
SP_XL ist einstarker
Kationenaustau-scher,der mitSulphopropyl-Gruppensubstituiertist.DieGelpartikelweiseneinen
Durchmesser von100 bis300 m auf und sind durch dieEinlagerung von
Quarz-kernen aufeine mittlereDichtevon1,2 g/mlspezi sch beschwert.
DieIonenaustauschchromatographieIEXisteineweitverbreiteteMethodezur
Auf-reinigung von Proteinen aus komplexen Lösungen. Die Bindung ist unspezi sch
und beruht aufden elektrostatischen Wechselwirkungenzwischen der Matrix und
den aufzureinigenden Molekülen. Die funktionellen Gruppen der
Anionenaustau-scher sind positivunddieder Kationenaustauscher negativgeladen. DieWahlder
Matrixrichtet sich nach dem isoelektrischen Punkt pI des Zielproteins, das durch
Erhöhung oder Erniedrigung des pH-Werts eine negative bzw. positive
Nettola-dung erhält und an einem entsprechend entgegengesetzt geladenen Austauscher
gebunden werdenkann.Der Zusammenhang zwischen dem amphoterenVerhalten
von Proteinen und den daraus resultierenden Aufarbeitungsbedingungen für das
tralisiert.WährendderanschlieÿendenBeladungkonkurrierendiegleichgeladenen
Probenmoleküle mit den sogenannten Counterionen um einen Platz auf der
sta-tionären Phase und werden gegen sie ausgetauscht. Zur Elution trägt man einen
Puer mit verändertem pH-Wert oder erhöhter Ionenstärke auf, wodurch die
la-dungsbedingtenBindungenaufgehobenbzw.dieSubstanzenvondenfunktionellen
Gruppen verdrängt werden.
DieWahldesAustauschersundderChromatographiebedingungenistauch
abhän-gigvonden Begleitproteineninder Lösung.JenachihrempI bestehtdie
Möglich-keit der Kochromatographie, die aufgrund der resultierenden Kapazitätsverluste
und Produktkontaminationen vermieden werden sollte. Eine Stufen- oder
Gradi-entenelution kann ineinigen Fällenden Reinheitsgrads der Zielmoleküleerhöhen.
Ionenaustauscher haben den Vorteil einer hohen chemischen Stabilität und sind
zudem relativ preisgünstig. Sie sind in einem weiten pH-Bereich einsetzbar und
durch die Behandlung mit 1 M Natronlauge regenerierbar. Die geringe
Emp nd-lichkeitder Liganden erlaubtzudem das Autoklavieren der Matrices.
DauntergeeignetenBedingungennahezujedesBiomolekülgebundenwerdenkann,
gehören siezu den amhäu gsten eingesetztenGelen in der F
estbettchromatogra-phie und nden sich in nahezu jedem Aufreinigungsschema wieder. Die
unter-schiedliche Ladungscharakteristikder Zielmoleküleund dieBindungseinbuÿenbei
hohen Salzkonzentrationen erfordern jedoch häu g sehr unphysiologische
Aufar-beitungsbedingungen, die die Verwendung in zellintegrativen Verfahren wie der
Flieÿbettadsorptionerschweren. Zudembesteht dieGefahr, daÿ durch das
unspe-zi sche, ladungsabhängige Bindungsverhalten auch Biomasse/Matrix
Interaktio-nen auftreten, diefür manche Anwendungen zu kaum lösbarenProblemen führen
[Ameskampet al.,1999, Feuser etal. 1999].
Streamline TM
rProtein Aisteine ieÿbettchromatographischeA nitätsmatrix
für die Aufreinigung von mono- und polyklonalen Antikörpern [Ameskamp et al.,
1997;Fahrneretal.,1999].DieMatrixpartikelbestehenausquervernetzter4%iger
AgaroseundenthaltenzurErhöhung ihresspezi schenGewichtseingestreute
Ker-ne aus einer inerten Metallegierung. Die Partikel haben eine mittlere Dichte von
1,3g/ml und einenDurchmesser zwischen 80und 165 m.
Allgemein läÿt sich mit der A nitätschromatographie eine Vielzahl
unterschied-licher Proteine unter Ausnutzung ihrer biologischen Funktion oder chemischen
Struktur aufreinigen [Labrou & Clonis, 1994]. Sie ist die Trennmethode mit der
gröÿtenSpezi tät.DasaufzureinigendeMolekülwirdaus derLösungreversibelan
Reaktionspartner analogen Struktur oder durch eine pH-Änderung eluiert
wer-den. Man unterscheidet zwischen mono- und gruppenspezi schen Liganden, die
entweder eine bestimmteSubstanz selektivoder eineganze Molekülklasse binden.
Eine gruppenspezi sche A nität liegtz.B. beidemEinsatz vonLektinen vor,die
mitsämtlichenProteineneinesbestimmtenGlykosilierungsmusterswechselwirken.
Bei der monospezi schen Bindungmacht man sichhingegen diehohe Selektivität
vonHormon/Rezeptor-,Enzym/Substrat-oderAntigen/Antikörper-Interaktionen
zunutze. Da die Wechselwirkungen hierbei im wesentlichen von der strukturellen
Paÿform der beiden Bindungspartner abhängig sind, und diese für jedes Protein
individuell ist, erreicht man bei der Trennung eine sehr hohe Selektivität. Aus
diesem Grund lassen sich mit dieser Methode Biomoleküle auch aus komplexen
Lösungen mit zahlreichen Begleitproteinene zient isolieren.
Abbildung1.6:StruktureinesKomplexesausderF
c
-EinheiteinesAntikörpersunddemF
rag-mentBdesProteins AnachDeisenhofer
Beidem Ligandender Streamline TM
Matrixhandeltessichumeinrekombinantes
Protein A, das wie seine native Variante eine hohe A nität zur F
c
-Region von
Immunglobulinen vom Typ IgG aufweist [Fuglistaller, 1989; MacKenzie et al.,
1978]. Abbildung 1.6 gibt die auf Basis von kristallographischen Untersuchungen
ermittelteStruktureinesKomplexesaus derF
c
-EinheiteinesAntikörpersunddem
wird. In der Natur bewirkt es die Bedeckung des Bakteriums mit wirtseigenen
Antikörpern, deren Antigenbindungsstellen F
ab
dann nach auÿen weisen und den
Prokaryonten gegenüber immunologischenAbwehrreaktionen maskieren.
In der Chromatographie wird die hohe Bindungsspezi tät und -selektivität des
Proteins zur Aufreinigung von Antikörpern aus Kultursuspensionen genutzt. Der
rekombinante Ligand des Streamline TM
Gels wird in Escherichia coli hergestellt
und vor der Kupplung an dieAgarose über mehrere Chromatographieschritte
ge-reinigt. Erunterscheidetsichvomnativen in erster Liniedurch dieDeletion einer
Albumin-Bindungsstelle und einen zusätzlichen Cysteinrest am C-Terminus, der
eine bevorzugte Orientierung bei der Verknüpfung des Moleküls an die
Basalma-trix ermöglicht. Auf diese Weise verbessert man die sterischen Bedingungen, die
die Interaktionen zwischen dem Protein A und den F
c
-Regionen der
aufzureini-genden Antikörper und somitdie Bindungskapazitätdes Materials starkerhöhen.
Die Nachteile der rProtein A Matrix sind die hohen Anschaungskosten und die
chemische und physikalische Instabilitätder Liganden, diedieLagerung und
Rei-nigungderGeleerschwert.Schonnachverhältnismäÿigwenigen
Chromatographie-zyklen kann es zu Ausblutungseekten oder Verminderung der Bindungsaktivität
kommen,wodurchdieStandzeitenimVergleichzuanderenMatricesstarkverkürzt
werden.
1.3.1.4 Physikalische Grundlagen der Fluidisierung
Um in der Flieÿbettchromatographie ähnliche Ergebnisse bzgl. Kapazität und
Trennleistung wie mitklassischen Festbettsäulen erzielen zu können,darfdie
auf-geschwemmteMatrix möglichstwenig Verwirbelungenhaben. Eine stabile
Fluidi-sierungwird dannerreicht,wenn sichsämtliche aufeineinzelnes Adsorberpartikel
wirkenden Kräfte aufheben und eine Art schwebender Gleichgewichtszustand
be-steht. Durch die Gröÿen- und Dichteunterschiede der speziell für den Einsatz in
der Flieÿbettchromatographie konzipierten Matrices ordnen sich die Gelpartikel
auf verschiedener Säulenhöhe an und bilden im Idealfall ein streng klassierendes
Adsorberbett mit geringen Rückvermischungseekten aus.
Im folgendenwerden diegrundlegenden physikalisch-mathematischen
Zusammen-hängedes Expansionsverhaltens einerangeströmtenMatrixschüttungnäher
erläu-tert [De Luca L. et al., 1994]. Eine genaue Charakterisierung durch analytische
Ansätze ist bis heute jedoch nur unvollständig gelöst [di Felice, 1995]. Aufgrund
Lösungs-Fluidisierungsverhalten einer umströmten Kugel
Betrachtet man ein einzelnes uidisiertes Gelpartikel, so muÿ die Wirkung von
drei unterschiedlichen Kräften berücksichtigt werden: Die Gewichtskraft F
G und
die Auftriebskraft F
A
nach Archimedes sowie die Widerstandskraft F
W nach
Newton.Für kugelförmige Partikel imSchwerefeld sind siegegeben durch:
F G = m p g = p d 3 p 6 g (1.1) F A = V p l g = l d 3 p 6 g (1.2) F W = c W A p l 2 U 2 = c W d 2 p 4 p U 2 2 (1.3) mit: m p Partikelmasse [kg] g Fallbeschleunigung, g=9,81 ms 2 [ms 2 ] d p Partikeldurchmesser [m] V p Partikelvolumen [m 3 ] A p Partikelquerschnitt [m 2 ] p
Dichte desPartikels [kgm 3
]
l
Dichte derFlüssigkeit [kgm 3 ] U Relativgeschwindigkeit [ms 1 ] c W Widerstandsbeiwert [-]
Die nach unten gerichtete Gewichtskraft F
G
eines Teilchens berechnet sich aus
seinerMasse m
p
undder Fallbeschleunigungg.Dieihrentgegengesetzte
Auftriebs-kraft F
A
ist gleich der Gewichtskraft der verdrängten Flüssigkeit. Die ebenfalls
nach oben gerichtete Widerstandskraft F
W
entsteht durch den Reibungs- und
Druckwiderstand des sich relativ zur umgebenden Flüssigkeit bewegenden
Par-tikels. Sie setzt sich aus dem Widerstandsbeiwert c
W
, der Querschnitts äche des
Teilchens A
p
und dem dynamischen Druck der Anströmung zusammen. Der
di-mensionslose Widerstandsbeiwert c
W
ist von der Form und
Ober ächenbeschaf-fenheitdes Teilchensund vonder jeweiligenStrömungsartabhängig, diedurchdie
Reynoldszahl Re charakterisiert wird. Tabelle 1.1 gibt den empirisch ermittelten
Zusammenhang zwischen dem Widerstandsbeiwert c
W
und der Reynoldszahl Re
Tabelle 1.1: Empirisch ermittelter Zusammenhang zwischen der Reynoldszahl Re und dem
Widerstandbeiwertc
W
fürdieUmströmungvonKugelnin verschiedenenStrömungsbereichen
StokesBereich Übergangsbereich Newton Bereich
Strömungsart laminar intermediär turbulent
Re 0 0,5 0,5 500 300 150.000 c W 24/Re 18,5/Re 0;6 0,44
In derPraxiswird dieWiderstandskraft F
W
aus Gleichung1.3überdieinTabelle
1.1dargestelltemathematischeAbhängigkeitdesWiderstandsbeiwertsc
W
vonder
Reynoldszahl Re berechnet. Dabei läÿt sich die Reynoldszahl Re durch folgende
Beziehung ersetzen: R e = d p l U l = d p U l (1.4) mit: l
dynamische Viskosität derFlüssigkeit [kgm 1 s 2 ] l
kinematische Viskosität derFlüssigkeit [m 2
s 1
]
Durch Umformung von Gleichung 1.3 erhält man für die Widerstandskraft F
W
einerKugelimlaminarenStrömungspro l(Stokes'scherBereich)eine
Abhängig-keitnach dem Stokes'schen Gesetz:
F W = 3 l d p U für Re <0,5 (1.5)
Reduziert man die Matrixexpansion in der Flieÿbettchromatographie auf die
Be-trachtungeineseinzelnenkugelförmigenGelpartikels,sobestehtfürjede
Anström-geschwindigkeit oberhalb eines bestimmten Grenzwerts u
min
ein
Gleichgewichts-zustand, in dem die Summe aus der Widerstands- und der Auftriebskraft gleich
der Gewichtskraft ist,und das Teilchen stabil inder Schwebe gehalten wird:
F G = F W + F A (1.6)
DieserGleichgewichtszustand wirddurchden Druckabfallinnerhalb der Säule
be-stimmt.Die nach oben gerichteten Kräfte nehmen aufgrunddes Druckabfalls mit
zunehmender Höhe ab und treiben das Partikelnursolange aufwärts, bisdie
Teilchen und dem umströmenden Fluid maximal. Sie entspricht unter diesen
Be-dingungen der terminalen Fallgeschwindigkeit u
t
des Partikels, die die maximale
Anströmgeschwindigkeit u
max
bestimmt. Unter der Annahme, daÿ es sich um ein
sphärisches Partikelhandelt, und einlaminaresStrömungspro l vorliegt,läÿtsich
die terminale Fallgeschwindigkeit u
t
durch Einsetzen der Beziehungen aus
Glei-chungen1.1, 1.2 und 1.5in Gleichung 1.6wie folgt berechnen:
u t = u max = d 2 p g 18 l ( p l ) (1.7)
Bei einer Anströmgeschwindigkeit oberhalb von u
t
bzw. u
max
kann der
Gleichge-wichtszustand bei gegebener Säulenhöhe nicht mehr erreicht werden, so daÿ das
Partikelausgespültwird.SomitwirdderDurchsatz beider Beladungdes
Chroma-tographiematerials durch die terminale Fallgeschwindigkeit der Gelpartikel
limi-tiert.Die E zienz einesFlieÿbettprozesseshängtfolglichneben der
Bindungscha-rakteristik und Kapazität im wesentlichen von den physikalischen Eigenschaften
der Basalmatrix ab, die eine Gleichgewichtseinstellung innerhalb der Säule bei
möglichst hoher Flieÿgeschwindigkeit gewährleisten müssen. Dies erreicht man in
erster Linie durch eine Erhöhung der Gewichtskraft, die in der Praxis über
ei-ne Erhöhung der spezi schen Dichte durch eingelagerte Quarz- oder Metallkerne
realisiertwird.
Fluidisierungsverhalten eines Gelbetts
Da die Partikel in einem uidisierten Gel aufgrund der Interaktionen durch
Ad-häsionskräfte nicht unabhängig voneinander betrachtet werden können, ist die
mathematisch-physikalische Charakterisierung in der Realität wesentlich
komple-xer.EsexistierteineVielzahlvonTheorienundGleichungen,diedieFluidisierung
verschiedener Schüttungssysteme beschreiben [di Felice, 1995]. Eine einfache
em-pirische Korrelationist von Richardson und Zaki festgestellt worden [Richardson
J.F.&ZakiW.N.,1954].SiestelltdieBeziehung zwischen derFlieÿgeschwindigkeit
u und dem Lückengrad der expandierten Schüttung als Funktion der
termina-len Fallgeschwindigkeit u
t
eines einzelnen Partikels und dem systemspezi schen
sogenannten Expansionsindex oder Richardson-Zaki-Koe zienten ndar:
u = u
t
n
(1.8)
ObwohlderZusammenhangausdemFluidisierungsverhaltenmonodisperser,
sphä-rischer Materialienabgeleitetwurde, kann erinhinreichendgenauerNäherungfür
Flieÿbettsy-Beziehung, über die sich anhand von Fluidisierungsversuchen die terminale F
all-geschwindigkeitu
t
und der Richardson-Zaki-Koe zientn experimentellermitteln
lassen.
lnU = nln + lnU
t
(1.9)
Dazu miÿt man zunächst die Bettexpansion in Abhängigkeit von der
Anström-geschwindigkeit u und bestimmt dann nach Gleichung 1.10 den dazugehörigen
Lückengrad aus der Höhe des uidisierten Gelbetts H sowie der Höhe H
0 und
des Lückengrads
0
der sedimentiertenMatrix.Letzterer beträgtfür gleichförmige
Kugeln bei maximaler Packungsdichte etwa einen Wert von 0,4, der auch für das
Adsorbermaterial mitausreichender Genauigkeitangenommenwerden kann.
= 1 (1 0 ) H 0 H (1.10)
DurchdiedoppeltlogarithmischeDarstellungderFlieÿgeschwindigkeitugegenden
Lückengrad nachGleichung 1.9lassen sichdieRichardson-Zaki-Parameterdann
aus der resultierenden Regressionsgeraden bestimmen. Dabei entspricht die
Stei-gungdemExpansionskoe zienten n,währenddieterminaleFallgeschwindigkeitu
t
nach Extrapolation aus dem Ordinatenabschnitt berechnet wird.
Eine mathematische Abschätzung des Expansionskoe zienten n, der durch die
Partikelform, die Reynoldszahl und durch Wandeekte beein uÿt wird, ist nach
Richardson und Meikle fürsphärische Partikeldurch Gleichung 1.11 gegeben
[Richardson &Meikle, 1961].
n = 4;65 + 19;5d p d c (1.11)
DieFluidisierungscharakteristikwirdnachdi FelicejedochnurdannvonW
and-eekten beein uÿt, wenn der Partikeldurchmesser d
p
und der Säulendurchmesser
d
c
eine ähnliche Gröÿenordnung aufweisen, was für die Flieÿbettchromatographie
nicht zutrit.
Aus detaillierteren mathematischen Beschreibungen nach Martin et al. können
dieRichardson-Zaki-Parameterauch über diedimensionsloseGallileozahlGa(Gl.
1.12) und die terminale Reynoldszahl Re
t
(Gl. 1.13) berechnet werden [Martin
B.L.A.et al.,1981]. Ga = p g( p g )d 3 p 2 l (1.12) R e t = 23 Ga + 0;6 Ga 0;5 1 1 1 + 2;35 d p d (1.13)
DieKalkulationderterminalenFallgeschwindigkeitu
t
erfolgtdannnachUmstellen
der Gleichung 1.4 und Einsetzen der terminalen Reynoldszahl Re
t
aus Gleichung
1.14, währendder Expansionsindex nüberdieinGleichung 1.15dargestellte
Kor-relationzur GallileozahlGa ermitteltwird.
U t = U max = R e t l l d p (1.14) 5;1 n n 2;4 = 0;016Ga 0;67 (1.15)
Zur Verbesserung der Au ösung und Kapazität wird inder Chromatographie die
Realisierung einerPfropfenströmung mitminimalerRückvermischung angestrebt.
In der Flieÿbettadsorption versucht man, dies durch den Aufbau einer
klassie-renden Expansion zu erreichen. Dazu werden die Matrices aus Partikeln mit
de- nierten Gröÿen- und Dichtegradienten eingesetzt. Durch die unterschiedlichen
terminalen Fallgeschwindigkeiten der Teilchen werden sie auf verschiedener
Säu-lenhöhe imKräftegleichgewichtgehalten und nehmen imIdealfall stabile,nahezu
stationäre Positionen ein.Die entstehende Klassierung verringert dieBildung von
Rückvermischungseekten im Vergleich zu einer uidisierten homogenen Matrix
stark, so daÿ sich der Zustand einer Pfropfenströmung besser realisieren läÿt.
Bei der Kalkulation der hydrodynamischen Verhältnisse müssen die heterogenen
Partikeleigenschaften der EBA-Medien strenggenommen durch dementsprechend
modi zierteGleichungenberücksichtigtwerden[Al-DibouniM.R.etal.,1979].Zur
Abschätzung der Richardson-Zaki Parameter reichtesin hinreichendgenauer
Nä-herungjedochaus, diemittlerePartikelgröÿeund-dichteindieaufgeführten
Glei-chungeneinzusetzen.
1.3.2 Peptidchemie
Peptide sind durch ihre vielfältigen Strukturen und Funktionen in der Biochemie
von groÿer Bedeutung. In Organismen sind sie als Hormone, Neurotransmitter
sowie Immuno- und Neuromodulatoren an einer groÿen Anzahl von
Regulations-mechanismen beteiligt. Dazugehören beispielsweise diePankreashormone Insulin
[Marglin&Merrifield, 1966]undGlucagon, dieauf den BlutzuckerspiegelEin uÿ
nehmen, aber auch diemit 8bzw. 13Aminosäuren wesentlich kleinerenHormone
AngiotensinII undNeurotensin,die eineblutdrucksteigerndebzw.-senkende
ben zahlreichen Peptidalkaloidenund-insektiziden diePeptidtoxine,dieaus Pilz-,
Schlangen-oder Insektengiften isoliertwerden konnten.
Vongroÿer medizinischer Bedeutung sind die natürlichen und synthetischen
Pep-tidantibiotika,dieaufunterschiedliche Weise das Wachstum oder dieVermehrung
vonMikroorganismenhemmen.SiestelleneineäuÿerstheterogeneStoklassedar,
zu der beispielsweise die Cephalosporine, die Actinomycine oder die zu den
Iono-phoren zählenden Gramicidine A-C und das Valinomycin gehören. Auch für die
1928 von Fleming entdeckten Penicilline besteht aufgrund der biosynthetischen
Bildung aus Aminosäureneine formale Beziehung zu den Peptidantibiotika.
Die industrielle Nutzung biologisch aktiver Peptide gewann in den letzten
Jahr-zehnten durch dieVerbesserung der Strukturaufklärung und anderer analytischer
Methoden immergröÿereBedeutung. Einbesonderer Schwerpunkt liegtdabeiauf
der Entwicklung pharmazeutisch nutzbarer Substanzen, wie Enzyminhibitoren,
Impfstoen, Immunsuppressiva oder neuartiger Antibiotika.In der
Lebensmittel-industrie ndenGeschmacks-oderZuckeraustauschstoe wiedasAspartambereits
heute eine weitverbreitete Anwendung.
Ein neues Einsatzgebiet der Peptide bietet die in den vergangenen Jahren stark
forcierte Biotechnologie.Die Vielfaltder inder Natur vorkommendenspezi schen
Wechselwirkungen zu anderen Biomolekülenmacht sie zu idealen potentiellen
Li-ganden für die Verwendung in der Chromatographie. Aktuelle F
orschungsergeb-nisse zeigen bereits heute, daÿ sie die klassischen Proteinliganden aus der
A ni-tätschromatographie eektiv ersetzen können. Bisher lag der Schwerpunkt dabei
in erster Linie auf der Modi kation bestehender Liganden, mit dem Ziel, sie
sta-biler zu machen und eine ökonomisch preiswertere Herstellung zu realisieren. Als
Beispiel sind die sogenannten A bodies zu nennen, beidenen es sich um auf den
funktionellen Bereich reduzierte Protein A Moleküle handelt[Nord etal.,2000].
FürdiemedizinischeundbiotechnischeNutzungvonPeptidenistnebender
Struk-tur diedetaillierte Kenntnis der biologischen Funktionund Wirksamkeit
erforder-lich.DurchModi kationundAustauschoder DeletionvonAminosäurebausteinen
lassensichdieWirkstoegezieltfürihreAnwendung optimieren.Derartige
Unter-suchungen können jedoch nur durchgeführt werden, wenn das betreende Peptid
in ausreichender Menge zur Verfügung steht. Da sich das natürliche Vorkommen
häu g nur im Nanogrammbereich bewegt, muÿ auf andere Quellen
zurückgegrif-fen werden. Eine echte Alternative bietet neben der gentechnischen Herstellung
Heute ermöglichtdieautomatisierteFestphasen-Sytheseeine verhältnismäÿig
ein-fache und schnelle Produktion unzähliger Peptidstrukturen. Von besonderer
Be-deutung sind diedarausentwickelten Verfahren der multiplenSynthese, beider es
sichumdiegleichzeitigeSynthese einerVielzahlvonPeptidsequenzen
unterschied-licher Länge und beliebiger Aminosäurezusammensetzung handelt. Durch die
lo-kale Trennung auf einem festen Träger lassen sich vielfältige Peptidbibliotheken
erstellen, diedanninScreening-Tests fürdieEntwicklungpharmazeutisch
nutzba-rer Substanzen oder zur gezielten Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen
Biomoleküleneingesetzt werden können. Peptidbibliotheken dieser Artsind somit
auch für Bindungsstudienzur Selektionund Optimierung vonpotentiellen
A ni-tätsliganden für die chromatographische Aufarbeitung biotechnisch hergestellter
Produkte geeignet.
1.3.2.1 Struktureller Aufbau von Peptiden
Peptide undProteinesind Oligo-und Polymereder Aminosäuren,dieüber
Amid-bindungen (Peptidbindungen) miteinander verknüpft sind. Abbildung 1.7
veran-schaulichtdieBildungeinesDipeptids,beiderdie -Carboxylgruppeeiner
Amino-säure unter Abspaltung eines Wassermoleküls mitder -Aminogruppeeiner
zwei-ten Aminosäure reagiert.
Abbildung 1.7: BildungeinesDipeptidsauszweiAminosäuren
Die Grenze zwischen diesemeinfachen Peptid und den Proteinen wird in neueren
Veröentlichungen mit 50 und in älteren mit 100 Aminosäurebausteinen
angege-ben. BeieinerKettenlängevonwenigerals10bis15Aminosäurensprichtmanvon
Oligopeptiden(griech. oligos = wenige). Das Molekulargewicht einer Aminosäure
beträgt etwa 110 Dalten(d), so daÿ Polypeptidketten miteiner Masse von bis zu
5500 d (11000 d) noch der Klasse der Peptide zugerechnet werden können, wobei
dieAbgrenzung zum Protein jedochnicht immer klarde niert ist.
DienatürlichvorkommendenVerbindungensetzensichinderRegelaus
zweiunterschiedlichefunktionelleGruppenaufweisen,istdiePrimärstruktureiner
Polypeptidkettedurcheinede nierteAusrichtung gekennzeichnet. V
ereinbarungs-gemäÿ betrachtet man das Aminoende (N-Terminus) als Beginn der Kette, was
auch für dieSchreibweise imEin-oder Drei-Buchstaben-Code gilt.
Der Abstand zwischen dem C-und demN-Atom einer Peptidbindung(0,132 nm)
istgegenübereinernormalen CN-Einfachbindung (0,149nm)verkürzt.Aufgrund
der Delokalisierung der -Elektronen des benachbarten Sauerstos weist sie
teil-weise die Charakteristik einer Doppelbindung (0,127 nm) auf, was die
Rotati-onsfreiheit stark einschränkt. Es existieren zwei Isomere, die cis- und die
trans-Peptidbindung, wobei letztere durch die energetisch günstigere Anordnung mit
einem Anteilvon etwa99,95 %starküberwiegt. Eine Ausnahme bildetdie
Imino-säure Prolin. Da die Energie der trans-Xaa-Pro-Bindung etwas erhöht ist, bildet
diecis-Orientierung hiereinen Anteil von 6,5%. Die enzymkatalysierte cis/tr
ans-Isomerisierung vonPeptidbindungen am N-Terminuseines Prolinbausteins istfür
diebiochemische FunktionvielerPeptideundProteinevongroÿerBedeutung.Des
weiteren verursacht das Ringsystem der Iminosäure einen Knick in der
anson-sten regelmäÿig strukturierten Peptidkette und verhindert die Ausbildung einer
-Helix.
Neben den dominierenden linearenVerbindungenkommen auch zyklische Peptide
vor, die formal durch die Knüpfung einer Peptidbindung zwischen dem N- und
dem C-Terminuseiner Kette entstehen. Manunterscheidet bei der
Charakterisie-rung von Peptiden und Proteinen zwischen der Primär-, der Sekundär- und der
Tertiärstruktur.
Die Primärstruktur gibt lediglich Auskunft über die Anzahl und Reihenfolge der
Einzelbausteine,diesichdurchAminosäureanalysennachTotalhydrolyseund
suk-zessive Sequenzanalysen imstufenweisen Edman-Abbau aufklären lassen.
Der partielle Doppelbindungscharakter der Peptidbindungen bedingt eine
pla-nare Anordnung des Moleküls. Durch die periodische Ausbildung von W
asser-stobrückenbindungen zwischen dem Sauersto- und dem Stickstoatom zweier
Peptidbindungen tritt jedoch häu g eine verhältnismäÿig stabile
dreidimensiona-le Konformation auf, die als Sekundärstruktur bezeichnet wird. Dabei handelt es
sichinersterLinieum dieFormierungeiner gleichmäÿigen -Helixoder F
altblatt-struktur. Jedoch zählen auch Elemente wie -Schleifen, die durch eine H-Brücke
zwischen den endständigen Peptidgruppen von vieraufeinanderfolgenden
Amino-säureresten stabilisiertwerden, und sonstige nach dem gleichen Prinzip gebildete
Die Tertiärstruktur bzw. endgültige Raumstruktur einer Peptidkette wird neben
den Wasserstobrücken zwischen den Atomen der Peptidbindungen noch durch
weitere Bindungen und Wechselwirkungen festgelegt. Diese beruhen auf den
In-teraktionen zwischen den Seitenketten der trifunktionellen Aminosäurebausteine.
Hierzu gehörendieDisul dbindungen,diedurchOxidationder SH-Gruppen
zwei-er Cysteinreste sowohl intra- als auch intermolekular auftreten können und sich
durch die Zugabe von Thiolreagenzien, wie Mercaptoethanol oder Dithioerythrit
(DTE) reduktiv spaltenlassen.
Neben den kovalenten Disul dbindungen sind jedochauch dieWasserstobrücken
zwischen geeigneten Drittfunktionen sowie die elektrostatischen
Wechselwirkun-gen zwischen sauren und basischen Aminosäureresten für die Konformation des
Moleküls von Bedeutung. Letztere basieren auf der vollständigen oder partiellen
Ionisierung der Carboxyl- und Aminogruppen am C- und N-Terminus sowie der
SeitenkettenfunktionenvonAspartat,Glutamat,Arginin, Lysinund Histidin.Die
elektrostatischenWechselwirkungenvongeladenen Funktionensindstarkvonden
äuÿeren Bedingungen wie dem pH-Wert, der Salzkonzentration und der
Dielektri-zitätskonstante des Mediums abhängig.
Eine eher untergeordnete Rolle spielen die Van-der-Waals-Bindungen, bei denen
essich um eineunspezi sche Anziehungskraft handelt, dieaufgrundeiner
zeitwei-sen Asymmetrie der Elektronenverteilung in einem Abstand von 0,3 bis 0,4 nm
zwischenzwei Atomen auftritt.Demgegenübergeht einweitererwichtiger Beitrag
zur Stabilisierung der Molekülkonformation von den hydrophoben Interaktionen
zwischen den aliphatischen und aromatischen Seitenketten der Aminosäuren aus.
Diese Form der Wechselwirkung tritt nur im wäÿrigen Milieu auf, da sie nicht
auf der A nität der unpolaren Gruppen zueinander sondern auf der energetisch
günstigeren Anordnung der umgebenden Wassermoleküle beruht. Diese sind
be-strebt, möglichst vieleWasserstobrückenbindungen einzugehen, diein der
stren-gen Anordnung um vereinzelte hydrophobe Bereiche starkdezimiert werden. Der
Freiheitsgrad (Entropie) der Wasserdipole nimmt bei Aggregation solcher
Regio-nen zu, so daÿ bei der Betrachtung eines Gesamtsystems die Zusammenlagerung
unpolarerFunktionenimmerfavorisiertwird.AusdiesemGrund ndetmaninder
globulären Konformation längererPolypeptidketten die Aminosäuren mit
alipha-tischen oder aromatischen Seitenketten meist assoziiert im Inneren des Moleküls
vor.
Das Zusammenwirken aller beschriebenen Bindungen und Wechselwirkungen
be-stimmtletztendlich die Konformationund somit auch die biochemische Funktion
