UNIVERSITÄTSKLINIKUM HAMBURG-EPPENDORF
Klinik für Stammzelltransplantation
Prof. Dr. med. Nicolaus Kröger
Etablierung eines Mausmodells der Chronisch Myeloischen Leukämie für die Untersuchung der kombinierten Therapie mit Tyrosinkinaseinhibitoren und Spenderlymphozyten
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin an der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg.
vorgelegt von:
Lina Mechtild Alexandra Hildebrandt aus Oldenburg
(wird von der Medizinischen Fakultät ausgefüllt)
Angenommen von der
Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg am: 24.09.2015
Veröffentlicht mit Genehmigung der
Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg.
Prüfungsausschuss, der/die Vorsitzende: PD. Dr.med. Francis Ayuk
Prüfungsausschuss, zweite/r Gutachter/in: Prof. Dr.med. Gunhild von Amsberg
Inhalt
1. Einleitung: ... 5
1.1 Definition und Epidemiologie ... 5
1.2 Ätiologie und Pathogenese: ... 6
1.3 Diagnosestellung ... 9 1.4 Klinik... 9 1.5 Prognose ...11 1.6 Therapie ...12 1.6.1 Bewertungskriterien: ...12 1.6.2 Frühere Behandlungsoptionen: ...13 1.6.3 Tyrosinkinaseinhibitoren: ...13
1.6.3a Erste Generation: ...13
1.6.3b Zweite Generation: ...17
1.6.3c Neuere, noch nicht zugelassene TKI ...20
1.6.3d Immunsupressive Wirkung der TKI ...20
1.6.4 Allogene Stammzelltransplantation ...21
1.6.4a Therapie von Rezidiven nach allogener Stammzelltransplantation: ...22
1.6.4b Adoptive Immuntherapie mit DLI ...23
1.7 Spender-gegen-Wirt-Reaktion ...23
1.8 Spender-gegen-Leukämie-Effekt ...26
1.9 Kombination von DLI und TKI nach Rezidiv nach SZT ...27
1.10 Fazit ...28
1.11 Mausmodelle ...28
2. Fragestellung: ...30
3.Material und Methoden ...30
3.1 Material ...30
3.1.1 Geräte und Laborausstattung: ...30
3.1.2 EDV: ...31 3.1.3 Verbrauchsmaterialien: ...32 3.1.4a Chemikalien ...32 3.1.4b Puffer: ...33 3.1.5 Kits: ...34 3.1.6 Zytokine: ...34 3.1.7 Primer: ...34
3.1.8 Medien für die Zellkultur ...35
3.1.9 Zellinien ...35
3.2 Methoden ...35
3.2.1 allgemeine zellbiologische Methoden ...35
3.2.2 Umklonierung von Plasmiden ...37
3.2.2a Lentivektoren: ...37 3.2.2b Gammaretrovektoren: ...39 3.2.3 Transplantationsversuche ...43 3.2.4 Nachweismethoden: ...48 4. Ergebnisse ...52 4.1 Transduktionsversuche ...52 4.1.1 Lentivektor ...52
4.1.1a Klonierung der Legovektoren: ...52
4.1.1b Transfektion und Titration der Lego-Vektoren: ...54
4.1.1.c Transduktion von BAF3 Zellen mit den beiden Lentivektoren ...55
4.1.1.d Imatinibtestung der mit den beiden Lentivektoren transduzierten BA/F3-Zellen ...56
4.1.1eTransduktion von murinen Stammzellen mit dem WT-Bcr-Abl und dem Bcr-Abl-T315I Lentivektor ...57
4.1.1f Stimulation von murinen Stammzellen mit zwei verschiedenen Zytokincocktails mit anschließender Facs-Färbung auf Stammzellmarker, an verschiedenen Zeitpunkten nach Entnahme ...58
Dreifache Transduktion muriner Stammzellen ...63
4.1.2 Gammaretrovektor ...64
4.1.2a Klonierung der retroviralen Vektoren ...64
4.1.2b Transduktion muriner Stammzellen mit den retroviralen Vektoren ...67
4.2 Transplantationsversuche ...68
4.2.1 Lentivektor ...68
4.2.1a Dosisfindung der Knochenmark letalen Bestrahlung und Testung einer Knochenmarksupportdosierung ...68
4.2.1b Transplantation von dreifach transduzierten murinen Stammzellen ...72
4.2.2 Gammaretrovektor ...73
4.2.2a ErsteTransplantationen von mit dem Retrovirus transduzierten Knochenmarkzellen .73 4.2.2b Zweiter Transplantationsversuch ...78
4.3 Therapietestungen und weitere Transplantationsversuche ...82
4.3.1 Übersichten über die Hemmung der beiden Leukämiezellarten durch die verschiedenen Behandlungen ...99
4.3.2 Übersicht über die mittlere Überlebenszeit in den verschiedenen Behandlungsgruppen ... 102 5. Diskussion ... 103 5.1.Das Tiermodell ... 103 5.2.Die Therapien ... 107 6. Abkürzungsverzeichnis ... 110 7. Literaturverzeichnis ... 113 8. Eidesstattliche Versicherung ... 123
1. Einleitung:
1.1 Definition und Epidemiologie
Die chronisch myeloische Leukämie (Synonym: chronische Myelose) ist eine myeloproliferative Erkrankung (myeloproliferative disease, MPD) des hämatopoetischen Systems. Sie geht mit einer klonalen Expansion von hämatopoetischen Stammzellen des Knochenmarkes einher und führt zur Anreicherung von hauptsächlich myeloiden Zellen im Blut. Dabei steigt sowohl die Zahl der reifen neutrophilen, eosinophilen und basophilen Granulozyten, als auch derer Vorstufen an. Die chronisch myeloische Leukämie (CML) macht 15-20% der Leukämien bei Erwachsen aus. Die jährliche Inzidenz liegt weltweit bei 1-2 Neuerkrankungen (Torgerson et al. 2012). Das mediane Alter bei Entdeckung der Krankheit liegt bei 53 Jahren, aber es können alle Altersklassen, auch Kinder betroffen sein (Sawyers 1999). 2,8% der Patienten sind bei der Diagnosestellung jünger als 20 Jahre (National Cancer Institute, NCI, 2005-2009). Die Inzidenz ist in verschiedenen ethnischen Gruppen unterschiedlich, so sind zum Beispiel Weiße 1,4-mal öfter betroffen als Asiaten (NCI, 2005-2009). Das Verhältnis von Erkrankungen bei Männer und Frauen liegt bei 1,4:1 (Torgerson et al. 2012). Die Prävalenz der CML steigt weltweit und gerade in der westlichen Welt stetig an, da aufgrund verbesserter Behandlungsstrategien ein enormer Effekt auf das Überleben erreicht wurde (Torgerson et al. 2012).
Der Begriff MPD wurde 1951 von William Damshack geprägt, im Jahre 2008 von der
World Health Organisation (WHO) aber umbenannt in myeloproliferative neoplasms
(MPN) um zu betonen, dass die klonalen Zellen, zwar maligner Entität sind, nicht aber von Natur aus dysplastisch (Kim et al. 2012). Zu dieser Gruppe von Erkrankungen zählen nach der typischen Definition neben der CML, auch die Polycythaemia vera (PV), die essentielle Thrombozythämie und die Osteomyelofibrose (OMF). Des Weiteren werden die chronisch neutrophile Leukämie, die chronisch eosinophile Leukämie und die Mastzellleukämie laut WHO dazugezählt (Tefferi et al. 2009). Die CML geht im Gegensatz zu den anderen MPNs mit der Bildung des so genannten Philadelphia-Chromosoms einher. Dabei entsteht
durch Translokation das Bcr-Abl-Fusionsgen ([(t9;22)(q34;q11)]. Diese Mutation führt zur Produktion einer daueraktiven Bcr-Abl-Tyrosinkinase, die wiederum eine starke Proliferation auslöst.
Die CML ist die erste neoplastische Erkrankung bei der die Identifikation des Genotyps zur Entwicklung wirkungsvoller Medikamente geführt hat. Daher dient sie als Modell für die Behandlung anderer Neoplasien und ist Inhalt vieler Studien, deren Zahl in keinem Verhältnis zu ihrer eher geringen Inzidenz steht (Hehlmann et al. 2007).
1.2 Ätiologie und Pathogenese:
Die Ätiologie der CML ist weitestgehend ungeklärt. Es wird vermutet, dass ionisierende Strahlen einen Risikofaktor darstellen, dieser Zusammenhang konnte aber nicht eindeutig belegt werden (Hehlmann et al. 2007). Zudem korreliert die Erkrankung mit peptischen Ulzera und anderen Krebserkrankungen in der persönlichen Vorgeschichte, auch nach Ausschluss von Bestrahlung und Chemotherapiebehandlungen; Als mögliche Erklärung dafür werden genetische Faktoren, die die Anfälligkeit für multiple Krebserkrankungen erhöhen, gehandelt (Johnson et al. 2012).
Bei der Pathogenese spielt die Bildung des Bcr-Abl-Fusionsgens eine wichtige Rolle. Dabei kommt es durch eine Translokation zur Verbindung des ABL-Genes auf Chromosom 9 und des BCR-Genes auf Chromosom 22, welche dann zum Fusionsgen verschmelzen. ABL steht dabei für Abelson murine leukemia viral
oncogene und BCR für Breakpoint cluster region. Das ABL-Gen kodiert für eine
rezeptorunabhängige Tyrosinkinase, die in zahlreichen Geweben exprimiert wird und sowohl im Zellkern, als auch im Zytoplasma lokalisiert ist. Sie kann auch zwischen diesen beiden Kompartimenten wandern. Dabei ist die nukleäre ABL für die Transkriptionskontrolle im Falle von DNA-Schäden verantwortlich und kann auch die Apoptose einleiten. (Wang 2000). Die zytoplasmatische ABL dagegen wird von Wachstumsfaktoren und Zelladhäsion aktiviert und spielt eine wichtige Rolle in der Dynamik des Zytoskeletts (Woodring et al. 2003). Die ABL Tyrosinkinase wird durch Phosphorylierung aktiviert. Durch die Fusion von BCR und ABL wird die Aktivität der
ABL Tyrosionkinase gesteigert. Dies erklärt sich durch die Möglichkeit der Trans-Autophosphorylierung durch Dimer- und Tetramerbildung über die doppeltgewundenen Bereiche der Bcr-Abl-Proteine. Die Phosphorylierung generiert eine hochaffine Bindungsstelle für Gaba-B Receptor-2 (GBR2), welche über
Src-homology 2 (SH2) an Bcr-Abl und über Src-Src-homology 3 (SH3) an Son of sevenless (SOS) und GRB2-associated binding protein 2 (GAB2) bindet. SOS aktiviert dann Rat sarcoma (RAS), GAB2 rekrutiert Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K) und SH2 tyrosine phosphatase (SHP2) Proteine. Das SH2 Modul von Abl kann SHC binden, welches nach erfolgter Phosphorylierung ebenfalls GRB2 rekrutieren kann. Der SH3 Bereich von ABL und die SH3 Bindungsstelle am c-terminalen Ende sind in der Lage einige Proteine, die für die Regulation der Zelladhäsion und –migration wichtig sind, zu binden. Außerdem kann Bcr-Abl mit Interferon Consensus Sequence Binding
Protein (ICSBP), jun B proto-oncogene (JUNB) und signal-induced proliferation-associated 1 (SIPA1) interagieren, welche die Proliferation und das Überleben von
myeloiden Zellen negativ regulieren. ICSBP in dem es deren Differenzierung zu Monozyten triggert, JUNB in dem es das Downstreamtarget von RAS JUN inhibiert und SIPA1 über die Inaktivierung von Ras-proximate-1 (RAP1), welches in aktiver Form über proto-oncogene B-Raf (BRAF) positiv auf die Proliferation von myeloiden Zellen wirkt. Bcr-Abl kann also über vielfältige Wege die Proliferation und das Überleben myeloider Zellen stimulieren: es aktiviert RAS, SHP2 und PI3K-AKT Signalwege und reguliert die Transkription von ICSBP, JUNB und SIPA1 herunter (Ren 2005).
Abbildung 1: Modifiziert nach: „Mechanisms of BCR–ABL in the pathogenesis of chronic myelogenous leukaemia”, Ruibao Ren 2005
Bei der CML wird Bcr-Abl in sich selbst erneuernden hämatopoetischen Stammzellen exprimiert. Diese sind in der Lage sich zu myeloiden oder lymphozytären Vorläuferzellen zu differenzieren. In der ersten Phasen der CML, der chronischen Phase, kommt es durch die proliferationssteigernden Effekte von Bcr-Abl zu einer exzessiven Vermehrung aller drei Granulozytenformen. Durch im Verlauf auftretende weitere Mutationen, welche durch die hohe Proliferationsrate und chromosomale Instabilität der Erkrankung noch getriggert werden, kommt es zum Übergang in die Akzelerationsphase und letztlich die Blastenkrise. Hierbei reichern sich unreife Vorstufen entweder der myeloiden (2/3 der Fälle) oder der lymphozytären (1/3 der Fälle) Reihe in Knochenmark und Blut an (Ren 2005). Die Blastenkrise entspricht dem Übergang in eine akute Leukämie (Torgerson et al. 2012)
1.3 Diagnosestellung
Um die Diagnose einer CML zu stellen und sie von den anderen MPN abzugrenzen, bedient man sich der konventionellen Zytogenetik, über die die Translokation nachgewiesen werden kann. Ist dies nicht direkt möglich, kommen modernere, sensitivere Verfahren wie die reverse Transkriptase (RT)- Polymerase Chain
Reaction (PCR) bzw. die Fluoreszenz-in-situ-Hybrisierung (FISH) zum Einsatz.
Wegweisend ist außerdem die Knochenmarksbiopsie und das Differentialblutbild, welches eine exzessive Granulozytose mit Linksverschiebung zeigt (Hehlmann et al. 2007). Bei der RT- PCR handelt es sich um eine Variante der PCR, bei der das Enzym reverse Transkriptase genutzt wird, um in Proben enthaltene Ribonucleic
acid (RNA) in komplementäre DNA umzuwandeln und diese dann mittels PCR zu
vervielfachen. Hierüber lässt sich das Bcr-Abl-Transkript in Blut oder Knochenmark nachweisen. Mit der FISH lässt sich dagegen das Philadelphia-Chromosom direkt nachweisen. Die Methode wurde 1982 von Langer-Safer et al. erstmals vorgestellt und beinhaltet die Hybridisierung der Probe mit einer vorher mit fluoreszierenden Verbindungen markierten Sonde aus DNA. Die gebundenen Sondenmoleküle können dann z.B. mittels Fluoreszenzmikroskop detektiert werden (Langer-Safer et al. 1982).
1.4 Klinik
Die CML verläuft unbehandelt gewöhnlich in 3 Phasen:
chronische Phase fortgeschrittene Phasen
Akzelerierte Phase Blastenkrise
Mediane Dauer Mediane Dauer Medianes Überleben
5-6 Jahre 6-9 Monate 3-6 Monate
Abbildung 2: Übersicht der drei Phasen der CML mit medianer Dauer (modifiziert nach: Central European Leukemia Study Group, www.cml-info.com)
Die chronische Phase dauert zumeist fünf bis sechs Jahre an (Schiffer et al. 2003). Ihr Leitsymptom ist die Leukozytose mit pathologischer Linksverschiebung und eine
Splenomegalie, als Folge der extramedullären Blutbildung. Der Blastenanteil liegt aber noch unter 10%. Da in 90% der Fälle die Diagnose der CML in dieser chronischen Phase gestellt wird, sind 20-50% der Patienten bei Diagnosestellung asymptomatisch (Torgerson et al. 2012). Die CML ist häufig ein Zufallsbefund bei Differentialblutbilduntersuchungen. Hier fällt eine Leukozytose mit Erhöhung der Granulozytenwerte auf. Treten Symptome auf, handelt es sich meist um Müdigkeit/Abgeschlagenheit, Blutungen, aufgrund von verringerter Plättchenfunktion, wie z.B. Epistaxis oder Menorrhagien, Völlegefühl, vermehrte Schweißneigung oder ungewollten Gewichtsverlust. Seltener lassen sich Symptome einer Splenomegalie, wie abdominelle Schmerzen feststellen.
Es folgt die ca. sechs Monate währende Akzelerationsphase, in der die Krankheit schneller fortschreitet und die anderen Reihen der Blutbildung zunehmend verdrängt werden. Daraus ergibt sich eine stärkere Leukozytose, eine Thrombozytopenie und Anämie, sowie eine stärker ausgeprägte Splenomegalie. Den Patienten geht es in diesem Stadium deutlich schlechter. Die WHO legte folgende Kriterien für die Einordnung in die Akzelerationsphase fest, dabei gilt schon ein erfüllter Punkt als ausreichend:
- 10-19% Blasten in den peripheren weißen Blutzellen oder Knochenmarkzellen - Mindestens 20% basophile Granulozyten im peripheren Blut
- andauernde Thrombozytopenie (< 100 x 109/L) unabhängig von der Therapie
- andauernde Thrombyzytose (> 1000 x 109/L) unempfänglich für Therapie
- zunehmende Milzgröße und steigende Leukozytenzahl, unempfänglich für Therapie
- zytogenetischer Nachweis von klonaler Entwicklung (z.B. das Auftreten von zusätzlichen genetischen Abnormalitäten, die zur Zeit der Diagnosestellung nicht in der Probe vorhanden waren)
- Megakaryozytenproliferation, verbunden mit Retikulin oder Kollagenfibrose und /oder starke Granulozytendysplasie weisen auf eine Akzelerationsphase hin, sind aber nicht beweisend.
Letztendlich geht diese Phase in die Blastenkrise über, bei der der Blastenanteil im Blut und/oder Knochenmark nun mehr als 20 (nach World Health Organisation, WHO) bzw. 30% (nach deutscher CML-Studiengruppe) beträgt bzw. großflächige
Cluster von Blasten in Knochenmarkbiopsien gefunden werden. In dieser Phase können sich die CML-Zellen neben Knochenmark, Lymphknoten und Milz auch in anderen Geweben ansammeln und dort s.g. Chlorome bilden (Vardiman et al. 2002). Die mittlere Überlebenszeit in dieser Phase beträgt weniger als 6 Monate (Schiffer 2007). Dadurch dass die Blasten die normale Blutbildung weitestgehend verdrängen, verstärken sich die oben genannten Symptome so stark, dass Infekte, Blutungen etc. das Leben des Patienten akut gefährden. Forscher des M.D. Anderson Cancer Center postulierten folgende Parameter als entscheidend für die Prognose und der Verlauf der Erkrankung (Kantarjian et al. 1988):
- zytogenetischer Nachweis einer klonalen Evolution - periphere Blasten >/= 15%
- >/= 20% periphere Basophile
- >/= 30% periphere Blasten und Promyelozyten - Thrombozytopenie
Dank neuer Behandlungsmethoden nimmt die Erkrankung nur noch selten diesen dreistufigen Weg und kann oft in der chronischen Phase gehalten werden.
1.5 Prognose
Die Überlebenszeit ist sehr variabel und hängt unter anderem vom Zeitpunkt der Diagnosestellung, dem Zeitpunkt des Behandlungsbeginns, evtl. vorhandenen Tyrosinkinaseinhibitor-resistenten Formen von Bcr-Abl (He et al. 2012), dem Alter der Patienten und der Compliance des Patienten ab (Rosti et al. 2007). Bevor es Behandlungsmöglichkeiten gab, lag die mittlere Überlebenszeit bei etwa 3,5 Jahren (Sokal et al. 1984). Je nach Studie schwanken die Überlebensraten zwischen 89% nach 60 Monaten Imatinib-Behandlung (Druker et al. 2006) und 97,7% nach 6 bzw. 95,2% nach 8 Jahren Imatinib-Behandlung (Gambacorti-Passerini et al. 2011). Die Überlebensraten nach Stammzelltransplantation (SZT) wurden lange als deutlich tiefer liegend eingeschätzt, da es hier deutlich höhere Komplikationsraten gibt. Allerdings zeigen neuere Studien, dass z.B. das 3-Jahres-Überleben nach Stammzelltransplantation mit dem von Patienten mit Imatinib-Behandlung vergleichbar ist (Saussele et al. 2010). Dafür ist aber nur durch die SZT eine
komplette Heilung der Erkrankung möglich. Abschätzen lässt sich das Risiko der Patienten mit Hilfe des 1984 entwickelten und noch bis heute Anwendung findenden Sokal Score, bei dem am Zeitpunkt der Diagnose folgende Parameter bestimmt werden und so eine Einteilung der Patienten in Niedrig-, Mittel- und Hoch-Risikopatienten möglich ist (Sokal et al. 1984):
- Prozentsatz der Blasten im peripheren blut - Thrombozytenzahl
- Milzgröße (gemessen in cm unter dem Rippenbogen) - Alter des Patienten
1.6 Therapie
1.6.1 Bewertungskriterien:
Therapieerfolge werden bei der CML in 3 Arten unterteilt. Das hämatologische Ansprechen ist dabei definiert als Grad der Normalisierung des Blutbildes und der Milzgröße. Ein vollständiges hämatologisches Ansprechen beinhaltet ein komplettes Erfüllen der folgenden Punkte: Hämoglobin: >11g/dl, Thrombozytenzahl: <500.000/mm³, Leukozytenzahl: <10.000/mm³, ein Differentialblutbild ohne Blasten und Promyelozyten und < 5% Metamyelozyten und Myelozyten, sowie eine nicht palpable Milz. Ein partielles hämatologisches Ansprechen ist definiert als das Vorliegen eines der folgenden Punkte: Hämoglobin: 9-11g/dl, Thrombozytenzahl: >500.000/mm³, Leukozytenzahl: 10-50.000/mm³, 1-5 Vorläuferzellen im Differentialblutbild oder eine 1-5cm unter dem Rippenbogen tastbare Milz. Das zytogenetische Ansprechen entspricht dem Prozentsatz der Metaphasen ohne nachweisbares Philadephia-Chromosom. Dabei sollten mindestens 25 Metaphasen untersucht werden Es wird unterteilt in: kein zytogenetisches Ansprechen: 0%, minimales: 1-32%, geringes: 33-66%, partielles: 67-99%, komplettes: 100% (the Italian cooperative study group on chronic myeloid leukemia, 1994). Abschließend gibt es noch das molekulare Ansprechen, welches per RT und/oder nested-PCR untersucht wird und den genauesten Nachweis liefert. Als komplettes molekulares Ansprechen (complete molecular response, CMR) wird keinerlei Nachweis von Bcr-Abl-mRNA-Transkripten in 2 aufeinander folgenden Blutproben angesehen. Von
einem partiellen Ansprechen (major molecular response, MMR) spricht man bei einem Verhältnis von Bcr-Abl zu Abl von </= 0,1 auf der internationalen Skala, die eingeführt wurde um die Ergebnisse verschiedener Labore vergleichbar zu machen. Selbst durch eine langjährige Tyrosinkinaseinhibitorbehandlung ist nur selten ein komplettes molekulares Ansprechen möglich (Gambacorti-Passerini et al. 2011). Als wohl wichtigster Therapieerfolg ist das verlängerte Überleben der Patienten zu sehen, dieses wird zumeist als 5-Jahres-Überleben angegeben. Aber auch andere Zeiträume werden je nach Studiendauer angewendet.
1.6.2 Frühere Behandlungsoptionen:
Die erste mögliche Therapie bestand in der Gabe von Zytostatika wie Hydroxycarbamid, welches die DNA-Synthesekapazität durch Inhibition der Ribonukleotidreduktase stark einschränkt und Busulfan, welches Zellen durch die Alkylierung ihrer DNA zerstört. Dies beeinflusste das Outcome der Patienten nur gering, wobei Hydroxycarbamid aber noch deutlich überlegen war (Hehlmann et al. 1993). Der nächste Schritt in der Geschichte der Therapie der CML war der Übergang zur Behandlung mit Interferon-alpha (IFN-alpha). IFN-alpha ist ein von Leukozyten produziertes Zytokin, das zytotoxische T-Zellen und Makrophagen aktiviert, sowie negativ auf die Proliferation von (virus-)infizierten Zellen wirkt. Es hat insgesamt einen immunsuppressiven Effekt. Ein lebensverlängernder Effekt im Vergleich zu Hydroxycarbamid und Busulfan konnte in zahlreichen Studien gezeigt werden und betrug im Mittel etwa 15% Zuwachs, auf 57% im fünf-Jahres-Überleben (O’Brien & Deininger 2003). Die Kombination von IFN-alpha mit Cytarabin, einem weiteren Zytostatikum, welches als Isomer des Nukleosids Cytosin in die DNA eingebaut wird und zum Kettenabbruch führt, führte zwar zu einer besseren hämatologischen und zytogenetischen Antwort, eine Verlängerung des Überlebens konnte aber nicht gezeigt werden (Baccarani et al. 2002).
1.6.3 Tyrosinkinaseinhibitoren:
1.6.3a Erste Generation:
Revolutioniert wurde die medikamentöse Therapie der CML durch die Entwicklung des Tyrosinkinaseinhibitors Imatinib. Imatinib ist ein kompetitiver Inhibitor der Bcr-Abl-Tyrosinkinase und das erste Medikament, das anhand der Kristallstruktur eines Enzyms (Tyrosinkinase) entwickelt wurde. Es wurde damit zum Vorbild für viele
weitere Medikamente, die ein bestimmtes Enzym als Ziel haben. Imatinib blockiert die ATP-Bindungsstelle des Enzyms und verhindert dadurch die weitere Phosphorylierung von Proteinen in der Bcr-Abl-Signalkaskade. Es verhindert eine Proliferation von Bcr-Abl-positiven hämatopoetischen Zellen oder führt sogar zu deren Apoptose (Druker et al. 1996). Imatinib ist in hohem Maße spezifisch für Bcr-Abl, bindet aber auch an den Plättchen-abhängigen Wachstumshormonrezeptor (Buchdunger et al. 1995) und die c-Kit-Tyrosinkinase. Letztere ist als Stammzellfaktorrezeptor in die Hämatopoese involviert und ihre Inhibition daher ebenfalls ein wichtiger Bestandteil der in vivo Wirksamkeit von Imatinib (Druker & Lydon 2000). Entdeckt wurde Imatinib 1992 von Nicolas Lydon und Brian Druker. Vertrieben wird das Medikament unter dem Namen Glivec (deutsch) bzw. Gleevec (englisch) von Novartis. Seine Wirksamkeit wurde in zahlreichen Studien belegt (z.B. (Druker et al. 2001), (Kantarjian et al. 2002), (O’Brien & Deininger 2003). In der s.g. IRIS (International Randomized Study of IFN versus STI571) wurde eine 6-Jahresüberlebensrate von 88% nachgewiesen. Patienten, die sich zwei Jahre nach Therapiebeginn in kompletter zytogenetischer Remission befinden, haben sogar keinerlei Überlebensnachteil gegenüber der nicht erkrankten Normalbevölkerung (Gambacorti-Passerini et al. 2011). Kritiker der IRIS-Studie betonen, dass die Ergebnisse durch den Ausschluss von Patienten aus der Statistik, die die Therapie aus anderen Gründen als Krankheitsprogression abbrachen, geschönt wurden. Reproduzierende Studien zeigten, dass etwa ein Drittel der neudiagnostizierten Patienten eine potenziell besser wirkende Therapie als Imatinib benötigen, wie z.B. neuere Tyrosinkinaseinhibitoren (TKI) oder eine Kombination mehrerer TKI (Pinilla-Ibarz & Flinn 2012). Verabreicht wird Imatinib je nach Verträglichkeit ein- oder zweimal täglich oral. Seine Halbwertszeit beträgt 22 Stunden. Seine orale Bioverfügbarkeit beträgt etwa 98%, wobei die höchsten Plasmakonzentrationen 2-4 Stunden nach Einnahme gemessen werden. Üblich sind Dosierungen von 400mg/d in der Behandlung der CML, bei Unwirksamkeit kann auf 600mg/d gesteigert werden. Da Imatinib plazentagängig und auch über die Muttermilch an das Kind weitergegeben wird, sollte die Einnahme während der Schwangerschaft und Stillzeit sorgfältig abgewogen werden. Über die Anwendung in dieser Zeit gibt es wenige Daten (Di Gion et al. 2011). Das Nebenwirkungsprofil von Imatinib beinhaltet Muskelkrämpfe, Ödeme, allgemeines Schwächegefühl, Hautbrüchigkeit, Diarrhoe, Haarausfall sowie Läsionen von Bändern und Sehnen. Selten wird über
Hepatotoxizität und Herzfehler berichtet. Ernsthafte Nebenwirkungen sind aber selten und treten nur in 3,2% der Fälle auf (Gambacorti-Passerini et al. 2011). Neben der Behandlung der CML ist Imatinib auch für die Behandlung von gastrointestinalen Stromatumoren (GIST), Philadelphia-Chromosom-positiver akuter lymphatischer Leukämie (ALL) und anderen myeolodysplastische Syndrome zugelassen. Es wird eine Wirkung gegen pulmonale Hypertension (Tapper et al. 2009) und das retikuläre Neurofibrom erforscht (Yang et al. 2008)
Imatinib bindet an eine Konformation der Kinasendomäne, in der das s.g. DFG-Motiv (Asp381–Phe382–Gly383, siehe Abbildung unten) eine um fast 180° gedrehte Konstellation annimmt, genannt DFG-out. Diese Konstellation bildet jenseits des Thr315 „Türhüter”-Restes eine Tasche, in der das Amid und das N-Methylpiperazin
von Imatinib binden. Das hochgradig konservierte DFG-Motiv liegt am N‘terminalen Ende der Aktivierungsschleife, welche der Standort von aktivierender Phosphorylierung in vielen Proteinkinasen ist. Die Aktivierungsschleife als ganzes nimmt eine eindeutig inaktive Konformation im Komplex mit Imatinib an; Sie faltet sich auf das aktive Zentrum und tritt eher mit der phosphatbindenden P-Schleife in Kontakt, als die „Haarnadel“-Konformation, die charakteristisch für aktive Kinasen ist einzunehmen. Die P-Schleife selbst verbindet sich eng mit Imatinib. Sechs Wasserbrückenbindungen stabilisieren den Imatinib Komplex. Sie beinhalten das Pyridin-N und das Backbone-NH von Met318, das Aminopyrimidin und Seitenketten-Hydroxyl von Thr315, das Amid-NH und Seitenketten Carboxylat von Glu285, das Carbonyl und Backbone-NH von Asp381, das protonierte Methylpiperazin mit den Backbone-Carbonyl Atomen von Ile360 und His361. Zusätzlich unterstützen zahlreiche van der Waal's Kräfte die Bindung (Eck & Manley 2009). So stabilisiert Imatinib die inaktive Form der Tyrosinkinase, verhindert die Autophosphorylierung und hemmt dadurch die Proliferation von hämatopoetischen Zellen.
Abbildung 3: Darstellung der Kristallstruktur der Abl Kinasendomäne im Komplex mit Imatinib (gelb) (Young et al. 2006).
Trotz der guten Wirksamkeit treten immer wieder Fälle von Imatinib-Resistenz auf. Etwa 25% neudiagnostizierter Patienten erreichen keine komplette zytogenetische Remission und 25% der anfangs empfänglichen Patienten werden im Laufe der Behandlung resistent. Patienten die erst in der Akzelerationsphase oder Blastenkrise mit Imatinib behandelt werden weisen noch deutlich häufiger Resistenzen auf (Apperley 2007). Zuerst vermutete Ursachen waren eine Überexpression von Bcr-Abl (le Coutre et al. 2000) und/oder P-Glykoprotein (Mahon et al. 2000), die aber nur ein verringertes Ansprechen auf Imatinib erklärten und keine komplette Resistenz. Weitere Analysen ergaben als ursächlich hierfür Mutationen im Bcr-Abl-Gen, die zu Veränderungen im Aufbau der Tyrosinkinase führen und somit eine Bindung von Imatinib an den ATP-bindenen Bereich verhindern. Die zuerst entdeckte Mutation ist die T315I-Mutation, bei der eine Punktmutation (statt eines Cytosin wird ein Thymin eingebaut) einen Austausch von Threonin zu Isoleucin an Stelle 315 veranlasst. Das nun fehlende Sauerstoffatom verhindert die Ausbildung einer Wasserstoffbrückenbindung zwischen Imatinib und der ATP-bindenden Region von
Bcr-Abl. Außerdem führt das voluminösere Isoleucin zu einem sterischen Zusammenprall mit Imatinib, sodass eine Bindung nicht mehr möglich ist. Der hemmende Effekt von Imatinib entfällt also komplett (Gorre et al. 2001). Die Glu255Lys Mutation führt zu einem Verlust von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen der Glutamatseitenkette und dem Tyrosinhydroxyl an Stelle 257 und dem Lysinamin an Stelle 247, welche die Konformation von Bcr-Abl stabilisieren an die Imatinib bindet (Eck & Manley 2009). Die Entdeckung dieser und zahlreicher weiterer Mutationen, sowie deren Strukturaufklärung spornt die Forschung zur Entwicklung immer neuer Tyrosinkinaseinhibitoren an.
1.6.3b Zweite Generation:
Dasatinib wurde 2004 als vielfältiger Inhibitor von Abl und SRC-Kinasenfamilien vorgestellt. In der Röntgenstrukturanalyse der Verbindung aus Dasatinib und Abl zeigt sich, dass im Gegensatz zur Bindung mit Imatinib, hier sowohl die aktive, als auch die inaktive Form gebunden und durch drei Wasserstoffbrückenbindungen stabilisiert wird. Es wird vermutet, dass die weniger strengen Bindungsanforderungen von Dasatinib im relativen Vergleich zu denen von Imatinib, verantwortlich für die günstige Aktivität gegenüber mutierten Kinaseformen ist (Talpaz et al. 2006). Dasatinib ist neben seiner ATP-kompetitiven Inhibition von Src und Bcr-Abl auch wirksam gegen c-Kit und PDGFRβ. In vitro wurde eine Wirksamkeit gegen 32 von 33 Bcr-Abl-Mutationen nachgewiesen, einzige Ausnahme bildet die oben beschriebene T315I-Mutation. Die orale Bioverfügbarkeit – also der Anteil des Wirkstoffs der nach oraler Aufnahme unverändert im Blutkreislauf zur Verfügung steht - im Menschen ist unbekannt. In Tierversuchen wurden Werte zwischen 14 und 51% bei Mäusen gemessen und die Halbwertszeit liegt zwischen 3 und 5 Stunden (Di Gion et al. 2011). Typische Nebenwirkungen sind Diarrhö, Ödeme und Kopfschmerzen. Seltener treten Fälle von Pleuraergüssen und Leberfunktionsstörungen auf. Patienten, die Imatinib nicht vertrugen, hatten keine ähnlichen Beschwerden bei der Einnahme von Dasatinib. In einer Phase-1 Dosis-Eskalationsstudie konnte die Wirkung von Dasatinib gegen Imatinib-resistente Mutationen von Bcr-Abl gezeigt werden. Dasatinib inhibiert Bcr-Abl deutlich effektiver als Imatinib (es ist etwa 325mal potenter) und ist zudem kein Substrat von P-Glykoprotein, was zu einer höheren intrazellulären Anreicherung in Stammzellen führen kann, da diese die Effluxpumpe hochgradig exprimieren (Talpaz et al. 2006). In präklinischen Studien wurden Bcr-Abl Mutationen entdeckt, die zwar gegen Dasatinib, nicht aber gegen Imatinib resistent
sind, daher wurden Überlegungen zu einer Kombinationsbehandlung angestellt (Burgess et al. 2005). Dasatinib wird von Brystol-Myers-Squibb unter dem Namen Sprycel vertrieben und ist seit Ende 2006 in der EU für die Behandlung von der CML bei Patienten, die Imatinib nicht tolerieren oder nicht darauf ansprechen, zugelassen. 2010 erfolgte die Zulassung als first-line Behandlung anhand der Phase3-Studie: „Dasatinib versus Imatinib Study in Treatment-Naive CML Patients (DASISION)“ (Kantarjian et al. 2010). Die normale Dosierung beträgt 100mg einmal täglich.
Für die Entwicklung von Nilotinib war die Strukturaufklärung der Bindung von Imatinib an Bcr-Abl ausschlaggebend. Es wurde 2005 erstmalig unter dem Namen AMN107 vorgestellt und unterscheidet sich von Imatinib nur durch die Einführung einer alternativen Bindungsgruppe (Weisberg et al. 2005). Dadurch hat Nilotinib eine höhere Selektivität gegenüber Bcr-Abl, was zu einer mindestens 10-fach höheren pharmakologischen Potenz führt. Es stabilisiert aber wiederum die inaktive DFG-out Form, die oben beschrieben wurde (Eck & Manley 2009). Die Art der Bindung unterscheidet sich aber von der des Imatinib: Die Met351 enthaltende Helix wird in einer Aussparung neben Leu364 in Position gehalten (Weisberg et al. 2005).
Nilotinib verhindert ebenfalls die Autophosphorylierung von Bcr-Abl und schränkt so die Proliferation hämatopoetischer Zellen ein. Zusätzlich fördert es die Entdifferenzierung der CML-Vorläuferzellen und unterbindet dadurch deren klonale Expansion. Da eine große Menge an Vorläuferzellen die Bildung von Resistenzen fördert, wurde Nilotinib auch eine vorbeugende Wirkung gegen Resistenzen zugeschrieben und seine Nutzung als First-line Behandlung gefordert (Pinilla-Ibarz & Flinn 2012). Nilotinib ist gegen viele der Imatinib-resistenten Mutationen von Bcr-Abl in verträglichen Konzentrationen wirksam (Weisberg et al. 2005). Nilotinib wird zweimal täglich oral eingenommen, mit einer Tagesgesamtdosis von 600 (neu diagnostizierte CML) bzw. 800mg (Imatinib-resistente vorbehandelte CML), da die orale Bioverfügbarkeit bei lediglich 30% liegt. Da die Aufnahme von Nilotinib durch (fettreiche) Nahrung noch weiter abnimmt, sollte es in größerem zeitlichem Abstand zu Nahrungsaufnahmen eingenommen werden (Di Gion et al. 2011). In der ENESTnd-Studie (Evaluating Nilotinib Efficacy and Safety in Clinical Trials – Newly Diagnosed Patients), in der die Wirkung von Nilotinib und Imatinib in Patienten verglichen wurde, erreichten doppelt so viele Patienten eine MMR nach 12 Monaten und auch der Prozentsatz der CMRs nach 24 Monaten war mehr als doppelt so hoch
in der Nilotinibgruppe (Pinilla-Ibarz & Flinn 2012). Nilotinib wird wie Imatinib allgemein gut vertragen, das Nebenwirkungsprofil beinhaltet eher Ausschläge, Haarausfall, Kopfschmerzen und Juckreiz, als gastrointestinale Nebenwirkungen (wie bei Imatinib beobachtet). Es ist unbekannt, ob Nilotinib die Plazentaschranke überwinden kann und ob es in die Muttermilch übertritt, daher sollte es in Schwangerschaft und Stillzeit nicht verschrieben werden (Di Gion et al. 2011). Nilotinib wird unter der Handelsnamen Tasigna von der Firma Novartis vertrieben. Das Medikament ist seit 2008 in der EU für die Behandlung der CML bei Patienten, die Imatinib nicht tolerieren oder nicht darauf ansprechen, sowie auch seit 2010 für neu diagnostizierte CML Patienten zugelassen (Europäischer öffentlicher Beurteilungsbericht (EPAR) und Produktinformation zu Tasigna).
Bosutinib ist ebenfalls ein TKI der zweiten Generation, erstmalig vorgestellt als Inhibitor von Abl im Jahre 2003. Es wirkt wiederum gegen alle Mutationen, außer T315I. Die übliche Dosierung beträgt 500mg und in einer Phase2 Studie wurde eine gute Wirksamkeit und Verträglichkeit nachgewiesen (Santos et al. 2011). In Europa erfolgte die Zulassung im März 2013, zur Behandlung von Patienten mit CML, die mit einem oder mehreren TKI vorbehandelt sind, und bei denen die Behandlung mit einem der anderen TKI Imatinib, Nilotinib oder Dasatinib nicht geeignet sind.
2009 wurde mit AP24534, genannt Ponatinib ein vielversprechender pan-Inhibitor – die Substanz hemmt also die Proliferation aller, auch der mutierten, Formen von Bcr-Abl - von Bcr-Bcr-Abl und der T315I Mutation vorgestellt. Dieser bindet die T315I-Seitenkette mit einer Kohlenstoff-Kohlenstoff Dreifachbindung und es zeigen sich sogar van-der-Waals-Kräfte zwischen dem Isoleucin der Mutation, statt Abstoßung durch sterische Schwierigkeiten, wie es bei den anderen TKI der Fall ist. Dieses Medikament zeigte in vitro Wirksamkeit gegen alle bisher bekannten Imatinib-resistenten Bcr-Abl-Mutationen und sogar gegen die Kombination mehrerer Mutationen auf einem Allel. Auch in Mausmodellen konnte die Wirksamkeit bestätigt werden (O’Hare et al. 2009). In einer Phase I Studie wurde die antileukämische Wirkung auch gegen T315I gezeigt und eine Dosierung von 45mg/d für weitere Studien empfohlen. In einer Phase II Studie (“PONATINIB for Chronic Myeloid Leukemia (CML) Evaluation and Ph+ Acute Lymphoblastic Leukemia” (PACE), Studiennummer: NCT01207440) zeigte sich die Effektivität des Medikaments bei Patienten, die TKI der zweiten Generation nicht tolerieren oder bei denen die T315I
Mutation nachgewiesen wurde. Daher erfolgte im Juli 2013 die Zulassung von Ponatinib in Europa. Entwickelt wurde Ponatinib von ARIAD Pharmaceuticals. (O’Hare et al. 2011).
1.6.3c Neuere, noch nicht zugelassene TKI
2008 wurde SGX393 als Inhibitor der T315I Mutation vorgestellt. Seine inhibitorische Potenz ist mit der von Dasatinib vergleichbar. Die Wirkung von SGX393 gegen Bcr-Abl-T315I konnte sowohl in vitro anhand von leukämischen Zelllinien, als auch im Mausmodell (subkutan, s.c. injizierte Leukämiezelllinie) gezeigt werden. Gegen einige andere Imatinib-resistente Mutationen von Bcr-Abl, zeigt SGX393 allerdings keine Wirkung. Eine Kombination von SGX393 und Nilotinib oder Dasatinib zeigte vielversprechende Ergebnisse (O’Hare et al. 2008).
Bei DCC-2036 handelt es sich um einen weiteren Inhibitor der T315I-Mutation, der aufgrund seiner Bindung ohne die Wasserstoffbrücke am Threonin315, nicht am voluminösen Isoleucin in der mutierten Variante abprallt und unabhängig davon seine Wirkung entfalten kann. DCC-2036 ist wiederum nicht für alle Imatinib-resistenten Mutationen wirksam. Diese Substanz wurde 2011 vorgestellt und auch bei dieser zeigte die Kombination mit Nilotinib oder Dasatinib bessere Ergebnisse. (Eide et al. 2011).
1.6.3d Immunsupressive Wirkung der TKI
Für alle drei bisher zugelassenen TKI wurde in vitro eine dosisabhängige immunmodulatorische Wirkung nachgewiesen.
Für Imatinib wurde eine Inhibierung der T-Zell-Proliferation nachgewiesen. Es führt zu einer Verminderung der T-cell-receptor (TCR)-vermittelten T-Zellaktivierung durch Inhibierung der Signaltransduktion des CD3-TCR Komplexes und Verringerung der Phosphorylierung von ZAP70 und LAT, welche für die T-Zellaktivierung wichtig sind. Die Produktion von IL-2 wurde ebenfalls gehemmt. Außerdem konnten Homologien zwischen der ATP-Bindungstasche von bekannten Imatinibzielen wie Bcr-Abl und der ATP-Bindungstasche cytoplasmatischer Tyrosinkinasen, die in Immunrezeptor Signalwege involviert sind, nachgewiesen werden. Eine direkte Apoptose der
T-Zellen wurde nicht ausgelöst (Seggewiss et al. 2005). Imatinib hemmt ebenfalls die Entwicklung dendritischer Zellen, inhibiert deren Fähigkeit T-Zell-Antworten hervorzurufen (Appel et al. 2004) und wirkt sich auch negativ auf die Proliferation von Monozyten und Makrophagen aus (Dewar et al. 2005).
Dasatinib inhibiert ebenfalls die T-Zellaktivierung und Proliferation ohne Auslösung der Apoptose der Zellen. Es konnte zusätzlich eine Inhibierung der Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine wie z.B. TNF-α, IL-2 und IL-6 nachgewiesen werden. Außerdem konnte eine Potenzierung der immunsuppressiven Wirkung von Cyclosporin-A und Rapamycin durch Kombination mit Dasatinib gezeigt werden (Schade et al. 2008).
Nilotinib inhibiert als Struktur-Analogon von Imatinib ähnliche Tyrosinkinasen und hat somit ebenfalls einen immunsuppressiven Effekt, bei dem vor allem CD8+-T-Zellen in Aktivierung und Proliferation gehemmt werden. Dieser Effekt war doppelt so stark wie bei Imatinib (Chen et al. 2008).
Diese Effekte könnten als Unterdrückung bzw. Verringerung der Entzündungsreaktion im Sinne einer Graft-versus-Host-Disease (GvHD) in Patienten genutzt werden, die im Rahmen eines Rezidivs nach allogener SZT Donor-lymphocyte-infusion (DLIs) erhalten.
1.6.4 Allogene Stammzelltransplantation
Die allogene Stammzelltransplantation ist bisher die einzige gesichert kurative Therapieoption der CML. Kurativ bedeutet dabei, dass keine Bcr-Abl-Transkripte nach der Therapie im Patientenmaterial mehr nachweisbar sind und es nach Absetzen aller Medikamente nicht zu einem Rückfall der CML kommt. Die ersten erfolgreichen Stammzelltransplantationen erfolgten 1979, wobei die Spender jeweils eineiige Zwillingspartner waren (Fefer et al. 1979). Dies nennt man syngene Stammzelltransplantation. Bis zur Einführung von Imatinib, war die allogene Stammzelltransplantation die Behandlungsmethode der ersten Wahl für Patienten, für die ein passender Spender zur Verfügung stand (Gratwohl et al. 1998). Heute wird sie nur noch für Hochrisikopatienten, Patienten in höheren Krankheitsstadien, sowie bei Versagen der Therapie mit TKI in Betracht gezogen, da es sich um eine komplikationsreiche Behandlung mit vergleichsweise hoher Mortalität und Morbidität
handelt (Zuckerman et al. 2012). Die Faktoren Therapieversagen und höheres Krankheitsstadium korrelieren insofern miteinander, als aus TKI-resistenten Formen der CML schneller fortgeschrittene Stadien entstehen. Diese Gruppen von Patienten haben ein höheres Rezidivrisiko, als Patienten ohne diese Faktoren. In einer Studie über Patienten die zwischen 1989 und 1997 transplantiert wurden, lebten nach über 10 Jahren etwa 50% der Patienten, deren Spender HLA-identische Geschwister waren, ohne Anzeichen eines Rückfalls. Die Transplantations-assoziierte-Mortalität (transplantation related mortality, TRM) nach 5 Jahren lag bei etwa 20%, wenn die Patienten eine Risikobewertung von 0-1 hatten (dieser wurde aus Transplantatart, Phase der CML, Alter, Geschlechterkombination von Spender und Empfänger, sowie der Zeit zwischen Diagnosestellung und Transplantation berechnet und kann zwischen 0 und 7 betragen) und bei etwa 70% bei einem Score von 6-7 (Gratwohl et al. 1998). Die häufigsten Gründe für TRM sind Infektionen, die durch Immunsuppression und/oder Spender-gegen-Wirt-Reaktion (GvHD) begünstigt werden, sowie Organversagen (Khoury et al. 2012). Versuche die TRM durch T-Zell-Depletion zu verringern, führten zu einer höheren Rezidivrate, durch Verringerung des Spender-gegen-Leukämie-Effektes. Dank verbesserter Nachsorge und mehr klinischer Routine konnte eine vergleichbare Sterblichkeit zur TKI-Behandlung erreicht werden, die TRM betrug in dieser Studie nur noch 8%, dennoch bleiben die TKIs first-line Behandlung (Saussele et al. 2010).
1.6.4a Therapie von Rezidiven nach allogener Stammzelltransplantation:
Bevor es geeignete Behandlungsoptionen gab, bestand die einzige Möglichkeit bei Rezidiven nach SZT in einer zweiten SZT. Dies birgt ein hohes Risiko für den Patienten, hohe Kosten und ist nicht immer effektiv. Aufgrund des erhöhten Rezidivrisikos durch die aktuelle Patientenselektion für SZT, wurde verstärkt nach Optionen für diese Patienten geforscht. Dabei wurden im Wesentlichen zwei Möglichkeiten entdeckt:
- Behandlung auch nach der SZT mit TKI, um die Rezidivrate zu senken. Dabei werden bei Patienten, welche die SZT aufgrund von Imatinibresistenz erhalten haben, vor allem TKIs der zweiten Generation angewendet, bei denen ein Ansprechen aufgrund des größeren Wirkungsprofils wahrscheinlicher ist. Die Wirkung ist bei Patienten in der chronischen Phase am besten und auch eine prophylaktische Gabe erscheint sinnvoll (Klyuchnikov et al. 2009).
- Adoptive Immuntherapie mit Spenderlymphozyteninfusionen (donor
lymphocyte infusion, DLI) um die Immunantwort der Spenderzellen gegen
auch nach der SZT verbliebene Leukämiezellen zu verstärken (Kolb et al. 1990).
1.6.4b Adoptive Immuntherapie mit DLI
Die adoptive Immuntherapie mit DLI für Patienten mit Rezidiven der CML nach SZT begann 1990 mit einem ersten Bericht über 3 mit DLI von ihrem ursprünglichen Spender behandelte Patienten, bei denen eine Remission nach der Behandlung beobachtet wurde (Kolb et al. 1990). Diese Ergebnisse wurden in zahlreichen Studien bestätigt und es wurden Versuche der Kombination bzw. Vorbehandlung der DLI mit Interleukin-2 (IL-2) (Slavin et al. 1996) oder humanem Granulozyten Kolonie-stimulierendem Faktor (recombinant human granulocyte colony stimulating factor, rhG-CSF) (Sica et al. 1995) unternommen. Anfangs wurden DLI nur bei Patienten, die Stammzellspenden von HLA-identischen Geschwistern erhalten hatten angewandt, nach einigen Jahren Routine wurde auch von DLI nach SZT von HLA-identischen, nicht verwandten Spendern berichtet. Die besten Ergebnisse werden bei Patienten beobachtet, die nur einen molekularen und/oder zytogenetischen Rückfall hatten (zwischen 82 und 100% komplette Remission je nach Studie). Bei den Patienten, die einen hämatologischen Rückfall erlitten, sprachen diejenigen deutlich besser auf die Therapie an, die sich in der chronischen Phase der Erkrankung befanden (Collins et al. 1997), (Shiobara et al. 2000). Für Patienten in späteren Phasen ist die Wirkung begrenzt, lässt sich aber durch vorherige Reduktion der Leukämiezellen durch Chemotherapie verbessern. Die DLI-Behandlung hat eine spät einsetzende (erste Wirkungen können nach etwa 2-3 Monaten beobachtet werden, die komplette Bandbreite der Wirkung kann aber erst nach einem Jahr beurteilt werden (Deol & Lum 2010), aber lang anhaltende Wirkung; der erste Patient, der vor über 20 Jahren so behandelt wurde, lebt immer noch in Remission (Kolb 2008). Die Wirkung der DLI beruht auf dem Spender-gegen-Leukämie-Effekt, Schwierigkeiten bereitet die oft gemeinsam auftretende Spender-gegen-Wirt-Reaktion.
1.7 Spender-gegen-Wirt-Reaktion
Spender-gegen-Wirt-Reaktionen (Graft-versus-host-disease, GvHD) können nach allogenen Stammzelltransplantationen und nach DLI als akute oder chronische Form
auftreten (Khoury et al. 2012). Etwa 60-80% der Patienten mit HLA-kompatiblem nicht verwandtem Spender erleiden eine mehr oder minder schwerer Form der GvHD (Derlin et al. 2014). Die akute GvHD wird in 4 Stadien nach Glucksberg unterteilt (Glucksberg et al. 1974), diese Einteilung wurde aber kontrovers diskutiert
(Przepiorka et al. 1995) und in einem Consensus Treffen des National Institutes of Health (NIH) wurde beschlossen, die GVHD insgesamt nach Symptomen und nicht nach dem Zeitpunkt der Manifestation zu klassifizieren, sodass die late-onset akute GVHD und das Overlapsyndrom als Kategorie der GVHD aufgenommen wurden. Tabelle 1 zeigt diese Klassifikation nach NIH Konsensus. Die late-onset akute GVHD tritt häufiger nach einem reduced-intensity conditioning (RIC) auf (Ferrara et al. 2009).
Tabelle 1
Kategorie Zeitpunkt nach
HSCT oder DLI Manifeste Zeichen der akuten GVHD Manifeste Zeichen der chronischen GVHD Akute GVHD
Klassische akute GVHD ≤ 100 Tage Ja Nein
Persistierende, rezidivierende
oder late-onset akute GVHD >100 Tage Ja Nein
Chronische GVHD
Klassische chronische GVHD Keine Grenzen Nein Ja
Overlapsyndrom Keine Grenzen Ja Ja
Tabelle 1: Klassifikation der GVHD nach NIH Konsensus (Filipovich et al. 2005)
Ihre Ursache liegt unter anderem in Unterschieden zwischen den HLA-Molekülen von Spender und Empfänger. Es gibt HLA-Moleküle der Klasse I, die auf allen kernhaltigen Zellen exprimiert und von CD8+-T-Zellen erkannt werden sowie HLA-Moleküle der Klasse II, die nur auf immunkompetenten Zellen exprimiert und von CD4+-T-Zellen erkannt werden. Diese Oberflächenantigene helfen dem Körper zwischen körpereigen und körperfremd zu unterscheiden. Je größer die Unterschiede zwischen Spender und Empfänger ausfallen, desto wahrscheinlicher ist eine GvHD, da die übertragenden T-Zellen des Spenders die Antigene, die ihnen von immunkompetenten Zellen des Empfängers in sekundären Lymphorganen präsentiert werden, als fremd erkennen. Daraufhin vermehren sich vom Spender abstammende naive T-Zellen und entwickeln sich zu Effektor T-Zellen, die dann vor allem im Gastrointestinaltrakt, der Leber, der Lunge und der Haut Entzündungsreaktionen auslösen (Joo et al. 2012). Die Hautmanifestation tritt häufig zuerst auf. Charakteristisch ist ein makulopapulöser Ausschlag, der sich auf dem ganzen Körper außer der Kopfhaut ausbreiten kann. In schweren Fällen kann es zu
Blasenbildung und Ulzerationen kommen. Eine gastrointestinale Beteiligung zeigt sich meist mit schleimigen, bis hin zu blutigen Diarrhoen, aber auch mit Erbrechen und abdominellen Krämpfen. Eine Lebermanifestation der GVHD ist oft schwer von anderen Komplikationen mit Leberbeteiligung, wie z. B. der veno-okklusiven Krankheit, Medikamententoxizität oder virale Infektion, zu unterscheiden und bleibt oft eine Ausschlussdiagnose (Ferrara et al. 2009). In Tabelle 2 und 3 werden die Stadieneinteilung und das Grading der akuten GVHD gezeigt.
Tabelle 2
Organ Haut Leber Gastrointestinal Trakt
Parameter Makulopapulöses Exanthem Gesamtbilirubin Diarrhoe
Stadium
1 <25% der Haut betroffen 2-2,9 mg/ dl 500-1000 ml/ Tag oder persistierende Übelkeit
Stadium
2 25-50% der Haut betroffen 3-6 mg/ dl 1000-1500 ml/ Tag
Stadium
3 >50% der Haut betroffen 6,1-15 mg/ dl >1500 ml /Tag
Stadium 4
Generalisiert, z. T.
Blasenbildung >15 mg/ dl
>2000 ml/ Tag und starke Schmerzen mit/ ohne Ileus
Tabelle 2: Akute GVHD Stadien Einteilung (Przepiorka et al. 1995)
Tabelle 3
Grad Haut Stadium Leber Stadium Gastrointestinal Trakt
Stadium
I 1 bis 2 0 0
II 3 oder 1 oder 1
III - 2 bis 3 oder 2 bis 4
IV 4 oder 4 4
Tabelle 3: Grading der akuten GVHD (Przepiorka et al. 1995)
Ein Spender sollte daher ein möglichst ähnliches HLA-Profil besitzen. Schon 1979 wurde erkannt, dass das Auftreten einer GVHD die Wahrscheinlichkeit eines Rezidivs verringert (Weiden et al. 1979). Insgesamt bestätigte sich, dass die chronische GVHD mit geringeren Rezidivraten, aber einer höheren TRM assoziiert ist (Lee et al. 2002).
Die firstline Therapie der aktuen GvHD (aGvHD) beinhaltet im Stadium I topische Glukokortikoide oder Calcineurininhibitoren. In fortgeschrittteneren Stadien wird
ebenfalls mit systemischen Glukokortikoiden behandelt. Die secondline Therapie bei steroidrefraktärer aGvHD wird nach Patienten- und Arztpräferenz, zu erwartenden Arzneimittelinteraktionen, Kosten und Praktikabilität ausgewählt. Es stehen zahlreiche Therapieoptionen zur Verfügung, jedoch ohne eindeutige prospektive Daten für eins dieser Agenzien. Verwendet werden u.a. niedrig dosiertes Methotrexat (MTX), Mycophenolat-Mofetil (MMF), extrakorporale Photopherese, CD3-, CD7-, CD25-, CD52-, CD147-, IL-2R-, IL-1- und TNFα-Antikörper, Antithymozytenglobulin (ATG) und mesenchymale Stammzellinfusionen (Qian et al. 2013). Zur Vorbeugung einer GvHD werden u.a. ATG, Calcineurininhibtoren, sowie MTX und MMF verwendet (Ferrara et al. 2009). Behandelt wird die chronische GvHD üblicherweise mit systemischen Kortikosteroiden. Durch Kombination mit Calcineurininhibitoren kann die Mortalität von Patienten mit niedrigen Thrombozytenzahlen gesenkt werden. Milde Formen der GvHD können auch mit topischen Immunsuppressiva behandelt werden, um negative Effekte der systemischen Gabe zu verhindern (Wolff et al. 2010).
1.8 Spender-gegen-Leukämie-Effekt
Der Spender-gegen-Leukämie- (Graft-versus-leukemia, GvL) Effekt wurde erstmals von Barnes et al. beschrieben. Es konnte gezeigt werden, dass bestrahlte leukämische Mäuse durch die Transplantation von allogenem, nicht aber von syngenem Knochenmark geheilt werden können (BARNES et al. 1956). Der GvL-Effekt wird wie der GvHD GvL-Effekt durch CD4+ und CD8+ T-Zellen vermittelt, wobei erstere hauptsächlich durch Fas-FasLigand induzierte Apoptose und letztere eher durch die Ausschüttung von Perforin und Granzym wirken (Hsieh & Korngold 2000). Von T-Zellen produzierte Zytokine wie IL-2, Interferon-γ (IFN-γ) und Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) potenzieren den Effekt durch Rekrutierung anderer Effektorzellen (Schmaltz et al. 2003). Auch Natural Killer Zellen (NK-Zellen) scheinen einen –wenn auch schwächeren- GvL-Effekt zu vermitteln, der im Gegensatz zu dem Effekt der T-Zellen aber vermutlich nur in den ersten ca. sechs Monaten zum Tragen kommt (Yu et al. 2009). Dieser Effekt funktioniert besonders in Fällen, bei denen dem
Empfänger ein HLA-I Allel fehlt, das der Spender besitzt. Dieses Mismatch führt dazu, dass es dem Empfänger an Liganden für Spender-inhibitorische Killer-Zell-Immunglobulin-Rezeptoren (KIRs) fehlt. Somit haben KIR-inkompatible NK-Zellen vermutlich einen größeren GvL-Effekt. (Ruggeri et al. 2002). Außerdem wurde der GvL-Effekt vermittelt durch IL-2 aktivierte NK-Zellen beschrieben (Hauch et al. 1990). Der genaue Mechanismus des GvL-Effektes ist noch nicht geklärt. Da er aber eng mit dem GvH-Effekt verknüpft ist, wird vermutet, dass ein ähnlicher Mechanismus zugrunde liegt. Die beiden Effekte treten oft gemeinsam auf, wobei ein guter GvL-Effekt oft mit einer chronischen GvHD einhergeht. Es gibt aber auch Fälle in denen der GvL-Effekt allein auftritt (Weiden et al. 1981). Abhängig ist der GvL-Effekt vor allem von Tumormasse und Stadium der Erkrankung. Somit funktioniert der Effekt am besten in der chronischen Phase der CML, in der die Zahl der leukämischen Zellen noch vergleichsweise niedrig ist. Genutzt wird dieser Effekt unter anderem beim RIC, bei der im Vorfeld der Stammzelltransplantation nur ein Teil der leukämischen Zellen durch Bestrahlung und/oder Chemotherapie zerstört wird und die verbliebenen Zellen dem GvL-Effekt überlassen bleiben. Diese Variante ermöglicht besonders älteren und multimorbiden Patienten, die eine myeloablative Konditionierung nicht verkraften würden, eine Stammzelltransplantation und somit mögliche Heilung ihrer Erkrankung (Storb 2009)
1.9 Kombination von DLI und TKI nach Rezidiv nach SZT
Den GvL-Effekt der DLIs zur Eradikation verbleibender Leukämiezellen nach SZT in Verbindung mit der einerseits immunsuppressiven, andererseits auch antileukämischen Wirkung der TKIs gemeinsam zu nutzen, erscheint als eine sinnvolle Option zur Behandlung von Rezidiven der CML nach SZT. Dabei reduziert der TKI den Großteil der Leukämiezellen, sodass eine zytogenetische Remission erreicht wird. Eine dauerhafte molekulare Remission ist allein durch TKI aber selten möglich, da leukämische Vorläuferzellen nicht komplett ausgelöscht werden und sich gerade nach Absetzen des Medikaments wieder vermehren und entdifferenzieren, sodass es zum Rezidiv kommt. Hier setzt dann die Wirkung der Spenderlymphozyten ein, die die wenigen verbleibenden Zellen abtöten und so zu einer molekularen Remission führen, die auch ohne Weiterführung der TKI anhält (Savani et al. 2005). Erfahrungen mit dieser Kombination sind minimal. 2002 wurde von einigen Patienten berichtet, die DLI’s im zeitlichen Abstand von 3-29 Monaten vor Imatinib-Behandlung erhielten. Die Behandlung war zwar gut verträglich, zeigte aber keine bessere
Wirkung als ohne die DLIs (Kantarjian et al. 2002). Insgesamt wurden DLIs und TKI meistens im Abstand von mehreren Monaten verabreicht und es gab keine negativen Auswirkungen der Kombination (Palandri et al. 2007). Savani et al. berichteten dagegen schon 2005 von einer konkurrierenden Gabe von Imatinib und DLI. Diese sowie auch die zeitverzögerte getrennte Gabe der Behandlungen zeigte eine deutlich schnellere und häufigere molekulare Remission im Vergleich zu DLI oder TKI-Gabe allein. Auch die Überlebensrate in der Kombinationsbehandlungsgruppe war höher (100%). GvHD Grad 1 entwickelte sich in weniger Fällen in der Kombinationsgruppe, als in der DLI Gruppe (2/11, 5/13). GvHD höheren Grades wurde überhaupt nicht beobachtet. Allerdings handelt es sich um eine kleine Studie mit nur 9-13 Patienten pro Gruppe (Savani et al. 2005). Inwiefern der oben beschriebene immunmodulatorische Effekt der TKI den GvH-Effekt, als auch den GvL-Effekt einschränkt, wurde bisher nicht geklärt.
1.10 Fazit
TKI der ersten und zweiten Generation sind für den Großteil der Patienten eine gute Behandlungsmöglichkeit, da sie eine gute Wirkung zeigen und mit relativ geringen Nebenwirkungen einhergehen. Für TKI-resistente Formen von Bcr-Abl befinden sich zahlreiche TKI der dritten Generation in Erprobung. Die Stammzelltransplantation erscheint immer noch als risikoreiche Option und wird daher seltener und meist zu späten Zeitpunkten im Krankheitsverlauf verwendet. Das führt zu einer hohen Rezidivrate, die wiederum mit TKI oder DLI allein oder in Kombination behandelt wird. Für junge Patienten in wenig fortgeschrittenem Krankheitsstadium und Patienten, die an einer TKI-resistenten Variante leiden, für die ein passender Spender zur Verfügung steht, bietet die SZT jedoch gute Heilungschancen und den Ausblick auf ein Leben ohne tägliche Medikamenteneinnahmen. Für Rezidive nach SZT stellt die Kombination von DLI und TKI eine vielversprechende Möglichkeit dar, die es zu testen gilt.
1.11 Mausmodelle
Es existieren bisher zahlreiche Mausmodelle zur Erforschung der CML-Behandlung. Sie reichen von s.c. Modellen, bei denen Leukämiezelllinien wie BAF-3-Zellen eingesetzt werden (O’Hare et al. 2008), über iv. Modelle mit injizierten Leukämiezelllinien wie K562 (Wicklein et al. 2013) bis hin zu Modellen, in denen retroviral transduzierte Stammzellen in zuvor bestrahlte Mäuse transplantiert werden
(Weisberg et al. 2007). Das in dieser Doktorarbeit genutzte Model wurde weiterentwickelt nach einem Mausmodell von Krause und van Etten (Krause & Van Etten 2004). Dieses beinhaltet einen gemischten Chimärismus und eine Bcr-Abl-positive myeloproliferative Erkrankung und wurde zur Erforschung der DLI Wirkung allein genutzt. In diesem Model stellen männliche Balb/c Mäuse die Spender dar, ihnen wird nach einer Vorbehandlung mit 5-Fluoruracil Knochenmark entnommen und dieses mit dem p210 BCR-ABL MSCV-IRES/GFP Retrovirus transduziert. Die Empfänger sind weibliche Balb/c, welche nach einer Bestrahlung mit 1200 cGy die transduzierten Zellen und im Verhältnis 1:150 untransduzierte T-Zell-depletierte Knochenmarkzellen von männlichen C57Bl/6 Spendern (total major histocompatibility
complex (MHC) -mismatch) erhalten. Dieses Verhältnis wird zur Induktion des
gemischten Chimärismus benötigt. Dieser sowie die myeloproliferative Erkrankung lassen sich nach 13 Tagen nachweisen und die Erkrankung kann mit DLIs aus männlichen C57Bl/6 behandelt werden. Um näher an der Patientensituation, deren Spender meistens gematchte Geschwister oder andere gematchte Spender sind, zu forschen, wurde ein ähnliches Modell beschrieben. Bei diesem wurde jedoch statt des C57Bl/6 Knochenmark, B10.D2 Knochenmark im Verhältnis 1:30, welches auf MHC-Ebene, nicht aber auf minor histocompatibility antigen (miHA)-Ebene zu den Balb/c gematcht war, verwendet. In diesem Modell verlängerten DLIs zwar das Überleben der Mäuse, aber geheilt werden konnten sie nicht. Dies suggeriert, dass in der mismatch-Situation die Wirkung der DLI deutlich stärker ist (Krause & Van Etten 2004).
All diese Modelle sind geeignet um die Wirkung von Behandlungen wie TKI und/oder DLI zu testen. Allerdings ist es mit ihnen, im Falle einer Kombinationstherapie unmöglich zu beurteilen, welcher Teil des Behandlungserfolgs von welcher Behandlung herrührt. Um den antileukämischen und evtl. immunsuppressiven Effekt der TKI und gleichzeitig, aber getrennt davon, die Wirkung der DLIs messen zu können, wird ein neues Mausmodell benötigt. Das in dieser Arbeit etablierte Modell enthält ebenfalls einen gemischten Chimärismus und eine Bcr-Abl-positive myeloproliferative Erkrankung. Es unterscheidet sich vom oben beschriebenen Modell aber insofern, als ein Teil der Erkrankung durch syngene mit dem Wildtyp-Bcr-Abl transduzierte Zellen und ein anderer Teil durch allogene mit der TKI-resistenten T315I Mutation transduzierte Zellen ausgelöst wird. Empfänger sind wiederum weibliche Balb/c Mäuse, die unbehandelte Knochenmarkspenden von
männlichen C57Bl/6, sowie Spenden für transduziertes Knochenmark von männlichen Balb/c (für die T315I Mutation) und C57Bl/6 Mäusen (für Wildtyp Bcr-Abl) erhalten. Sie entwickeln dann eine Erkrankung, die sich zum Teil (Bcr-Abl) durch TKI und zum Teil (T135I) durch DLI aus männlichen C57Bl/6 Milzen behandeln lässt. Für die Transduktion wurden γ-Retroviren genutzt, wobei die Wildtyp Bcr-Abl Variante mit einem GFP und die Bcr-Abl-T315I Variante mit einem Venus-Protein gekoppelt ist. Daher können per Durchflusszytometrie beide Teile der Erkrankung nachgewiesen werden und eine Zu- oder Abnahme der Erkrankung durch die Behandlung beurteilt werden. Getestet wurden verschiedene DLI Dosierungen, verschiedene Nilotinib (als TKI) Dosierungen, sowie die Kombination von beiden. Analysiert wurde der Therapieeffekt auf TKI-resistente und -sensitive CML-Zellen und klinische Zeichen der GvHD.
2. Fragestellung:
Es soll ein Mausmodell entwickelt und etabliert werden, welches es ermöglicht, die Wirkung von TKI und DLI simultan zur Entfaltung zu bringen und zu beurteilen. Dabei soll ein Knochenmarktransplantations-Mausmodell entwickelt werden, das einen gemischten Chimärismus und eine Bcr-Abl-positive chronisch myeloproliferative Erkrankung simultan in den Empfängermäusen etabliert, bei dem ein Teil der Erkrankung (syngen) nur durch die Wirkung der TKI und der andere Teil (allogen und TKI-resistent) durch immunkompetente Spenderzellen, aber nicht durch TKI eliminiert werden kann. In diesem Modell sollen dann TKI und Spenderlymphozyteninfusionen allein und in Kombination untersucht werden. Analysiert werden der Therapieeffekt auf TKI-resistente und -sensitive CML-Zellen und klinische Zeichen der GvHD.
3.Material und Methoden
3.1 Material
3.1.1 Geräte und Laborausstattung:
Abzug: Tee-onomic AZ 1500
Durchflusszytometer: Facs CantoII BD Fluoreszenzmikroskop Leitz Fluorovert FS Knopfkanüle gebogen, Luer Lock
Kompaktnetzteil Biometra Standard Powerpack P25
Kryoboxen inkl. Rastereinsatz, Pappe, Hassa Laborbedarf, Lübeck Kryoboxen, Plastik
Kühlschränke: 4°C Liebherr profi line, -20°C Privileg, -20°C Siemens, -80°C Heraeus Hera freeze HFU688Top
Mikroskop invers Olympus CKX41 Mikrowelle Bosch
Neubauer Zählkammer, improved, Assistent, Sondheim, Germany
PCR-Geräte: Eppendorf Mastercycler gradient, Biometra UNO-Thermoblock
Pipetten: Eppendorf Research 10, 20, 100, 200, 1000µl Gilson Pipetman 2, 10, 20, 200, 1000µl
Pipettierhilfe: Hirschmann Pipetus, Stripettor Costar, IBS Pipetboy acu Integra Bioscience
Reagenzglasgestell, Biochrom, Berlin Reagenzglasständer, Biochrom, Berlin
Reaktionsgefäßständer, Neolab, Heidelberg und Omnilab, Bremen Sicherheitswerkbank „Herasafe“ Klasse II HS18 Heraeus Instruments Spectrophotometer: Nanodrop 1000, Peqlab
Steriles Besteck: Pinzette und Schere, Hammacher, Solingen Thermomixer compact und comfort, Eppendorf, Hamburg
Tischzentrifugen: Heraeus Biofuge pico, Eppendorf Centrifuge 5417R Ultraschallbad Sonorex TK22, Bandelin, Berlin
Vortexer: Janke&Kunkel VF2, Heidolph
Waagen: Sartorius TI5412, Sartorius MC1 und LC6205 Wasserbad 37°C, GFL
Wecker: Beckmann Coulter “Timer Countdown” Zellseperatoren: MACS, Multistand 2fach und 4fach
Zentrifugen: Heraeus Megafuge 1.OR, Sigma 6K10, Sorvall RC5C Plus
3.1.2 EDV:
Microsoft® Office Professional Edition 2003, Microsoft Corporation, Redmond, USA pDRAW, Acaclone Software
3.1.3 Verbrauchsmaterialien:
Cellstrainer 70µm, Nylon, BD, Franklin Lakes, USA
Einwegkanülen: Microlance 3, steril 0,45mm*13mm und Eclipse 0,8mm*40mm, BD Franklin Lakes, USA
Einwegspritzen 1ml, 20ml, 50ml latexfrei Omnifix, Braun, Melsungen Filter Millex HV 0,45µm 33mm PVDF, Hassa Laborbedarf, Lübeck Flow Cytometry Röhren, Sarstedt, Nürnbrecht-Rommelsdorf
Gewebekulturschalen, 100*20mm, Sarstedt, Nürnbrecht-Rommelsdorf
Handschuhe: Nitrile Powder Free Blue, Aurelia, Supermax Healthcare Inc, Aurora, USA und Peha-soft satin, Hartmann, Heidenheim
Kapillaren, bds offen AD 1,0 LG 75mm, Hirschmann, Schalksmühle Kryoeinfriergerät: Mister Frosty, Schmidt Laborgeräte, Wien, Austria Kryotubes 1ml, 2ml, Nunc, Langenselbold
Lanzetten Accu-Ceck Softelix XL, Roche Diagnostics, Grenzach-Wyhlen Op-Tücher, steril, Barrier, Göteborg
PCR-Rack, Carl Roth, Karlsruhe
Plastik-Stabpipetten 2 ,5, 10, 25ml Falcon, BD, Franklin Lakes, USA Pipettenspitzen 10, 200, 1000µl, Sarstedt, Nürnbrecht-Rommelsdorf Plastikröhrchen 15, 50ml Falcon, BD, Franklin Lakes, USA
Reaktionsgefäße 0,5, 1,5, 2ml Eppendorf, Hamburg
Weißdeckeltubes, Röhrchen PS 30ml, Greiner bio-one, Frickenhausen
Zellkulturflaschen, cellstar® tissue culture flasks Greiner bio-one, Frickenhausen -white filter cap, PS, 50 ml/250ml - für Suspensionszellen
-red filter cap, PS, 50 ml/250ml- für adhärent wachsende Zellen
Zellkulturplatten: 6-Well, 12-Well, 24-Well, 96-Well, Greiner bio-one, Frickenhausen Zellseperationssäulen MACS 25LS, MiltenyiBiotec, Gladbach
3.1.4a Chemikalien
Ampicillin Natriumsalz 10g, Th. Geyer, Renningen Baytril, Bayer AG, Leverkusen
Chloroquine
Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck, Darmstadt
DNA-Marker, 1kb Plus Gene ruler, Fermentas, St. Leon-Rot dNTPs Set 4*100µmol, Fermentas, St. Leon-Rot
DMEM, Life Technologies Invitrogen, Carslbad, USA Ethanol 70%, 80%, vergällt TH. Geyer, 100% reinst FACSFlow™ Becton Dickinson, Heidelberg
Fötales Kälberserum (FKS) Gibco
Glycogen, MB Grade, Roche Diagnostics, Grenzach-Wyhlen Hepes Sigma, Life Technologies Invitrogen, Carslbad, USA
Hepes-buffered-saline (HBS)-Puffer, Life Technologies Invitrogen, Carslbad, USA Isopropanol J. T. Baker, Griesheim
LB-Medium (Lennox) 1kg, Th. Geyer, Renningen
L-Glutamin 200MM, Life Technologies Invitrogen, Carslbad, USA Millipore-Wasser
N-Methyl-2-pyrrolidon
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) Invitrogen, Karlsruhe
Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco’s CA MG, Life Technologies Invitrogen, Carlsbad, USA
Polybrene = Hexadimetrin-Bromid, Sigma, Steinheim Polyethylenglykol 300, Sigma Aldrich Chemie, St. Gallen Polymerasen: Dream-Taq, Fermentas, St. Leon-Rot Retronektin, Lonza, Basel
RPMI 1640 Medium Liquid, Life Technologies Invitrogen, Carlsbad, USA Sodium Pyruvat MEM, Life Technologies Invitrogen, Carlsbad, USA Stemspan SFEM Medium, Stemcell Technologies, Grenoble, France T4 DNA Ligase, Fermentas, St. Leon-Rot
Trypan-Blau (0,4 %) Sigma, Deisenhofen
Trypsin/EDTA 0,05 %, Life Technologies Invitrogen, Carlsbad, USA
Versuchssubstanz: Nilotinib: NVP-AMN107-AA, Novartis Institutes for BioMedical Research, Oncology
3.1.4b Puffer:
Macs-Puffer (PBS + 0,5 BSA und 2mM EDTA) Blockpuffer (2% BSA in PBS)
Erythrozytenlysepuffer (8,3g NH4Cl, 1,0g KHCO3, 0,0372g Mg-Titriplex auf 1l
Wasser + mit 5M KOH auf pH 7,4 einstellen)
3.1.5 Kits:
Lineage Cell Depletion Kit (mouse), MiltenyiBiotec, Gladbach CD3e Microbeads Kit (mouse), MiltenyiBiotec, Gladbach Miniprep Kit, Qiagen, Hilden
Qiamp DNA Blood Mini und Micro Kit, Qiagen, Hilden Qiaprep Spin Mini und Maxiprep, Qiagen, Hilden Qiaquick Gelextraktionskit, Qiagen, Hilden
3.1.6 Zytokine:
Cocktail A:
SCF recombinant murine 10µg, Peprotech, USA
Fl+3-Ligand recombinant human, 10µg, Peprotech, USA IL-11 recombinant human, 10µg, Peprotech, USA
IL-3 recombinant human, 10µg, Peprotech, USA Cocktail B:
SCF recombinant murine 10µg, Peprotech, USA TPO recombinant murine 10µg, Peprotech, USA
FGF-acidic recombinant human 10µg, Peprotech, USA IGF2, recombinant murine 50µg, Peprotech, USA
3.1.7 Primer:
für die PCR und die Kontrollsequenzierungen wurden spezielle Primer designt, hierfür wurde die Software der Firma Eurofins MWG Operon genutzt, hier wurden die Primer ebenfalls bestellt. Primersequenzen:
bcrabl3: 5`-TGGGTCCCAAGCAACTACATCAC CS697: 5'-TGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGT Bcrabl Blut rev: GCACACCGGCCTTATTCCAAGC Bcrabl14: GAAATCAGTGACATAGTGCAGAGG Bcrabl18: 5’- TTTCCACCCAAATCAAGAGC Bcrabl19: 5’- ACAGTGGCTGACAAGGGACT
