Zentrumsabteilung für Lebensmitteltoxikologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Untersuchungen zum intestinalen Metabolismus von Retinol und dessen aktivem Metaboliten
all-trans-Retinsäure
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines
DOCTOR MEDICINAE VETERINARIAE
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Silke Meyer
aus Bremerhaven
Hannover 2000
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. Nau 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Coenen
Tag der mündlichen Prüfung: 01.12.2000
1. Einleitung 15
2. Schrifttum 18
2.1 „Vitamin A“ und seine physiologischen Funktionen 18
2.2 Natürliche und synthetische Retinoide 18
2.3 Retinoid-bindende Proteine 20
2.3.1 Retinol-bindendes Protein (RBP) 20
2.3.2. Intrazelluläre Bindeproteine (CRBP, CRABP) 20
2.3.3 Nukleäre Retinoid-Rezeptoren 21
2.4 Aufnahme und Metabolismus von Vitamin A und Retinsäure 22
2.4.1 Die Biosynthese von Retinsäuren 24
2.4.2 Phase-I-Metabolismus von Retinsäuren 26
2.4.3 Phase-II-Metabolismus von Retinsäuren 27
2.5 Genregulation durch Retinoide und Retinoid-Rezeptoren 28
2.6 Retinoide in der Krebstherapie 30
2.7 Phytol und Phytansäure 30
2.8 Cytochrom P450-Enzyme und ihre Verbreitung im Gastrointestinaltrakt 31 2.9 Caco-2 Zellen als intestinales Metabolismus-Modell 32
3. Material und Methoden 34
3.1 Material 34
3.1.1 Chemikalien 34
3.1.1.1 Retinoide 34
3.1.1.2 Sonstige Reagenzien, Bezugsnachweis 35
3.1.1.3 Fertigmedien für die Zellkultur 37
3.1.1.4 Verwendete Puffer 37
3.1.2 Verbrauchsmaterialien und Laborhilfsmittel 37
3.1.3 Supersomen 38
3.1.4 Permanente Zellinien 38
3.1.5 Humanes Untersuchungsmaterial 38
3.1.6 Untersuchungsmaterial vom Schwein 38
3.2.1.1 Isolierung und subzelluläre Fraktionierung von Enterozyten 39 aus der Mucosa des Duodenums (Mensch, Schwein)
3.2.1.2 Proteinbestimmung 41
3.2.1.3. Metabolisierung von Retinol durch Cytosol und 41 Mikrosomen des Dünndarms (Mensch, Schwein)
3.2.1.4 Hemmung des oxidativen Metabolismus von Retinol zu 42 all-trans-RA
3.2.2 Intestinaler in vitro-Metabolismus von all-trans-Retinsäure 42 3.2.2.1 Metabolisierung durch Caco-2 und TC7 Zellen 42
3.2.2.1.1 Methoden zur Zellkultur 43
3.2.2.1.2 Optimierung der Inkubationszeiten und 44 Konzentrationen für Induktion und Metabolismus
3.2.2.1.3 Induktion der CYP-Enzyme in den Zellen 44 3.2.2.1.4 Chemische Hemmung der CYP-Enzyme 45 3.2.2.2 Metabolisierung durch humane Dünndarmmikrosomen 45
3.2.2.3 Metabolisierung durch Supersomen 46
3.2.3 HPLC-Analytik von Retinoiden 46
3.2.3.1 Verwendete Geräte 46
3.2.3.2 Probenaufbereitung 47
3.2.3.3 HPLC-Analyse 47
3.2.4 Untersuchungen zur Genregulation und Expression der CYP-Enzyme 49 3.2.4.1 Induktion von CYP26 durch rezeptorspezifische Retinoide 49 3.2.4.2 Isolierung von RNA aus humanem Darm, Caco-2 und 50
Caco-2-TC7 Zellen
3.2.4.3 Gelelektrophorese zur Auftrennung der RNA 52
3.2.4.4 RT-PCR Analyse 53
3.2.4.4.1 cDNA-Synthese 53
3.2.4.4.2 PCR Amplifizierung mit Oligonukleotiden 54
3.2.5 Statistik 55
4.1.1 Metabolisierung von Retinol durch Enterozytencytosol 56 des Dünndarms (Schwein)
4.1.2 Metabolisierung von Retinol durch Enterozytencytosol 58 des humanen Dünndarms
4.1.3 Hemmung des oxidativen Metabolismus von Retinol zu 60 all-trans-Retinsäure im humanen Enterozytencytosol
4.1.4 Phytol als konkurrierendes Substrat 61
4.2 Intestinaler in vitro-Metabolismus von all-trans-Retinsäure 63 4.2.1 Metabolisierung von all-trans-RA durch humane 63
Dünndarmmikrosomen
4.2.2 Metabolisierung von all-trans-RA durch Supersomen 64 4.2.3 Metabolisierung von all-trans-RA durch Caco-2- und 65
Caco-2-TC7-Zellen
4.2.3.1 Untersuchung von Caco-2 Zellen auf Expression von CYP26 66 und Optimierung der zu verabreichenden Konzentrationen an
all-trans-RA und Inkubationszeiten
4.2.3.2 Nachweis der spezifischen Induktion der einzelnen 69 CYP-Enzyme über RT-PCR
4.2.3.3 Metabolisierung von all-trans-RA durch CYP1A1 71
4.2.3.3.1 Induktion von CYP1A1 71
4.2.3.3.2 Hemmung von CYP1A1 72
4.2.3.4 Metabolisierung von all-trans-RA durch CYP3A 73 4.2.3.5 Metabolisierung von all-trans-RA durch CYP26 74
4.2.3.5.1 Induktion von CYP26 74
4.2.3.5.2 Hemmung von CYP26 75
4.2.4 Untersuchung von humanem Darm auf Expression von CYP26 76
Induktion von CYP26, Kombinationen mit dem synthetischen RXR-Liganden CD2608
4.3.2 Der natürliche RAR-Ligand all-trans-RA sowie der synthetische 83 RARα-Ligand Am580 in Kombination mit dem synthetischen
RXR-Liganden CD3159
4.3.3 Der natürliche RAR-Ligand all-trans-RA sowie der synthetische 86 RARα-Ligand Am580 in Kombination mit dem natürlichen
RXR-Liganden Phytansäure
5. Diskussion 91
6. Zusammenfassung 104
Summary 108
7. Literaturverzeichnis 112
Abb. 2.1: Retinoide der ersten Generation 19 Abb. 2.2: Strukturformeln einiger synthetischer Retinoide 20 Abb. 2.3: Strukturformeln von all-trans-4-hydroxy-RA und 13-cis-4-oxo-RA 27 Abb. 2.4: Intrazellulärer Metabolismus von Retinol zu aktiven RA-Isomeren 29
und deren Wirkung als Liganden für nukleäre Transkriptionsfaktoren
Abb. 2.5: Strukturformeln von Phytol und Phytansäure 31
Abb. 3.1: Standardchromatogramm polare Retinoide 49
Abb. 4.1a: Chromatogramme: Bildung von all-trans-RA aus 25 µM, 50 µM und
100 µM Retinol im Cytosol aus Dünndarmenterozyten des Schweins 57 Abb. 4.1b: Enzymkinetik der Oxidation von Retinol zu all-trans-Retinsäure
durch Cytosol aus Dünndarmenterozyten (Schwein) 57
Abb. 4.1c: Lineweaver-Burk-Plot 58
Abb. 4.2a: Enzymkinetik der Oxidation von Retinol zu all-trans-Retinsäure
durch Cytosol aus Dünndarmenterozyten (Mensch) 59
Abb. 4.2b: Lineweaver-Burk-Plot 59
Abb. 4.3: Hemmung der Oxidation von Retinol zu all-trans-RA durch
4-Methylpyrazol 60
Abb. 4.4: Hemmung der Oxidation von Retinol zu all-trans-RA durch Citral 61 Abb. 4.5: Hemmung der Oxidation von Retinol zu all-trans-RA durch Phytol 62 Abb. 4.6: Metabolisierung von all-trans-RA durch humane
Dünndarmmikrosomen und Lebermikrosomen 64
Abb. 4.7: Metabolisierung von all-trans-RA durch Supersomen 65 Abb. 4.8a: RT-PCR Analyse, Expression der CYP26 mRNA in Caco-2 Zellen
nach Behandlung mit all-trans-RA in Konzentrationen von
0,001 µM bis 10 µM über 24 h 67
Abb. 4.8b: Densitometrische Auswertung von Abb. 4.8 a, Intensität der
Genexpression von CYP26 im Verhältnis zu ß-Actin 67 Abb. 4.9: RT-PCR Analyse, Expression der CYP26 mRNA in Caco-2 Zellen
nach Behandlung mit all-trans-RA in einer Konzentration von 1 µM
für die Dauer von 20 min bis 48 h 68
Abb. 4.10A: Bildung der Phase-I-Metaboliten von all-trans-RA im Zeitverlauf
nach Induktion von CYP26 69
Abb 4.10B: Bildung von all-trans-4-hydroxy-RA in induzierten und
unbehandelten Caco-2 Zellen 69
Abb. 4.12: RT-PCR Analyse, Expression der CYP3A4- und CYP3A5 mRNA in
Caco-2-TC7 Zellen nach Behandlung mit Rifampicin 70 Abb. 4.13a: Chromatogramme. Metabolismus von all-trans-RA in Caco-2 Zellen.
Dargestellt sind die entstandenen Metaboliten nach Induktion mit dem CYP1A1-Induktor ß-Naphthoflavon im Vergleich zur nicht induzierten
Kontrolle 71
Abb. 4.13b: Metabolismus von all-trans-RA in Caco-2 Zellen (Metaboliten
nach Induktion mit dem CYP1A1-Induktor ß-Naphthoflavon) 72 Abb. 4.14: Hemmung des Metabolismus von all-trans-RA in Caco-2 Zellen
durch α-Naphthoflavon 73
Abb. 4.15: Metabolismus von all-trans-RA in Caco-2-TC7 Zellen (Metaboliten
nach Induktion mit dem CYP3A-Induktor Rifampicin) 74 Abb. 4.16: Metabolismus von all-trans-RA in Caco-2 Zellen (Metaboliten nach
Induktion von CYP26 mit 1 µM all-trans-RA) 75 Abb. 4.17: Hemmung des Metabolismus von all-trans-RA in Caco-2 Zellen
durch Liarozol 76
Abb. 4.18: RT-PCR Analyse, Genexpression der CYP26 mRNA in Caco-2
Zellen und Mucosa des humanen Darmes 77
Abb. 4.19a: RT-PCR Analyse, Expression der CYP26 mRNA nach Behandlung
von Caco-2 Zellen mit verschiedenen RAR-Agonisten 79 Abb. 4.19b: Densitometrische Auswertung von Abb.4.20 a, Intensität der
Genexpression von CYP26 im Verhältnis zu ß-Actin 79 Abb. 4.20a: RT-PCR Analyse, Expression der CYP26 mRNA nach Behandlung
von Caco-2 Zellen mit verschiedenen RXR- und RAR-Agonisten 80 Abb. 4.20b: Densitometrische Auswertung von Abb.4.20 a, Intensität der
Genexpression von CYP26 im Verhältnis zu ß-Actin 80 Abb. 4.21: Metabolismus von all-trans-RA in Caco-2 Zellen nach Induktion
mit dem natürlichen RAR-Liganden all-trans-RA und dem
synthetischen RXR-Liganden CD2608 81
Abb. 4.22: Metabolismus von all-trans-RA in Caco-2 Zellen nach Induktion mit dem synthetischen RARα-Liganden Am580 und dem
synthetischen RXR-Liganden CD2608 82
Abb. 4.23a: RT-PCR Analyse, Expression der CYP26 mRNA nach Behandlung
von Caco-2 Zellen mit verschiedenen RXR- und RAR-Agonisten 84 Abb. 4.23b: Densitometrische Auswertung von Abb.4.23 a, Intensität der
Genexpression von CYP26 im Verhältnis zu ß-Actin 84
RXR-Liganden CD3159 85 Abb. 4.25a: RT-PCR Analyse, Expression der CYP26 mRNA in Caco-2 Zellen
nach Behandlung mit Phytansäure und all-trans-RA 87 Abb. 4.25b: Densitometrische Auswertung von Abb.4.25 a, Intensität der
Genexpression von CYP26 im Verhältnis zu ß-Actin 87 Abb. 4.26a: RT-PCR Analyse, Expression der CYP26 mRNA in Caco-2
Zellen nach Behandlung mit Phytansäure und Am580 88 Abb. 4.26b: Densitometrische Auswertung von Abb.4.25 a, Intensität der
Genexpression von CYP26im Verhältnis zu ß-Actin 88 Abb. 4.27: Metabolismus von all-trans-RA in Caco-2 Zellen nach Induktion
mit dem natürlichen RAR-Liganden all-trans-RA und dem
natürlichen RXR-Liganden Phytansäure 89
Abb. 4.28: Metabolismus von all-trans-RA in Caco-2 Zellen nach Induktion mit dem synthetischen RAR-Liganden Am580 und dem natürlichen
RXR-Liganden Phytansäure 89
TABELLENVERZEICHNIS
Tab. 3.1: Maximale Absorptionswellenlängen (λmax) und
Extinktions-koeffizienten (ε) der verwendeten Retinoide 35
Tab. 3.2: Verwendete Zellinien und ihre Herkunft 38
Tab. 3.3: Bedingungen der HPLC-Methode 48
Tab. 3.4: Verwendete Rezeptor-selektive Liganden 50
Tab. 3.5: Für die PCR verwendete Primer 55
Abb. Abbildung
ADH Alkohol-Dehydrogenase AlDH Aldehyd-Dehydrogenase
AUFS engl. Absorption Units Full Scale ARAT Acyl-CoA: Retinol Acyl-Transferase
bp Basenpaar
BSA Rinserserumalbumin (bovine serum albumin) cDNA engl. complementary desoxyribonucleic acid CEH Carboxylester-Hydrolase
CRABP Zelluläres Retinsäure-bindendes Protein (cellular retinoic acid-binding protein)
CRBP Zelluläres Retinol-bindendes Protein (cellular retinol-binding protein)
CYP Cytochrom P450
DMEM Dulbecco`s Modified Eagles Medium DMSO Dimethylsulfoxid
DNA engl. desoxyribonucleic acid DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
ELISA engl. enzyme-linked immunosorbant assay ER Endoplasmatisches Retikulum
FCS Fetales Kälberserum (fetal calf serum) g Vielfaches der Erdbeschleunigung GTC Guanidinumthiocyanat
IC50 Halbmaximale Hemmkonzentration KM Michaelis-Menten-Konstante LRAT Lecithin: Retinol Acyl-Transferase
min Minute(n)
MOPS 3-(N-Morpholino) Propansulfonsäure mRNA engl. messenger ribonucleic acid NAD+ Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid
NADPH Nicotinamidadenindinucleotid (oxidierte Form)
NEAA Nicht essentielle Aminosäuren (non essential amino acids)
neg negativ
OD Optische Dichte
PCR engl. polymerase chain reaction
PPAR Peroxisomen-Proliferator aktivierter Rezeptor RA Retinsäure (retinoic acid)
RAR Retinsäure-Rezeptor (retinoic acid receptor) RBP Retinol-bindendes Protein (retinol-binding protein) RNA engl. ribonucleic acid
RoDH Retinol-Dehydrogenase
ROH Retinol
RT-PCR engl. reserve transkriptase-polymerase chain reaction RXR Retinoid X Rezeptor
SCAD Dehydrogenase kurzkettiger Alkohole (short chain alcohol dehydrogenase) SD Standardabweichung
Tab. Tabelle
TCDD 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin T-4-O-RA all-trans-4-oxo-Retinsäure
T-4-OH-RA all-trans-4-hydroxy-Retinsäure TTR Transthyretin (Präalbumin)
Vmax maximale Umsatzgeschwindigkeit
1. EINLEITUNG
Vitamin A ist für zahlreiche physiologische Funktionen im Körper von Bedeutung. Der aktive Metabolit ist hierbei in vielen Fällen all-trans-Retinsäure (all-trans-RA). Diese kommt in der Nahrung gar nicht oder nur in geringen Konzentrationen vor. Die endogenen Plasmakonzentrationen sind sehr niedrig und liegen beim Menschen um 1 - 2 ng/ml (ECKHOFF u. NAU 1990; TANG u. RUSSEL 1990). Die Zellen synthetisieren daher Retinsäure aus Retinol. In in vitro-Versuchen konnte die Biosynthese von Retinsäure aus Retinol in zahlreichen Retinoid-abhängigen Geweben (Leber, Trachea, Haut, Hoden, Lunge, Niere) von Hamster, Maus und Ratte nachgewiesen werden (FROLIK et al. 1981; NAPOLI u.
RACE 1987; CONNOR u. SMIT 1987a).
Im Dünndarm erfolgt eine direkte Aufnahme von Retinol aus der Nahrung. Da Epithelzellen in hohem Maße für Wachstum und Differenzierung Retinol bzw. Retinsäure benötigen, sollten auch die Enterozyten des Dünndarms in der Lage sein, aus dem aufgenommenen Retinol Retinsäure zu synthetisieren. Bisher wurde die Synthese von Retinsäure aus Retinol im Dünndarm von Ratte und Maus beschrieben (NAPOLI u. RACE 1987; POSCH et al.
1989). Hierzu wurden jedoch keinerlei Daten publiziert.
Ein weiterer Aspekt ist die Aufnahme von Phytol mit der Nahrung, welches Bestandteil des Chlorophyllmoleküls und Vorläufersubstanz von Phytansäure ist. Phytansäure bindet an einen nukleären Retinoid-Rezeptor (RXRα) und weist somit gemeinsame Signalwege mit den Retinoiden auf (LE MOTTE et al. 1996). Hieraus ergibt sich die Überlegung, daß bereits Phytol ein konkurrierendes Substrat zu Retinol bei der Biosynthese von all-trans-RA sein könnte und diese damit beeinflussen würde.
Aus all-trans-RA werden in einem weiteren Schritt polare Metaboliten (4-hydroxy-RA, 4- oxo-RA, 5,6-epoxy-RA) geformt. Diese sind zum Teil selbst aktive Metaboliten (all-trans-4- oxo-RA), zum Teil sind es aber auch Abbauprodukte. Ein solcher Phase-I-Metabolismus von RA wurde bislang überwiegend in der Leber nachgewiesen (ROBERTS et al. 1992). Um mehr über die physiologische Rolle der Retinoide im Dünndarmepithel zu erfahren, ist es von Bedeutung, herauszufinden, ob in den Enterozyten neben der Biosynthese bereits ein Phase-I-
Metabolismus von Retinsäure stattfindet und welche Enzyme daran beteiligt sind. Dieses ist auch von klinischer Relevanz, da Retinsäuren zur Behandlung von Tumoren, insbesondere zur Behandlung von akuter promyelocytischer Leukämie, eingesetzt werden. Ein bisher kaum gelöstes Problem ist die geringe Bioverfügbarkeit von all-trans-Retinsäure von etwa 50 % und die sich rasant entwickelnde Retinoid-Resistenz während der Therapie (REGAZZI et al.
1997). Ein intestinaler Metabolismus von Retinsäure könnte möglicherweise zu diesem Effekt beitragen.
Von besonderem Interesse ist hierbei auch das kürzlich entdeckte CYP26 (P450RAI), ein P450-Enzym, welches speziell Retinsäure metabolisiert und auch durch diese induziert wird.
RAY et al. (1997) konnten dieses Enzym in humaner Leber, Gehirn und Plazenta nachweisen.
Bis heute liegt noch kein Nachweis von CYP26 im menschlichen Darm vor, es könnte aber auch hier eine entscheidende Rolle im Metabolismus von all-trans-Retinsäure spielen.
Retinsäuren sind Liganden für nukleäre Rezeptoren (RARs und RXRs) und üben über diese ihre Effekte auf die Genregulation aus. Welche Rezeptoren an der Induktion von CYP26 beteiligt sind, wurde bisher nur in geringem Ausmaß an Zellkulturen (HCT 116- und F9 Zellen) untersucht (SONNEVELD et al. 1998; ABU-ABED et al. 1998), so daß auch hier ein Bedarf an weiteren Untersuchungen besteht.
Das Ziel der vorgelegten Arbeit ist deshalb:
- die Biosynthese von all-trans-Retinsäure aus Retinol in Dünndarmenterozyten von Mensch und Schwein nachzuweisen und die Beeinflussung der Biosynthese durch Phytol als konkurrierendes Substrat zu untersuchen
- der Nachweis des Phase-I-Metabolismus von all-trans-RA in humanen Dünndarmmikrosomen
- der Nachweis des Phase-I-Metabolismus von all-trans-RA in Supersomen,die überexprimierte Cytochrom P450-Enzyme enthalten
- der Nachweis des Phase-I-Metabolismus von all-trans-RA in Caco-2 Zellen, welche in differenziertem Zustand die morphologischen und biochemischen Eigenschaften von Dünndarmenterozyten haben (DELIE u. RUBAS 1997) mit Identifizierung der beteiligten CYP-Enzyme
- die Untersuchung der an der Induktion von CYP26 beteiligten nukleären Rezeptoren in Caco-2 Zellen mit Hilfe von Phytansäure sowie verschiedener natürlicher und synthetischer Retinoide, die als rezeptorselektive Liganden fungieren
2. SCHRIFTTUM
2.1 „Vitamin A“ und seine physiologischen Funktionen
Der Begriff „Vitamin A“ umschreibt jedes Retinoid, das eine biologische Aktivität aufweist, die qualitativ der von Retinol entspricht (SPORN u. ROBERTS 1985; BLOMHOFF et al.
1992). Nach CHYTIL (1984) sollte der Begriff etwas exakter definiert werden und nur all- trans-Retinol und all-trans-Retinylester umfassen.
Vitamin A und seine Metaboliten sind für eine Vielzahl physiologischer Funktionen von Bedeutung. Es ist essentiell für die Oogenese, Spermatogenese sowie für die plazentare und embryonale Entwicklung (ESKILD u. HANSON 1994). Auch die Proliferation und Differenzierung von Epithelien sind von der Vitamin-A-Zufuhr abhängig. WOLBACH und HOWE (1925) sowie FELL und MELLANBY (1953) stellten hierzu Untersuchungen an Ratten bzw. in Kultur gehaltener Hühnerepidermis an. Im Auge ist Vitamin A für den Sehzyklus von Bedeutung, der von WALD bereits in den dreißiger Jahren untersucht wurde (WALD 1934; WALD 1968). Das aktive Retinoid ist hier 11-cis-Retinaldehyd. Die Bedeutung von Vitamin A für das Wachstum wurde mehrfach in Versuchen an Ratten untersucht. Vitamin-A-defiziente Ratten wuchsen mit verminderter Rate gegenüber den Tieren, die in ausreichender Menge mit Vitamin A versorgt worden waren (UNDERWOOD 1984). Die Gabe geringer Mengen all-trans-RA führte zu einer Wiederherstellung des Wachstums (ZILE u. DELUCA 1968). Die Wirkung von Vitamin A auf das Immunsystem wurde von ROSS und HÄMMERLING (1994) in tierexperimentellen Studien aufgezeigt. Die zelluläre als auch die humorale Immunität war bei Tieren mit Vitamin-A-Mangel geschwächt, konnte allerdings durch Gabe von Retinol wiederhergestellt werden. Auch für die, durch eine erhöhte Infektionsanfälligkeit bedingte, hohe Kindersterblichkeit in der Dritten Welt wird ein Mangel an Vitamin A als Hauptursache angesehen. Epidemiologische Studien an erkrankten Kindern in Asien und Afrika haben gezeigt, daß eine Vitamin-A-Supplementation zu einer signifikanten Reduktion der Sterblichkeit führte (SOMMER 1994).
2.2 Natürliche und synthetische Retinoide
Unter dem Begriff Retinoide werden Stoffe mit einer Strukturverwandschaft zu Vitamin A oder einer mit Vitamin A vergleichbaren biologischen Aktivität zusammengefaßt.
Die Stammkomponente der Retinoide ist all-trans-Retinol (Retinol oder Vitamin-A-Alkohol).
Es handelt sich um einen primären Alkohol mit einer molekularen Masse von 286,5. Unter den Gesamtbegriff „Vitamin A“ fallen außerdem noch Retinylester, die Konjugate des Alkohols mit Fettsäuren (z.B. Palmitin-, Stearin-, Öl- oder Linolsäure) darstellen. Die Oxidation des Alkohols führt zum all-trans-Retinaldehyd (all-trans-Retinal), das wiederum weiter oxidiert werden kann zu all-trans-Retinsäure (all-trans-RA, Tretinoin). Diese drei Retinoide stellen die wichtigsten Vertreter der natürlich vorkommenden Retinoide dar (s.
Abbildung 2.1) und zählen zu den Retinoiden der ersten Generation. Die Struktur dieser Moleküle läßt sich generell in drei Abschnitte einteilen: einen hydrophoben ß-Iononring, eine konjugierte Tetraen-Seitenkette und eine polare Endgruppe. Weitere natürliche Retinoide werden durch Isomerisierung, durch Phase-I- bzw. Phase-II-Metabolismus oder durch die bisher wenig aufgeklärte Umwandlung zu sog. retro-Retinoiden gebildet. Von der Retinsäure (RA) sind neben der all-trans-Form verschiedene Stellungs-Isomere bekannt (u.a. 9-cis-RA, 11-cis-RA, 13-cis-RA und 9,13-di-cis-RA). Auch von Retinol und Retinylestern sind Stellungs-Isomere beschrieben (BRINKMANN et al. 1995).
1 2 3
4 5
6 16
17 7
8 9
18
19 20
11 10 12
13 14
15
All-trans-Retinol All-trans-Retinaldehyd All-trans-Retinsäure
Abb. 2.1: Retinoide der ersten Generation.
Das Ersetzen des ß-Iononrings durch einen substituierten Benzolring führt zu aromatischen Komponenten, von denen einige einen höheren therapeutischen Index als die natürlichen Retinoide aufweisen. Die so modifizierten, aktiven Komponenten gehören zu den Retinoiden der zweiten Generation. Ein Beispiel dafür stellt Etretinat dar (KLAUS 1990).
Retinoide der dritten Generation erhält man, indem die hohe Flexibilität der konjugierten Seitenkette natürlicher Retinoide durch den Einbau aromatischer Ringsysteme an verschiedenen Positionen so verringert wird, daß bestimmte starre Konformationen entstehen (CD437). Diese Strategie wurde kombiniert mit dem Einbau von Amiden, Sulfonamiden oder
anderen Gruppen, so z.B. bei Am580 (WILLHITE et al. 1996) oder AGN191701 (s.
Abbildung 2.2).
Etretinat CD437 Am580 AGN191701
Abb. 2.2: Strukturformeln einiger synthetischer Retinoide.
2.3 Retinoid-bindende Proteine
2.3.1 Retinol-bindendes Protein (RBP)
Da Retinoide in Wasser eine sehr geringe Löslichkeit haben, müssen sie in wässriger Umgebung an Proteine gebunden sein. Im Blutkreislauf übernimmt Albumin als unspezifischer Träger für lipophile Komponenten diese Funktion. Für Retinol existiert im Plasma zudem ein spezifischer Träger, das Retinol-bindende Protein (RBP). Seine Aufgabe ist es, in der Leber gespeichertes Retinol aufzunehmen und über den Blutkreislauf zu Zielgeweben zu transportieren. An den Blutkreislauf abgegebenes holo-RBP (= Komplex aus Retinol und RBP) bindet an ein weiteres Protein, das Transthyretin (TTR, 55 kDa). Durch die Bildung dieser ternären Verbindung wird die renale Elimination des holo-RBP-Komplexes durch glomeruläre Filtration verhindert (WOLF 1995).
2.3.2. Intrazelluläre Bindeproteine (CRBP, CRABP)
Außer dem extrazellulären Bindeprotein gibt es auch spezifische, intrazelluläre Trägerproteine für Retinoide. Vier zelluläre Retinoid-bindende Proteine, die zur Familie der Fettsäure-bindenden Proteine (fatty acid-binding protein, FABP) gehören, sind bekannt. Diese Proteine besitzen untereinander einen hohen Grad an Ähnlichkeit und sind auch im Laufe der Evolution in hohem Maße konserviert geblieben (ONG 1994). Es gibt zwei zelluläre Retinol- bindende Proteine, CRBP I und CRBP II (cellular retinol-binding protein). Beide können all- trans-Retinol, 13-cis-Retinol und all-trans-Retinaldehyd binden (ONG u. CHYTIL 1975 a).
CRBP I ist ubiquitär im Organismus verteilt und kommt in höchsten Konzentrationen in Leber, Niere und Nebenhoden vor (PORTER et al. 1983; KATO et al. 1985). Im Gegensatz
dazu wird CRBP II fast ausschließlich in den Epithelzellen des Dünndarms exprimiert (CROW u. ONG 1985; ONG 1984). Diese Tatsache läßt darauf schließen, daß CRBP II eine spezielle Funktion bei der oralen Aufnahme von Vitamin A spielt.
Zur Bindung von Retinsäuren stehen zwei weitere Proteine zur Verfügung, CRABP I und CRABP II (cellular retinoic acid-binding protein). Beide weisen eine sehr hohe Bindungsaffinität zu all-trans-RA sowie deren Metaboliten 4-hydroxy-, 4-oxo- und 18- hydroxy-RA auf (ONG u. CHYTIL 1975 b; BAILEY u. SIU 1988), wohingegen die Bindung von 13-cis-RA oder 9-cis-RA wesentlich geringer ausgeprägt ist (FIORELLA et al. 1993;
ALLENBY et al. 1993). Der Metabolismus von an CRABP gebundener Retinsäure ist etwa 7 fach effizienter als der von freier Retinsäure (REGAZZI et al. 1997). CRABP I wird hauptsächlich in Gehirn, Augen, Hoden, Nebenhoden, Ovarien und Uterus exprimiert, CRABP II fast ausschließlich in der Haut (ONG et al. 1982; ERIKSSON et al. 1987;
BLANER et al. 1987; GIGUERE et al. 1990).
2.3.3 Nukleäre Retinoid-Rezeptoren
Ein Großteil der vielfältigen Wirkungen der Retinoide - insbesondere der Retinsäuren - wird über nukleäre Transkriptionsfaktoren vermittelt. Zwei Familien nukleärer Retinoid- Rezeptoren wurden entdeckt: Die Retinsäure-Rezeptoren (Retinoic Acid Receptors, RAR) und die Retinoid X Rezeptoren (Retinoid X Receptors, RXR). Sie sind Mitglieder einer Superfamilie, zu denen der Thyroidhormon-Rezeptor (THR), der Vitamin-D-Rezeptor (VDR) und der Peroxisomen-Proliferator aktivierte Rezeptor (PPAR) sowie einige Rezeptoren mit bisher noch nicht identifizierten Liganden (orphan receptors) zählen. Bis jetzt wurden bei der Maus und beim Menschen drei Gene identifiziert, die für hochgradig verwandte RAR- Proteine kodieren (RARα, RARβ, RARγ). Zusätzlich wurden ebenfalls drei verschiedene RXR exprimierende Gene (RXRα, RXRβ, RXRγ) in der Maus, im Menschen sowie in Ratten, Hühnern und Fröschen lokalisiert (LEID et al. 1992; MANGELSDORF 1994).
Die nukleären Rezeptoren weisen eine DNA-Bindungsdomäne (DBD) und eine Liganden- Bindungsdomäne (LBD) auf. Diese Domänen zeigen ein hohes Maß an Übereinstimmung unter den Mitgliedern einer Familie. Im Gegensatz dazu wurde eine wesentlich geringere Homologie zwischen RAR und RXR festgestellt, besonders in der LBD (LEVIN et al. 1992;
LEID et al. 1992).
Retinoid-Rezeptoren wirken als Liganden-aktivierte Transkriptionsfaktoren, indem sie an bestimmte DNA-Sequenzen (Response-Elemente) in der Promotorregion von Zielgenen binden. All-trans-RA ist ein hochaffiner Ligand für den RAR, aber nicht für den RXR. 9-cis- RA bindet an beide Rezeptor-Familien (LEVIN et al. 1992; HEYMANN et al. 1992). Einige synthetische Retinoide binden gezielt an bestimmte RAR-Subtypen, so z.B. Am 580 an den RARα (HASHIMOTO u. SHUDO 1991), CD 2019 an den RARß und CD 437 an den RARγ (DARMON et al. 1989; BERNARD et al. 1992), andere binden an den RXR (CD 3159, CD 2608) (KOCH et al. 1996). Kürzlich konnte gezeigt werden, daß auch einige nichtzyklische Terpene (z.B. Methopren) sowie Phytansäure RXR-Liganden darstellen, die aber nicht die RAR aktivieren (HARMON et al. 1995; LE MOTTE et al. 1996).
2.4 Aufnahme und Metabolismus von Vitamin A und Retinsäure
Der Bedarf an Vitamin A wird bei Mensch und Tier über die Nahrung gedeckt. Die Aufnahme erfolgt entweder in Form von Retinol, Retinylestern oder über Carotinoide, die Vorläufersubstanzen von Vitamin A. In der Folge soll nur auf Retinol bzw. Retinylester eingegangen werden. Hauptnahrungsquellen für Retinol und Retinylester sind Leber, Lebertran, Eigelb sowie Milch und Milchprodukte.
Retinylester stellen die Hauptform des in der Nahrung vorkommenden Vitamin A dar. Sie müssen im Darmlumen zunächst hydrolysiert werden, bevor sie in die Darmepithelzellen aufgenommen werden können. Die Hydrolyse der Ester wird von zwei Enzymen aus dem Pankreas-Sekret, der Pankreas-Lipase und der Carboxylester-Hydrolase (CEH) katalysiert.
Nach der Hydrolyse kann unverestertes Retinol, das auch in geringen Mengen als solches in der Nahrung vorkommt, über die Bürstensaummembran in die Epithelzellen des Dünndarms aufgenommen werden. Hierbei scheint ein spezifisches Trägerprotein eine Rolle zu spielen, da bei geringen Konzentrationen (0,2 - 0,3 µM Retinol) eine hyperbolische Aufnahmekinetik beobachtet wurde, die erst bei höheren Konzentrationen sättigbar war (HOLLANDER u.
MURALIDHARA 1977). Bei sehr hohen, unphysiologischen Konzentrationen fand einfache, passive Diffusion statt. Auch Proteine scheinen eine Rolle bei der Aufnahme von Retinol in die Enterozyten zu spielen. Durch in vitro-Experimente konnte gezeigt werden, daß ß- Laktoglobulin, ein Protein, das in der Milch verschiedener Spezies vorkommt und sehr große strukturelle Ähnlichkeiten zu dem spezifischen Plasmaprotein RBP aufweist, Retinol bindet
und die Aufnahme des Komplexes in Enterozyten schneller abläuft als die des freien Retinols (RASK u. PETERSON 1976; SAID et al. 1989; PERVAIZ u. BREW 1985).
Nach der Aufnahme von Retinol in die Enterozyten findet eine Wiederveresterung des Vitamin-A-Alkohols mit langkettigen Fettsäuren statt. Zwei mikrosomale Enzyme wurden identifiziert, die diesen Prozeß ausführen: eine Acyl-CoA:Retinol-Acyltransferase (ARAT) und eine Lecithin:Retinol-Acyltransferase (LRAT). ARAT kann freies Retinol in vitro verestern, ist aber nicht in der Lage, CRBP II-gebundenes Retinol als Substrat zu nutzen (ONG et al. 1987). LRAT hingegen ist in der Lage, sowohl freies als auch gebundenes Retinol zu verestern (MAC DONALD u. ONG 1988). Da unter physiologischen Bedingungen nahezu das gesamte Retinol an CRBP II gebunden ist, wurde vermutet, daß LRAT hauptsächlich während der Aufnahme normaler Dosen die Veresterung durchführt, wohingegen ARAT nur überschüssiges Retinol nach Aufnahme hoher Dosen Vitamin-A und CRBP II-Sättigung verestert (BLOMHOFF et al. 1992). Nach der Bildung von Retinylestern werden diese zusammen mit Triglyzeriden, Carotinoiden, Phospholipiden, anderen fettlöslichen Vitaminen und spezifischen Apolipoproteinen in Chylomikronen verpackt, die anschließend in die intestinale Lymphe entlassen werden. Diese Chylomikronen gelangen dann in den allgemeinen Blutkreislauf, wo sie nach einigen biochemischen Prozessen in Chylomikronen-Remnants umformiert werden (GREEN u. GLICKMAN 1981). Während dieser Umwandlung verbleiben die Retinylester überwiegend in den Chylomikronen- Remnants. Ein geringer Anteil der Retinylester aus den Chylomikronen-Remnants wird von extrahepatischen Zellen des Fettgewebes, der Skelettmuskeln, der Niere und des Knochenmarks direkt aufgenommen, der Hauptteil jedoch gelangt zur Leber, wo er nach Spaltung und erneuter Veresterung in den Kupffer-Sternzellen gespeichert wird (BLOMHOFF et al. 1992). Bei Bedarf können die Retinylester wieder gespalten werden und von dort aus, oder nach Transport in die Parenchymzellen der Leber, an RBP gebunden in den Blutkreislauf freigesetzt werden.
Andere oral verabreichte Retinoide, wie z.B. die therapeutisch wirksamen Formen all-trans- RA (Tretinoin) oder 13-cis-RA (Isotretinoin), werden durch passive Diffusion in das Dünndarmepithel aufgenommen und anschließend an die Portalvene abgegeben, von wo aus sie nach Passage der Leber gebunden an Albumin in den allgemeinen Blutkreislauf gelangen
(BLANER u. OLSON 1994). Eine Speicherung von all-trans-RA findet in keinem Gewebe statt (REGAZZI et al. 1997).
2.4.1 Die Biosynthese von Retinsäuren
All-trans-RA ist in vielen biologischen Systemen der aktive Metabolit von Vitamin A. In mehreren in vitro-Studien erwies sie sich als 100 – 1000 fach potenter als Retinol (CULLUM u. ZILE 1985). Da all-trans-RA in der Nahrung überhaupt nicht oder nur in sehr geringen Konzentrationen vorkommt, ist ihre Bildung aus Retinol ein sehr wichtiger Schritt. Die endogenen Plasmakonzentrationen sind sehr niedrig und liegen beim Menschen um 1-2 ng/ml (ECKHOFF u. NAU 1990; TANG u. RUSSEL 1990).
Die Bildung von all-trans-RA aus Retinol läuft in einem zweistufigen Prozeß ab: zunächst wird in einem reversiblen Schritt Retinol zu Retinaldehyd und anschließend in einem irreversiblen Schritt Retinaldehyd zu Retinsäure oxidiert.
-Oxidation von Retinol zu Retinaldehyd
EMERICK et al. (1967) konnte die Biosynthese von all-trans-RA in der Leber von Ratten nach Gabe von physiologischen Dosen Retinol nachweisen. Später konnte diese Reaktion in nahezu allen Retinoid-abhängigen Geweben (Trachea, Haut, Hoden, Lunge) von Hamster, Maus und Ratte festgestellt werden (FROLIK et al. 1981; NAPOLI u. RACE 1987;
CONNOR u. SMIT 1987a). 4-Methylpyrazol, ein Inhibitor der Alkohol-Dehydrogenase, konnte die Synthese von all-trans-Retinsäure aus Retinol hemmen (NAPOLI u. RACE 1987).
In weiteren in vitro-Experimenten konnte gezeigt werden, daß die Oxidation zum Aldehyd zum einen durch cytosolische Alkohol-Dehydrogenasen katalysiert wird, zum anderen wurden Dehydrogenasen kurzkettiger Alkohole (short chain alcohol dehydrogenase, SCAD), Mitglieder einer zweiten Enzym-Familie, ebenfalls als für diesen Schritt physiologisch relevante Enzyme beschrieben (BOLEDA et al. 1993; DUESTER 1996; NAPOLI 1996).
Diese Enzyme kommen in Zellen und Geweben in relativ geringen Mengen vor und sind an Membranfraktionen gebunden. Viele dieser SCAD bevorzugen an CRBP I gebundenes Retinol als Substrat. Dies steht im Gegensatz zu den cytosolischen ADH, die nur freies Retinol umsetzen können. Beim Menschen existieren drei ADH-Isoenzyme, die in vitro NAD+-abhängig Retinol zu Retinaldehyd oxidieren können (ADH I, II und IV). Die humane
ADH IV zeigte sich als katalytisch aktivstes Isoenzym, so daß diesem Enzym auch in vivo eine Beteiligung an der Biosynthese von Retinsäuren zugeschrieben wird. Die Verwendung verschiedener Isomere des Retinols als Substrat zeigte, daß die humane ADH IV all-trans- Retinol und 9-cis-Retinol, aber nicht 13-cis-Retinol oxidieren kann. All-trans-RA und 13-cis- RA stellten sich dabei als potente Inhibitoren der Retinol-Oxidation dar (ALLALI-HASSANI et al. 1998). In vitro-Untersuchungen mit humaner, aufgereinigter ADH IV und aufgereinigtem CRBP I der Ratte ergaben, daß gebundenes Retinol nicht an die aktive Stelle der ADH IV gelangen kann (KEDISHVILI et al. 1998). Die Autoren schlossen daraus, daß der Beitrag von ADH-Isoenzymen an der Biosynthese von all-trans-RA von in der Zelle vorhandenem, freiem Retinol abhängt. Da unter physiologischen Bedingungen nahezu das gesamte Retinol an CRBP gebunden ist, ist die physiologische Bedeutung dieser Enzyme damit in Frage gestellt.
Von den mikrosomalen Enzymen der SCAD-Familie, die an CRBP I gebundenes Retinol als Substrat verwenden können, wurden bisher drei Retinol-Dehydrogenasen aus der Rattenleber geklont und charakterisiert (POSCH et al. 1991; CHAI et al. 1995; BOERMAN u. NAPOLI 1995; NAPOLI 1996). Sie wurden als Retinol-Dehydrogenasen Typ I-III (RoDH I-III) bezeichnet und sind hauptsächlich in der Leber exprimiert. RoDH I und II kommen außerdem in geringeren Mengen in Niere, Lunge , Gehirn und Hoden der Ratte vor. Auch in humaner Leber konnte eine mikrosomale Retinol-Dehydrogenase der SCAD-Familie (RoDH IV) identifiziert werden (GOUGH et al. 1998).
-Oxidation von Retinaldehyd zu Retinsäure
LEE et al. (1991) konnten zeigen, daß der zweite Oxidationsschritt bei der Bioaktivierung von Retinol zur Retinsäure in der Leber von Mäusen, durch cytosolische, substratunspezifische, NAD+-abhängige Aldehyd-Dehydrogenasen durchgeführt wird. Andere Arbeitsgruppen konnten vergleichbare Aktivitäten in cytosolischen Präparationen aus Niere, Hoden und Lunge der Ratte beobachten (BHAT et al. 1988a; BHAT et al. 1988b). CHEN u. JUCHAU (1997) stellten fest, daß Cytosol aus Rattenembryonen (incl. Fruchthüllen und Dottersack) die Oxidation von all-trans-, 9-cis- und 13-cis-Retinal zu Retinsäure katalysiert. Die Reaktion war durch Citral, einen Aldehyd-Dehydrogenase-Inhibitor, hemmbar. Die humane,
cytosolische Aldehyd-Dehydrogenase (ALDH1) aus der Leber akzeptierte neben all-trans- Retinal ebenfalls 9-cis- und 13-cis-Retinal als Substrat (BHAT u. SAMAHA 1999).
Eine Retinal-Dehydrogenase - als RalDH I bezeichnet - wurde aus Rattenleber isoliert, aufgereinigt und charakterisiert (POSCH et al. 1992; EL-AKAWI u. NAPOLI 1994). Diese cytosolische Dehydrogenase erkannte auch an CRBP I gebundenes Retinol und katalysierte die NAD+-abhängige Oxidation sowohl von all-trans- als auch von 9-cis-Retinal, wohingegen 13-cis-Retinal kein effektives Substrat war.
Untersuchungen mit Lebermikrosomen des Kaninchens ergaben, daß die Cytochrom P450- Isoformen 1A1, 1A2 und 3A6 ebenfalls in der Lage sind, Retinaldehyd zur entsprechenden Retinsäure zu oxidieren. CYP 1A1 wurde dabei die größte Bedeutung zugemessen (ROBERTS et al. 1992; RANER et al. 1996).
2.4.2 Phase-I-Metabolismus von Retinsäuren
Polare Metaboliten der Retinsäure-Isomere, die in vivo erzeugt werden, umfassen 5,6-epoxy- RA, 4-hydroxy-RA und 4-oxo-RA (BLANER u. OLSON 1994). Einige dieser Retinoide sind aktive Metaboliten in Bezug auf die Vermittlung der Funktion von Retinsäuren, so z.B. all- trans-4-oxo-RA (PIJNAPPEL et al. 1993), andere sind vermutlich Abbauprodukte. Mitglieder der Cytochrom P450-Familie (s. Abschnitt 2.8) scheinen eine Schlüsselrolle im Phase-I- Metabolismus von Retinsäuren zu spielen. ROBERTS et al. (1979) konnten zeigen, daß die Bildung polarer Metaboliten aus Retinsäure durch Enzymaktivitäten katalysiert wurde, die sich im 100.000g-Sediment von Leber- bzw. Darmhomogenaten des Hamsters befanden. Die Enzyme benötigten NADPH und Sauerstoff als Kofaktoren und waren durch Kohlenmonoxid inhibierbar. Spätere Untersuchungen ergaben, daß viele CYP-Isoformen aus Lebermikrosomen des Kaninchens (1A2, 2A4, 2B4, 2E1, 2E2, 2C3, 2G1 und 3A6) die 4- Hydroxylierung von Retinsäuren durchführen (ROBERTS et al. 1992). Der gleiche Reaktionsschritt wurde auch von CYP3A in Rattenlebermikrosomen (MARTINI u.
MURRAY 1993) und CYP2C8 in humanen Lebermikrosomen katalysiert (LEO et al. 1989;
NADIN u. MURRAY 1999).
Ein bis vor kurzem unbekanntes Cytochrom, CYP26 (P450RAI), das in der Lage ist, Retinsäuren zu metabolisieren und durch diese induziert wird, wurde unabhängig von mehreren Gruppen entdeckt. RAY et al. (1997) konnte dieses Enzym in humaner Leber, im
Gehirn und in der Plazenta nachweisen. Homologe von CYP 26 konnten sowohl beim Menschen (WHITE et al. 1997) als auch bei der Maus (ABU-ABED et al. 1998) geklont werden. Beide katalysierten die Bildung von 4-hydroxy-, 18-hydroxy- und 4-oxo-RA.
Da an CRABP I gebundene all-trans-RA durch mikrosomale Fraktionen wesentlich effizienter metabolisiert wird als freie all-trans-RA, wurde vermutet, daß CRABP I in der Zelle eine wichtige Rolle beim Abbau dieses aktiven Metaboliten spielt (FIORELLA u.
NAPOLI 1991).
All-trans-4-hydroxy-RA 13-cis-4-oxo-RA
Abb. 2.3: Strukturformeln von all-trans-4-hydroxy-RA und 13-cis-4-oxo-RA.
2.4.3 Phase-II-Metabolismus von Retinsäuren
Einen weiteren, wichtigen Schritt im Metabolismus von Retinsäuren stellt die Konjugation mit Glukuroniden dar. Die β-Glukuronidierung von RA-Isomeren wird durch eine mikrosomale UDP-Glukuronosyl-Transferase (UGT) im Dünndarm, in der Leber, in der Niere und in anderen Geweben ermöglicht (MILLER u. DE LUCA 1986; SALYERS et al. 1993;
SASS et al. 1994). Beim Menschen ist das für die Glukuronidierung von Retinoiden verantwortliche Isoenzym überwiegend in der Niere und nur in ganz geringen Mengen in der Leber exprimiert (EBNER u. BURCHELL 1993; SUTHERLAND et al. 1993; WOOSTER et al. 1993). Dennoch konnten auch in humaner Gallenflüssigkeit die Glukuronide der Phase-I- Metaboliten 13-cis-4-oxo-RA, 13-cis-16-hydroxy-RA und 13-cis-18-hydroxy-RA nachgewiesen werden (VANE et al. 1990). Ein Teil der über die Galle in den Darm ausgeschiedenen Glukuronide werden über den enterohepatischen Kreislauf zurück zur Leber transportiert (SWANSON et al. 1981). All-trans-RAG wurde endogen in menschlichem Plasma nachgewiesen (BARUA u. OLSON 1986), andere Arbeitsgruppen konnten das Vorkommen von Retinoid-Glukuroniden im Plasma sowohl endogen als auch nach Gabe von Retinoiden nicht bestätigen (TANG u. RUSSELL 1990; ECKHOFF et al. 1991). Nach Gabe pharmakologischer Dosen von all-trans-RA oder 13-cis-RA wurden jedoch hohe
Konzentrationen der entsprechenden RAG-Isomere im Plasma von Affen oder Mäusen gefunden (CREECH et al. 1991; KRAFT et al. 1991).
2.5 Genregulation durch Retinoide und Retinoid-Rezeptoren
Die Regulierung der Genexpression durch Retinoide und ihre Rezeptoren kann entweder transkriptional oder posttranskriptional erfolgen. Auf der transkriptionalen Ebene können Retinoid-Effekte durch Wechselwirkungen eines Retinoid-Rezeptors (s. 2.3.3) mit Retinoid- Response-Elementen (RARE oder RXRE) eines Gens vermittelt werden. Ein Überblick über die Signalwege ist in Abbildung 2.4 dargestellt. Sobald all-trans-RA oder 9-cis-RA im Cytoplasma einer Zelle vorliegen, gelangen sie über einen noch unbekannten Mechanismus in den Nukleus und binden dort an die entsprechenden Rezeptoren. Eine hochaffine Bindung eines RAR an eine RARE setzt eine Heterodimerisierung mit einem RXR voraus. RAR/RXR- Heterodimere binden an die meisten RARE und können somit in Gegenwart von all-trans-RA oder sehr geringen Konzentrationen 9-cis-RA als Transkriptionsaktivatoren fungieren. Im Gegensatz dazu kann eine DNA-Bindung der Rezeptoren in Abwesenheit der Liganden zu einer Genrepression führen. Liegen hohe Konzentrationen an 9-cis-RA vor, so wird die Bildung von RXR-Homodimeren bevorzugt, die dann an RXRE binden und ebenfalls zu einer Aktivierung der DNA führen (ZHANG et al. 1992). Unter den RA-responsiven Genen mit einem RARE in der Promotor-Region gibt es eine große Anzahl, die für Retinoid-bindende Proteine kodieren (mCRBP, mCRABP II, mRARα2, hRARα2, mRARβ2, hRARβ2, hRARγ; m=Maus, h= Mensch). Außerdem enthalten die Gene von CRBP II der Ratte, CRABP II der Maus und das humane Apolipoprotein A1 ein RXRE in ihren Promotoren (GIGUERE 1994).
Der RXR spielt bei der Signaltransduktion die Rolle eines „Master-Regulators“, da er auch als Heterodimerpartner für andere Rezeptoren der Steroid-/Thyroidhormon-Familie fungiert, so z.B. für den Vitamin-D-Rezeptor (VDR), den Thyroidhormon-Rezeptor (THR) und den Peroxisomen-Proliferator aktivierten Rezeptor (PPAR). Der RXR kann einerseits bei Abwesenheit des Liganden als stiller Partner fungieren, andererseits mit gebundenem Liganden als aktiver Heterodimerpartner zur Signaltransduktion beitragen bzw. diese verstärken.
RAR RXR
RXR RXR RARE
RXRE Retinol
(ROH)
ROH
all-trans-RA
9-cis-RA
Retinylester (Speicherform)
CRBP I
andere Metaboliten
CRABP
Genexpression
Genexpression
Nukleus Cytoplasma
all-trans-RA
Abb. 2.4: Intrazellulärer Metabolismus von Retinol zu aktiven RA-Isomeren und deren Wirkung als Liganden für nukleäre Transkriptionsfaktoren (ARNHOLD 1999).
Die Induktion von CYP26 über nukleäre Rezeptoren
SONNEVELD et al. (1998) untersuchten die Beteiligung verschiedener RAR-Subtypen an der Expression von CYP26 in RA-resistenten humanen Kolon-Karzinomzellen (HCT 116), die kein CYP26 exprimieren. Diese Zellen wurden mit verschiedenen RAR-Subtypen transfiziert. Die Expression der eingeschleusten Gene wurde mit Hilfe eines Western Blots überprüft. Die Expression des RARα und RARγ sowie in geringerem Maße des RARß konnte die Expression von CYP26 wiederherstellen. Eine weitere Arbeitsgruppe führte Untersuchungen an embryonalen Karzinomzellen der Maus (F9 Zellen) durch, denen einzelne RAR- oder RXR-Subtypen fehlten. Die Gruppe kam zu dem Ergebnis, daß der RARγ und der RXRα die Wirkung von Retinsäure auf die Induktion von CYP26 vermitteln (ABU-ABED et al. 1998).
2.6 Retinoide in der Krebstherapie
Tierexperimentelle Studien haben gezeigt, daß Retinoide chemisch induzierte Kanzerogenese in einer Vielzahl von epithelialen Geweben unterdrücken können (BOLLAG u. HOLDENER 1992). Ihre Antitumor-Aktivität steht in den meisten Fällen in Zusammenhang mit ihrer Wirkung auf Zellwachstum und Differenzierung. Das synthetische Retinoid 4- hydroxyphenyl-Retinamid (4-HPR, Fenretinid) wurde zur Prävention von Brustkrebs verabreicht (COSTA et al. 1994). 13-cis-RA (Isotretinoin) zeigte sich erfolgreich bei der Behandlung von präneoplastischen Läsionen der Mundhöhle, der Speiseröhre und der Haut.
All-trans-RA (Tretinoin) wird bei der Behandlung von akuter promyelocytischer Leukämie mit Remissionsraten von 84 –87 % eingesetzt (HUANG et al. 1988).
Das Problem der Retinoidresistenz
Ein bisher nur unzureichend gelöstes Problem bei der oralen Verabreichung von all-trans-RA als Therapeutikum ist der drastische Abfall der Plasmakonzentration ab dem 2. bis 7. Tag nach Beginn der Therapie auf 10 – 60 % der Ausgangskonzentration. Als Ursache hierfür werden eine verminderte intestinale Absorption, die Induktion von CRABP mit daraus folgender erhöhter Pufferkapazität für all-trans-RA und verstärktem Transport zu den metabolisierenden Enzymen sowie ein erhöhter enzymatischer Katabolismus über Cytochrom P450-Enzyme diskutiert. Der Oxidation von all-trans-RA durch CYP-Enzyme wird dabei die größte Bedeutung zugemessen, da zum einen die Konzentration der 4-oxo-Metaboliten im Urin mit zunehmender Retinoid-Resistenz um das bis zu 10fache ansteigt und zum anderen die Verabreichung der CYP-Inhibitoren Ketoconazol und Liarozol die Plasmakonzentration von all-trans-RA im Tiermodell als auch beim Menschen erhöhen konnte (REGAZZI et al.
1997).
2.7 Phytol und Phytansäure
Phytol ist ein Bestandteil des ubiquitär vorkommenden Chlorophyllmoleküls und eine Vorläufersubstanz für Phytansäure in Säugetieren. In tierexperimentellen Studien konnte gezeigt werden, daß Phytol in vivo zu Phytansäure metabolisiert wurde, so daß dieser Metabolit nach Verabreichung von Phytol im Organismus akkumulierte (STEINBERG et al.
1965, 1966a, 1966b). Phytansäure selbst wird außerdem im Fettgewebe von Wiederkäuern
angereichert und kann durch den Verzehr von tierischem Schmalz oder von Milchprodukten aufgenommen werden. Eine durchschnittliche Mahlzeit kann bis zu 50-100 mg Phytansäure enthalten (STEINBERG 1995).
Die Aufklärung der Biosynthese und des Abbauweges von Phytansäure hat an Bedeutung gewonnen, nachdem gezeigt werden konnte, daß Phytansäure ein natürlicher Ligand für einen der Retinoid-Rezeptoren (RXRα) ist. Phytansäure zeigte sich in der Lage, RXR-responsive Promotoren zu aktivieren und eine Änderung der Konformation des RXRα-Proteins, ähnlich der durch 9-cis-RA induzierten Änderung, zu erzielen (LE MOTTE et al. 1996). Damit ergaben sich erste Hinweise darauf, daß die Signalwege von Retinoiden und von Phytansäure Gemeinsamkeiten haben.
Abb. 2.5: Strukturformeln von Phytol und Phytansäure
2.8 Cytochrom P450-Enzyme und ihre Verbreitung im Gastrointestinaltrakt
Die Cyp-Enzyme gehören zu einer Familie von Hämoproteinen, die mit Ausnahme reifer Erythrozyten und Skelettmuskelzellen ubiquitär in jeder Zelle vorkommen (OKITA u.
MASTERS 1997). Nach Bindung von Kohlenmonoxid an das reduzierte Häm weisen die Enzyme ein Absorptionsmaximum bei 450 nm auf, weshalb sie als P450-Enzyme bezeichnet werden (OMURA u. SATO 1964). Ihre Aufgabe ist die oxidative Biotransformation verschiedener Substrate, unter anderem sind sie an der Biosynthese von Steroiden und dem Metabolismus von Fettsäuren sowie der toxikologischen Aktivierung/Inaktivierung von Xenobiotika beteiligt (OKITA u. MASTERS 1997). Da von zwei Sauerstoffatomen nur eins in das Substrat eingeführt wird, gehören die CYP-Enzyme zu den Monooxygenasen. In der Zelle sind sie in den Membranen des glatten endoplasmatischen Reticulums und in geringerem Maße in den Mitochondrien lokalisiert. Nach der Nomenklatur von NELSON et
Phytol Phytansäure
al. (1993) werden die Enzyme einer Supergenfamilie zugeordnet. Bei Übereinstimmung der Proteinsequenz von mehr als 40 % werden die P450-Enzyme einer Familie zugerechnet, die mit einer arabischen Ziffer gekennzeichnet wird. Bei Übereinstimmung von über 55 % spricht man von einer Subfamilie, die zusätzlich mit einem großen lateinischen Buchstaben beschrieben wird (z.B. CYP3A). Mehr als 200 Isoenzyme sind inzwischen charakterisiert. Die meisten Cytochrome sind chemisch induzierbar und weisen häufig eine überlappende Substratspezifität auf (PARK et al. 1995). Das CYP-Muster in den extrahepatischen Geweben unterscheidet sich erheblich von dem der Leber. Im Gegensatz zur Leber, wo CYP3A 20 % der CYP-Enzyme ausmacht, ist CYP3A die Hauptform im Dünndarm und macht dort etwa 70
% des CYP-Gehaltes aus (WATKINS 1990). Im Dünndarm kommen P450-Enzyme in den höchsten Konzentrationen im Duodenum, in der Nähe des Pylorus vor. Ihre Konzentration nimmt nach distal hin ab, um im Ileum die niedrigste Konzentration zu erreichen.
Hauptlokalisation der CYP-Enzyme sind die Spitzen der Mikrovilli; in den Krypten kommen sie gar nicht oder in sehr geringer Konzentration vor. Die CYP-Enzyme 1A1, 3A, 2C8 – 10 und 2D6 konnten im humanen Dünndarm identifiziert werden (KAMINSKY u. FASCO 1992;
LAMPEN et al. 1998). Eine Arbeitsgruppe aus den USA untersuchte den Gastrointestinaltrakt einer 31 jährigen Organspenderin auf Vorkommen und Verteilung von CYP3A-Enzymen. Die Epithelzellen des Magens exprimierten überwiegend CYP3A5, aber auch CYP3A4 war vorhanden. Im Dünndarm war CYP3A4 die Hauptform, während CYP3A5 auf einem relativ geringen Level exprimiert wurde. CYP3A7 konnte nicht durchgehend nachgewiesen werden, was zu der Annahme führte, daß dieses Cytochrom nur in sehr geringem Maße im Dünndarm vorhanden ist. Im Kolon wurden CYP3A4 und CYP3A5 entdeckt. Die Menge war jedoch weit geringer als im Dünndarm. Die Patientin hatte vor der Organentnahme u.a. die Medikamente Dexamethason und Phenytoin erhalten, die beide als Induktoren von CYP3A4 bekannt sind; daher war unklar, in wie weit die Studie durch die Medikation beeinflußt wurde (KOLARS et al. 1994). Zum Vorkommen des kürzlich entdeckten CYP26 im humanen Darm wurde bisher nichts beschrieben.
2.9 Caco-2 Zellen als intestinales Metabolismus-Modell
Bei den Caco-2 Zellen handelt es sich um eine stabile humane Zellinie, die usprünglich einem Adenokarzinom des Kolons entstammt. Ähnlich intestinalen Epithelzellen kommt es nach
Abschluß der Proliferationsphase zur spontanen Differenzierung der Zellen (CHANTRET et al. 1988). Differenzierte Caco-2 Zellen zeigen eine für Enterozyten typische morphologische Polarisation mit ausgeprägtem Bürstensaum und der Ausbildung von Tight Junctions. Ferner exprimieren sie Enzyme (Sucrase Isomaltase, Alkalische Phoshatase und Aminopeptidase), die typischerweise in Dünndarm-Enterozyten vorhanden sind und in Kolonzellen kaum vorkommen (PINTO et al. 1983). Bei Untersuchungen von PINTO et al. (1983) dauerte die Proliferationsphase der Zellen bis zum 9. Tag nach Aussaat an, danach begannen sie sich zu differenzieren. Während der Differenzierung konnte ein ständiger Anstieg der Enzymaktivitäten in den Zellen gemessenen werden, der mit dem 15. – 21. Tag das Maximum erreichte. Caco-2 Zellen exprimieren eine Vielzahl von Enzymen. Von den P450-Enzymen ist CYP1A1 vorhanden, welches stark induzierbar ist, während CYP1A2 nicht gefunden wurde (BOULENC et al. 1992; ROSENBERG u. LEFF 1993; LAMPEN et al. 1998). LAMPEN et al. (1998) konnten die Expression des CYP3A-Proteins in Caco-2 Zellen nachweisen.
CARRIERE et al. (1994) untersuchten verschiedene Caco-2 Klone auf CYP3A. Nur ein einziger Klon, der Caco-2 Klon TC7 exprimierte CYP3A in signifikanter Menge. Spätere Untersuchungen ergaben, daß es sich hierbei um CYP3A4 handelt (RAEISSI et al. 1999).
CYP2E1 konnte ebenfalls in Caco-2 Zellen nachgewiesen werden (LAMPEN et al. 1998).
Caco-2 Zellen beinhalten einige weitere Komponenten, die für den Metabolismus von Vitamin A bzw. Retinsäure von Bedeutung sind: das zelluläre Bindeprotein CRBP II , die Acyl-CoA:Retinol-Acyltransferase (ARAT) und die Lecithin:Retinol-Acyltransferase (LRAT) (QUICK u. ONG 1990). Die genannten Autoren konnten auch die Bildung von Retinylestern aus ß-Carotin, Retinylacetat und Retinol in Caco-2 Zellen nachweisen. Nach LEVIN und DAVIS (1997) exprimieren Caco-2 Zellen die nukleären Rezeptoren RARα, RARß, RARγ und RXRα. Die Verabreichung von all-trans- oder 9-cis-Retinsäure konnte den CRBP II mRNA-Spiegel um das zwei- bis dreifache erhöhen. Dieses ging mit einem Anstieg der Retinol-Absorption um 50 % einher.
3. MATERIAL UND METHODEN
3.1 Material
3.1.1 Chemikalien
3.1.1.1 Retinoide
Retinoide sind sehr empfindlich gegenüber Licht, Sauerstoff und Wärme. Um Isomerisierung und Zersetzung zu vermeiden, wurde mit den verwendeten Retinoiden nur in abgedunkelten Räumen unter Gelblicht gearbeitet (LANDERS u. OLSON 1986). Die Standardlösungen wurden bei -20°C im Dunkeln aufbewahrt, Proben unverzüglich bei -80°C eingefroren.
Stammlösungen der Retinoide wurden zunächst in einer Konzentration von 0,1 mg/ml (all- trans-Retinol: 1 mg/ml) eingewogen und in Ethanol hergestellt. Die genaue Konzentration wurde dann photometrisch ermittelt und unter Verwendung des spezifischen, molaren dekadischen Extinktionskoeffizienten (ε) bei der maximalen Wellenlänge (λmax) berechnet.
Die Werte wurden der Literatur entnommen (FURR et al. 1994). Die photometrischen Messungen erfolgten unter Verwendung eines UV-VIS Spektrometers Lamda Bio 20 (Perkin Elmer, Überdingen). Die Umrechnung der erhaltenen Extinktionswerte in Konzentrationen erfolgte gemäß dem Lambert-Beerschen Gesetz nach folgender Formel:
c [g/l] = (E x V x M) / (ε x d)
(E = ermittelte Extinktion, V = Verdünnungsfaktor, M = Molmasse (g/mol), ε = molarer dekadischer Extinktionskoeffizient (1000 cm2/mol), d = Schichtdicke der Küvette in cm).
Retinoid λmax (nm) ε (1000 cm2 / mol) All-trans-Retinol 325 52.770
All-trans-Retinsäure 350 45.300 13-cis-Retinsäure 354 39.750
9-cis-Retinsäure 345 36.900
All-trans-4-oxo-Retinsäure 360 58.220 13-cis-4-oxo-Retinsäure 361 39.000
Tabelle 3.1: Maximale Absorptionswellenlängen (λmax) und Extinktions- koeffizienten (ε) der verwendeten Retinoide (gelöst in Ethanol).
Die als Standardsubstanzen, bzw. in Versuchen eingesetzten Retinoide (all-trans-, 13-cis-, 9- cis-Retinsäure sowie all-trans-Retinol) wurden von Sigma, Deisenhofen bezogen. All-trans- 4-oxo-Retinsäure und 13-cis-4-oxo-Retinsäure waren ein Geschenk von Hoffmann-La Roche (Basel, Schweiz). Die synthetischen Retinoide (Am 580, CD 2019, CD 437, CD 2608, CD 3159) wurden freundlicherweise von Dr. U. Reichert (CIRD-Galderma, Sophia Antipolis, Frankreich) zur Verfügung gestellt.
3.1.1.2 Sonstige Reagenzien, Bezugsnachweis
Acetonitril Roth, Karlsruhe
Ammoniumacetat Merck, Darmstadt
Bicinchoninsäure-Lösung (BCA) Sigma, Deisenhofen
Bromphenolblau AppliChem, Darmstadt
Citral Aldrich, Steinheim
Chloroform Merck, Darmstadt
Dithiothreitol (DTT) AppliChem, Darmstadt
Dimethylsulfoxid (DMSO) Fluka, Buchs, Schweiz
Ethanol Merck, Darmstadt
Ethidiumbromid Merck, Darmstadt
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Merck, Darmstadt
Formaldehyd AppliChem, Darmstadt
Formamid Roth, Karlsruhe
Glycerol Sigma, Deisenhofen
Guanidinthiocyanat (GTC) Roth, Karlsruhe
HEPES (Pufferan) Roth, Karlsruhe
Isoamylalkohol Merck, Darmstadt
Isocitrat Sigma, Deisenhofen
Isocitrat-Dehydrogenase Sigma, Deisenhofen
Isopropanol Riedel-de Haen, Seelze
Kupfer-(II)-sulfat Merck, Darmstadt
2-Mercaptoethanol Sigma, Deisenhofen
Methanol Merck, Darmstadt
4-Methylpyrazol Sigma, Deisenhofen
3-(N-Morpholino) Propansulfonsäure Roth, Karlsruhe
NAD+ Sigma, Deisenhofen
NADP AppliChem, Darmstadt
α-Naphthoflavon Sigma, Deisenhofen
ß-Naphthoflavon Sigma, Deisenhofen
tri-Natriumcitrat-2-hydrat Merck, Darmstadt Natrium-Laurylsarcosin Sigma, Deisenhofen
Natriumpyrophosphat Sigma, Deisenhofen
Penicillin-Streptomycinlösung GibcoBRL, Eggenstein Phenol, wassergesättigt Roth, Karlsruhe
Phytansäure Sigma, Deisenhofen
Phytol Aldrich, Steinheim
Rifampicin Sigma, Deisenhofen
Rinderserumalbumin (BSA) Sigma, Deisenhofen
Troleandomycin Sigma, Deisenhofen
Trypsin GibcoBRL, Eggenstein
Alle nicht gesondert aufgeführten Reagenzien wurden von der Firma Merck, Darmstadt, bezogen. Liarozol wurde freundlicherweise von der Firma Janssen (Beerse, Belgien) zur Verfügung gestellt.
Lösungsmittel, die für die HPLC oder zum Ansetzen von Standards verwendet wurden, hatten die Qualität „HPLC gradient grade“. Alle anderen Substanzen wurden in den Graden „reinst“
oder „p.a.“ verwendet. Hochreines Wasser wurde einem Milli-Q plus-Wasserreinigungs- System entnommen (Millipore, Eschborn).
3.1.1.3 Fertigmedien für die Zellkultur
Dulbecco´s Modified Eagles Medium (DMEM) wurde von GibcoBRL, Eggenstein, bezogen.
3.1.1.4 Verwendete Puffer
0,1 mol/l Phosphatpuffer (pH 7,4): 2,681 g/l KH2PO4
14,293 g/l Na2HPO4 x 2 H2O PBS-Puffer: 8,0 g/l NaCl
0,2 g/l KCl
1,15 g/l Na2HPO4 x 2H2O 0,2 g/l KH2PO4
0,1 g/l MgCl2 x 6H2O 0,1 g/l CaCl2
3.1.2 Verbrauchsmaterialien und Laborhilfsmittel
Freezing Container Nalgene, Rochester, NY, USA Mikrotiterplatten (96-Loch) Sarstedt, Nümbrecht
Selbstklebefolie Sarstedt, Nümbrecht
Sterilfiltereinheiten (0,22 µm) Millipore, Molsheim, Frankreich Zellkulturflaschen, 75 cm2 Greiner Cellstar, Frickenhausen
3.1.3 Supersomen
Die verwendeten SupersomenTM wurden von der Firma Gentest (Woburn, MA, USA) hergestellt und über NatuTec (Frankfurt am Main) bezogen.
3.1.4 Permanente Zellinien
Zellinie Herkunftsorgan Spezies Kulturmedium
Caco-2 Colon Mensch DMEM + 10% FCS
Caco-2-TC7 Colon Mensch DMEM + 20% FCS + 5% NEAA
Tabelle 3.2: Verwendete Zellinien und ihre Herkunft
Die Caco-2 Zellen wurden von der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA bezogen. Die Caco-2-TC7 Zellinie wurde großzügigerweise von Dr. A. Zweibaum (INSERM U178, Cedex, Frankreich) zur Verfügung gestellt.
3.1.5 Humanes Untersuchungsmaterial
Die humanen Darmstücke aus Dünndarm und Kolon, die zur Gewinnung von Cytosol und Mikrosomen sowie zum Nachweis von CYP26 verwendet wurden, wurden von Prof. Dr. H.
Dralle aus der Klinik für Abdominal- und Transplantationschirurgie der Medizinischen Hochschule Hannover unter Zustimmung der Ethikkommission zur Verfügung gestellt.
3.1.6 Untersuchungsmaterial vom Schwein
Der zur Gewinnung von Cytosol und Mikrosomen genutzte Schweinedarm wurde direkt aus der Schlachtung vom Schlachthof Laatzen/Gleidingen bezogen.
3.2 Methoden
3.2.1 Intestinaler in vitro-Metabolismus von Retinol
3.2.1.1 Isolierung und subzelluläre Fraktionierung von Enterozyten aus der Mucosa des Duodenums (Mensch, Schwein)
Zur Isolation der Enterozyten wurde die Chelations-Elutionsmethode von WEISER (1973), modifiziert nach PORTEOUS et al. (1979) und PINKUS (1981), angewendet. Das proximale Drittel des Dünndarms von 2 bis 6 cm Länge (Schwein: ca. 20 cm Länge) wurde in 1,32
%iger NaCl-Lösung bei 4 °C gereinigt. Anschließend wurden die Därme mit Lösung A befüllt und 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Danach wurden die Mukosazellen durch zweimaliges Inkubieren mit Lösung B (jeweils 20 Minuten, 37°C) und Massieren der Därme gewonnen.
Die Bindung der Zellen an die Basalmembran wird hierbei durch Komplexierung mit EDTA (Di-Natriumsalz) gelockert. Die Zellen können dann durch wiederholte Dehnung und Kontraktion der Darmwand freigesetzt und herausgespült werden.
Lösung A (pH 7,3): 96,0 mmol/l NaCl 27,0 mmol/l Na3-Citrat 5,6 mmol/l KH2PO4
1,5 mmol/l KCl Lösung B (pH 7,4): 137,0 mmol/l NaCl
8,2 mmol/l Na2HPO4 1,5 mmol/l KH2PO4
3,2 mmol/l KCl 1,5 mmol/l EDTA 1,0 mmol/l DTT 0,1 % w/v BSA
Die mit Enterozyten angereicherte Lösung B wurde 3 Minuten bei 300 x g zentrifugiert (Beckmann, GS-6KR Centrifuge), die abzentrifugierten Zellen anschließend in Puffer A resuspendiert, nochmals zentrifugiert und im vierfachen Volumen des gleichen Puffers wieder aufgenommen. Durch Differentialzentrifugation nach GUENGERICH (1982) wurden aus den frisch isolierten Mukosazellen Cytosol und Mikrosomen gewonnen. Sämtliche Arbeitsschritte erfolgten bei 4°C. Die in Puffer A aufgenommenen Enterozyten wurden als nächstes in einem Glas-Teflon-Potter und anschließend mit dem Ultraschallfinger (Bandelin Sonoplus HD 2070) (2 x 1 Minute, 50 W) homogenisiert und anschließend 20 Minuten bei 10.000 x g zentrifugiert (Beckmann, Avanti-J25 I). Das Pellet, welches Kerne, Mitochondrien und Plasmamembranen enthielt, wurde verworfen, der Überstand gesammelt und 60 Minuten bei 100.000 x g in einer Ultrazentrifuge (Sorvall, Ultra Pro 80, Festwinkelrotor Typ 647.5) zentrifugiert. Der Überstand (= cytosolische Fraktion) wurde aliquotiert und bei -80°C eingefroren. Das Sediment wurde in Puffer B resuspendiert und erneut durch pottern und mit dem Ultraschallfinger homogenisiert. Danach folgte eine weitere Ultrazentrifugation bei 100.000 x g (60 Minuten)(Sorvall, Ultra Pro 80, Festwinkelrotor Typ 65). Das nun erhaltene Sediment stellte die mikrosomale Fraktion dar. Es wurde zu einem gleichen Volumen in Puffer C aufgenommen, aliquotiert und ebenfalls bei -80°C eingefroren.
Puffer A (pH 7,4): 0,1 mol/l Phosphatpuffer (pH 7,4) 0,1 mol/l KCl
1,0 mmol/l EDTA 0,1 mmol/l DTT
Puffer B (pH 7,4): 0,1 mol/l Phosphatpuffer (pH 7,4) 0,1 mol/l Natriumpyrophosphat 1,0 mmol/l EDTA
0,1 mmol/l DTT
Puffer C (pH 7,4): 0,1 mol/l Phosphatpuffer (pH 7,4) 20,0 % (w/v) Glycerol
1,0 mmol/l EDTA
3.2.1.2 Proteinbestimmung
Die Proteinbestimmung der cytosolischen und mikrosomalen Fraktion erfolgte mit einem Reagenz aus 4%iger Kupfer-(II)-sulfatlösung und Bicinchoninsäurelösung im Verhältnis 1:50 (v/v) (SMITH et al. 1985). Das Prinzip beruht darauf, daß zweiwertiges Kupfer von den Aminosäureresten des Cysteins, des Tyrosins, des Tryptophans sowie jeder Peptidbindung zu einwertigem Kupfer reduziert werden kann. Bicinchoninsäure bildet mit einwertigem Kupfer einen intensiv violetten Komplex, der photometrisch bestimmt wurde. Die Messung erfolgte auf 96-Loch-Mikrotiterplatten. Die Proben wurden mit 0,1 M Phosphatpuffer in verschiedenen Verdünnungsstufen (1:100 bis 1:1000) vorverdünnt. Zu 100µl Probe oder Standard wurden 100µl des frisch angesetzten Reagenzes gegeben. Nach Verschließen der Mikrotiterplatten mit einer Selbstklebefolie wurde für 45 Minuten bei 60°C inkubiert.
Anschließend wurde mit einem ELISA Reader (Bio Rad, München) die UV-Absorption bei 550 nm gemessen. Die Proteinkonzentrationen wurden der Kalibrierkurve entnommen, die auf der gleichen Platte mit Standards aus BSA (1-100 µg/ml) aufgestellt wurde.
3.2.1.3 Metabolisierung von Retinol durch Cytosol und Mikrosomen des Dünndarms (Mensch, Schwein)
Um den oxidativen Metabolismus von Retinol zu all-trans-RA durch die cytosolischen und mikrosomalen Fraktionen der Dünndarmenterozyten zu untersuchen, wurden Inkubationsansätze in Dreifachbestimmung durchgeführt. Diese Ansätze enthielten 100 µl Assaypuffer (5-fach), 1 mg cytosolisches Protein (oder 0,5 mg mikrosomales Protein vom Schwein) sowie 5 µl Substratlösung in unterschiedlichen Konzentrationen und wurden mit destilliertem Wasser auf ein Volumen von 500 µl ergänzt.
Assaypuffer (5-fach)(pH 7,5): 10 mM NAD+ 750 mM KCl 100 mM HEPES
10 mM DTT
Die ethanolische Retinol-Stammlösung für die Substratzugabe wurde so herunterverdünnt, daß die angestrebte Konzentration durch Zugabe von 5 µl Substratlösung zum Ansatz von 500 µl erreicht wurde, um den Lösungsmittelanteil konstant auf 1 Vol.-% zu halten. Die Inkubationen, die in Eppendorfgefäßen durchgeführt wurden, erfolgten für 25 min bei 37°C unter Verwendung eines Thermoschüttlers (Eppendorf, Hamburg). Die Reaktion wurde gestoppt, indem 400 µl des Ansatzes mit 1,2 ml Isopropanol gemischt wurden. Nach kurzem Vortexen wurden die Proben bis zur weiteren Analyse bei -80°C eingefroren.
3.2.1.4 Hemmung des oxidativen Metabolismus von Retinol zu all-trans-RA
Um die Hemmbarkeit des zweistufigen Prozesses zu überprüfen, wurde 4-Methylpyrazol als Inhibitor der ADH und Citral als AlDH-Inhibitor eingesetzt (CONNOR u. SMIT 1987b). Die Versuche wurden wie in Abschnitt 3.2.1.3 dargestellt durchgeführt. Zusätzlich wurden in DMSO gelöst, entweder 10 µM - 20 mM 4-Methylpyrazol oder 10 µM – 1 mM Citral (Endkonzentrationen) zugesetzt. Weiterhin wurde untersucht, ob die Anwesenheit von Phytol die Biokonversion von Retinol zu all-trans-Retinsäure beeinflussen kann. In diesem Fall wurde dem Versuchsansatz Phytol (in DMSO gelöst) in unterschiedlichen Konzentrationen (10 µM – 5 mM, Endkonz.) zugegeben.
3.2.2 Intestinaler in vitro-Metabolismus von all-trans-Retinsäure
3.2.2.1 Metabolisierung durch Caco-2 und TC7 Zellen
Um den Phase-I-Metabolismus von all-trans-RA durch CYP-Enzyme zu untersuchen, kamen Caco-2 Zellen und Caco-2-TC7 Zellen zum Einsatz.
3.2.2.1.1 Methoden zur Zellkultur -Auftauen der Zellen
Die Gefrierröhrchen wurden durch kurzes Eintauchen in ein 37°C warmes Wasserbad aufgetaut. Die Zellen wurden entnommen, zweimal mit 20 ml Medium gewaschen und auf Kulturflaschen verteilt.
-Kultivierung der Zellen
Die Zellen wurden in 75 cm2 Kulturflaschen kultiviert und in einem Zwei-Tage-Rhythmus gefüttert. Im Alter von 5-7 Tagen, vor Differenzierung der Zellen, wurde passagiert. Hierbei wurden die Zellen mit einer Trypsin-EDTA-Lösung (0,5 % Trypsin (w/v), 0,02 % EDTA (w/v)) vom Flaschenboden abgelöst und anschließend bei 500 x g abzentrifugiert (Beckmann, GS-6KR Centrifuge). Die Zellen wurden mit einer Fuchs-Rosenthal-Zählkammer gezählt und bei einer Zelldichte von 200.000 bis 250.000 Zellen/ml ausgesät. Die Inkubation der Zellen erfolgte in einem Brutschrank (NUAIRE™ , Zapf Instrumente, Sarstedt) bei 37°C, 95 % relativer Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 Begasung.
Mit einem Alter von 21-24 Tagen wurden die Zellen für die Versuche verwendet. Bei den Caco-2 Zellen kamen die Passagen 42-63, bei den Caco-2-TC7 Zellen die Passagen 30-42 zum Einsatz.
-Einfrieren der Zellen
Zur Langzeitlagerung der Zellen im Stickstoffbehälter wurden die Zellen vom Flaschenboden abtrypsinisiert und zweimal mit Medium gewaschen. Danach wurden sie im Verhältnis 10:1 (Medium/Zellpellet) in ein Einfriermedium eingebracht und in Gefrierröhrchen pipettiert. Die Röhrchen wurden in einem speziellen, mit Isopropanol gefüllten Freezing Container zunächst für einige Stunden bei -80°C eingefroren und danach in den Flüssigstickstoffbehälter (- 196°C) überführt.
Einfriermedium: 89 ml DMEM mit 20 % (v/v) Zusatz von FCS 10 ml DMSO
1 ml Penicillin/Streptomycinlösung (Endkonz.: 100 U/ml)
3.2.2.1.2 Optimierung der Inkubationszeiten und Konzentrationen für Induktion und Metabolismus
Die zu verabreichenden Konzentrationen sowie die Dauer der Inkubation für eine optimale Expression der CYP-Enzyme wurde anhand der Induktion von CYP26 durch all-trans- Retinsäure in Caco-2 Zellen bestimmt. All-trans-RA wurde in Konzentrationen von 0,001 µM – 10 µM auf die Zellen gegeben, die daraufhin 24 h inkubiert wurden. In einem zweiten Versuchsansatz wurde all-trans-RA in einer Konzentration von 1 µM verabreicht, und die Zellen 20 min bis 48 h inkubiert. Die Stärke der Genexpression in Abhängigkeit von der Zeit bzw. Konzentration wurde mit Hilfe der RT-PCR (3.2.4.4) untersucht. Um die optimale Inkubationsdauer zur Metabolisierung des Substrates herauszufinden, wurden über 48 h mit all-trans-Retinsäure (1 µmol/l) induzierte Caco-2 Zellen, nach einem Waschschritt mit PBS- Puffer, mit 10 µmol/l all-trans-RA versetzt und ebenfalls unterschiedlich lange (0-420 min) inkubiert. Die Auswertung der Proben erfolgte hier über die HPLC (3.2.3).
3.2.2.1.3 Induktion der CYP-Enzyme in den Zellen
Um die Bedeutung der einzelnen CYP-Enzyme bei der Metabolisierung von all-trans-RA aufzuklären, wurden spezifische Induktoren eingesetzt. Zur Induktion von CYP1A1 wurde 50 µmol/l ß-Naphthoflavon in DMSO (GUENGERICH 1992), zur Induktion von CYP3A 10 µmol/l Rifampicin in DMSO (KOLARS et al. 1992) verwendet. CYP26 ließ sich durch all- trans-RA in unterschiedlichen Konzentrationen induzieren (FUJII et al. 1997). Die Zellen wurden für 48 h mit den einzelnen Induktoren in DMEM inkubiert. Das Medium in den Kontrollflaschen enthielt keinen Induktor. Nach der Induktion wurde entweder die gesamte RNA isoliert und die Expression der CYP-Enzyme mit Hilfe der RT-PCR (3.2.4.4) untersucht, oder die induzierten Zellen wurden zur Metabolisierung von all-trans-RA eingesetzt. In diesem Fall folgte der Induktion ein Waschschritt mit PBS-Puffer. Danach wurde 10 µmol/l all-trans-Retinsäure in DMEM als Substrat auf die Zellen gegeben und weitere 3,5 h inkubiert. Anschließend wurde der Überstand gesammelt und wie unter Abschnitt 3.2.3 beschrieben, mit Hilfe der HPLC analysiert.
