Zentrum für Innere Medizin
III. Medizinische Klinik: Nephrologie/Rheumatologie mit Sektion Endokrinologie
Direktor: Prof. Dr. med. Rolf A. K. Stahl
Untersuchungen zur Funktion von ATP-Binding Cassette Transporter A1
(ABCA1) im HDL-Stoffwechsel in vivo
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin an der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg
vorgelegt von
Björn Stahmer geboren in Mannheim
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Angenommen von der
Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg am: 16.04.2014
Veröffentlicht mit Genehmigung der
Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg
Prüfungsausschuss, der/die Vorsitzende: Prof. Dr. F. Rinninger
Prüfungsausschuss, zweite/r Gutachter/in: PD Dr. J. Aberle
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Inhaltsverzeichnis
1!
Einleitung ... 5!
1.1! HDL&Cholesterin1und1der1Reverse1Cholesterol1Transport1...15! 1.2! High1Density1Lipoprotein1(HDL)1...15! 1.2.1! Struktur!und!Zusammensetzung!von!HDL!...!5! 1.2.2! Funktion,!Eigenschaften!und!Stoffwechsel!von!HDL!...!6! 1.3! ATP&Binding1Cassette1Transporter1A11(ABCA1)1...18! 1.3.1! Aufbau!und!Struktur!von!ABCA1!...!8! 1.3.2! Funktion!und!Eigenschaften!von!ABCA1!...!10! 1.4! Scavenger1Receptor1Class1B1Type1I1(SR&BI)1...112! 1.4.1! Aufbau!und!Struktur!von!SRLBI!...!12! 1.4.2! Funktion!und!Eigenschaften!von!SRLBI!...!13! 1.5! Zielsetzung1dieser1Arbeit1...114! 1.5.1! ABCA1!und!der!HDLLStoffwechsel!der!Maus!...!14! 1.5.2! SRLBILExpression!der!Leber!bei!Mäusen!mit!veränderter!ABCA1LExpression!...!15!2!
Material und Methoden ... 16!
2.1! Mauslinien1...116! 2.1.1! Genehmigungen!für!Tierexperimente!...!16! 2.2! Bestimmung1von1Proteinkonzentrationen1...117! 2.3! Präparation1von1Zellmembranen1aus1Lebergewebe1...118! 2.4! Polyacrylamid&Gel&Elektrophorese1(PAGE)1...119! 2.5! Immunoblot1...120! 2.6! Cholesterin&Bestimmung1im1Plasma1...123! 2.7! HDL&Cholesterin&Bestimmung1im1Plasma1...124! 2.8! Markierung1von1HDL1mit1zwei1radioaktiven1Markern1...125! 2.9! Lipidextraktion1nach1Dole1...127! 2.10! Durchführung1der1In1vivo&Experimente1...128! 2.10.1!Orale!Behandlung!von!Mäusen!mit!T0901317!(Tularik)!...!29! 2.10.2!Berechnung!der!Fractional!Catabolic!Rates!(FCR)!...!30! 2.10.3!Statistik!...!31!
3!
Ergebnisse ... 32!
3.1! ABCA11und1der1HDL&Stoffwechsel1der1Maus1...132! 3.2! Untersuchungen1zum1HDL&Stoffwechsel1der1Maus1...133!Ei nle itu ng 3.2.1! PlasmaLCholesterinspiegel!und!hepatische!ABCA1LExpression!bei!Mäusen!! mit!induzierter!Überexpression!von!ABCA1!...!33!
3.2.2! Stoffwechsel!von!125ILTCL/[3H]CEtLHDL!im!Plasma!von!Mäusen!! mit!Überexpression!von!ABCA1!...!35!
3.2.3! Aufnahme!von!125ILTCL/[3H]CEtLHDL!durch!Gewebe!von!Mäusen!! mit!Überexpression!von!ABCA1!...!38!
3.2.4! PlasmaLCholesterinLSpiegel!von!Mäusen!mit!ABCA1LDefizienz!...!40!
3.2.5! Stoffwechsel!von!125ILTCL/[3H]CEtLHDL!im!Plasma!von!Mäusen!! mit!ABCA1LDefizienz!...!40!
3.2.6! Aufnahme!von!125ILTCL/[3H]CEtLHDL!durch!Gewebe!von!Mäusen!! mit!ABCA1LDefizienz!...!41!
3.2.7! Stoffwechsel!von!125ILTCL/[3H]CEtLHDL!im!Plasma!bei!Mäusen!! mit!leberspezifischer!ABCA1LDefizienz!...!45!
3.2.8! Aufnahme!von!125ILTCL/[3H]CEtLHDL!durch!Gewebe!von!Mäusen!! mit!leberspezifischer!ABCA1LDefizienz!...!48! 3.3! Hepatische1SR&BI&Expression1von1Mäusen1mit1veränderter1ABCA1&Expression1...150! 3.3.1! Hepatische!Expression!von!SRLBI!bei!Mäusen!mit!Überexpression!von!ABCA1!...!50! 3.3.2! Hepatische!Expression!von!SRLBI!bei!Mäusen!mit!ABCA1LDefizienz!...!51! 3.3.3! Hepatische!Expression!von!SRLBI!bei!Mäusen!! mit!leberspezifischer!ABCA1LDefizienz!...!52!
4!
Diskussion ... 53!
4.1! HDL&Stoffwechsel1bei1Mäusen1mit1Überexpression1von1ABCA11...155! 4.2! HDL&Stoffwechsel1bei1Mäusen1mit1ABCA1&Defizienz1...156! 4.3! SR&BI1in1Tiermodellen1mit1veränderter1ABCA1&Expression1...157! 4.4! Ausblick1...158!5!
Zusammenfassung ... 59!
6!
Abkürzungen ... 60!
7!
Literaturverzeichnis ... 63!
8!
Danksagung ... 75!
9!
Lebenslauf ... 76!
10!Erklärung ... 77!
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1 Einleitung
1.1 HDL-Cholesterin und der Reverse Cholesterol Transport
Niedrige Spiegel von High Density Lipoprotein (HDL) sind ein Risikofaktor in der Genese von kardiovaskulären Erkrankungen beim Menschen (Gordon und Rifkind 1989). Verschiedene epidemiologische Studien, z. B. die Framingham-Studie (Castelli et al. 1986) oder die PROCAM-Studie (Assmann und Schulte 1987), konnten zeigen, dass ein inverser Zusammenhang zwischen HDL-Plasmaspiegeln und dem Risiko für das Auftreten der koronaren Herzerkrankung (KHK) beim Menschen besteht. Diese Beziehung ist wahrscheinlich auf die zentrale Funktion von HDL im sogenannten Reversen Cholesterol Transport (RCT) zurückzuführen (von Eckardstein et al. 2001). Unter RCT versteht man die Aufnahme von unverestertem Cholesterin aus extrahepatischen Geweben, z. B. der Gefäßwand, durch HDL-Vorläuferpartikel und „reifes“ HDL. Dieses mit HDL-Partikeln assoziierte Cholesterin wird im Plasma durch das Enzym Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase (LCAT) verestert. Von der Leber werden die HDL-assoziierten Cholesterinester (CE) schließlich aufgenommen und über die Galle aus dem Körper eliminiert (Glomset 1968; Fielding und Fielding 1995). Die Beschreibung von Scavenger Receptor Class B Type I (SR-BI) und ATP-Binding Cassette Transporter A1 (ABCA1), die im HDL-Stoffwechsel eine physiologische Bedeutung haben, hat dazu beigetragen dass der RCT besser verstanden wird (Acton et al. 1996; Fitzgerald et al. 2001).
1.2 High Density Lipoprotein (HDL)
1.2.1 Struktur und Zusammensetzung von HDLHumanes HDL ist mit einer Dichte (d) von d = 1,063 bis 1,210 g/ml und einer Größe von 5 bis 17 nm der kleinste Partikel aus der Lipoprotein-Familie von Säugetieren, weiterhin hat er die höchste Dichte (von Eckardstein et al. 1994). Das Molekulargewicht eines HDL-Partikels beträgt zwischen 200.000 und 400.000 Dalton (Eisenberg 1984). Größe, Dichte und Molekulargewicht sind abhängig von der Menge an Lipid und Protein, mit welcher HDL beladen ist. Auf der Basis von Unterschieden in der Dichte bzw. der Zusammensetzung kann HDL durch Ultrazentrifugation in die Subklassen HDL2 (d=1,063-1,125 g/ml) und HDL3
(d=1,125-1,21 g/ml) differenziert werden (Havel et al. 1955; Patsch et al. 1974). HDL hat, in Analogie zu anderen Lipoprotein-Fraktionen, einen hydrophoben Kern, in dem die schlecht
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wasserlöslichen CE und in quantitativ geringem Maße Triglyzeride (TG) enthalten sind und eine hydrophile Hülle; letztere besteht aus den bipolaren Phospholipiden (PL), aus unverestertem oder freiem Cholesterin (FC) und aus Protein (Eisenberg 1984). Die verschiedenen mit HDL-assoziierten Proteine werden als Apolipoproteine (Apo) bezeichnet. Die Enzyme LCAT und das Cholesterin-Ester-Transfer-Protein (CETP) sind weiterhin in quantitativ geringem Ausmaß mit HDL assoziiert. Funktionell vermittelt das Enzym LCAT die Veresterung von HDL-assoziiertem Cholesterin. CETP vermittelt vorwiegend den Transfer von HDL-assoziierten CE zu ApoB-haltigen Lipoproteinen; gleichzeitig werden TG von ApoB-haltigen Partikeln zu HDL transferiert (Eisenberg 1984; Francone et al. 1996).
Apolipoproteine sind Strukturproteine von Lipoproteinen einerseits und interagieren mit Zelloberflächen oder Enzymen andererseits. HDL enthält eine Vielzahl unterschiedlicher Apolipoproteine, z. B. Apolipoprotein A-I (ApoA-I), A-II (ApoA-II), A-IV (ApoA-IV), C-I (ApoC-I), C-II (ApoC-II), C-III (ApoC-III), D (ApoD), E (ApoE) und F (ApoF) (Eisenberg 1984). Quantitativ dominieren ApoA-I und ApoA-II.
ApoA-I wird in der Leber und im Darm synthetisiert. Dieses Protein findet sich auf nahezu jedem HDL-Partikel und stellt quantitativ das Hauptstrukturprotein dieser Lipoprotein-Fraktion dar. ApoA-I ist mit dem jeweiligen Partikel nicht fest assoziiert sondern kann als mobiles Apolipoprotein zwischen verschiedenen HDL-Molekülen ausgetauscht werden (Eisenberg 1984). ApoA-II ist das quantitativ zweithäufigste Apolipoprotein von HDL und findet sich auf etwa zwei Drittel aller Partikel. ApoA-I und ApoA-II sind nicht nur für die Struktur von HDL, sondern auch bei der Bindung an Rezeptoren und bei der Aktivierung von Enzymen von Bedeutung (Eisenberg 1984; von Eckardstein et al. 2005).
1.2.2 Funktion, Eigenschaften und Stoffwechsel von HDL
HDL-Vorstufen, z. B. lipid-arme ApoA-I Moleküle, werden von Hepatozyten und Zellen der Darmmukosa synthetisiert (Castle et al. 1991; Danielsen et al. 1993). Neben HDL ist ApoA-I auch mit Chylomikronen und Very Low Density Lipoproteinen (VLDL) assoziiert. Bei der Hydrolyse von TG von diesen Lipoprotein-Fraktionen durch die Lipoprotein Lipase (LpL) (Musliner et al. 1991) oder bei der HDL-Modifikation mittels CETP (Francone et al. 1996), Phospholipid-Transfer-Protein (PLTP) (von Eckardstein et al. 1996) und Hepatischer Lipase (HL) (Barrans et al. 1994) wird ApoA-I freigesetzt. Diese ApoA-I Moleküle können sich wiederum mit HDL-Partikeln assoziieren (Abbildung 1).
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Funktionell führt die Interaktion zwischen lipidarmem ApoA-I und dem ATP-Binding Cassette Transporter A1 (ABCA1) zum Efflux von PL und unverestertem Cholesterin aus Hepatozyten, Makrophagen und verschiedenen anderen Zellen (Wang et al. 2000). Hierbei entstehen die diskoidalen HDL-Vorstufen. Letztere reifen durch die kontinuierliche Aufnahme von PL und Cholesterin bzw. durch die enzymatische Veresterung von Cholesterin durch das Enzym LCAT zu sphärischen HDL3-Partikeln. Aus HDL3 entstehen durch weitere
Anreicherung von Cholesterin bzw. CE (nach Veresterung) in den Partikel-Kern die lipidreicheren HDL2 (Lusa et al. 1996; Rye et al. 1999). HDL und damit assoziierte CE
werden über verschiedene Mechanismen in die Leber aufgenommen (Abbildung 1). In einem inzwischen gut charakterisierten Stoffwechselweg der hepatischen Lipidaufnahme ist SR-BI ein Schlüsselmolekül (Acton et al. 1996; Rigotti et al. 1995; Rigotti et al. 1997). SR-BI vermittelt die selektive CE-Aufnahme durch Zellen, d. h. CE-Moleküle der HDL-Partikel werden selektiv in die Leberzelle transferiert, also unabhängig von der Aufnahme des ganzen HDL-Partikels (Brundert et al. 2005). Ein alternativer Mechanismus für die HDL-CE-Aufnahme der Leber ist die sogenannte Holopartikel-HDL-CE-Aufnahme. Bei letzterer werden ganze HDL-Partikel diesem Organ direkt zugeführt. Auf molekularer Ebene ist die Holopartikel-Aufnahme bisher nicht charakterisiert. Im indirekten Stoffwechselweg der Lipidaufnahme durch die Leber werden beim Menschen und beim Kaninchen HDL-assoziierte CE im Austausch mit TG auf ApoB-haltige Lipoproteine übertragen (Chylomikronen, VLDL, IDL, LDL). Diese Transferreaktion wird durch CETP vermittelt. ApoB-haltige Lipoproteine, welche CE enthalten die von HDL stammen, werden schließlich über den LDL-Rezeptor von der Leber aufgenommen und danach weiter metabolisiert (Tall et al. 2000). Cholesterin und Phosphatidylcholin werden über ABCG5, ABCG8 (Cholesterin) und ABCB4 (Phosphatidylcholin) direkt in das Darmlumen abgegeben und von der Leber über die Galle ausgeschieden (Schmitz et al. 2001; von Eckardstein et al. 2005; Wang et al. 2010). Bei den vielseitigen Abbauvorgängen von HDL entstehen wiederum lipidarme ApoA-I oder lipidarme prä-ß-HDL (Rye et al. 1999), die entweder erneut dem HDL-Stoffwechselweg zugeführt werden oder in der Niere filtriert und ausgeschieden werden (von Eckardstein et al. 2005) (Abbildung 1).
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1.3 ATP-Binding Cassette Transporter A1 (ABCA1)
1.3.1 Aufbau und Struktur von ABCA1Die Familie der ATP-Binding Cassette Transporter (ABC-Transporter) bildet eine große Gruppe von strukturell ähnlichen Proteinen, die funktionell vorzugsweise Substanzen über die zelluläre Plasmamembran hinweg transportieren. ABC-Transporter werden in 7 Unterklassen eingeteilt, die als ABCA bis ABCG bezeichnet werden (Dean et al. 2001). Mutationen in den Genen von ABC-Transportern führen zu vielfältigen Erkrankungen, darunter beispielsweise Zystische Fibrose, Makuladegeneration und Störungen des Lipid- und Lipoprotein-Stoffwechsels. Allen ABC-Transportern ist gemeinsam, dass sie Adenosintriphosphat (ATP) als energiereiches Substrat benötigen. ABC-Transporter kommen als komplette Transporter und als halbe Transporter vor. Komplette Transporter bestehen aus zwei identischen Untereinheiten, die kovalent miteinander verbunden sind. Halbe Transporter bestehen aus einem Teil und bilden aktive Heterodimere oder Homodimere (Dean et al. 2001).
ABCA1 enthält 2261 Aminosäuren (AS) (Fitzgerald et al. 2001). Dieses Protein ist ein kompletter Transporter. ABCA1 enthält zwei transmembranöse Domänen, welche aus jeweils
Abbildung 1 – HDL-Stoffwechsel. HL=hepatische Lipase.
PLTP=Phospholipid-Transfer-Protein. CETP=Cholesterin-Ester-Transfer-Protein. LCAT=Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase. LPL=Lipoprotein Lipase (modifiziert nach von Eckardstein et al. 2001). liver peripheral cell holoparticle uptake
apoA-I
pre-ß1-HDL HDL3 VLDL chylomicrons LPL CETP, HL/EL se lectiv e u ptake CHOL CHOL dir ec t p ath w ay in dir ec t p ath w ay LCAT LCAT PLTP PLTP surface remnants ABCG8 intestine ABCG5 ABCB11 HDL3 ki dn eyEi
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6 Helices und einer Nukleotid-bindenden Domäne (NBD) zusammengesetzt sind (Fitzgerald et al. 2001) (Abbildung 2). In der NBD finden sich spezifische Protein Signaturen: Walker A, Walker B und Walker C. Walker A und Walker B finden sich vor allem in Proteinen die ATP verstoffwechseln. Walker C findet sich ausschließlich in ABC-Transportern. ABCA1 besitzt ein N-terminales Ende im Zytosol und zwei große extrazelluläre Schleifen. Diese sind stark glykosyliert und durch Cystin-Bindungen verbunden (Bungert et al. 2001; Oram und Heinecke 2005) (Abbildung 2). ABCA1 wird in zahlreichen Geweben exprimiert. Beim Menschen finden sich hohe Konzentrationen von ABCA1 in der Leber, in den Nebennieren, in den Lungen, im Dünndarm, in der Plazenta und in Makrophagen (Kielar et al. 2001; Lawn et al. 2001). S S C N NBD-1 NBD-2 Walker A Walker C Walker B Walker A Walker C Walker B
Abbildung 2 – Modell von ABCA1. S-S steht für die Disulfid-Brücke. NBD-1 und
NBD-2 stehen für die nukleotid-bindenden Domänen, die die Walker A, B und C Domänen enthalten (nach Oram und Heinecke 2005).
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1.3.2 Funktion und Eigenschaften von ABCA1
ABCA1 vermittelt den Efflux von Cholesterin, PL und anderen lipophilen Molekülen aus Zellen. Extrazellulär werden diese Substanzen schließlich von HDL-Vorläufer- und von reiferen HDL-Partikeln übernommen (Oram 2003). Im Hinblick auf die molekular gut definierte Funktion und Struktur anderer ABC-Transporter wird vermutet, dass der Funktion von ABCA1 nachfolgend genannter Mechanismus zugrunde liegt. Danach bildet ABCA1 einen Kanal in der Plasmamembran und erleichtert durch letzteren den Transport von Lipiden von der inneren auf die äußere Seite der Zellmembran. Bei diesem Prozess wird ATP verbraucht (Oram 2003).
Die Expression von ABCA1 wird reguliert. Ein intrazellulärer Anstieg von Cholesterin steigert die Expression dieses Transportproteins. Oxysterole und Retinoic Acid binden an den Liver X Receptor (LXRα und LXRβ) und den Retinoid X Receptor (RXR). LXR und RXR binden an Domänen im Bereich des ABCA1-Gen-Promotors und aktivieren die Transkription von ABCA1 (Repa und Mangelsdorf 1999). Als synthetische LXR-Agonisten von ABCA1 stehen z. B. T0901317 und GW3965 zur Verfügung (Joseph et al. 2002). Es sind weitere Stimulatoren der nukleären Rezeptoren beschrieben worden. Unter anderem zeigte die Inkubation von Makrophagen mit 8-bromo-cAMP einen gesteigerten Cholesterinefflux und eine gesteigerte Expression von ABCA1 (Oram et al. 2000). Es sind eine Reihe weiterer Transkriptionsfaktoren bekannt, die unabhängig von LXR und RXR die Expression von ABCA1 regulieren (Oram et al. 2000).
Wichtig für die Definition der Funktion von ABCA1 im Lipid-Stoffwechsel waren einerseits natürliche Mutationen, die bei Patienten vorkommen (Fredrickson et al 1961; Brooks-Wilson et al. 1999; Rust et al. 1999). Andererseits erbrachten Experimente mit Zellkulturen und mit genetisch veränderten Tieren wichtige Schlussfolgerungen zur Rolle von ABCA1 im Stoffwechsel in vitro und in vivo (Vaisman et al. 2001; Singaraja et al. 2002; Wellington et al. 2003)
Die Tangier-Krankheit (TD) ist eine autosomal-rezessiv vererbte Erkrankung, die mit sehr niedrigen HDL-Plasmaspiegeln und mit Cholesterinablagerungen in Gewebsmakrophagen einhergeht (Brooks-Wilson et al. 1999). Diese Erkrankung wurde 1961 erstmals beim Menschen als familiäres HDL-Defizienzsyndrom auf Tangier Island, Chesapeake Bay, USA,
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beschrieben (Fredrickson et al. 1961). Bei diesen Patienten wurden Mutationen im ABCA1-Gen nachgewiesen (Brooks-Wilson et al. 1999). Als Folge dieser Mutationen akkumulieren Cholesterin und PL in Zellen. Nach einer Hypothese werden lipidarme HDL-Vorläuferpartikel bei TD unzureichend mit Lipiden beladen; wohl deshalb werden diese „unreifen“ HDL mit einer erhöhten Rate katabolisiert (Batal et al. 1998). Klinisch zeigen Tangier Patienten vielfach eine vorzeitige Manifestation einer Arteriosklerose, beobachtet wird weiterhin häufig auch eine Hepatosplenomegalie (Serfaty-Lacrosniere et al. 1994). Verschiedene Mutationen im ABCA1-Gen konnten im Jahr 1999 als molekulares Korrelat dieser Erkrankung identifiziert werden (Bodzioch et al. 1999; Rust et al. 1999).
Untersuchungen zum HDL-Metabolismus erfolgten bei Tangier Patienten in vivo (Schaefer et al. 1978). Bei diesen Studien wurden HDL-Partikel verwendet, die konventionell mit radioaktivem Iod markiert waren. Bei Tangier Patienten bzw. bei ABCA1-Mutationen war der HDL-Proteinkatabolismus beschleunigt (Schaefer et al. 1978). Aussagekräftige in vivo Studien mit HDL, bei welchem auch die dominierende Lipidkomponente, nämlich CE, markiert ist, liegen bisher nicht vor.
Im Tiermodell bzw. bei Mäusen mit genetisch induzierter vollständiger Defizienz von ABCA1 (ABCA1-KO) konnte gezeigt werden, dass induzierte Mutationen im ABCA1-Gen bzw. dass eine vollständige Defizienz von ABCA1 zu einem sehr ähnlichen Phänotyp führt wie bei TD beim Menschen (McNeish et al. 2000; Aiello et al. 2003). Eine Überexpression von ABCA1 in stabil transgenen Mäusen führt hingegen zu erhöhten HDL-Spiegeln (Singaraja et al. 2002; Joyce et al. 2003). Die leberspezifische Überexpression von ABCA1 mittels Adenovirus führt ebenfalls zu erhöhten HDL-Plasmaspiegeln bei der Maus (Wellington et al. 2003). Letztere Untersuchungen führen zu der Schlussfolgerung, dass die ABCA1-Expression in der Leber maßgeblich die Höhe des HDL-Spiegels im Plasma reguliert.
Untersuchungen zum HDL-Katabolismus bei leberspezifischen ABCA1-KO-Mäusen zeigen dass der Abbau von HDL-Protein bei diesen Tieren erhöht ist im Vergleich zur Kontrolle (Timmins et al. 2005). Eine Aussage zum Metabolismus des HDL-Lipidanteils kann in dieser Studie nicht gemacht werden. Im Gegensatz hierzu zeigen in vivo Untersuchungen an ABCA1-TG-Mäusen einen reduzierten HDL-Proteinkatabolismus (Vaisman et al. 2001).
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Diese Untersuchungen konnten keinen signifikanten Einfluss von ABCA1 auf den Katabolismus des HDL-Lipidanteils feststellen.
Zusammenfassend haben Studien an menschlichen HDL-Defizienzsyndromen, in kultivierten Zellen und in genetisch veränderten Mausmodellen gezeigt, dass ABCA1 maßgeblich für den Efflux von Cholesterin und PL aus Zellen verantwortlich ist. In vivo hat ABCA1 einen wesentlichen Effekt auf die Höhe der Spiegel im Plasma und auf den HDL-Stoffwechsel in der Zirkulation.
1.4 Scavenger Receptor Class B Type I (SR-BI)
1.4.1 Aufbau und Struktur von SR-BIScavenger Receptor Class B Type I (SR-BI) wurde 1996 erstmals beschrieben und gehört wie CD36 zur Familie der Scavenger Rezeptoren (Acton et al. 1996; Febbraio et al. 2001). SR-BI ist ein Glykoprotein welches aus 509 Aminosäuren (AS) besteht. Das SR-BI-Gen liegt auf Chromosom 12q24.2-qter und hat 13 Exons (Cao et al. 1997). Die Aminosäuren-Sequenz von SR-BI ist bei Hamster, Maus, Ratte, Rind und Menschen zu 75 bis 80 % identisch (Cao et al. 1997). Strukturell bildet SR-BI eine große extrazelluläre Schleife (ca. 403 AS), die an beiden Enden transmembranöse Domänen besitzt. An letztere schließen sich endständig ein kurzes N-terminales (ca. 8 AS) und ein C-terminales Ende (ca. 45 AS) an. Die extrazelluläre Domäne enthält 6 Cystin-Reste und ist an vielen Stellen N-glykosyliert (Babitt et al. 1997) (Abbildung 3). Durch die ausgeprägte Glykosylierung ist das erwartete Molekulargewicht anhand der AS-Sequenz (57 kDa) von dem durch immunochemische Methoden nachgewiesene Gewicht (87 kDa) verschieden (Babitt et al. 1997; Rigotti et al. 1997; Krieger 1999). SR-BI wird vor allem in der Leber, den Nebennieren und dem Ovar exprimiert (Acton et al. 1996; Landschulz et al. 1996). Außerdem findet sich SR-BI in geringeren Konzentrationen im Hoden und im Darm. Niedrige Konzentrationen von diesem Protein finden sich in Milz, Thymus, Kolon und Leukozyten (Landschulz et al. 1996). Ultrastrukturell findet sich SR-BI vor allem in besonders cholesterin- und glykolipidhaltigen Bereichen der zellulären Plasmamembran, letztere nennt man Caveolae. SR-BII ist eine Isoform von SR-BI, welche sich durch eine andere Aminosäure-Sequenz im Bereich der C-terminalen zytoplasmatischen Domäne von SR-BI unterscheidet (Cao et al. 1997; Krieger 1999).
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Abbildung 3 – Modell von murinem SR-BI. Die extrazelluläre Schleife ist
mit beiden Enden in der Plasmamembran verankert. Die ungefähren Positionen der Cystin-Reste sind in der Abbildung rot markiert (nach Krieger 1999).
C C C C C C C C C N Outside Inside 1.4.2 Funktion und Eigenschaften von SR-BI
SR-BI erkennt mehrere Liganden: natives HDL und LDL, modifizierte Lipoproteine, Albumin, anionische PL und apoptotische Thymozyten (Rigotti et al. 1995; Acton et al. 1996; Murao et al. 1997). SR-BI vermittelt die hochaffine Bindung von HDL an Zellen. Im Gegensatz zum LDL-Rezeptor vermittelt dieses Protein keine Endozytose oder lysosomale Degradation des intakten Lipoprotein-Partikels. Vielmehr vermittelt SR-BI die selektive Aufnahme von CE in Zellen und Geweben (Acton et al. 1996; Brundert et al. 2005). Neben der CE-Aufnahme stimuliert SR-BI zumindest in vitro auch den Efflux von unverestertem Cholesterin aus peripheren Zellen und Geweben. Auch durch eine mögliche Funktion im zellulären Cholesterin-Efflux hat SR-BI eventuell eine Rolle im RCT zur Leber (Ji et al. 1997; Jian et al. 1998).
In Zellen und Geweben die Steroidhormone synthetisieren (Nebennieren, Ovar, Hoden), regulieren ACTH, hCG und cAMP die Expression von SR-BI im Sinne einer Stimulation (Rigotti et al. 1996). Cholesterin und 17α-ethinyl-estradiol führen zu einer verminderten Expression von SR-BI in der Leber der Ratte (Fluiter et al. 1998). In Steroidhormon synthetisieren Geweben vermittelt SR-BI die selektive CE-Aufnahme aus HDL. Dieses selektiv aufgenommene Cholesterin dient als Substrat für die Steroidhormon-Biosynthese.
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1.5 Zielsetzung dieser Arbeit
1.5.1 ABCA1 und der HDL-Stoffwechsel der Maus
Die Expression von ABCA1 hat bei der Maus einen wesentlichen Einfluss auf die Höhe des Plasmaspiegels. Eine Überexpression von ABCA1 führt zu einem Anstieg von HDL-Cholesterin im Plasma (Singaraja et al. 2001; Vaisman et al. 2001; Basso et al. 2003). Eine Defizienz von ABCA1 in allen Geweben führt zu einer Erniedrigung der HDL-Plasmaspiegel (McNeish et al. 2000; Orso et al. 2000; Timmins et al. 2005). Die Höhe des HDL-Plasmaspiegels wird offensichtlich durch die hepatische Expression von ABCA1 wesentlich beeinflusst (Singaraja et al. 2001). Andererseits ist die Leber das zentrale Organ im HDL-Abbau in vivo. Durch die hepatische Regulation des HDL-HDL-Abbaus wird andererseits auch wieder die Höhe der HDL-Spiegel im Plasma determiniert (Brundert et al. 2005).
Aufgrund der zentralen Stellung der Leber im HDL-Abbau und in der HDL-Synthese wurde der HDL-Stoffwechsel dieses Organs in verschiedenen Mausmodellen in dieser Arbeit charakterisiert. Die zentrale Frage dieser Studien war, welche Wirkung eine Änderung der
ABCA1-Expression der Leber auf den HDL-Katabolismus von diesem zentralem Organ hat.
In bisherigen in vivo Studien mit TD Patienten (Schaefer et al. 1978) und an Mäusen mit veränderter ABCA1-Expression (Vaisman et al. 2001; Timmins et al. 2005) wurde nur der HDL-Protein-Stoffwechsel untersucht. Aussagen zum Katabolismus des HDL-Lipidanteils wurden nicht gemacht (Schaefer et al. 1978; Timmins et al. 2005) oder lieferten nur unzureichende Ergebnisse (Vaisman et al. 2001). Ein Ziel der hier durchgeführten Untersuchungen war es deshalb, den Stoffwechsel von HDL-Protein und HDL-assoziierten CE simultan in vivo zu charakterisieren.
Neben der Leber sollte der HDL-Stoffwechsel von Mäusen mit veränderter ABCA1-Expression in vivo an weiteren Geweben in dieser Arbeit charakterisiert werden. Organe von Interesse waren hierbei Nebennieren, Nieren, Milz, Magen, Darm, Gehirn, Herz, Lunge und Kadaver.
Modell für unsere in vivo Studien waren zum einen Mäuse, die eine vermehrte ABCA1-Expression in allen Geweben aufweisen (ABCA1-TG) (Joyce et al 2003; Coutinho et al. 2005). In einigen Versuchs-Ansätzen wurden diese Tiere vor den Experimenten mit einem
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synthetischen LXR-Agonisten behandelt, um eine Hochregulation der ABCA1-Expression zu erreichen (Coutinho et al. 2005).
Ein weiteres Modell für die hier durchgeführten Stoffwechselstudien waren Mäuse, die eine induzierte ABCA1-Defizienz aufweisen (Aiello et al. 2003). Hier wurden Studien an Tieren durchgeführt, die entweder eine komplette ABCA1-Defizienz (ABCA1-KO) (McNeish et al. 2000) oder eine leberspezifische ABCA1-Defizienz (LS-ABCA1-KO) haben (Timmins et al. 2005). Mit letzterem Modell sollte insbesondere die Funktion von ABCA1 der Leber definiert werden.
Zusätzlich wurde hier ein Mausmodell verwendet, welches statt dem mauseigenen (murinen) ABCA1 das menschliche (humane) ABCA1 exprimiert (ABCA1-KO/ABCA1-BAC-TG) (Coutinho et al. 2005). Diese Tiere werden auch als „humanized mice“ bezeichnet.
Ziel dieser Arbeit war es, den Metabolismus im Plasma und den Katabolismus durch Gewebe des HDL-Proteins und des HDL-Lipids simultan in vivo zu studieren. Hierzu wurde eine radioaktive HDL-Doppelmarkierung mit Iod 125 (125I) (Protein) und Tritium-Cholesterin-Oleyl-Ether ([3H] CEt) (Lipid) durchgeführt.
1.5.2 SR-BI-Expression der Leber bei Mäusen mit veränderter ABCA1-Expression
SR-BI vermittelt die selektive Aufnahme von HDL-assoziierten CE in die Leber (Acton et al. 1996; Brundert et al. 2005). SR-BI ist ein physiologisch relevanter HDL-Rezeptor, der eine physiologische Bedeutung insbesondere in der HDL-Aufnahme durch die Leber hat.
Eine Arbeitshypothese von hier durchgeführten Experimenten war, dass eine modifizierte ABCA1-Expression die selektive HDL-CE-Aufnahme der Leber reguliert. In Kenntnis der Tatsache, dass SR-BI ein physiologisch relevanter HDL-Rezeptor ist, der eine zentrale Funktion in der hepatischen HDL-Lipid-Aufnahme hat, musste die Expression von SR-BI in der Leber bei verschiedenen hier verwendeten Mausmodellen charakterisiert werden.
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2 Material und Methoden
Falls nicht besonders vermerkt wurden Chemikalien mit dem Reinheitsgrad pro analysi (p. a.) verwendet.
2.1 Mauslinien
Als Modell für eine hohe ABCA1-Expression dienten C57BL6/J Mäuse, die mit Hilfe eines „Bacterial Artificial Chromosome“ (BAC) das humane ABCA1-Protein (ABCA1-BAC-TG) exprimieren (Singaraja et al. 2001; Coutinho et al. 2005). Diese Tiere exprimieren sowohl das transgene (humane), aber auch das endogene (murine) ABCA1-Protein.
Mäuse, die nur das transgene (humane) ABCA1 exprimieren und eine Defizienz von endogenem murinem ABCA1 aufweisen, werden als „humanized“ (ABCA1-KO/ABCA1-BAC-TG) bezeichnet (Coutinho et al. 2005). Auch diese Tiere fanden in den hier beschriebenen Experimenten Verwendung.
Zwei Tier-Modelle für eine induzierte ABCA1-Defizienz fanden Verwendung. Vollständig ABCA1-defiziente (ABCA1-Knockout-Mäuse (ABCA1-KO)) Tiere exprimieren kein ABCA1 in allen Geweben des Organismus (Aiello et al. 2003). Leberspezifische ABCA1-Knockout-Mäuse (LS-ABCA1-KO) waren ein Modell für eine organ-selektive, d. h. hepatische, Defizienz von ABCA1 (McNeish et al. 2000; Timmins et al. 2005).
Für alle Untersuchungen wurden Kontroll-Mäuse (Wildtyp) verwendet, die aus dem gleichen Wurf stammten wie die genetisch veränderten Tiere. Weiterhin hatten diese Mäuse ein identisches Geschlecht und ein vergleichbares Alter wie die genetisch veränderten Tiere.
Alle Mauslinien wurden freundlicherweise von der Arbeitsgruppe Michael R. Hayden, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Kanada, zur Verfügung gestellt.
2.1.1 Genehmigungen für Tierexperimente
Alle Tierversuche wurden der Freien und Hansestadt Hamburg, Behörde für Soziales, Familie, Gesundheit und Verbrauch, Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, vor Beginn
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der Experimente zur Begutachtung vorgelegt. Erst nach Eingang der Genehmigung für die Tierversuche wurden die entsprechenden Experimente durchgeführt.
2.2 Bestimmung von Proteinkonzentrationen
Geräte:
• Vortexer VF2 (Janke & Kunkel, Staufen)
• Magnetrührer Ikamag RH (Janke & Kunkel, Staufen) • Photometer SSE-343 (Jasco, Groß-Umstadt)
• Pipettierhilfe Pipetus® (Hirschmann, Eberstadt)
Material:
• Natriumcarbonat (Merck, Darmstadt) • Kalium-Natriumtartrat (Merck, Darmstadt)
• Kupfer-(II)-Sulfat-Pentahydrat (Merck, Darmstadt) • Folin-Cialcalteus Phenolreagenz (Merck, Darmstadt)
• Rinder (Bovine) Serum Albumin (BSA) (Invitrogen, Karlsruhe) • Reagenzgläser 13 x 75 mm, 5 ml (Sarstedt, Nümbrecht)
• Photometerküvetten 10 x 4 x 45 mm (Sarstedt, Nümbrecht)
Methode:
Die Bestimmung der Proteinkonzentrationen wurde nach der Methode von Lowry (Lowry et al. 1951) durchgeführt. Letztere beruht darauf, dass Proteine mit einem Cu2+-Reagenz einen Komplex bilden. Dieser Komplex reduziert das Folin-Cialcalteus Phenolreagenz (Folin-Reagenz). Die Aminosäurereste Tryptophan und Tyrosin können das Folin-Reagenz auch direkt reduzieren. Das gelbe Folin-Reagenz reagiert durch die Reduktion mit einem Farbumschlag zu blau. Anhand der Farbänderung kann der Proteingehalt quantitativ mit einem Photometer bestimmt werden.
Zur Verwendung kamen 5 µl Proben (Doppelwerte oder Dreifachwerte). Die Proben wurden mit NaOH (0,1 N) auf 100 µl aufgefüllt. Dann wurde 1 ml des ersten Reagenz zugegeben; letzteres besteht aus Lösung A (2%ige Kalium-Natriumtartrat-Lösung), Lösung B (2%ige Kupfer-(II)-Sulfat-Pentahydrat-Lösung) und Lösung C (2%ige Natriumcarbonat-Lösung in NaOH (0,1 N)). Gleichen Teilen von Lösung A und B wird die 100fache Menge an Lösung C
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zugefügt. Nach dem Mischen der Probe folgte eine Inkubation für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Als zweites Reagenz wurde das Folin-Reagenz (1:1 mit Aqua bidest. verdünnt) jeder Probe zugegeben (0,1 ml pro Probe). Nach dem Mischen erfolgte eine weitere Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nach Überführung der Proben in Photometerküvetten wurden letztere bei λ=578 nm im Photometer gemessen. Anhand einer Albumin-Standardeichreihe mit den Konzentrationen 5, 10, 20, 40, 60, 80 und 100 µg konnten die Proteinkonzentrationen aus den Extinktionen errechnet werden.
2.3 Präparation von Zellmembranen aus Lebergewebe
Geräte:
• Homogenisator Polytron PT 3100 (Kinematica, Luzern, Schweiz) • Zentrifuge Rotanta/TRC (Hettich, Tuttlingen)
• Ultrazentrifuge OPTIMA™ Max (Beckman Coulter, Krefeld) • Tube Topper® (Beckman Coulter, Krefeld)
Material:
• 1 ml Spritze • Kanüle
• 15 ml Falcon-Tube (Becton Dickinson, Heidelberg) • Ultrazentrifugenröhrchen (Beckman Coulter, Krefeld) • Puffer
o 50 ml PBS ohne Kalzium, ohne Magnesium (Invitrogen, Karlsruhe) o Protease-Inhibitoren Complete (Roche, Grenzach-Wyhlen)
o 100 µl EDTA 0,5 M (1:500) (Sigma-Aldrich, München) o 100 µl PMSF 100 mM (1:500) (Serva, Heidelberg) o 500 µl DTT 100 mM (1:100) (Sigma-Aldrich, München) • Anästhetikum/Sedativum
o 2,4 ml Ketamin (Ketasol®, Graeub) o 0,8 ml Xylazine (Rompun®, Bayer) o 1,8 ml Aqua pro injectione
Ma te ria l u nd Me th od en Methode:
Die Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion von einem Anästhetikum/Sedativum (Ketamin und Xylazine, siehe Material) (50 µl/10 g KG) in tiefe Narkose versetzt. Nach Laparotomie folgte die Perfusion der Leber mit PBS über die Portalvene. Schließlich erfolgte die Entnahme von einem kleinen Stück Lebergewebe und Überführung von letzterem in ein Falcon-Tube (15 ml). Anschließend Zugabe von 3 ml Puffer (siehe Material) zum Gewebe und Lagerung aller Proben auf Eis. Anschließend wurde das Gewebe für 1 Minute bei 17.500 RpM homogenisiert. Die Proben lagerten währenddessen auf Eis. Anschließend folgte eine Zentrifugation der Proben für 10 Minuten bei 4 °C und 1.000 RpM. Der Überstand der Tubes wurde in Ultrazentrifugenröhrchen überführt. Das Röhrchen wurde mit Puffer welchem erneut 100 µl PMSF zugegeben wurde aufgefüllt. Anschließend konnte das Röhrchen verschweißt werden. Es folgte eine Ultrazentrifugation für 40 Minuten bei 4 °C und 90.000 RpM. Die Tubes wurden danach geöffnet und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde mit 200 bis 400 µl Puffer versetzt und Aliquots bei -20 °C gelagert.
2.4 Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE)
Geräte:
• Blockthermostat BT 100 (Kleinfeld, Gehrden) • Vortexer VF2 (Janke & Kunkel, Staufen)
• Tischzentrifuge Biofuge fresco (Heraeus, Hanau) • Mini-Gel-Elektrophorese System (Bio-Rad, München) • Netzteil Pharmacia Multidrive XL (Amersham, Freiburg)
Material:
• Reaktionsgefäße 1,5 ml (Sarstedt, Nümbrecht) • PBS (Invitrogen, Karlsruhe)
• Pipettenspitze lang (Roth, Karlsruhe)
• Color-Marker BenchMark® (Invitrogen, Karlsruhe) • Polyacrylamid-Gele (Bio-Rad, München)
o 10 % Tris-HCl-Gel, 10 Well (SR-BI) o 4-15 % Tris-HCl Gel, 10 Well (ABCA1)
Ma te ria l u nd Me th od en • Probenpuffer (5 x)
o 25 ml Tris 0,5 M, pH 6,8 (Sigma-Aldrich, München) o 25 ml Glycerol (Merck, Darmstadt)
o 5 g SDS (Serva, Heidelberg)
o 0,25 g Bromophenolblau (Sigma-Aldrich, München)
o 10 mM DTT (Sigma-Aldrich, München) vor Verwendung dem 1 x Puffer hinzufügen
• Laufpuffer (10 x)
o 15 g Tris (Sigma-Aldrich, München) o 72 g Glycin (Merck, Darmstadt) o 5 g SDS (Serva, Heidelberg)
o mit Aqua bidest. auf 500 ml auffüllen
Methode:
Die Gelelektrophorese wurde nach der von Laemmli beschriebenen Methode durchgeführt (Laemmli 1970). Nach der Proteinbestimmung überführten wir definierte Mengen der Proben in Reaktionsgefäße. Nach Zugabe von 5 µl Probenpuffer und Auffüllen mit PBS auf 25 µl Endvolumen folgte das Erhitzen der Proben bei 100 °C für 10 Minuten im Heizblock. Entstandenes Kondenswasser entfernten wir aus den Deckeln durch kurzes zentrifugieren. Das verwendete Gel wurde entsprechend Anleitung des Herstellers vorbereitet und in die Elektrophorese Apparatur eingesetzt. Anschließend konnte der sogenannte Kamm am oberen Ende des Gels entfernt werden. Die entstandenen Kammern wurden mit Laufpuffer gefüllt und Luftblasen in den Gel-Taschen entfernt. Die Proben (25 µl) pipettierten wir schließlich mit Hilfe einer langen Pipettenspitze in die jeweiligen Taschen. Die erste und die letzte Tasche eines jeden Gels haben wir mit jeweils 10 µl Color-Marker als Protein-Molekulargewichts-Standard beladen. Die Elektrophorese erfolgte bei einer Stromstärke von 25 mA. Der Lauf konnte beendet werden, sobald die Farbstoffbanden das untere Ende des Gels erreicht hatten. Die typische Laufzeit der Gel-Elektrophorese entsprach 90 Minuten.
2.5 Immunoblot
Geräte:
• Mini-Blot-System (Bio-Rad, München)
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• Magnetrührer Ikamag RH (Janke & Kunkel, Staufen) • pH-Meter CG 714 (Schott, Hofheim)
• Schwenker IKA-Vibrax-VXR (Janke & Kunkel, Staufen) • Filmentwickler CP 100 (AGFA, Köln)
Material:
• Methanol (Merck, Darmstadt) • Salzsäure (Merck, Darmstadt)
• Milchpuffer (Non-Fat Dry Milk) (Carnation, USA) • PBS (Invitrogen, Karlsruhe)
• Tween®-20 (Sigma-Aldrich, München)
• Immobilon™ P Membran (PVDF) (Millipore, Eschborn) • Filterpapier 3 MM Chr 0,34 mm (Whatman, Kent, UK) • Röntgenfilm Biomax NR 18 x 24 (Kodak, Stuttgart) • ECL-Chemielumineszenz-Kit (Amersham, Freiburg) • Transferpuffer
o 10,53 g Glycin (Merck, Darmstadt) o 2,4 g Tris (Sigma-Aldrich, München) o in 700 ml Aqua bidest. lösen
o pH 8,3 mit Salzsäure einstellen o 200 ml Methanol hinzugeben
o mit Aqua bidest. auf 1000 ml auffüllen o vor Gebrauch auf 4 °C kühlen
• Blockpuffer
o 10 % Milchpulver in PBS (ohne EDTA) • Waschpuffer
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Tabelle 1 - Immunoblot / 1. Antikörper
Antikörper Hersteller/Herkunft Gewonnen
aus
Verdünnung
Anti-SR-BI J.C. Fruchard, Frankreich Kaninchen 1:5.000
Anti-ABCA1 M. Hayden, Kanada Kaninchen 1:1.000
Anti-ß-Actin Sigma-Aldrich, München Maus 1:30.000
Tabelle 2 - Immunoblot / 2. Antikörper
Antikörper Hersteller/Herkunft Gewonnen
aus
Verdünnung
Anti-Kaninchen-HRP Jackson Immuno Research Esel 1:5.000
Anti-Maus-HRP Jackson Immuno Research Ziege 1:5.000
HRP=horseradish peroxidase
Methode:
Immunoblots wurden nach der von Towbin beschriebenen Methode durchgeführt (Towbin et al. 1979). Eine Immobilon P Membran (PVDF-Membran) wurde vor Gebrauch 5 Minuten in Methanol getränkt. Der Plastikträger der Blotkammer wurde wie folgt bestückt: Schwamm, 2 x Filterpapier, PVDF-Membran, Polyacrylamid-Gel, 3 x Filterpapier, Schwamm. Kühlaggregat und Plastikträger wurden nach Angaben des Herstellers in die Kammer eingesetzt. Gekühlter Transferpuffer wurde eingefüllt. Die Kammer wurde in einen Kühlschrank bei 4 °C auf einen Magnetrührer gestellt. Der Protein-Transfer wurde über Nacht (20 Stunden) durchgeführt. Stromstärke 25 mA.
Die nachfolgend beschriebenen Schritte wurden bei Raumtemperatur ausgeführt. Die PVDF-Membran wurde der Kammer entnommen und in Methanol getränkt. Anschließend wurde die Membran auf einem elektrisch angetriebenen Schwenker in Blockpuffer für 1 Stunde geblockt.
Es folgte die Inkubation mit dem 1. Antikörper (gegen SR-BI oder ABCA1). Letzterer wurde in PBS gelöst, welches Milchpulver (10 %) enthalten hat. Die Inkubation wurde auf einem Schwenker für 1 Stunde durchgeführt. Daraufhin wurde die Membran 3 x für je 10 Minuten mit Waschpuffer gewaschen.
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Anschließend wurde die PVDF-Membran für 45 Minuten mit dem 2. Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper war mit Peroxidase (HRP) konjugiert. Dieser Antikörper wurde in PBS welches Milchpulver (10 %) enthält gelöst. Anschließend konnte die Membran 5 x für je 7 Minuten mit Waschpuffer gewaschen werden.
Als letzter Schritt zur Anfertigung von Immunoblots schloss sich die Gel-Entwicklung auf einem Röntgenfilm an. Diese Entwicklung wurde mit dem ECL-Chemilumineszenz-Kit durchgeführt. Die Entwicklungszeiten betrugen je nach Signalstärke zwischen 2 und 4 Minuten.
2.6 Cholesterin-Bestimmung im Plasma
Geräte:
• Vortexer VF2 (Janke & Kunkel, Staufen)
• Tischzentrifuge Biofuge fresco (Heraeus, Hanau) • Wasserbad Typ 1003 (GFL, Burgwedel)
• Photometer SSE-343 (Jasco, Groß-Umstadt) • ELISA Lesegerät MRX II (Dynex, USA)
Material:
• Reaktionsgefäße 1,5 ml (Sarstedt, Nümbrecht)
• Photometerküvetten 10 x 4 x 45 mm (Sarstedt, Nümbrecht) • Cholesterinstandard (Roche, Grenzach-Wyhlen)
• Cholesterinreagenz (Roche, Grenzach-Wyhlen) • ELISA-Platte 96-Well (Greiner, Frickenhausen)
Methode:
Die Cholesterin-Konzentration in Plasmaproben bestimmten wir mit einer enzymatischen Methode mit einem Cholesterinreagenz (Roche). Routinemäßig wurden jeweils 10 µl Probe (Doppelwerte) in geeignete Röhrchen pipettiert. Als Leerwerte dienten 10 µl Aqua bidest (Doppelwerte). Als Standard wurde der Cholesterinstandard (Roche) benutzt (Dreifachwerte). Letzterer hat eine Cholesterinkonzentration von 153 mg/dl. Allen Proben, den Leerwerten und den Standards wurde jeweils 1 ml des Cholesterinreagenz zugeführt und gut gemischt. Danach folgte eine Inkubation im Wasserbad für 10 Minuten bei 37 °C. Die Proben wurden in
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geeignete Küvetten überführt und bei λ=546 nm im Photometer gemessen. Anhand der Standardeichkurve und den Extinktionen konnte der Gesamtcholesteringehalt der jeweiligen Proben errechnet werden.
Bei sehr kleinen Plasma-Volumina wurde als Alternative zur oben genannten Standardtechnik eine Mikromethode für die Cholesterin-Analytik verwendet (siehe Absatz 2.7). Hierbei wurden jeweils 5 µl Plasma in eine 96-Well ELISA-Platte pipettiert (Doppelwerte). Als Leerwerte wurden 5 µl Aqua bidest. pipettiert (Doppelwerte). 5 µl Cholesterinstandard (Roche) wurden als Standard verwendet (Doppelwerte). Nach Zugabe von Cholesterinreagenz (1 ml) und Inkubation für 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Platte bei λ=490 nm im Reader gelesen. Der Cholesteringehalt konnte mit der Software Revelation (Dynex, USA) errechnet werden.
2.7 HDL-Cholesterin-Bestimmung im Plasma
Geräte:
• Tischzentrifuge Biofuge fresco (Heraeus, Hanau) • Vortexer VF2 (Janke & Kunkel, Staufen)
• ELISA Lesegerät MRX II (Dynex, USA)
Material:
• Reaktionsgefäße 1,5 ml (Sarstedt, Nümbrecht) • Glycin (Merck, Darmstadt)
• Polyethylene-Glycol (PEG) (Sigma-Aldrich, München) • Cholesterinstandard (Roche, Granzach-Wyhlen)
• Cholesterinreagenz (Roche, Grenzach-Wyhlen) • ELISA-Platte 96-Well (Greiner, Frickenhausen) • Polyethylen-Glycol-Lösung (20%ig)
o 60 ml Glycin Puffer 0,2 M, pH 10 o 20 g PEG
o mit Glycin-Puffer auf 100 ml auffüllen o Lösung vor Gebrauch mischen
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Die HDL-Cholesterin-Konzentration im Plasma musste von zahlreichen Mäusen analysiert werden. Das Prinzip der hier verwendeten Technik beruht auf der Fällung ApoB-haltiger Lipoproteine; HDL-Cholesterin befindet sich nach dieser Präzipitation im Überstand. Zu einem Plasma-Aliquot von 15 µl wurden 15 µl einer 20%iger-PEG-Lösung gegeben. Die Proben wurden 3 x für je 10 Minuten gemischt. Danach folgte eine Inkubation für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend wurden die Proben für 10 Minuten bei 13.000 RpM zentrifugiert. 10 µl des Überstandes wurden jeweils auf eine 96-Well ELISA-Platte aufgetragen (Doppelwerte). Als Standard wurde 5 µl des Cholesterinstandards pipettiert (Doppelwerte oder Vierfachwerte). Als Leerwert dienten 5 µl Aqua bidest. 200 µl des Cholesterinreagenz wurden den Proben, den Standards und den Leerwerten zugegeben. Es folgte eine Inkubation von 10 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend wurde die Farbentwicklung bei λ=490 nm gemessen. Die HDL-Konzentration wurde mit Hilfe der Software Revelation (Dynex, USA) errechnet.
2.8 Markierung von HDL mit zwei radioaktiven Markern
Geräte:
• Ultrazentrifuge OPTIMA™ Max (Beckman Coulter, Krefeld) • Tube Topper® (Beckman Coulter, Krefeld)
• Magnetrührer Ikamag RH (Janke & Kunkel, Staufen) • Sonifier (Branson, USA)
• pH-Meter CG 714 (Schott, Hofheim)
Material:
• Dialyseschläuche (6 mm, 16 mm) (Serva, Heidelberg) • Ultrazentrifugenröhrchen (Beckman Coulter, Krefeld) • Tyramin-Cellobiose (Synthese Universität Hamburg) • Cholesterin-Oleat (Sigma-Aldrich, München)
• L-α-Ei-Phosphatidylcholin (Sigma-Aldrich, München) • [3H]Cholesterin-Oleyl-Ether (Amersham, Freiburg)
• CETP (R. Morton, Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, USA) • Sterilfilter 0,8 µm (Millipore, Eschborn)
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o EDTA 0,3 mmol/l (Sigma-Aldrich, München) o Natrium-Azid (NaN3) 0,02 %
o pH 7,4 • Austausch-Puffer
o PBS (Invitrogen, Karlsruhe)
o EDTA 1mM (Sigma-Aldrich, München) o Natrium-Azid 0,01%
o DTNB 1,5 mM o pH 7,4
Methode:
Initial Präparation von murinem HDL (Brundert et al. 2005). Hierzu wurde C57BL/J6-Wildtyp-Mäusen 4 Stunden vor venöser Blutentnahme durch das Fachpersonal der Tierhaltung des UKE das Futter entzogen. Blut wurde den Tieren durch Fachpersonal aus dem retroorbitalen Gefäß-Plexus abgenommen und in EDTA-haltige Röhrchen überführt. Murines HDL wurde aus EDTA-Plasma durch sequentielle Ultrazentrifugation im Dichtebereich von d=1,063 bis 1,21 g/ml präpariert (Havel et al. 1955). Schließlich wurde das HDL in einen Dialyseschlauch überführt und 48 Stunden in PBS, pH 7,4, bei 4 °C intensiv dialysiert.
Der erste Schritt für die radioaktive Doppelmarkierung von HDL war die kovalente Bindung des 125I-Tyramin-Cellobiose-(125I-TC-)Liganden (Pittman und Taylor 1986). Durch diesen Marker werden die HDL-Apolipoproteine radioaktiv markiert.
Als zweiter Schritt folgte die Markierung der HDL-assoziierten CE von 125I-TC-HDL mit [3H]Cholesterin-Oleyl-Ether. Hierzu wurde zunächst eine Liposomen-Präparation hergestellt. Unmarkiertes Cholesterin-Oleat (7 µg), L-α-Ei-Phosphatidylcholin (449 µg) und [3H]Cholesterin-Oleyl-Ether (0,5 bis 1 ,0 mCi) wurden in ein konisches Glas-Vial pipettiert. Anschließend folgt ein Verdampfen der Lösungsmittel mit Argon-Gas. Schließlich Zugabe von 1 ml Phosphat-Puffer (50 mM, pH 7,4) zu dem Lipid-haltigen Glasröhrchen. Anschließend wurde die Suspension 30 Minuten auf Eis soniciert. Während der Sonicierung wurde die Probe in einer Argon-Gas-Atmosphäre gehalten.
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Die HDL-Lipidmarkierung wurde durch Lipid-Austausch des [3H]CEt der Liposomen mit den
CE des HDL-Moleküls erreicht. Hierzu wurden die Liposomen-Präparation, hochgereinigtes humanes CETP und 125I-TC-HDL für 8 Stunden bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die Liposomen-Partikel und das markierte HDL durch Ultrazentrifugation bei d= 1,063 mg/ml wieder getrennt (90.000 RpM, 4 °C, 12 Stunden). Um auch das CETP wieder von der HDL-Präparation zu entfernen folgte eine weitere Ultrazentrifugation bei d=1,21 g/ml. Danach wurden eine ausgeprägte Dialyse gegen PBS (+ EDTA, pH 7,4, 4 °C, 48 Stunden) und schließlich eine Sterilfiltration (0,80 µm) durchgeführt (Pittman und Taylor 1986; Brundert et al. 2005).
2.9 Lipidextraktion nach Dole
Geräte:
• Vortexer VF2 (Janke & Kunkel, Staufen)
• Szintillationszähler Tri-Carb 2900 TR (Canberra-Packard, Kanada)
Material:
• Reagenzgläser (Sarstedt, Nümbrecht) • Dole’s Reagenz
o 600 ml Isopropylalkohol (Merck, Darmstadt) o 150 ml n-Heptan (Merck, Darmstadt)
o 15 ml H2SO4 (1N) (Merck, Darmstadt)
• Szintillationsgel Ultima Gold (Canberra-Packard, Kanada)
Methode:
Von den vivo Experimenten mit Mäusen sind zahlreiche Plasma- und Gewebeproben angefallen, von denen gleichzeitig die Radioaktivität für Gamma- (125I) und Beta-Strahlung ([3H]) analysiert werden musste. Da die Gamma-Strahlung energiereich, die Beta-Strahlung hingegen energiearm ist, mussten beide Isotope getrennt werden.
Zunächst wurde von allen Proben eine Gamma-Zählung (125I) durchgeführt. Zur Analytik der [3H]CEt-Radioaktivität der Proben wurde der Lipid- bzw. der [3H]CEt-Anteil der Proben extrahiert nach der von Dole beschriebenen Methode (Dole 1961).
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Jeweils 1 ml der wässrigen Proben wurde in gläserne Reagenzgefäße überführt. Anschließend erfolgte die Zugabe von 5 ml Dole’s Reagenz. Auf kurzes mischen der Proben folgte eine Inkubation bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Nach Zugabe von 2 ml n-Heptan und 30 Sekunden Mischen mit einem Vortexer wurde noch jeweils 3 ml Aqua bidest. hinzugefügt und erneut gemischt. Aus der oberen Phase (=organisch) entnahmen wir 3 x 0,9 ml und gaben jeweils 10 ml Szintillationsgel hinzu. Anschließend wurden die Proben im Flüssigkeits-Szintillationszähler gemessen.
2.10 Durchführung der In vivo-Experimente
Geräte:
• Tischzentrifuge Biofuge Fresco (Heraeus, Hanau)
• Homogenisator Polytron PT 3100 (Kinematica, Schweiz)
• Szintillationszähler Tri-Carb 2900 TR (Canberra-Packard, Kanada) • Gamma-Strahlungs-Zählgerät (Berthold, Bad Wildbad)
Material:
• Spritze 1ml • Kanüle
• Reaktionsgefäße (Sarstedt, Nümbrecht) • Anästhetikum/Sedativum
o 2,4 ml Ketamin (Firma Atarost) o 0,8 ml Xylazine (Rompun®, Bayer) o 1,8 ml Aqua pro injectione
Methode:
4 Stunden vor Beginn des Experimentes wurde den Tieren das Futter entzogen; alle Tiere hatten jedoch während dieses Zeitraums freien Zugang zu Trinkwasser.
Zum Zeitpunkt t = 0 Stunden erfolgte bei jeder Maus die Injektion von 125I-TC-/[3H]CEt-HDL (maximal 50 µg murines HDL-Protein pro Maus) über eine Schwanzvene (Glass, C. et al. 1985; Rinninger und Pittman 1987). Nach der Aufnahme beider HDL-Tracer in Zellen und Gewebe verbleiben die radioaktiven HDL-Marker intrazellulär und werden von den Geweben nicht wieder abgegeben. Diese Marker werden auch als „intracellularly trapped tracers“
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bezeichnet, sie sind besonders gut geeignet für Experimente mit Tieren (Pittman und Taylor 1986).
Blutentnahmen erfolgten periodisch 0,16, 0,5, 2, 6, 20 und 24 Stunden nach Injektion von markiertem HDL. 24 Stunden nach der Injektion von markiertem HDL wurde den Tieren eine Überdosis (50 µl/10 g KG) eines Anästhetikums/Sedativums (Ketamin und Xylazine) verabreicht. Nach dem Tod haben wir die Tiere transkardial intensiv mit PBS (50 ml pro Maus) perfundiert, um die HDL-Marker aus dem intravasalen Raum zu entfernen (Rinninger und Pittman 1987). Die Organe der Tiere wurden entnommen. Schließlich Homogenisierung der Organe und der Kadaver. In Gewebe-Homogenat-Aliquots direkte Bestimmung der
125I-TC-Radioaktivität mittels Gamma-Zählung. Die Analytik der [3H]-Aktivität erfolgte nach
Lipidextraktion aus den Gewebe-Homogenaten nach der von Dole beschriebenen Methode (Dole 1961) (siehe Absatz 2.9). Die Cholesterin- und die HDL-Cholesterin-Spiegel bestimmten wir aus terminal gewonnenem Blut bzw. Plasma.
2.10.1 Orale Behandlung von Mäusen mit T0901317 (Tularik)
Material:
• Sterilfilter (Nalge-Nunc, USA)
• Reaktionsgefäße 1,5 ml (Sarstedt, Nümbrecht) • Tularik (T0901317) (Alexis, Schweiz)
• Cremophor®EL (Fluka, Schweiz) • DMSO (Merck, Darmstadt) • Mannitol (Merck, Darmstadt) • Knopfsonde
• Spritze
Methode:
Sämtliche Substanzen wurden vor Gebrauch sterilfiltriert. 50 mg Tularik wurden in 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und bei -20 °C gelagert. 1 Teil der Tularik/DMSO-Lösung (die Kontrollgruppe erhielt nur DMSO) wurde zu 1 Teil Cremophor®EL gegeben und gut gemischt. 1 Teil dieser Lösung wurde mit 9 Teilen 5%iger Mannitol-Lösung verdünnt. Es wurde wenigstens die doppelte Menge oder 1 ml mehr angesetzt als benötigt. Es wurden jeweils 100 µl der Tularik/DMSO-Lösung pro Maus durch Fachpersonal der Tierhaltung des
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UKE über eine Knopfsonde in den oberen Gastrointestinaltrakt verabreicht. Dies entspricht einer Tularik-Konzentration von 0,25 mg pro Tag (10 mg/kg KG/Tag) (Coutinho et al. 2005). Die Tiere wurden für 4 Tage mit der Tularik/DMSO-Lösung behandelt. Am 5. Tag wurden den Mäusen nach 4 Stunden fasten (die Tiere hatten freien Zugang zu Trinkwasser) die Blutproben entnommen oder diese wurden für die in vivo Experimente verwendet.
2.10.2 Berechnung der Fractional Catabolic Rates (FCR)
Aus den im Tierexperiment gewonnenen Blutproben bzw. der in diesen enthaltenen Radioaktivität (125I, [3H]) können die Abbauraten der HDL-Tracer (Plasma-Fractional Catabolic Rates, FCR’s) im Plasma errechnet werden (Le et al. 1986; Brundert et al. 2005). Die Plasma-FCR’s spiegeln die Aufnahme des jeweiligen Markers aus dem HDL-Plasma-Pool durch alle Gewebe des Organismus wider.
Die HDL-Aufnahme in Gewebe wird als Organ-Fractional-Catabolic-Rate (Organ-FCR) ausgedrückt. Die Organ-FCR wird berechnet als Plasma-FCR x Fraktion des im jeweiligen Organ gemessenen Markers (in Prozent von der Gesamtaufnahme in alle Gewebe) (Glass et al. 1985; Rinninger und Pittman 1987). Diese Organ-FCR’s repräsentieren die Fraktionen der Marker aus dem Plasma-Pool, die während einer Stunde in definierte Organe aufgenommen wurden. Die selektive Aufnahme in ein Gewebe von HDL-CE wird als Differenz zwischen [3H]CEt und 125I-TC berechnet (Glass et al. 1985).
Den Berechnungen der FCR’s liegt das Kompartment-Modell von Matthews zu Grunde (Matthews 1957). Diese Theorie geht davon aus, dass biologische Systeme in verschiedene Kompartimente eingeteilt werden können. Es wird für dieses System angenommen, dass sich zwischen den Kompartimenten ein dynamisches Gleichgewicht einstellt. Dies bedeutet, dass das Gesamtprotein in den jeweiligen Kompartimenten als konstant vorausgesetzt wird. Die Abbauraten stehen im Gleichgewicht mit den Syntheseraten.
Die Plasma-FCR’s für den Abbau von 125I-TC-/[3H] CEt-HDL wurden freundlicherweise von Herrn R. Ramakrishnan, Ph.D., Columbia University, New York, USA, berechnet. Diese Berechnungen erfolgten wie zuvor beschrieben (Varban et al. 1998; Rinninger et al. 1999; Brundert et al. 2005).
Ma te ria l u nd Me th od en 2.10.3 Statistik
Statistische Berechnungen wurden unter Verwendung des Student’s t-Test durchgeführt. Die angegebenen Werte sind Mittelwerte ± Standardfehler der Standardabweichung (SEM). Die Ergebnisse wurden als nicht signifikant (ns) angenommen bei p > 0,05.
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3 Ergebnisse
3.1 ABCA1 und der HDL-Stoffwechsel der Maus
In vivo determiniert die Expression von ABCA1 in Geweben wesentlich die Höhe des HDL-Spiegels im Plasma (Singaraja et al. 2001; Basso et al. 2003). Die adenovirale Expression von ABCA1 in der Leber führt zu einem signifikanten Anstieg des HDL-Cholesterins im Plasma von Wildtyp-Mäusen (WT) (Basso et al. 2003; Wellington et al. 2003). Im Gegensatz hierzu zeigen Mäuse bei denen das ABCA1-Gen (sogenannte Knockout, KO) ausgeschaltet ist, ein Absinken des HDL-Spiegels im Plasma um über 90 % (McNeish et al. 2000; Orso et al. 2000).
Unter der Vorstellung, dass ABCA1 in peripheren Zellen durch den Transfer von Lipiden auf ApoA-I den HDL-Spiegel maßgeblich beeinflusst (McNeish et al. 2000), wurden Untersuchungen an Mäusen mit selektiver ABCA1-Defizienz von Makrophagen durchgeführt (Haghpassand et al. 2001). Überaschenderweise zeigten diese Untersuchungen, dass die ABCA1-Defizienz von Makrophagen nur einen geringen Einfluss auf die Höhe der HDL-Spiegel im Plasma bei Mäusen hat (Haghpassand et al. 2001). Im Gegensatz hierzu führte die selektive Ausschaltung des ABCA1-Gens in der Leber zu deutlich erniedrigten HDL-Spiegeln im Plasma im Vergleich zu Kontroll-Mäusen (Timmins et al. 2005). Diese Untersuchungen schlagen vor, dass ABCA1 der Leber und nicht ABCA1 von Makrophagen einen entscheidenden Beitrag an der Regulation des HDL-Plasmaspiegels hat. Es stellt sich die Frage, welcher Mechanismus für die Regulation der HDL-Spiegel durch die hepatische ABCA1-Expression verantwortlich ist. Die ABCA1-vermittelte Regulation der HDL-Plasmaspiegel durch die Leber könnte sowohl durch eine gesteigerte HDL-Synthese, als auch durch einen beschleunigten Abbau von HDL, erfolgen. Auf beide Parameter könnte ABCA1 einen entscheidenden Effekt haben.
Ziel der Untersuchungen dieser Dissertation war die Charakterisierung des HDL-Stoffwechsels von Mäusen mit induzierter Verminderung oder Vermehrung der ABCA1-Expression. Im Vordergrund des Interesses stand hierbei der HDL-Abbau durch die Leber.
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3.2 Untersuchungen zum HDL-Stoffwechsel der Maus
3.2.1 Plasma-Cholesterinspiegel und hepatische ABCA1-Expression bei Mäusen mit induzierter Überexpression von ABCA1
Um die Bedeutung einer hohen ABCA1-Expression im HDL-Stoffwechsel zu charakterisieren waren C57BL/J-Mäuse ein experimentelles Modell welche mit Hilfe eines „Bacterial Artificial Chromosome“ (BAC) zusätzlich das humane ABCA1 (ABCA1-BAC-TG) exprimieren. Diese Tiere exprimieren das transgene (humane) und das endogene (murine) ABCA1-Protein (Singaraja et al. 2001; Coutinho et al. 2005). ABCA1 wird in diesen Mäusen in der Leber und anderen Organen (zum Beispiel im Gehirn, Dünndarm, Hoden, Lunge) exprimiert (Singaraja et al. 2001; Coutinho et al. 2005). ABCA1-BAC-TG-Mäuse zeigten gesteigerte Gesamt-Cholesterin-Spiegel und HDL-Cholesterin-Spiegel im Vergleich zur Wildtyp-Kontrolle (Tabelle 3, Tabelle 4) (Singaraja et al. 2001).
Tabelle 3 – Gesamt- und HDL-Cholesterin im Plasma von Mäusen mit veränderter ABCA1-Expression
Plasma Cholesterin (mg/dl) HDL-Cholesterin (mg/dl) WT 83,7±5,1 (n=7) 52,8±3,4 (n=7) ABCA1-BAC-TG 85,3±2,14 (n=5) 71,7±3,17 (n=5) ABCA1-BAC-TG +LXR-Agonist 140,0±7.8 (n=7) 95,6±4,0 (n=7) ABCA1-KO 17,7±2,24 (n=7) 5,9±1* (n=6)
ABCA1-KO +LXR-Agonist nicht bestimmt** 4,4±0,4** (n=nicht verfügbar)
ABCA1-KO/ABCA1-BAC-TG 45.3±7,07 (n=6) 48,8±10* (n=8)
LS-ABCA1-KO 22,4±4,3 (n=6) 12±6*** (n=17)
Allen Mäusen wurde vier Stunden vor Blutentnahme das Futter entzogen, die Tiere hatten jedoch freien Zugang zu Trinkwasser. * Gezeigte Daten aus Couthino et al. 2005. ** Gezeigte Daten aus Singaraja et al. 2006. *** Gezeigte Daten aus Timmins et al. 2005. n=Anzahl der untersuchten Mäuse.
Da unbehandelte ABCA1-BAC-TG-Mäuse quantitativ nur eine moderate Steigerung der ABCA1-Protein-Expression und des HDL-Spiegels im Plasma zeigen im Vergleich zum Wildtyp (Tabelle 3) wurden die Tiere mit dem synthetischen LXR-Agonisten T0901317 behandelt (Coutinho et al. 2005). Fütterung der Mäuse mit dem LXR-Agonisten führte zu einer Steigerung der ABCA1-Expression der Leber im Immunoblot (Abbildung 4). Parallel dazu kam es zu einem Anstieg der Plasma-Cholesterinspiegel und Plasma-HDL-Spiegel im Vergleich zu den ABCA1-BAC-TG-Tieren ohne Behandlung mit dem LXR-Agonisten (Tabelle 3, Tabelle 5). Im Vergleich zu Wildtyp-Tieren zeigte sich bei
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Mäusen, welche mit dem LXR-Agonisten behandelt wurden, eine signifikante Steigerung des Gesamtcholesterins um 67 % und des HDL-Cholesterin-Spiegels im Plasma um 81 % (Tabelle 3).
Der ABCA1-Immunoblot von Lebermembranen der ABCA1-BAC-TG-Tiere nach Behandlung mit dem LXR-Agonisten zeigt eine deutlich gesteigerte Expression von ABCA1 im Vergleich zum unbehandelten Wildtyp (Abbildung 4).
LXR-Agonisten regulieren die Expression verschiedener Gene des Lipidstoffwechsels (Plosch et al. 2002). Um die Frage zu klären, ob tatsächlich ABCA1 für den oben gezeigten Anstieg des HDL-Cholesterins im Plasma (induziert durch den LXR-Agonisten) verantwortlich ist, wurden ABCA1-KO-Mäuse (ABCA1-KO) mit T0901317 behandelt. Hier zeigte sich kein Anstieg des Plasma-HDL-Spiegels im Vergleich zur Kontrolle (Tabelle 3) (Singaraja et al. 2006). Dieses Ergebnis erlaubt die Schlussfolgerung, dass ABCA1 bei den mit T0901317
100 Ko ntro ll e Wi ldty p A BC A 1-BA C -TG + LX R -A go ni st 20 A BC A 1-BA C -TG + LX R -A go ni st ! ABCA1 ! ß-Actin µg Protein 60 60 Wi ldty p 100
Abbildung 4 – Expression von ABCA1 in der Leber von Mäusen. Durchführung
des Immunoblots wie in Methoden (siehe Absatz 2.5) beschrieben. Auftragung von 60 µg oder 100 µg Protein aus Lebermembranen von Wildtyp- (n=7) und von ABCA1-BAC-TG-Mäusen, die mit dem LXR-Agonisten behandelt worden sind (n=7). Als Kontrolle diente Protein aus Zellen, die ABCA1 überexprimieren (Ragozin et. al 2005). ß-Actin dient als Kontrolle für die Gel-Beladung. Gezeigt ist ein typisches Experiment; 1 ähnliches Experiment erbrachte ein qualitativ identisches Ergebnis. n= Anzahl der untersuchten Mäuse.
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behandelten ABCA1-BAC-TG- Mäusen für den Anstieg des HDL-Cholesterins im Plasma verantwortlich ist (Singaraja et al. 2001).
3.2.2 Stoffwechsel von 125I-TC-/[3H]CEt-HDL im Plasma von Mäusen mit
Überexpression von ABCA1
Die Bedeutung einer gesteigerten ABCA1-Expression für den Stoffwechsel von radioaktiv markiertem HDL wurde in Experimenten charakterisiert. Nach intravenöser Injektion von
125I-TC-/[3H]CEt-HDL wurde der Abbau dieser Präparation im Plasma in Wildtyp-Mäusen, in
ABCA1-BAC-TG-Mäusen und in ABCA1-BAC-TG-Mäusen die mit T0901317 behandelt wurden, untersucht. Sowohl bei den ABCA1-BAC-TG-Mäusen, als auch bei den mit LXR-Agonist behandelten ABCA1-BAC-TG-Tieren, zeigte sich eine Erniedrigung der Plasma-FCR’s der HDL-Tracer 125I-TC und [3H]CEt im Vergleich zu Wildtyp-Tieren (Tabelle 4,
Tabelle 5). Obwohl nicht signifikant unterschiedlich schlagen diese Experimente vor, dass bei ABCA1-Überexpression der HDL-Abbau im Plasma verlangsamt ist.
Ergebnisse Tab el le 4 - HDL -S toffw ec h se l von W il d typ - u n d A BC A 1-BA C -TG -M äu se n WT -Mä us e AB C A1 -BA C -TG M äu se Ch ol es te ri n 125 I [ 3 H] [ 3 H] -125 I Ch ol es te ri n 125 I [ 3 H] [ 3 H] 125 I Pl as m a-Ch ol es te ri n (m g/ dl ) 61, 2 * ± 4, 19 85, 3 * ± 2, 14 Pl as m a-FC R ( Po ol /h ) 0, 0815± 0, 0047 0, 1778± 0, 0142 0, 0963± 0, 01 0, 0742± 0, 0045 0, 1594± 0, 0100 0, 0852± 0, 007 Or ga n-FC R (x 1 0 3 x h -1 ) Le be r 28, 79± 1, 64 114, 9± 8, 64 86, 14± 7, 3 25, 97± 0, 69 100, 46± 5, 10 74, 49± 4, 5 Ne be nn ie re n 0, 2± 0, 02 1, 72± 0, 13 1, 51± 0, 1 0, 2± 0, 02 1, 74± 0, 14 1, 53± 0, 1 Ni er en 3, 65± 0, 25 0, 81± 0, 08 - 3, 19± 0, 14 0, 77± 0, 04 - Mi lz 0, 90± 0, 06 2, 38± 0, 22 1, 48± 0, 19 0, 812± 0, 05 2, 20± 0, 16 1, 39± 0, 13 Ma ge n 2, 92± 1, 09 3, 5± 1, 27 0, 59± 0, 44 1, 33± 0, 32 1, 89± 0, 49 0, 55± 0, 19 Da rm 8, 65± 1, 44 5, 83± 0, 94 - 9, 18± 1, 56 7, 91± 1, 54 - Ge hi rn 0, 0306± 0, 0014 0, 0545± 0, 004 0, 0239± 0, 005 0, 0291± 0, 0052 0, 0479± 0, 0046 0, 0188± 0, 002 He rz 0, 42 * ± 0, 0239 0, 45± 0, 0336 0, 03± 0, 032 0, 32 * ± 0, 018 0, 39± 0, 018 0, 06± 0, 012 Lu ng e 0,6 2 * ± 0, 0771 1, 43± 0, 23 0, 81± 0, 16 0, 386 * ± 0, 058 0, 96± 0, 1 0, 574± 0, 028 Ka da ve r 35, 34± 0, 82 46, 74± 3, 74 11, 4± 3, 4 32, 76± 2, 36 43, 04± 2, 80 10, 28± 2, 81 WT Mä us en u nd A B C A 1-BA C -TG M äu se n w ur de v ie r St un de n vo r B eg in n de s Ex pe ri m en te s da s Fu tt er e nt zo ge n, d ie Ti er e ha tt en j ed oc h fr ei en Zu ga ng z u Tr in kw asser . Ü ber d ie Sc hw an zv en e w ur de j ed er M au s 125 I-TC -/[ 3 H] C E t-HDL i nj iz ie rt . Ve nö se B lu te nt na hme n er fo lg te n 0, 16 , 0 ,5 , 2 , 6 , 2 0 un d 24 S tu nd en n ac h de r In je kt io n. 2 4 S tu nd en n ac h In je kt io n de s m ar ki er te n H D L e rhi el te n di e T ie re e ine Ü be rdos is e ine s A nä st he ti kum s/S ed ativ um s. U nm itte lb ar n ac h de m T od w ur de n die T ie re tr an sk ar dia l m it S alz lö su ng p er fu nd ie rt. D ie Or ga ne d er T ie re wu rd en e nt no mme n un d ei ns ch li eß li ch Ka da ve r ho mo ge ni si er t. An sc hl ie ße nd f ol gt e di e di re kt e B es ti mmu ng d er 125 I-Ra di oa kt iv it ät ; di e A na ly se d er [ 3 H] -Ak ti vi tä t er fo lg te nach L ip id ex tr ak ti on. D ie P la sm a-FC R ’s und di e O rga n-FC R 's w ur de n be re ch ne t w ie i n M et ho de n be sc hr ie be n. W T: n =6 Mä us e. A B C A 1-BA C -TG : n= 5 Mä us e. A ng ab en si nd Mi tt el w er te± S tan dar df eh ler d er S tan dar dab w ei ch un g. * p< 0,0 5 ( S tu de nt's -t -Te st ) im V er gle ic h z u d en W T -Ti er en .
