Experimentelle Simulation von P-gp-bedingten Arzneimittelinteraktionen im HPCT-1E3 in vitro-Modell
Abschlussarbeit
Postgradualstudium Toxikologie der Universität Leipzig
Dipl.-Ökotrophologin Katja Sommer
Institut für Pharmakologie, Pharmazie und Toxikologie Veterinärmedizinische Fakultät
Universität Leipzig
Betreuer: Prof. Dr. Walther Honscha Dr. Carsten Kneuer
Datum: 18.02.2009
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis III
Tabellen- und Abbildungsverzeichnis V
1 Einleitung 1
1.1 Arzneimittelinteraktionen 2
1.2 Aktiver Wirkstofftransport 3
1.3 P-Glycoprotein (ABCB1) 8
1.3.1 P-gp-Substrate und –Inhibitoren 10
1.4 in vitro-Modelle für Transportuntersuchungen 13
1.5 Aufgabenstellung 14
2 Materialien und Methoden 16
2.1 Chemikalien 16
2.2 Kultivierung der HPCT-1E3-Zelllinie 17
2.3 MTT-Test 17
2.4 Rhodamin123-Akkumulationstest 18
2.5 Datenanalyse und statistische Auswertung 19
3 Ergebnisse 21
3.1 Zytotoxizität der Einzelsubstanzen 21
3.2 P-gp-Inhibitoreigenschaften der Einzelsubstanzen 23
3.3 Pharmakokinetische Wechselwirkungen als Basis von Arznei- mittelinteraktionen 24
3.3.1 Cyclosporin A als Inhibitor 25
3.3.2 Verapamil als Inhibitor 26
3.3.3 Amiodaron und Terfenadin als Inhibitoren 29
4 Diskussion der Ergebnisse 30
4.1 Zytotoxizität der Einzelsubstanzen 30
4.2 P-gp-Inhibitoreigenschaften der Einzelsubstanzen 34 4.3 Pharmakokinetische Wechselwirkungen als Basis von Arznei-
mittelinteraktionen 36
5 Zusammenfassung 40
6 Literaturverzeichnis 42
Abkürzungsverzeichnis
a-b apikal-basal
ABC ATP-Binding Cassette
ADME Adsorption Distribution Metabolismus Elimination
Ami Amiodaron
ASBT Apical Sodium-dependent Bile Salt Transporter
AT argentometrische Titration
ATP Adenosintriphosphat
b-a basal-apikal
BHS Blut-Hirn-Schranke
BSEP Bile Salt Export Pump
CI Konfidenzintervall (Confidence Interval)
CPZ Chlorpromazin
CsA Cyclosporin A
DCM Dichlormethan
DME-Medium Dulbecco´s Modified Eagle Medium
DMSO Dimethylsulfoxid
EMEA The European Agency for the Evaluation of
Medicinal Products
EtOH Ethanol
FKS Fetales Kälberserum
GSH Glutathion
HAT Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin
HIV Human Immunodeficiency Virus
HPCT Hepatocytoma
HPLC High Performance Liquid Chromatography
IC Inhibitory Concentration
k.A. keine Angaben
Km Michaeliskonstante (Substratkonzentration, die bei
der halbmaximalen Geschwindigkeit der Reaktion vorliegt)
Keto Ketoconazol
Konz. Konzentration
LC Lethal Concentration
LD Lethal Dose
MDR Multi-Drug Resistance
MEIC The Multicenter Evaluation of In Vitro Cytotoxicity
MeOH Methanol
MHK minimale Hemmkonzentration
MRP Multi-Drug Resistance Related Protein
MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-
tetrazoliumbromid
NBD Nukleotidbindende Domäne
n.n. nicht nachweisbar
NOEC No Observed Effect Concentration
NTCP Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide
P Irrtumswahrscheinlichkeit
PBS Phosphate Buffered Saline
P-gp P-Glycoprotein
SDS Natriumdodecylsulfat
SLC Solute Carrier Superfamily
SLCO Organic Anion Transporting Polypeptide
Ter Terfenadin
TLC Thin Layer Chromatography
TM Transmembranes Segment
Vera Verapamil
Vmax Maximale Reaktionsgeschwindigkeit bei Substrat-
sättigung
w/o without
Tabellen- und Abbildungsverzeichnis
Tabelle 1: Übersicht über die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Substanzen und deren Einordnung in Substrat und Inhibitor anhand von Referenzen
Tabelle 2: Chemikalien, Herkunft, Qualität und Stammlösungen Tabelle 3: NOEC- und LC50-Werte der Einzelsubstanzen
Tabelle 4: P-gp-Inhibitor-Eigenschaften der Testsubstanzen in HPCT-1E3 Zellen an Tag1-3 der Kultur (Rhodamin 123-Akkumulationstest)
Abbildung 1: Wege des Stofftransportes durch biologische Schranken Abbildung 2: Humane Transportproteine der Leber mit pharmakologisch –
toxikologischer Bedeutung
Abbildung 3: Dosis – Wirkungsbeziehung von Amiodaron und Ketoconazol
Abbildung 4: Zytotoxizität von Ketoconazol in HPCT-1E3 Zellen über 48 h mit und ohne Zugabe von 10 µg/ml Cyclosporin A
Abbildung 5: Zytotoxizität von Chlorpromazin in HPCT-1E3 Zellen über 48 h mit und ohne Zugabe von 2 µg/ml Cyclosporin A
Abbildung 6: Zytotoxizität von Cyclosporin A in HPCT-1E3 Zellen über 48 h mit und ohne Zugabe von 50 µg/ml Verapamil
Abbildung 7: Zytotoxizität von Ketoconazol in HPCT-1E3 Zellen über 48 h mit und ohne Zugabe von 50 µg/ml Verapamil
Abbildung 8: Zytotoxizität von Terfenadin in HPCT-1E3 Zellen über 48 h mit und ohne Zugabe von 50 µg/ml Verapamil
Abbildung 9: Zytotoxizität von Terfenadin in HPCT-1E3 Zellen über 48 h mit und ohne Zugabe von 15 µg/ml Verapamil
1 Einleitung
Die Polypragmasie (Komedikation), das heißt die gleichzeitige Einnahme mehrerer Arzneimittel, hat sich aufgrund der Zunahme von Erkrankungen mit steigender Lebenserwartung zu einer häufigen Praxis entwickelt. Aufgrund der höheren Lebenserwartung kommt es zu einem Anstieg der Inzidenz für Mehrfacherkrankungen, welche mit unterschiedlichen Arzneimitteln behandelt werden müssen.
Als wichtiger Risikofaktor sind die möglichen Folgen der Polypragmasie in der Therapie und Entwicklung von Arzneimitteln nicht zu ignorieren, da es bei der gleichzeitigen Einnahme mehrerer Arzneimittel zu einer erhöhten Toxizität oder zu einer verminderten Wirksamkeit von einem oder mehreren Wirkstoffen kommen kann. Eine Untersuchung stellte einen exponentiellen Anstieg der Arzneimittelinteraktionen schon ab einer Medikation mit 4 Arzneimitteln fest (1). Andere klinische Studien zeigten, dass es bei gleichzeitiger Einnahme von 6–10 Arzneimitteln pro Tag bei 7 % der Patienten zu Nebenwirkungen kam, und bei gleichzeitiger Einnahme von 16–20 Arzneimitteln bei 40 % der Patienten Nebenwirkungen beobachtet werden konnten (2).
Die Einschätzung von Arzneimittelinteraktionen gestaltet sich jedoch schwierig, da zwischen feststellbaren und klinisch relevanten Interaktionen unterschieden werden muss.
Bei den klinisch relevanten Arzneimittelinteraktionen wiederum ist es schwer klare Aussagen zu treffen, da diese meist eine starke Varianz zwischen den einzelnen Patienten aufweisen und oft nicht als solche erkannt werden. Entsprechend schwanken die Aussagen zur Inzidenz von Nebenwirkungen, die aus Arzneimittelinteraktionen resultieren. Etwa 6 % aller Hospitalisationen haben unerwünschte Arzneimittelnebenwirkungen als Ursache und von diesen 6 % wiederum schreibt man 20 % den Arzneimittelinteraktionen als Initiator zu (3).
Eine Studie in Frankreich (4) untersuchte 3147 Patienteneinlieferungen in Krankenhäuser und stellte bei 100 Patienten Arzneimittelinteraktionen als Ursache der Einlieferung fest.
Dies entspricht einer Inzidenz von durchschnittlich 3,19 %. Diese Studie zeigt außerdem, dass die Inzidenz mit dem Alter zunimmt. Bei Kindern z.B. lag die Inzidenz bei 1,91 %, während sie bei den über 65jährigen doppelt so hoch war. Die Folgen der Arzneimittelinteraktionen waren bei 78 Patienten reversibel, bei 9 Patienten waren sie irreversibel und bei weiteren 9 Patienten tödlich. Bei den Todesfällen wiederum war bei 4 Patienten direkt die Arzneimittelinteraktion die Todesursache.
Laut anderen Studien liegt die Inzidenz einer durch Arzneimittelinteraktionen verursachten Krankenhauseinlieferung in den USA zwischen 3,1–6,2 %, in Australien zwischen
2,4-3,6 % (4) und es gibt auch Angaben bis zu 8,8 % (2). Man kann jedoch davon ausgehen, dass die Fallzahlen um ein Vielfaches höher liegen, da ambulante Patienten in diesen Studien meist nicht berücksichtigt werden und die Arzneimittelinteraktion als Ursache einer unerwünschten Nebenwirkung oft nicht erkannt wird.
Auch wenn Arzneimittelinteraktionen meist nur leichte bzw. reversible Schäden zur Folge haben bzw. klinisch nicht relevant sind, so macht die doch relativ hohe Inzidenz weitere Untersuchungen notwendig. Des Weiteren kommt es auch immer wieder zu irreversiblen und tödlich verlaufenden Erkrankungen.
Neben den klinischen Studien am Humanpatienten sind auch Versuche am Tier und
in vitro-Methoden zur Charakterisierung von Arzneimittelinteraktionen heranzuziehen, da die zu Grunde liegenden Mechanismen sehr verschieden und komplex sind.
1.1 Arzneimittelinteraktionen
Arzneimittelinteraktionen können hinsichtlich ihrer Mechanismen auf verschiedenen Ebenen ablaufen, zum Einen auf der Ebene der Pharmakodynamik und zum Anderen auf der Ebene der Pharmakokinetik. Bei der Pharmakodynamik handelt es sich um die Wirkung des Arzneimittels auf das Lebewesen und bei der Pharmakokinetik um die Wirkung des Lebewesens auf das Arzneimittel (5).
Die relevanten Aspekte der Pharmakodynamik sind Wirkung und Wirkmechanismen. Man unterscheidet hier additive, potenzierende, synergistische und antagonistische Interaktionen sowie Wechselwirkungen am Wirkstoffrezeptor selbst (5).
Im Rahmen dieser Arbeit sollen jedoch die Interaktionen auf der Ebene der Pharmakokinetik betrachtet werden. Die Pharmakokinetik wird beschrieben durch das ADME-Konzept: Absorption (Aufnahme in den systemischen Kreislauf), Distribution (Verteilung im Organismus mit dem Blut), Metabolismus (Biotransformation) und Elimination (Exkretion). Die pharmakokinetischen Parameter Bioverfügbarkeit, Verteilungsvolumen, Clearance und Halbwertszeit sind vor allem von der Fähigkeit eines Arzneimittels biologische Membranen zu überwinden abhängig. Diese Fähigkeit wiederum wird durch physikalische und chemische Eigenschaften des Arzneimittels, interindividuelle Unterschiede, Alter und Erkrankung des Patienten und Wechselwirkungen mit anderen
Arzneimitteln bestimmt. Ein derart komplexes System bietet eine große Vielfalt für die unterschiedlichsten Arzneimittelinteraktionen, d.h. Effekte, die bei gleichzeitiger Aufnahme mehrerer Arzneimittel auftreten und zur Veränderung der Kinetik mindestens eines der Arzneimittel führen.
Die Absorption eines oral applizierten Arzneimittels kann gestört werden durch Veränderung des gastrointestinalen pH-Wertes, Adsorption, Chelat- oder andere Komplexbildungen und Veränderung der gastrointestinalen Peristaltik. Bei der Distribution spielt die Proteinbindung eine große Rolle, die Bindung und Speicherung im Gewebe und die Organdurchblutung. Der Metabolismus kann beeinflusst werden durch Enzyminduktion und –inhibition, v.a. der Cytochrom P450-Isoenzyme und Veränderungen des Blutflusses in der Leber. Hinsichtlich der Elimination können Arzneimittel zur Veränderung des Harn-pH- Wertes und des renalen Blutflusses sowie zur Beeinträchtigung der Darmflora führen, wenn eine biliäre Ausscheidung vorliegt (2).
Des Weiteren wurde in den letzten Jahren der aktive Transmembrantransport durch Wirkstoffcarrier-Proteine als ein wichtiger Angriffspunkt der Arzneimittelinteraktionen erkannt, der v.a. bei der Absorption und Elimination von großer Bedeutung ist (2).
1.2 Aktiver Wirkstofftransport
Es gibt verschiedene Möglichkeiten für die Permeation eines Stoffes durch Zellmembranen. Man unterscheidet die parazelluläre Diffusion, welche für hydrophile Arzneimittel bedeutsam ist, die kleiner als 200 Da sind, und verschiedene transzelluläre Transportwege. Der transzelluläre Transport ist unterteilt in passive Diffusion, den Carrier- vermittelten Transport und den vesikulären Transport.
In der folgenden Abbildung sind diese Möglichkeiten des Transportes einmal schematisch dargestellt.
Abbildung 1: Wege des Stofftransportes durch biologische Schranken
Stoffe können biologische Membranen auf parazellulären [1] oder transzellulären Weg überwinden. Beim transzellulären Weg unterscheidet man passive Diffusion [2], Carrier-vermittelter Transport [3] und vesikulären Transport [4].
Der vesikuläre Transport ist für Arzneimittel kaum relevant. Für die passive Diffusion über die Membranbarrieren von Epithelzellen müssen die Moleküle bestimmte Anforderungen erfüllen. Lipinski spricht hier von den ”Rule of 5” (6). Diese besagen, dass das Molekulargewicht kleiner 500 g/mol sein muss, der c logP (berechneter Oktanol-Wasser- Verteilungskoeffizient) kleiner als 5, es weniger als 5 Wasserstoffbrückendonoren pro Molekül gibt und die Gesamtzahl der N- und O-Atome (Wasserstoffbrückenakzeptoren) kleiner als 10 ist. Moleküle, welche diese Anforderungen nicht erfüllen, d.h. polare, hydrophile, ionisierte Moleküle können in der Regel nur über spezielle Carriersysteme, den Transmembrantransportern, Membranen überwinden. Bei diesen Transportern handelt es sich um Transmembranproteine, von welchen man annimmt, dass sie mit dem Substrat eine Bindung eingehen, somit eine Konformationsänderung herbeiführen und die Passage durch die Membran ermöglichen. Des Weiteren müssen hier noch die sogenannten Exchanger aufgeführt werden, welche über einen Ionenaustausch den Transport gewährleisten.
Die Carrier-vermittelten Transporte können ohne Energieverbrauch stattfinden, wenn sie dem Konzentrationsgradienten folgen. Man spricht dabei von einer erleichterten Diffusion.
Bei der aktiven Passage wird Energie benötigt, da sie entgegen dem Konzentrationsgradienten laufen kann. Bei dem sekundär aktiven Transport wird die Energie aus dem elektrochemischen Gradienten gewonnen, während bei dem primär aktiven Transport die Energiebereitstellung durch ATP-Hydrolyse gewährleistet wird (7).
Des Weiteren können die Transporter in Influx- und Effluxtransporter unterteilt werden.
Die Influxtransporter spielen bei der Resorption von Nährstoffen, Arzneimitteln und anderen endogenen Substanzen eine Rolle, während die Effluxtransporter für die Ausscheidung von Stoffen verantwortlich sind und somit hauptsächlich in exkretorischen Organen, wie Leber und Niere exprimiert werden. Darüber hinaus werden die Transportproteine insbesondere im Gastrointestinaltakt, an der Blut-Hirn-, Blut-Plazenta- und Blut-Testis-Schranke exprimiert.
Bisher sind mindestens 533 humane Transporter für organische und anorganische Substanzen bekannt, von denen die Mehrzahl 2 Superfamilien zugeordnet wird: die Solute Carrier Superfamily (SLC)-Transporter und die ATP-Binding Cassette (ABC)- Transporter (8).
Eine Vielzahl dieser Transporter wird v.a. in der Leber exprimiert, da diese das wichtigste Organ für den Metabolismus und die Detoxifizierung von Stoffen ist.
Der folgende Abschnitt konzentriert sich daher lediglich auf Transporter, welche in der Leber eine bedeutsame Expression haben.
Die folgende Abbildung zeigt die Nomenklatur dieser Transporter.
SLC-Superfamilie
ABC-Superfamilie
SLC10A1 / 2
SLCO1A2 / 2A1 / 3A1 / 4A1 / 1B1 / 1B3 / 2B1
SLC22A1 / 3 / 5 / 7 / 10
ABCB1 / 4 / 11
ABCC1 / 2 / 3 / 4 / 6
ABCG2
Abbildung 2: Humane Transportproteine der Leber mit pharmakologisch / toxikologischer Bedeutung Transmembrantransporter werden in Aufnahme- (v.a. Mitglieder der SLC-Superfamilie) und Efflux- transporter (v.a. Mitglieder der ABC-Superfamilie) eingeteilt. Für die Leber bedeutsam sind Vertreter der SLC10-, SLCO-, SLC22, ABCB-, ABCC- und ABCG-Familie
Bei den Mitgliedern der SLC-Familie handelt es sich um sekundär aktive Transporter. Die SLC-Transporter befinden sich in der basolateralen (sinusoidalen) Membran der Hepatozyten und gewährleisten vor allem die Stoffaufnahme aus dem systemischen Kreislauf in die Leber (9).
SLC10A1 (NTCP – Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeotide) wird v.a. in der Leber exprimiert und ist wie auch SLC10A2 (ASBT – Apical Sodium-dependent Bile Salt Transporter) für die Rückführung von Gallensäuren aus dem enterohepatischen Kreislauf in die Leber verantwortlich (9).
Die Mitglieder der SLCO (Organic Anion Transporting Polypeptide)-Familie transportieren organische Anionen. Aufgrund ihrer breiten Substratspezifität spielen sie eine wichtige Rolle bei der Aufnahme von Arzneimitteln in die Leber (9). SLCO1A2 kommt neben der Leber v.a. in der Blut-Hirn-Schranke vor und transportiert auch Gallensalze und organische Kationen. SLCO2A1, 3A1 und 4A1 werden ubiquitär exprimiert, während SLCO1B1 und 1B3 vorwiegend in der Leber funktional aktiv sind. SLCO1B1 und 1B3 sind ebenfalls Transporter für Gallensäuren. Des Weiteren ist SLCO1B3 ein typischer Transporter für
Digoxin (10). SLCO2B1 wird nicht ubiquitär exprimiert, jedoch neben der Leber in vielen anderen Geweben wie Herz, BHS, Plazenta, Lunge und Niere. Die Substratspezifität ist bei SLCO2B1 im Gegensatz zu den anderen SLCO-Mitgliedern stärker ausgeprägt (9).
Die Familie der SLC22-Transporter besteht aus Transportproteinen für organische Kationen (SLC22A1 und A3), für Zwitterionen und Kationen (SLC22A5) und für organische Anionen (SLC22A7 und A10). Beim Menschen wird SLC22A1 hauptsächlich in der Leber exprimiert, wodurch die Aufnahme von kationischen Xenobiotika durch die sinusoidale Membran in die Hepatozyten gewährleistet wird. SLC22A3 und A5 werden neben der Leber auch in vielen anderen Geweben exprimiert, wie z.B Skelettmuskulatur, Niere, Herz und Blut-Hirn-Schranke. Die Spezifität für Substrate und Inhibitoren überschneidet sich bei SLC22A1 und SLC22A3 stark. SLC22A7 wird neben der Leber im geringen Maß auch in der Niere exprimiert. Die Expression von SLC22A10 konnte bisher ausschließlich in der Leber festgestellt werden (11).
Die größte Familie der transmembranären Transporter ist die ABC-Familie. Es handelt sich hierbei um primär aktive Transporter. Sie befördern Arzneimittel und Metabolite vor allem entgegen dem Konzentrationsgefälle durch die kanalikuläre Membran der Hepatozyten in die Galle bzw. durch die basolaterale Membran ins Blut zurück. Bei Säugern sind mindestens 7 Unterfamilien und 49 Mitglieder bekannt (12). Der Name ATP-Binding Cassette leitet sich aus der kennzeichnenden Domäne ab, welche ATP bindet.
Aus der Gruppe der ABCB-Transporter (MDR – Multi-Drug Resistance Protein) sind in der Leber ABCB1 (MDR1), ABCB4 (MDR3) und ABCB11 (BSEP - Bile Salt Export Pump) vertreten.
Auf ABCB1 (P-Glycoprotein) wird im nächsten Kapitel näher eingegangen, da es Thema dieser Arbeit ist.
Im Gegensatz zu ABCB1 werden ABCB4 und ABCB11 ausschließlich in der Leber exprimiert. Während ABCB4 v.a. Phospholipide transportiert, gewährleistet ABCB11 den Transport von Gallensäuren aus den Hepatozyten über die kanalikuläre Membran in die Galle (9).
ABCC-Transporter (MRP – Multi-Drug Resistance Related Protein) sind weit verbreitet im Organismus; sie kommen v.a. in den Geweben von Gehirn, Plazenta, Niere, Lunge, Darm und Leber vor (9). ABCC1 ist ubiquitär verbreitet. In der Leber befindet sich ABCC1 in der basolateralen Membran der Hepatozyten und transportiert organische Anionen und GSH- Konjugate. Die organischen Anionen stellen neben den Glucuroniden auch Substrate
für ABCC2 dar. Dieses Transportprotein wird in der apikalen Membran der Hepatozyten exprimiert sowie in Niere und Darm. ABCC3 und ABCC4 werden in der basolateralen Membran der Hepatozyten exprimiert und ABCC6 ist in der basolateralen und der apikalen Membran lokalisiert. Des Weiteren sind alle drei Transporter noch in anderen Organen wie z.B. Niere, Darm, Lunge und Pankreas funktional aktiv. ABCC3 transportiert Glucuronide und Gallensäuren, ABCC4 organische Anionen und Nukleotidanaloga und ABCC6 anionische Peptide. Als letztes sei noch ABCG2 erwähnt, dieser Transporter befindet sich in der apikalen Membran von Leber, Plazenta und Darm und transportiert zahlreiche lipophile und amphiphile Substanzen (13).
1.3 P-Glycoprotein (ABCB1)
Das P-Glycoprotein (P-gp, P für Permeabilität), das Produkt des MDR1-Gens, war der erste bekannte humane ABC-Transporter. Er wurde 1968 von Juliano und Ling in MDR-Zellen des chinesischen Hamsters entdeckt und ist bis heute das am besten untersuchte Mitglied der ABC-Familie (7). Zusammen mit den fremdstoffmetabolisierenden Enzymen hat P-gp eine protektive physiologische Funktion - den Transport von Xenobiotika aus den Zellen in den systemischen Kreislauf , um somit die Ausscheidung zu gewährleisten (14).
Wie bei allen ABC-Transportern handelt es sich auch beim P-gp um ein Transmembranprotein. Es hat eine Größe von 170 kDa und besteht aus 1280 Aminosäuren, die zueinander zwei membrangebundene Domänen darstellen, welche eine Homologie von 45 % aufweisen, hydrophob sind und aus je 6 transmembranären Segmenten (TM) sowie 2 nukleotidbindenden Domänen (NBD) bestehen. Die Domänen sind über ein Polypeptidbindeglied miteinander verbunden, welches die Flexibilität des Proteins gewährleistet. In der ersten Domäne finden sich zusätzlich 3 extrazelluläre Glykosylierungsstellen (8).
Neben der Überexpression in Tumorzellen ist P-gp auch im physiologischen Gewebe von Leber, Niere, Intestinaltrakt, Gehirn, Plazenta und Testes lokalisiert. Als Effluxtransporter hat P-gp hier eine wichtige Schutzfunktion (8). In der kanikulären Membran der Hepatozyten ist P-gp für den Transport von Xenobiotika in die Galle verantwortlich. Eine ebenfalls protektive Rolle beim Efflux von Xenobiotika spielt P-gp in der apikalen Membran der Epithelzellen des proximalen Tubulus der Nieren und in der apikalen Membran der Enterozyten des Darms. Hier erfolgt bei den Nieren der Transport in das
Lumen des Tubulus und beim Darm in das Lumen des Gastrointestinaltraktes. In Gehirn (BHS), Plazenta und Testes ist P-gp in der luminalen Membran der Endothelzellen der Blutgefäße lokalisiert und vermindert hier die Persistenz hydrophober Stoffe im Gewebe.
Des Weiteren konnte P-gp in den Zellmembranen von bestimmten Leukozyten und Stammzellen des Knochenmarks nachgewiesen werden, wo es ebenfalls als Effluxtransporter für Xenobiotika fungiert (12).
Darüberhinaus besitzt P-gp noch weitere wichtige physiologische Funktionen. In den Nebennieren, dem Uterus und der Plazenta ist P-gp am Transport von Hormonen wie z.B.
Cortisol, Corticosteron und Aldosteron beteiligt (12).
Der Transportmechanismus ist noch nicht vollständig geklärt. Zuerst kommt es zur Substratbindung an den transmembranären Segmenten. Diese Bindung führt zur Aktivierung der ATPase, welche ATP hydrolysiert und somit die ATP-Bindung an die nukleotidbindenden Domänen gewährleistet. Es kommt zur Konformationsänderung des Proteins und zur Energiebereitstellung. Die Voraussetzungen für den eigentlichen Transport sind damit geschaffen. Es ist bisher nicht geklärt, ob der Transport über einen hydrophoben
”Vacuum Cleaner” stattfindet oder über eine Flippaseaktivität von P-gp (12).
Was P-gp so bedeutsam für die Elimination von Xenobiotika macht, ist v.a. seine breite Substratspezifität. Untersuchungen des National Cancer Institute haben gezeigt, dass es mehr als hundert Substrate gibt (15). Diese breite Spezifität ergibt sich wahrscheinlich daraus, dass die Substrate nicht an einer bestimmten Stelle am Molekül binden, sondern alle 12 transmembranären Segmente zur Verfügung stehen und hier je nach Substrat unterschiedliche Proteinsegmente genutzt werden (15).
Die Substrate sind strukturell sehr unterschiedlich, jedoch gibt es auch gemeinsame Merkmale. Es handelt sich um organische, hydrophobe Moleküle mit einem Molekulargewicht bis 1900 Da (7) und amphipatischen Charakter mit einem planaren Ringsystem. Häufig haben sie aromatische Gruppen und eine positive Ladung bei physiologischem pH (16). Nicht-aromatische lineare oder zirkuläre Verbindungen werden ebenfalls als Substrate akzeptiert. Ungeladene oder schwache Basen sind als Substrat weniger geeignet (7).
Aufgrund dieser breiten Substratspezifität von P-gp ist das Risiko für Arzneimittelinteraktionen erhöht (17).
1.3.1 P-gp-Substrate und –Inhibitoren
Wie in Kapitel 1.3 schon erwähnt, handelt es sich bei den P-gp-Substraten um die verschiedensten Fremdstoffe wie z.B. Zytostatika, herzwirksame Glykoside und Antiarrhythmika, HIV-Proteaseinhibitoren, Kalziumantagonisten, Antimykotika, Immunsuppressiva sowie Antihistaminika.
Neben den Substraten gibt es P-gp-Inhibitoren, welche teilweise gleichzeitig Substrat sind.
Diese Inhibitoren haben medizinisch eine hohe Relevanz und finden ihren Einsatz v.a. in der experimentellen Therapie der Multi-Drug Resistenz.
Viele Tumorzellen haben eine erhöhte P-gp-Expression, welche einen hohen Zytostatika- efflux zur Folge hat. Zytostatika, welche in der Krebstherapie eingesetzt werden, können in der Tumorzelle somit nicht wirken, man spricht hier von der Multi-Drug Resistenz. Um diesen Effekt zu umgehen, untersucht man derzeit in Studien den zum Zytostatikum parallelen Einsatz von Inhibitoren.
Die Inhibition des Transporters kann direkt über hydrophobe Interaktion mit den Substratbindungsstellen erfolgen oder indirekt durch Unterbrechung der mit dem Transportvorgang einhergehenden Modifikation des Proteins (18). Jedoch können Inhibitoren des Transportcarriers, wenn sie zur Akkumulation zytotoxischer Substanzen in der Zelle führen, auch zellschädigende Effekte haben.
Tabelle 1: Übersicht über die im Rahmen dieser Arbeit relevanten Substanzen und deren Einordnung in Substrat und Inhibitor anhand von Referenzen
Arzneimittelgruppe Substrat - Referenzen Inhibitor - Referenzen Cardiaka
Amiodaron 4 19 / 20 / 21 / 22 / 23
Digoxin 4 / 20 / 21 / 24 / 25 / 26
Verapamil 4 / 15 / 20 / 21 / 24 4 / 13 / 19 / 20 / 21 / 23 / 25 / 27 / 28/ 29 / 30 Antihistaminika
Terfenadin 4 / 24 19 / 21 / 29
Antimykotika
Ketoconazol 20 / 21 / 25 / 27
Antimalariamittel
Chloroquin 20 20
Neuroleptika
Chlorpromazin 20 19 / 20 / 29
Immunsuppressiva
Cyclosporin A 4 / 20 / 21 / 24 / 25/ 27 / 30 / 31
19 / 20 / 21 / 25 / 27/ 29 Zytostatika
Doxorubicin 4 / 19 / 24 20*
* morpholines Doxorubicin
Wie aus der Tabelle ersichtlich wird, sind viele Substanzen gleichzeitig Substrat und Inhibitor. Das Substrat verursacht in diesem Fall eine Sättigung des Transportcarriers, so dass dieser anderen Substanzen nicht mehr zur Verfügung steht.
Digoxin ist ein reines Substrat und hat keinen inhibitorischen Effekt, wohingegen Ketoconazol ausschließlich als Inhibitor agiert (26). Bei reinen Inhibitoren handelt es sich um Stoffe, die nicht transportiert werden. Ursächlich dafür kann sein, dass sie nicht an den Substratbindungsstellen binden und somit keine Konformationsänderung herbeifühern
oder, dass sie zwar an den Substratbindungstellen binden, aber z. B. aufgrund ihrer Molekülgröße nicht transportiert werden können.
Ein weiterer Aspekt, welcher die inhibitorische Potenz bestimmt, ist die biologische Verfügbarkeit, d.h. ob ausreichend hohe Konzentrationen des Inhibitors am Transporter erreicht werden, die dann zu einer Hemmung führen.
Litman et al. (15) teilt die Arzneimittelinteraktionen an P-gp wie folgt ein:
1. Agonisten, welche die ATPase-Aktivität stimulieren und Transportsubstrate sind (z.B. Anthrazykline)
2. Partielle Agonisten, welche die ATPase aktivieren, jedoch keine typischen Substrat- eigenschaften besitzen und wahrscheinlich aufgrund einer schnellen Rückdiffusion inhibitorisch auf den Transport wirken (z.B. Verapamil)
3. Antagonisten, welche P-gp über die ATPase- und Transportaktivität inhibieren (z.B. Cyclosporin A)
Auf die für diese Arbeit relevanten Arzneimittel soll im Folgenden kurz eingegangen werden.
Amiodaron, Digoxin und Verapamil gehören zur Gruppe der herzwirksamen Pharmaka (Cardiaka). Bei Amiodaron und Verapamil handelt es sich um Kalziumantagonisten und bei Digoxin um das Herzglycosid aus ”Digitalis lanata”. Bei Amiodaron kann es in seltenen Fällen zur Beeinträchtigung der Leberfunktion kommen. Für Digoxin sind keine lebertoxischen Nebenwirkungen bekannt und Verapamil kann als Nebenwirkung eine allergische Hepatitis auslösen.
Terfenadin, ein Antihistaminikum, kann ebenfalls zu Leberschäden führen, was eine Transaminaseerhöhung, Choleastase, Ikterus und Hepatits zur Folge haben kann.
Ketoconazol ist bekannt für seine schwere Hepatotoxizität, als Antimykotikum wird es bei Dermatomykosen eingesetzt. Folgende Nebenwirkungen können auftreten: Ikterus, Hepatitis bis hin zur Lebernekrose. Auch Fälle von einem letalen Leberversagen sind bekannt. Chloroquin, welches bei der Therapie von Malaria und Rheuma seine Anwendung findet, ist ebenfalls hepatotoxisch. Es führt zu Leberschäden bzw. verstärkt einen bestehenden Leberschaden u.a. bedingt durch seine starke Akkumulation in der Leber.
Chlorpromazin, ein Derivat von Phenothiazin, welches bei psychotischen Störungen eingesetzt wird, gilt ebenfalls als hepatotoxisch. Es kann zur Cholestase führen.
Auch Cyclosporin A und Doxorubicin sind hepatotoxisch. Als Interleukin-2-Inhibitor wird Cyclosporin A in der Transplantationsmedizin als Immunsuppressivum eingesetzt.
Doxorubicin ist ein zytotoxisches Antibiotikum und findet seinen Einsatz in der Krebstherapie (32).
1.4 in vitro-Modelle für Transportuntersuchungen
Grundsätzlich gibt es verschiedene in vitro-Modelle, mit welchen man P-gp-Substrate, -Inhibitoren und -Interaktionen untersucht. Die am häufigsten benutzten in vitro-Modelle sind MDR1 transfizierte Zelllinien und organotypische Zellen, d.h. nicht transfizierte Zellen.
Transfizierte Zellen zeigen eine Überexpression des P-gp-Transporters. Der Vorteil ist die deutlich höhere P-gp-Aktivität im Vergleich zu den nicht transfizierten Zellen und die Definiertheit des Modells. Die MDR1-transfizierten Zellen stellen ein sehr spezifisches Modell zur P-gp-Untersuchung dar, da nicht transfizierte Zellen nur eine geringe Hintergrundaktivität für den Transporter aufweisen. Problematisch ist jedoch, dass Influxtransporter für die hydrophilen Substrate fehlen. Keppler und Mitarbeitern ist es gelungen, mehrfach transfizierte Zellen herzustellen. Sie konnten bis zu 4 Gene einschleusen und somit dieses Problem teilweise beheben (33).
Nur organotypische Zellen haben eine nahezu vollständige Expression aller Transport- carrier und sind somit hinsichtlich der Repräsentativität geeigneter als die transfizierten Zellen. Problematisch ist hier wiederum die geringe Spezifität und Definierbarkeit, aufgrund der Vielzahl zum Teil überlappender Transportaktivitäten und die geringe Expressionsstärke der einzelnen Transporter.
Beispiele für organotypische Zellen sind die Caco-2-Zellen, welche aus humanen Kolonadenokarzinomen stammen, HepG2-Zellen, eine humane hepatozelluläre Karzinomzelllinie, sowie die LLC-PK1-Zellen. Bei letzteren handelt es sich um Schweinenierenepithelzellen. Die organotypischen Zellen dienen v.a. Untersuchungen hinsichtlich der Transportmechanismen.
Ebenfalls zu den organotypischen Zellen gehören die Hepatocytoma (HPCT)-Hybrid- Zellen. Bei diesen Zellen handelt es sich um eine Fusionszelllinie aus Fao-Reuber- Hepatoma-Zellen H35 und primären Rattenhepatozyten mit der Besonderheit, dass sie viele
Aufgrund der Morphologie werden bei den HPCT-Zellen zwei Typen unterschieden.
Typ 1-Zellen wachsen in unregelmäßigen Schichten und habe keine Kontakthemmung. Sie sind den Fao-Reuber-Zellen sehr ähnlich. Die Typ 2-Zellen dagegen bilden Monolayer, welche ein durch Zellkontakt reguliertes Wachstum haben. Im Gegensatz zu den Typ 1- Zellen und den Fao-Reuber-Zellen bilden sie Gallen-Kanalikuli (19).
Die im Rahmen dieser Arbeit verwendete Zelllinie HPCT-1E3 gehört zum Typ 2. In dieser Zelllinie konnte man kürzlich neben Phase 1- und Phase 2-Metabolismus und Gallesekretion die Expression vieler leberspezifischer Carrierproteine für organische Anionen sowie deren Funktionalität nachweisen, wie zum Beispiel Mdr1a und Mdr1b, welche funktionelle Homologe des humanen MDR1 sind (34).
Somit kann man die grundsätzliche Eignung dieser Zellline als in vitro-Modell für P-gp- Transport- und Regulationsstudien annehmen.
1.5 Aufgabenstellung
Nachdem kürzlich unter anderem die Mdr1-Expression in der HPCT-1E3-Zelllinie nachgewiesen wurde (34), soll nun im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden, ob diese Zelllinie als zuverlässiges in vitro-Modell für P-gp-Studien geeignet ist, wobei der Schwerpunkt auf der hepatozellulären Zytotoxizität als Folge von pharmakokinetischen Arzneimittelinteraktionen liegt.
Wie schon erwähnt, besteht die Möglichkeit, dass es bei einer Komedikation zu pharmakokinetischen Arzneimittelinteraktionen an den Transmembrantransportern kommen kann. Diese Arbeit konzentriert sich auf die hepatotoxischen Effekte aufgrund der Inhibition des Effluxtransporters P-Glycoprotein.
Die Hypothese ist, dass es bei Gabe eines Arzneimittels mit P-gp-inhibitorischen Eigenschaften zur Akkumulation von anderen Arzneimitteln in der Zelle kommt, wenn diese P-gp-Substrate sind. Handelt es sich bei den Substraten um zytotoxische Substanzen, so hat diese Akkumulation eine zellschädigende Wirkung zur Folge.
Dieser Vorgang soll im HPCT-1E3-Zellmodell im Rahmen dieser Arbeit simuliert werden.
Zunächst soll untersucht werden, inwieweit inhibitorische Effekte typischer P-gp- Inhibitoren in den HPCT-1E3-Zellen auftreten und das Ausmaß der Zytotoxizität ausgewählter Substrate bestimmt werden. Anhand dieser Ergebnisse sollen dann Kombinationen zweier Arzneimittel gefunden werden, welche das Potential haben, in den
HPCT-1E3-Zellen zytotoxische Effekte aufgrund einer Arzneimittelinteraktion hervorzurufen, wobei ein Arzneimittel als Inhibitor fungiert und das zweite als Substrat.
2 Materialien und Methoden
2.1 Chemikalien
In der folgenden Tabelle sind alle Substrate bzw. Inhibitoren und die verwendeten Stammlösungen aufgeführt.
Tabelle 2: Chemikalien, Herkunft, Qualität und Stammlösungen
Substrat / Inhibitor
Firma (Prod.-Nr.)
Qualität Stammlösung
Amiodaron
Hydrochlorid Sigma
(A8423) ≥ 98 % (TLC) 50 mg/ml MeOH Chloroquin
Diphosphat Sigma
(C6628) ≥ 98 % (TLC) 71,5 mg/ml Reinstwasser Chlorpromazin
Hydrochlorid
Fluka ≥ 95 % (AT) 50 mg/ml Reinstwasser Cyclosporin A Fluka
(30024) ≥ 98,5 % (TLC) 20 mg/ml EtOH
Digoxin Fluka
(37100)
95 % (HPLC) 48 mg/ml DCM/MeOH (50:50)
Doxorubicin Hydrochlorid
Fluka (44583)
≥ 98 % (TLC) 0,1 mg/ml DME-Medium
Ketoconazol Sigma
(K1003)
≥ 98 % (TLC) 50 mg/ml MeOH Rhodamin123 Calbiochem
(555505)
≥ 95 % (HPLC) 50 mM in DMSO
Terfenadin Sigma
(T9652)
k.A. 25 mg/ml MeOH
Verapamil Hydrochlorid
Fluka (94837)
≥ 99 % (TLC) 50 mg/ml MeOH
Alle in Reinstwasser gelösten Stammlösungen wurden mittels Filtration durch einen Filter mit 0,22 µm Porendurchmesser sterilisiert. Chemikalien, welche nicht explizit aufgezählt sind, stammen von Sigma oder Roth in p.a. Qualität.
2.2 Kultivierung der HPCT-1E3-Zelllinie
Die Zellen wurden in DME-Medium (1 g/l Glucose, 2 mM L-Glutamin, 0,1 % Inosin, 0,1
% Insulin, 0,1 % Dexamethason, 10 % FKS [PAA, Cölbe]) bei 37 °C, 5 % CO2 und 100 % Luftfeuchte kultiviert. Die Subkultivierung der Zellen erfolgte alle 3 - 4 Tage. Dazu wurde eine zu 80 % konfluent bewachsene T 75 Kulturflasche zweimal mit 10 ml PBS (8,59 g NaCl, 0,2 g KCl, 0,22 g KH2PO4 und 1,52 g Na2HPO4 auf 1 l bidestilliertem Wasser, autoklaviert)gewaschen. Zum Ablösen der Zellen vom Flaschenboden wurde anschließend 1 ml Trypsin-EDTA (PAA, Cölbe) zugegeben. Nach ca. einminütiger Inkubation wurden die Zellen in 10 ml DME-Medium aufgenommen und suspendiert. Um nach 3 Tagen konfluent gewachsene Zellen zu erhalten, wurden 1,3 Mio Zellen pro T 75 Kulturflasche ausgesät und bei 4 Tagen 1,1 Mio Zellen.
2.3 MTT-Test
Eine Methode zur Prüfung der Zytotoxizität von Sustanzen ist der MTT-Test. Er dient dem quantitativen Nachweis vitaler, metabolisch aktiver Zellen. Als Indikator nutzt der Test die Aktivität der mitochondrialen Dehydrogenasen, welche vom physiologischen Zustand der Zellen abhängig ist. Die mitochondrialen Dehydrogenasen sind in der Lage MTT, ein gelbes Tetrazoliumsalz, in das blaue wasserunlösliche Formazansalz zu überführen. Die Intensität der Blaufärbung wird nach Solubilisierung der Farbkristalle spektrometrisch erfasst und lässt auf die Vitalität der Zellen schließen.
Die Durchführung erfolgte in 96well-Platten mit einer Aussaatdichte von 15.000 HPCT- Zellen pro well. Nach 24 h Inkubation wurde ein Mediumwechsel (200 µl/well) vorgenommen. Das Medium wurde nun mit dem entsprechenden Substrat bzw.
Substrat/Inhibitor-Kombination in aufsteigender Konzentration versetzt. In der Negativkontrolle wurde das Medium ohne Substrat eingesetzt bzw. mit Substrat, aber ohne Inhibitor. Als Positivkontrolle diente Triton X-100 (0,1 % in Medium), welches direkt zytotoxisch ist und zu einem vollständigen Absterben der Zellen führt.
Nach einer Inkubationsdauer von 48 h erfolgte die Zugabe von 20 µl MTT-Lösung
(5 mg/ml in PBS) und eine weitere Inkubation von 2 h. Danach wurde der Überstand abgenommen und die Formazan/Farbstoffkristalle durch 100 µl SDS-Lysepuffer (0,67 % in
Die Messung der Absorption erfolgte im Spektrometer Tecan Spectra Rainbow bei einer Wellenlänge von 570 nm und einer Referenz-Wellenlänge von 630 nm.
2.4 Rhodamin123-Akkumulationstest
Zum Nachweis der funktionellen P-gp-Aktivität und den P-gp-Inhibitoreigenschaften von Substanzen wurde der Rhodamin123-Akkumulationstest herangezogen.
Rhodamin123 ist ein als spezifisches P-gp-Substrat bekannter Fluoreszenzfarbstoff, welcher aus den Zellen durch P-gp aktiv transportiert wird (20). P-gp aktive Zellen, welche mit Rhodamin123 beladen werden, zeigen daher eine zeitabhängige Abnahme der zell- assoziierten Fluoreszenz. Bei Zugabe eines Inhibitors kann man eine geringere Abnahme der Fluoreszenz erwarten, da die Inhibition von P-gp zu einem reduzierten Rhodamin123- Efflux führt. Als Parameter dient somit die Fluoreszenzintensität.
HPCT-Zellen wurden mit einer Dichte von 15.000 pro well in einer 96well-Platte ausgesät und für 24, 48 und 96 h inkubiert. Danach erfolgte ein Mediumwechsel und die Beladung der Zellen mit 10 µM Rhodamin123 in DME-Medium plus den entsprechenden Inhibitoren (100 µl/well). Als Kontrollen dienten Versuchsreihen mit Rhodamin123-freiem Medium und Rhodamin123-Medium ohne Inhibitor. Nach Ablauf von 2 h wurden alle wells dreimal mit eiskaltem PBS gewaschen und mit 1%igem SDS in PBS (100 µl/well) lysiert. Des Weiteren wurde bei jedem Ansatz eine Rhodamin123-Standardreihe mit 1%igem SDS in PBS als Leerwert hergestellt.
Die Fluoreszenzintensität wurde mit dem Spektrophotometer TECAN GENios bei einer Extinktionswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 535 nm gemessen.
2.5 Datenanalyse und statistische Auswertung
Zur Auswertung des Rhodamin123-Akkumulationstests wurden zuerst Mittelwert und Standardabweichung der jeweiligen Messreihen (n=6) ermittelt. Aus den Mittelwerten wurde die mittlere relative Akkumulation bezogen auf die Kontrolle (100 %) sowie die prozentuale Standardabweichung berechnet. Mittels zweiseitigen Students-t-Test wurde die Verschiedenheit zur Kontrolle überprüft. Bei gleicher Varianz in der Messgruppe wurde der t-Test homoskedastisch, in anderen Fällen heteroskedastisch durchgeführt. Als Signifikanzschwelle wurde ein Wert von P=5 % (P = Irrtumswahrscheinlichkeit) gewählt.
Liegt P unter 5 % wird davon ausgegangen, dass sich die beiden Messreihen signifikant unterscheiden. Die Auswertung des Rhodamin123-Akkumulationstests wurde mit der Software Microsoft Office Excel 2003 (Microsoft Corporation, Seattle, WA, USA) durchgeführt.
Zur Auswertung der Zytotoxizitätstests der Einzelsubstanzen mittels MTT-Test wurde die als optische Dichte gemessene MTT-Konversion zunächst in eine auf die Kontrolle bezogene prozentuale Vitalität umgerechnet. Weiterhin wurde die mittlere Vitalität jeder Behandlungsgruppe und deren Standardabweichung ermittelt
Im Rahmen der Auswertung der Untersuchungen zur Zytotoxizität wurden NOEC-, LC50- und IC50-Werte ermittelt. Dabei dienten der NOEC-Wert (No Observed Effect Concentration = Stoffkonzentration, bei welcher kein signifikanter Effekt auftritt) und der LC50-Wert (Lethal Concentration = Stoffkonzentration, bei welcher die MTT-Umwandlung und damit die Vitalität der Zellen um 50 % reduziert wird) der Beschreibung der Zytotoxizität der Einzelsubstanzen.
Wurden im Rahmen der P-gp-Interaktionsanalyse Zytotoxizitätstest mit Substanzkombinationen durchgeführt, so wurde zur Unterscheidung von Versuchen mit Einzelsubstanzen statt der Bezeichnung LC50 ein IC50-Wert (Inhibitory Concentration = Stoffkonzentration, bei welcher die MTT-Umwandlung zu 50 % inhibiert ist) berechnet.
Zur Ermittlung der LC50- und IC50-Werte wurde mit Hilfe der Software GraphPad Prism 4.03 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) eine nichtlineare Regression
(Y=Ymax /[1+10(Log(LC50)–X *Anstieg]) durchgeführt. Die Güte der Kurvenanpassung wurde anhand der Breite der berechneten Konfidenzintervalle (CI) sowie visuell überprüft. Werte, welche außerhalb der Testkonzentration lagen, wurden als nicht nachweisbar (n.n.) definiert.
Kurvenparameter einem unpaired (ungepaart) t-Test untergezogen. Dieser führt einen Vergleich zwischen zwei Gruppenmittelwerten mit t-Test aus.
Der NOEC wurde als höchste Konzentration abgeleitet, bei welcher der t-Test keinen signifikanten Unterschied zur Kontrolle zeigte. Die Berechnung erfolgte ebenfalls mit GraphPad Prism 4.03.
3 Ergebnisse
3.1 Zytotoxizität der Einzelsubstanzen
Als Grundlage für die Festlegung der Arbeitskonzentration in den geplanten Untersuchungen zur Inhibition von Pgp (Rhodamin123-Akkumulationstest) sowie der Analyse möglicher toxikokinetischer Interaktionen wurde zunächst die Zytotoxizität der ausgewählten Einzelsubstanzen untersucht. Hierzu wurde mittels MTT-Test die Gesamtvitalität von HPCT-1E3 Kulturen nach einer Inkubationsdauer von 48 h bestimmt.
Abbildung 3 zeigt exemplarisch die resultierende Dosis-Wirkungs-Beziehung für Ketoconazol und Amiodaron. Während für Ketoconazol der herkömmliche sigmoidale Zusammenhang beobachtet wurde, lässt sich für Amiodaron zunächst eine Zunahme der MTT Umwandlung bei subtoxischen Konzentrationen erkennen.
0 20 40 60 80 100 120 140 160
0 1 2 3 6 13 25 50 100
Konz. [µg/ml]
Vitalität [%]
Amiodaron Ketoconazol
Abbildung 3: Dosis–Wirkungsbeziehung von Amiodaron und Ketoconazol
Um einen derartigen Kurvenverlauf adäquat zu berücksichtigen, muss zur Charakterisierung der Zytotoxizität der Einzelsubstanzen neben der LC50 eine NOEC herangezogen werden, welche die höchste Konzentration darstellt, bei der keinerlei Beeinflussung der MTT-Umsetzung festgestellt werden kann.
Tabelle 3 gibt einen Überblick über die ermittelten NOEC- und LC50-Werte der einzelnen Substanzen.
Tabelle 3: NOEC- und LC50-Werte der Einzelsubstanzen
Substanz NOEC [µg/ml] LC50 (95 % CI) [µg/ml]
Amiodaron 0,78 25,36 (21,75 – 29,57)
Chloroquin 0,22 27,85 (24,11 – 32,18)
Chlorpromazin 0,23 21,01 (8,71 – 23,59)
Cyclosporin A 14,81 87,28 (56,27 – 135,4) Digoxin 48,00 786,50 (620,6 – 996,7) Doxorubicin 0,16 1,42 (0,83 – 2,44) Ketoconazol 10,70 42,82 (39,17 – 46,80) Terfenadin 4,00 9,91 (7,60 – 12,92) Verapamil 18,52 143,00 (74,73 – 273,70)
Von allen getesteten Substanzen reagierten die HPCT-1E3 Zellen auf Doxorubicin mit einer LC50 von 1,42 µg/ml am empfindlichsten, während die Mehrzahl der Verbindungen eine LC50 zwischen 9 und 90 µg/ml zeigte. Verapamil war mit einer LC50 von 143,00 µg/ml deutlich weniger zytotoxisch, wie auch Digoxin mit einer LC50 von 786,50 µg/ml.
Die jeweiligen NOEC´s lagen in der Regel nicht weit unter der LC50 (um < Faktor 10). Eine in Relation zur LC50 sehr geringe NOEC konnte bei Amiodaron (0,78 µg/ml), Chlorpromazin (0,23 µg/ml) und Chloroquin (0,22 µg/ml) beobachtet werden, hier lag die NOEC um Faktor 30 – 130 unter der LC50. Die NOEC von Digoxin mit 48,00 µg/ml lag um Faktor 16 unter der LC50.
Nicht für alle Substanzen war die NOEC die Konzentration vor Abnahme der Vitalität. V.a.
bei Amiodaron, Ketoconazol und Verapamil konnte man bei visueller Auswertung der Kurven zuerst eine Zunahme der MTT-Umwandlung feststellen. Die Vitalität stieg hier teilweise auf 110–135 % (siehe Abbildung 3).
3.2 Pgp-Inhibitoreigenschaften der Einzelsubstanzen
In einem nächsten Schritt wurde weiterhin überprüft, ob die ausgewählten Testsubstanzen die P-gp-Aktivität in HPCT-1E3-Zellen inhibieren. Hierzu diente der sogenannte Rhodamin123-Akkumulationstest. Eine signifikante Inhibition der P-gp-Aktivität führt zu einer verstärkten intrazellulären Anreicherung des fluoreszierenden Substrates Rhodamin123. Die folgende Tabelle zeigt die Akkumulation des Rhodamin123 in den Zellen nach Behandlung mit dem jeweiligen Inhibitor an Tag 1, 2 sowie 3 der Kultur. Als Ausgangswert (100 %) wurde die Akkumulation des Rhodamins123 in den Zellen ohne deren Behandlung mit einem Inhibitor angesehen.
Tabelle 4: P-gp Inhibitor-Eigenschaften der Testsubstanzen in HPCT-1E3-Zellen an Tag1-3 der Kultur (Rhodamin123-Akkumulationstest)
Inhibitor Konz. Rhodamin123-Akkumulation [%]
[µg/ml] Tag 1 Tag 2 Tag 3
Amiodaron 5 257,70 ± 71,17 ** 326,29 ± 84,51 *** 191,09 ± 23,08 ***
Chloroquin 2 125,21 ± 24,32 107,33 ± 11,14 129,83 ± 31,35 Chlorpromazin 10 116,40 ± 24,19 117,32 ± 34,88 112,69 ± 20,71 Cyclosporin A 10 335,60 ± 38,59 *** 283,30 ± 89,47 ** 431,02 ± 32,15 ***
2 373,56 ± 16,09 *** 534,92 ± 89,29 ** 543,67 ± 43,67 ***
1 403,45 ± 54,02 *** 426,61 ± 86,66 ** 418,35 ± 74,68 ***
Doxorubicin 1 110,38 ± 33,29 122,79 ± 11,52 * 119,40 ± 14,19 Ketoconazol 5 101,60 ± 22,68 124,24 ± 49,79 91,47 ± 38,31 Terfenadin 5 242,10 ± 100,58 * 257,93 ± 60,34 *** 207,44 ± 31,60 ***
Verapamil 50 299,77 ± 77,00 *** 386,74 ± 117,04 ** 277,38 ± 70,26 ***
15 365,52 ± 41,38 *** 317,92 ± 36,13 ** 515,19 ± 59,49 ***
5 357,47 ± 27,59 *** 394,87 ± 74,65 *** 746,84 ± 120,25 ***
* P ≤ 5 %; ** P ≤ 1 %; *** P ≤ 0,1 %
Der Rhodamin123-Akkumulationstest zeigte, dass nicht alle Substanzen, welche in anderen Studien als P-gp-Inhibitor identifiziert wurden, derartige Eigenschaften auch in dem für HPCT-1E3-Zellen untoxischen Konzentrationsbereich in diesem Modell besitzen.
Für 2 µg/ml Chloroquin, 10 µg/ml Chlorpromazin, 1 µg/ml Doxorubicin und 5 µg/ml Ketoconazol konnte keine signifikante Inhibition des Rhodamintransportes aus den Zellen festgestellt werden. Die gemessenen intrazellulären Rhodamin123-Konzentrationen bewegten sich im Bereich vom 0,9 bis 1,3fachen der jeweiligen Kontrolle.
Die bekannten P gp-Inhibitoren Cyclosporin A und Verapamil zeigten an Tag 1, 2 als auch 3 der Kultur eine statistisch hoch signifikante Zunahme der Rhodamin123-Akkumulation in den Zellen. Bei 2 µg/ml Cyclosporin A stieg die Rhodamin123-Akkumulation z.B. auf 543,67 % und bei 5 µg/ml Verapamil auf 746,84 %. Die Rhodamin123-Akkumulation nach P-gp-Inhibition durch Behandlung mit 2–10 µg/ml Cyclosporin A oder 5–15 µg/ml Verapamil stieg an Tag 1 auf das 3-3,7fache, an Tag 2 auf das 2,8-5fache und an Tag 3 auf das 2,8–7,5fache der jeweiligen Kontrolle.
Eine geringere, jedoch statistisch signifikante P-gp-Inhibition konnte ebenfalls für 5 µg/ml Amiodaron und 5 µg/ml Terfenadin an allen der 3 getesteten Kulturtage belegt werden. Die intrazelluläre Rhodamin123-Konzentration betrug für Amiodaron das 1,9–3,3fache, für Terfenadin das 2,1–2,6fache der jeweiligen Kontrolle.
3.3 Pharmakokinetische Wechselwirkungen als Basis von Arzneimittelinteraktionen
Beruhend auf den Ergebnissen der Rhodamin123-Akkumulationsstudien (siehe Kapitel 3.2) wurden nun die Substanzen mit nachgewiesenen inhibitorischen Effekten auf ihre Interaktionen mit anderen P-g-Substraten hin überprüft. Die verwendeten Inhibitoren umfassen Cyclosporin A, Verapamil, Amiodaron und Terfenadin. Diese wurden dem Zellkulturmedium in den zuvor ausgewählten Konzentrationen (siehe Kapitel 3.2) zugesetzt. Nach einer Inkubationsdauer von 24 h wurde erwartet, dass bei P-gp-Inhibition toxische P-pg Substrate verstärkt intrazellulär akkumulieren, was wiederum zu einer mittels MTT-Test messbaren Zunahme der Zytotoxizität führen sollte.
3.3.1 Cyclosporin A als Inhibitor
10 µg/ml Cyclosporin A führten bei der Zugabe zu Ketoconazol-behandelten Zellen (siehe Abbildung 4) zu einer statistisch signifikanten Abnahme der IC50 von 46,15 µg/ml auf 34,68 µg/ml (P ≤ 0,1 %). Dies wurde in einem zweiten Versuch mit einer Abnahme der IC50
von 65,81 µg/ml auf 54, 15 µg/ml (P ≤ 5 %)bestätigt.
0 20 40 60 80 100 120 140
0 2 3 6 11 19 33 57 100
Keto-Konz. [µg/ml]
Vitalität [%]
Keto w/o + 10 µg/ml CsA
Abbildung 4: Zytotoxizität von Ketoconazol in HPCT-1E3-Zellen über 48 h mit und ohne Zugabe von 10 µg/ml Cyclosporin A
Auch bei Zugabe von 2 µg/ml Cyclosporin A kam es zu einer signifikanten Abnahme der Vitalität Chlorpromazin-behandelter Zellen (siehe Abbildung 5) von IC50 = 23,17 µg/ml auf IC50 = 2,81µg/ml (P ≤ 0,1 %). Ein nachfolgender Versuch zeigte diesen Effekt ebenfalls, jedoch weniger stark ausgeprägt. Die IC50 verringerte sich von 15,37 µg/ml auf 11,45 µg/ml (P ≤ 0,1 %).
0 20 40 60 80 100 120
0,0 0,2 0,7 2 6 19 56 167 500
CPZ-Konz. [µg/ml]
Vitalität [%]
CPZ w/o + 2 µg/ml CsA
Abbildung 5: Zytotoxizität von Chlorpromazin in HPCT-1E3-Zellen über 48 h mit und ohne Zugabe von 2 µg/ml Cyclosporin A
Bei der Kombination von 1 µg/ml Cyclosporin A mit Verapamil kam es zu keiner statistisch signifikanten Inhibition (Verapamil w/o: IC50 = 138,80 µg/ml / + 1 µg/ml Cyclosporin A:
IC50 = 132,80 µg/ml).
3.3.2 Verapamil als Inhibitor
Verapamil als zweiter starker Inhibitor neben Cyclosporin A zeigte ebenfalls deutliche inhibitorische Effekte. Während bei 5 µg/ml Verapamil in Kombination mit ansteigenden Konzentrationen von Chlorpromazin keine Beeinflussung der Zytotoxizität beobachtet werden konnte (Chlorpromazin w/o: IC50 = 15,37µg/ml / + 5 µg/mlVerapamil: IC50 = 15,51 µg/ml), so zeigte sich bei 15 und 50 µg/ml Verapamil eine statistisch signifikante Reduktion der Vitalität. Bei der Zugabe von 50 µg/ml Verapamil zu Cyclosporin A- (siehe Abbildung 6), Ketoconazol- und Terfenadin-behandelten Zellen waren deutliche Effekte erkennbar. Die IC50 von Cyclosporin A-behandelten Zellen sank von 27,04 µg/ml auf 8,17 µg/ml (P ≤ 0,1 %) und wurde in einem zweiten Versuch bestätigt. Aufgrund von Problemen mit der Kurvenanpassung der Kontrolle wurde der Vergleich mit 15 µg/ml Verapamil herangezogen. Es kam zu einer konzentrationsabhängigen Abnahme der IC50 von 23,47 µg/
ml bei einer Zugabe von 15 µg/ml Verapamil auf 9,41 µg/ml bei Zugabe von 50 µg/ml Verapamil (P ≤ 0,1 %).
0 20 40 60 80 100 120 140
0,0 0,2 0,5 2 5 15 44 133 400
CsA-Konz. [µg/ml]
Vitalität [%]
CsA w/o
+ 50 µg/ml Vera
Abbildung 6: Zytotoxizität von Cyclosporin A in HPCT-1E3 Zellen über 48 h mit und ohne Zugabe von 50 µg/ml Verapamil
Bei Ketoconazol sank die IC50 nach Zugabe von 50 µg/ml Verapamil (siehe Abbildung 7) von 65,81 µg/ml auf 44,83µg/ml (P ≤ 0,1 %) und in einem zweiten Versuch von 47,02 µg/
ml auf 30,99 µg/ml (P ≤ 0,1 %).
0 20 40 60 80 100 120
0 2 3 6 11 19 33 57 100
Keto-Konz. [µg/ml]
Vitalität [%]
Keto w/o + 50 µg/ml Vera
Abbildung 7: Zytotoxizität von Ketoconazol in HPCT-1E3 Zellen über 48 h mit und ohne Zugabe von 50 µg/ml Verapamil
Auch die mit Terfenadin behandelten Zellen reagierten sensitiv auf 50 µg/ml Verapamil (siehe Abbildung 8). Es kam zur Abnahme der IC50 von 13,90 µg/ml auf 6,48 µg/ml
(P ≤ 0,1 %). Eine Abnahme der IC50 von 4,55 µg/ml auf 0,67 µg/ml (P ≤ 5 %) bestätigte diesen Effekt in einem zweiten Versuch.
0 20 40 60 80 100 120
0 1 2 4 8 13 17 20 50
Ter-Konz. [µg/ml]
Vitalität [%]
Ter w/o
+ 50 µg/ml Vera
Abbildung 8: Zytotoxizität von Terfenadin in HPCT-1E3-Zellen über 48 h mit und ohne Zugabe von 50 µg/ml Verapamil
Eine Ausnahme bildete Chlorpromazin. Bei der Zugabe von 50 µg/ml Verapamil zu Chlorpromazin-behandelten Zellen war kein statistisch signifikanter Effekt feststellbar (Chlorpromazin w/o: IC50 = 17,11 µg/ml / + 50 µg/mlVerapamil: IC50 = 15,69 µg/ml).
Reduzierte man die Verapamilkonzentration auf 15 µg/ml, so konnte man die bei 50 µg/ml erreichten Effekte bei den Cyclosporin A-behandelten Zellen nicht erzielen (Cyclosporin A w/o: IC50 = 27,04 µg/ml / + 15 µg/mlVerapamil: IC50 = 23,47 µg/ml). Bei den Terfenadin- behandelten Zellen kam es auch bei einer Verapamilkonzentration von 15 µg/ml (siehe Abbildung 9) zu einer Abnahme der IC50 von 13,90 µg/ml auf 11,45 µg/ml (P ≤ 0,1 %).
0 20 40 60 80 100 120
0 1 2 4 8 13 17 20 50
Ter-Konz. [µg/ml]
Vitalität [%]
Ter w/o
+ 15 µg/ml Vera
Abbildung 9: Zytotoxizität von Terfenadin in HPCT-1E3 Zellen über 48 h mit und ohne Zugabe von 15 µg/ml Verapamil
3.3.3 Amiodaron und Terfenadin als Inhibitoren
Amiodaron und Terfenadin, welche im Rhodamin123-Akkumulationstest ebenfalls P-gp inhibitorische Wirkungen zeigten, führten in den Interaktionsversuchen zu keiner statistisch signifikanten Beeinflussung der Zytotoxizität von Ketoconazol oder Terfenadin:
Die Kombination Ketoconazol mit 5 µg/ml Amiodaron führte zu einer signifikanten Abnahme der IC50 von 46,15 µg/ml auf 26,79 µg/ml. In einem weiteren Versuch konnte dieser Effekt nicht bestätigt werden. Die IC50 von Ketoconazol lag ohne Amiodaron bei 34,92 µg/ml und nach Zugabe von 5 µg/ml Amiodaron bei 32,89 µg/ml.
Bei Ketoconazol und 5 µg/ml Terfenadin war zunächst auch eine signifikante Abnahme der IC50 von 47,02 µg/ml auf 18,33 µg/ml zu verzeichnen. In einem zweiten Versuch lag die IC50 ohne Terfenadin bei 34,92 µg/ml und nach Zugabe von 5 µg/ml Terfenadin bei 33,13 µg/ml und bestätigte somit ebenfalls nicht den Effekt aus dem ersten Versuch.
Andere Kombinationen führten ebenso zu keiner statistisch signifikanten Zunahme der Toxizität. Die IC50 von Ketoconazol lag ohne Inhibitor bei 39,71 µg/ml und mit 1 µg/ml Amiodaron bei 40,56 µg/ml. Auch bei Terfenadin kam es nach Zugabe von Amiodaron zu keiner signifikanten Abnahme der IC50. Ohne Amiodaron lag die IC50 von Terfenadin bei 8,41 µg/ml, nach Zugabe von 1 µg/ml Amiodaron bei 11,03µg/ml und nach Zugabe von 5 µg/ml Amiodaron bei 6,80 µg/ml.
4 Diskussion der Ergebnisse
Gegenstand der durchgeführten Arbeiten war die Hypothese, dass sich die Toxizität von Substraten des P-gp-Effluxsystemes in Anwesenheit von Pgp-Inhibitoren im HPCT-1E3 Hepatozytoma-Modell verstärkt und als Abnahme der im MTT-Test bestimmten LC50
messbar wird. Zur Überprüfung der Hypothese wurde in Vorarbeiten die Toxizität der Einzelsubstanzen bestimmt und die P-gp-Inhibitorwirkung der vorgesehenen Inhibitoren überprüft.
4.1 Zytotoxizität der Einzelsubstanzen
Doxorubicin zeigte mit einer LC50 von 1,42 µg/ml die höchste Toxizität aller untersuchten Substanzen in den HPCT-1E3-Zellen. Dies war zu erwarten, da es sich um ein Zytostatikum handelt. Terfenadin, Chlorpromazin, Amiodaron und Chloroquin zeigten mit LC50 – Werten zwischen 9 und 30 µg/ml eine mittlere Toxizität in den Zellen.
Das Antihistaminikum Terfenadin wies mit einer LC50 von 9,91 µg/ml die zweitstärkste Hepatotoxizität auf. Bei therapeutischem Einsatz werden maximale Plasmakonzentrationen von nur 1-3 ng/ml erreicht (35). Daher überrascht es wenig, dass eine klinische Toxizität sich an anderen Organen, in diesem Fall insbesondere am Herz, äußert. In einem Gutachten der EMEA (The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products) heißt es hierzu: …, dass die Sicherheit von Terfenadin-haltigen Arzneimitteln wegen deren arrhythmogenen Potentials und ihrer schweren kardialen Nebenwirkungen, für die verschiedene Risikofaktoren festgestellt worden sind (einschließlich die gleichzeitige Gabe von arrhythmogenen Arzneimitteln), besondere Sorge bereite (36).
Auffällig beim Terfenadin ist die steile Dosis-Wirkungs-Kurve. Die LC50 liegt nur um den Faktor 2,5 unter der NOEC von 4,00 µg/ml, während bei den meisten Substanzen (Cyclosporin A, Digoxin, Doxorubicin und Verapamil) die NOEC um Faktor 4 - 17 unter der LC50 lag. Eine steile Dosis-Wirkungskurve zeigte sich ebenso beim Ketoconazol. Mit 10,70 µg/ml lag die NOEC nur um Faktor 4 unter der LC50 von 42,82 µg/ml. Das Gegenteil konnte bei Amiodaron, Chloroquin und Chlorpromazin beobachtet werden. Hier lagen die LC50-Werte um Faktor 30 – 130 unter der NOEC, die Dosis-Wirkungskurve ist also dementsprechend flacher.
Ob eine Dosis-Wirkungskurve steil oder flach verläuft, kann von dem Mechanismus der Toxizität bestimmt und damit substanzabhängig sein. Je lebenswichtiger ein Vorgang ist, in den die Substanz eingreift, um so schneller wird sie zum Vitalitätsverlust führen oder eine Apoptose auslösen. Eingriffe zum Beispiel in die Atmungskette bzw. die Energiegewinnung führen eher zum Zelluntergang als zum Beispiel Eingriffe in die DNA, da die Zelle hier über zusätzliche Reparaturmechanismen verfügt. Zum Anderen können die Expressionsrate des Transporters, die Km-Werte der Substrate und die Vmax-Werteeine Rolle spielen. Ein niedriger Km-Wert zum Beispiel könnte zu einer steileren Dosis- Wirkungskurve führen. Diese Theorie konnte bei Terfenadin und Ketoconazol jedoch nicht bestätigt werden. Trotz der steilen Dosis-Wirkungskurve sind die Km-Werte beider Substrate mit 2,2 µM (37) und 8,6 µM (38) im gleichen Bereich wie die Km-Werte anderer Substrate.
Chlorpromazin konnte mit einer LC50 von 21,01 µg/ml als toxisch für die HPCT-1E3-Zellen eingestuft werden. Typische therapeutische Plasmaspiegel liegen im Bereich unter 0,1 µg/
ml (39). Eine Lebertoxizität ist für Chlorpromazin bekannt, bezieht sich jedoch eher auf die cholestatische Wirkung (40), welche hier nicht Bestandteil der Untersuchung war. Toxische Leberschädigungen werden unterteilt in hepatozelluläre und cholestatische bzw. eine Mischform beider Schädigungen (41).
Gleichermaßen sensitiv, wie auf Chlorpromazin, reagierten die Zellen auf Amiodaron (LC50
= 25,36 µg/ml) und Chloroquin (LC50 = 27,85 µg/ml).
Die Toxizität von Amiodaron war zu erwarten. Beobachtungen an Patienten haben gezeigt, dass bei bis zu 1 % der Patienten, welche mit potenziell hepatotoxischen Arzneimitteln therapiert werden, unerwünschte Nebenwirkungen an der Leber auftreten, wobei sich im Fall von Amiodaron diese Zahl auf 3 – 4 % erhöht (41).
Akute Vergiftungsfälle mit Chloroquin sind durch Herzmuskellähmungen sowie Kreislauf- und Atmungsstörungen gekennzeichnet (42). Dies befindet sich in Übereinstimmung mit einem großen Abstand zwischen den typischen maximalen Plasmaspiegeln von 0,01-0,03 µg/ml in Prophylaxe und 0,1-0,2 µg/ml in Therapie einerseits (42), und der in HPCT-1E3- Zellen bestimmten LC50 von 27,85 µg/ml. Die hepatotoxische Wirkung von Chloroquin äußert sich durch einen Anstieg der Leberenzyme (43).
Das für seine Lebertoxizität bekannte Ketoconazol (32) war mit einer LC50 von 42,82 µg/ml im Vergleich zu den anderen Substanzen weniger toxisch. Dem steht jedoch eine Erreger- abhängige MHK (minimale Hemmkonzentration) im Bereich von 1-50 µg/ml gegenüber
(44), so dass aufgrund des geringen therapeutischen Index in der BRD derzeit keine Präparate zur systemischen Anwendung von Ketoconazol vertrieben werden.
Ebenso kann Cyclosporin A mit einer LC50 von 87,28 µg/ml im Vergleich zu den anderen hier getesten Substanzen als weniger toxisch eingestuft werden. Trotz eines großen Abstandes zum therapeutischen Bereich von 0,35-0,8 µg/ml Blut (45) gilt Cyclosporin A als zytotoxisch (46) bzw. lebertoxisch (32).
Obwohl für Verapamil lebertoxische Wirkungen beschrieben werden (47), erwies es sich in den Toxizitätsversuchen mit der HPCT-1E3-Zelllinie als relativ untoxisch. Die LC50 von 143,00 µg/ml spiegelte eine geringe Sensitivität der Zellen gegenüber Verapamil wieder und ist deutlich geringer als die LC50 in vivo von ca. 10 µg/ml (48). Diese Diskrepanz ist dadurch zu erklären, dass die Letalität auf Effekte am kardiovaskulären System und nicht auf Lebertoxizität zurückzuführen ist.
Die mit Abstand geringste Zytotoxizität zeigte Digoxin mit einer LC50 von 786,50 µg/ml.
Dies war zu erwarten, da für Digoxin keine lebertoxischen Wirkungen bekannt sind (32).
Eine Untersuchung zur akuten Toxizität einiger Substrate unter gleichen Bedingungen in der HPCT-1E3-Zelllinie aus dem Jahre 2007 (49) konnte für Chloroquin (LC50 = 50,6 µM ≈ 26,1 µg/ml), Amiodaron (LC50 = 45,5 µM ≈ 31 µg/ml), Ketoconazol (LC50 = 59,5 µM ≈ 31,6 µg/ml) bestätigt werden [Angaben in Klammern entsprechen den Ergebnissen aus (104)]. Berücksichtigt man einen Faktor 2 – 3 für die Varianz in biologischen Versuchen fallen auch Terfenadin (LC50 = 10,5 µM ≈ 5 µg/ml), Chlorpromazin (LC50 = 18,4 µM ≈ 6,5 µg/ml) und Verapamil (LC50 = 118 µM ≈ 58 µg/ml) in den akzeptablen Abweichungsbereich. Mit Abweichungen um Faktor 6 – 12 zeigt sich ein deutlicher Unterschied in der Sensitivität der HPCT-1E3-Kulturen zwischen den Studien für Doxorubicin (LC50 = 14,7 µM ≈ 8,5 µg/ml), Digoxin (LC50 = 88 µM ≈ 69 µg/ml) und Cyclosporin A (LC50 von 491 µM ≈ 590,5 µg/ml). Dieser Vergleich betont die Notwendigkeit einer stärkeren Standardisierung und möglicherweise Einführung eines konsequenten Master-/Working-Zellbank-Systems um die Vergleichbarkeit zwischen einzelnen Passagen oder Chargen einer Zelllinie zu gewährleisten.
Die gleiche Studie (49) untersuchte die Zytotoxizität einiger Substanzen ebenso in der HepG2-Zelllinie. Die höchste Sensitivität zeigte sich auch in dieser Zelllinie gegenüber Doxorubicin (LC50 = 3,1 µM ≈ 1,9 µg/ml) und Terfenadin (LC50 = 4,1 µM ≈ 1,9 µg/ml).
Die HepG2-Zellen reagierten auf Terfenadin um Faktor 5 empfindlicher als die HPCT-1E3- Zellen. Amiodaron und Chlorpromazin reduzierten die Vitalität der HepG2-Zellen um Faktor 2 -3 stärker als die Vitalität der HPCT-1E3-Zellen. Cyclosporin A zeigte in den
