Entwicklung eines enzymatischen Testes zum Nachweis
von
Antikörpern gegen Lassavirus in menschlichen Seren unter
Berücksichtigung verschiedener Lassavirus Serotypen
vorgelegt dem
Fachbereich 2 (Biologie/Chemie)
der Universität Bremen
als Dissertation zur
Erlangung des Grades eines Doktors
der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
Dezember 2005
vorgelegt von
Petra Emmerich-Paloh
Tag des öffentlichen Kolloquiums: 2. Februar 2006 Universität Bremen
Gutachter der Dissertation:
1. Prof. Dr. rer. nat. Angelika Vallbracht
Universität Bremen, FB 2
2. Prof. Dr. med. Herbert Schmitz
1. INHALTSVERZEICHNIS
1. INHALTSVERZEICHNIS...1
2. EINLEITUNG...3
2.1. ARENAVIREN...3
2.1.1. Arenaviridae...3
2.1.2. Molekularbiologie der Arenaviren ...4
2.1.3. Transmission von Arenaviren...6
2.1.4. Lassa-Fieber...7
2.1.4.1. Lassa-Virus...8
2.1.4.2. Übertragung und Epidemiologie...8
2.1.4.3. Klinik und Pathogenese ...10
2.1.4.4. Immunreaktion und Labordiagnostik...12
2.2. ZIELSETZUNG DER ARBEIT...14
3. MATERIAL UND METHODEN...17
3.1. PRÄPARATION DES RHEUMAFAKTORS (RF) ...17
3.1.1. Auswahl des Serums zur Abtrennung des Rheumafaktors...17
3.1.2. Ermittlung des RF-Titers im Serum...17
3.1.3. Abtrennung der IgM-Fraktion über Ionenaustauschchromatographie...18
3.1.4. Bestimmung des Proteingehaltes der Fraktion...18
3.2. BESCHICHTUNG DER POLYSTYROLPLATTEN...19
3.2.1. Lagerung im flüssigen Zustand bei 4°C ...19
3.2.2. Lyophilisation - Lagerung bei Raumtemperatur...19
3.3. HERSTELLUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN GEGEN LASSA-VIRUS IM MAUSSYSTEM...20
3.3.1. Viruskultivierung ...20
3.3.2. Virusaufreinigung aus dem Gewebekulturüberstand...21
3.3.3. Herstellung von infektiösem Babymausgehirn ...21
3.3.4. Immunisierung ...22
3.3.5. Kultivierung der Myelomzellen...22
3.3.6. Bestimmung der Zellzahl...23
3.3.7. Gewinnung von Mausserum...24
3.3.8. Zellhybridisierung durch Polyethylenglykol (PEG-Fusion) ...24
3.3.9. Hybridomakultivierung...25
3.3.9.1. Einfrieren von Hybridomazellen...26
3.3.9.2. Nachweis von monoklonalen Antikörpern im Zellkulturüberstand – Indirekte Immunfluoreszenz...26
3.3.9.3. Subklassenbestimmung...27
3.4. RECLONIERUNG, AUFREINIGUNG, MARKIERUNG UND KONSERVIERUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN...28
3.4.1. Auftauen und Reclonierung von Hybridomazellen...28
3.4.2. Aufreinigung und Ankonzentrierung durch Abtrennung des IgG über Affinitäts-Chromatographie ...29
3.4.3. Biotin-Markierung monoklonaler Antikörper ...31
3.5. HERSTELLUNG, INAKTIVIERUNG UND KONSERVIERUNG...32
3.5.1. Anzüchtung verschiedener Arenaviren...32
3.5.2. Inaktivierung...33
3.5.3. Konservierung...34
3.6. LASSAVIRUS-ANTIKÖRPER NACHWEIS MIT DER INDIREKTEN IMMUNFLUORESZENZ: DOPPELFLUORESZENZTEST...34
3.7. LASSA-VIRUS IGM ELISA...36
3.8. PATIENTENMATERIAL...37
3.9. PUFFER UND LÖSUNGEN...40
4. ERGEBNISSE...42
4.1. OPTIMIERUNG DER TESTREAGENZIEN...43
4.1.1. Virusantigen...43
4.1.1.1. Aufbau eines Antigentestes – Ermittlung der Antigenkonzentration in Kulturüberstand und Zelllysat ...43
4.1.1.2. Ermittlung der Zelllysat-Antigenkonzentration in Abhängigkeit von Infektionsdosis und Inkubationszeit ...45
4.1.1.3. Konservierung und Inaktivierung der Virusantigene...46
4.1.2. Monoklonaler Antikörper gegen Lassavirus...47
4.1.2.1. Reclonierung, Aufarbeitung, Biotynilierung ...47
4.1.3. RF-Plattenbeschichtung...49
4.1.4. Optimierung der Testparameter ...50
4.2. UNTERSUCHUNG ZUR SENSITIVITÄT UND SPEZIFITÄT DES RF-LASSA TESTS...53
4.2.1. Bestätigt positive und negative Seren...53
4.2.2. Vergleich zwischen IIF und RF-Test...55
4.2.2.1. Austestung von 450 Touristen mit fieberhaften Infektionen ...56
4.2.2.2. Austestung von Seren Personen mit Autoimmunerkrankungen ...57
4.2.2.3. Austestung von gesunden Personen aus Afrika...58
4.3. UNTERSUCHUNG MIT VERSCHIEDENEN LASSAVIRUS-ANTIGENEN...60
4.3.1. Lassavirus-Antigene Las-CSF, Las-NL, Las-AV ...60
4.4. ANTIKÖRPERKREUZREAKTIONEN IN WESTAFRIKA UNTER BERÜCKSICHTIGUNG VIER VERSCHIEDENER LASSAVIRUS SUBTYPEN...65
5. DISKUSSION ...74 6. ZUSAMMENFASSUNG...80 7. ABKÜRZUNGEN...81 8. LITERATUR...82 9. DANKSAGUNG ...87 10. ANHANG...88 10.1. LEBENSLAUF...88 10.2. PUBLIKATIONEN...89
2. EINLEITUNG 2.1. Arenaviren
2.1.1. Arenaviridae
Die Arenaviren erhielten ihren Namen von lat. „arena“ = Sand, da nach elektronenmikroskopischen Dünnschnitt-Aufnahmen der optischer Eindruck erscheint, als enthielten die mit einer pleomorphen Hülle ausgestatteten Viren „Sand“-Granula. Bei diesen Granula handelt es sich um eingelagerte zelluläre Ribosomen (siehe Abbildung 4).
Arenaviren verursachen in Westafrika und Südamerika zoonotische Virusinfektionen des Menschen, die bei ähnlicher Symptomatik mit Blutungen, Nierenfunktionsstörungen und hypovolämischem Schock ablaufen. Sie persistieren in chronisch und asymptomatisch infizierten Nagetieren und können von diesen auf den Menschen übertragen werden. Das Sabia Virus, ein Vertreter der südamerikanischen Tacaribe Viren, wurde als einziges Arenavirus aus Früchte fressenden Fledermäusen isoliert.
Das Lymphozytäre Choriomeningoenzephalitis Virus (LCMV) wurde erstmals 1933 isoliert. Weitere Isolierungen mit gleicher Morphologie und Eigenschaften zeigen, dass einige dieser Viren schwere Hämorrhagien mit einer Letalität bis zu 30% beim Menschen verursachen können, andere hingegen nicht human pathogen zu sein scheinen (Peters, Jahrling et al. 1996; Clegg 2002). Es sind bisher 23 miteinander verwandte Arena-Virusspezies bekannt (Charrel and de Lamballerie 2003), wobei sechs als human pathogen gelten (Clegg 2002; McCormick and Fisher-Hoch 2002). Die Einteilung erfolgt aufgrund ihres phylogenetischen, serologischen und geographischen Vorkommens in Altwelt- (Afrika, Europa, Asien) und Neuweltviren (Nord- und Südamerika). Zu den Arenaviren der Alten Welt gehören das Virus der lymphozytären Choriomeningitis, das Lassavirus, das Mopeia Virus, das Mobala Virus und das Ippy-Virus. Der größere, sogenannte Tacaribe-Viruskomplex, umfasst die Virusspezies der Neuen Welt. Diese werden entsprechend ihrer genetischen Verwandtschaft drei „Linien“ (A, B, C) zugeordnet. Die Linie B umfassen die in Südamerika vorkommenden hämorrhagischen Fieberviren Junin-(Argentinien), Machupo-(Bolivien), Guanarito-(Venezuela) und Sabia-(Brasilien)Virus, die alle schwere Erkrankungen beim Menschen auslösen können.
Abbildung 1: Verteilung von Neuwelt und Altwelt Arenaviren
Die Einteilung erfolgt aufgrund ihres phylogenetischen, serologischen und geographischen Vorkommens in Altwelt- (Afrika, Europa, Asien) und Neuweltviren (Nord- und Südamerika). Zu den Arenaviren der Alten Welt gehören das Virus der lymphozytären Choriomeningitis, das Lassavirus, das Mopeia Virus, das Mobala Virus und das Ippy-Virus; zu den Neuwelt-Viren u.a. Pichinde-, Junin-, Machupo- und Guanaritovirus.
2.1.2. Molekularbiologie der Arenaviren
Arenaviren sind pleomorph, haben eine sphärische Form mit variablen Durchmesser von 50 bis 300 nm und sind umhüllt von einer Lipidmembran, in der die viralen Glycoproteine G1 und G2 eingelagert sind. Das G1-Protein (44 kD) ist durch nicht kovalente Bindung mit der Partikeloberfläche assoziiert, das G2 (72 kD) hingegen fest mit der Membran verankert.
Die viralen Genomsegmente im Inneren bestehen aus zwei Segmenten einzelsträngiger RNA, komplexiert mit den Nukleoproteinen (NP, 63 kD). Die Länge dieser RNA-Genomsegmente kann bei den unterschiedlichen Arenavirus-Spezies variieren. Die generelle Organisation der S- und
L-genomischen-RNA ist dagegen innerhalb der Arenaviridae konserviert (Meyer, de la Torre et al. 2002):
Das kleinere S-Segment (S = small, ca. 3,4 kb)) codiert für das Vorläuferprotein GPC (glycoprotein precursor) der G1 und G2- Proteine und das NP-Protein. Beide Gene überlappen nicht miteinander und sind durch eine intergenische Region voneinander getrennt, die in der RNA-Sequenz eine stabile Haarnadelstruktur ausbildet. Das N-Protein wird von einem zur genomischen RNA komplementären Messenger am 3`-Ende und die Hüllproteine G1 und G2 von einem Messenger in Genomrichtung am 5`-Ende abgelesen (Ambisense Kodierung).
Das größere L-Segment (L = large, ca. 7,2 kb) codiert für die virale Polymerase und ein hydrophobes Z-Protein (11 kD), dieses Polypeptid befindet sich in großen Mengen in den Viruspartikeln. In vitro beeinflußt das Z-Protein die RNA-Transkription und Replikation. Auch hier liegen zwei nicht miteinander überlappende Leserahmen in Ambisense-Orientierung vor. Das L-Protein wird in der 3`-Hälfte des Segmentes in negativer Orientierung codiert. In der 5`-Region findet man einen Leserahmen in entgegen gesetzter Leserichtung, der für das oben beschriebene Z-Protein codiert.
Sowohl das S- als auch das L-Segment besitzen an ihren Enden komplementäre Sequenzen, die ihnen eine quasi zirkuläre Form verleihen.
Das Nukleoprotein ist das am häufigsten vorkommende Protein (70% der viralen Proteine bei Pichinde-Virus). In Analogie zu anderen Negativstrang-RNA-Viren vermutet man, dass die Nukleoproteine mit einem Molekulargewicht von ca. 60 bis 68 kDa, bei Lassavirus ca. 61 kDa, auch das Umschalten vom Transkriptions- zum Replikationsmodus reguliert. In infizierten Zellen und in gereinigten Viruspräparationen findet man reproduzierbare Mengen von Abbauprodukten des NP-Proteins, sowie eine phosphorylierte Variante. Es ist bisher wissenschaftlich noch nicht bestätigt, dass diese Produkte an der Regulation der Transkription und Replikation beteiligt sind.
Zur Isolierung von Arenaviren können eine Vielzahl von Zelllinien von Nagern und Primaten z.B. Verozell- HeLa, BHK, oder U 937 Monozyten-Zelllinienen verwendet werden. Die Replikation findet im Zytoplasma der Zellen statt. Die Freisetzung neu synthetisierter Viruspartikel kann innerhalb von 12 bis 24 Stunden durch Budding der Plasmamembran in den extrazellulären Raum erfolgen. Ein deutlicher cytopathischer Effekt (CPE) ist optisch nicht ersichtlich.
Bisher wurde ein zellulärer Rezeptor, alpha-Dystroglycan, beschrieben (Cao, Henry et al. 1998), der den breiten Zell- und Wirtstropismus der Arenaviren untermauert.
Abbildung 2: Komplettes Lassavirus
Das Genom besteht aus zwei Segmenten einzelsträngiger RNA, die als Negativstrang mit den NP- und L-Proteinen zu helikalen Nucleocapsiden komplexieren. Komplementäre Sequenzen an den Enden verleihen ihnen eine quasizirkuläre Form. Die Nucleocapside sind von einer Membranhülle umgeben, in welche die viralen Glycoproteine G1 und G2 eingelagert sind. Als weitere Komponenten findet man im Inneren der Partikel Untereinheiten zellulärer Ribosomen.
2.1.3. Transmission von Arenaviren
Die Hauptwirte der Arenaviren sind chronisch subklinisch bzw. asymptomatisch infizierte Nagetiere. Die angeborene Infektion kann eine lang andauernde oder lebenslange Infektion des natürlichen Wirtes bewirken, ohne dass eine klinische Symptomatik auftritt. Es wurde gezeigt, dass über den Urin hohe Virustiter ausgeschieden werden, so dass eine Infektion auf den Menschen durch kontaminierte Nahrungsmittel oder über Aerosole wahrscheinlich sind (ter Meulen, Lukashevich et al. 1996).
Die Infektion innerhalb der Nagetierpopulation erfolgt überwiegend transovariell von der Mutter auf das Ungeborene. Untersuchungen der Gattung Mastomys haben ergeben, dass eine sexuelle Übertragung unter den Nagern erfolgen kann. Dieser horizontale Übertragungsweg führt dann zu einer selbstlimitierenden Infektion mit nur geringem Einfluß auf die Fortpflanzungsfähigkeit. Infizierte weibliche Tiere können die Infektion auf ihre Nachkommen diaplazentar (vertikaler Übertragungsweg) übertragen. Dies führt zu einer persistierenden Infektion bei den Nachkommen ohne wesentliche Auswirkungen auf die Fruchtbarkeit. Hieraus resultieren teilweise eine bis zu 80% ige Durchseuchungsrate der Mäusebestände mit Lassaviren (McCormick, Webb et al. 1987). Eine horizontale Virusübertragung über Nasalsekrete, Speichel, Urin ist vorstellbar und wurde für LCMV experimentell gezeigt (Peters, Jahrling et al. 1996).
Abbildung 3: Mastomys natalensis
Die „Vielzitzenratte“ ist eine der häufigsten Nagerarten südlich der Sahara und gilt als Hauptreservoir des Lassa-Virus.
2.1.4. Lassa-Fieber
Lassa-Fieber ist eine durch ein Arenavirus hervorgerufene Zoonose, verbunden mit einem variabelem Krankheitsbild von milderen fieberhaften Infektionen zu schweren, häufig tödlich verlaufenden Blutungs-und Schockzuständen.
2.1.4.1. Lassa-Virus
1969 starben 3 amerikanische Missionsschwestern in dem Ort Lassa im Nordosten Nigerias an einem hämorrhagischen Fieber unklarer Genese. Die Virusisolierung gelang 1970 (Frame, Baldwin et al. 1970) und das Virus wurde nach seinem Herkunftsort Lassavirus benannt.
Es wurde in die Sicherheitsstufe 4 eingeordnet und es obliegt nur speziellen Laboratorien, die über ein BSL-4 Labor verfügen, mit infektiösen Lassaviren zu arbeiten.
Bisher sind phylogenetisch 6 verschiedene Lassavirus Subtypen bekannt (siehe Ergebnisse 4.3.).
Abbildung 4: Elektronenmikroskopische Aufnahme infizierter Vero-Zellen Vergrößerung ca. 60.000x. Die Infektion erfolgte mit einer MOI von 0,01; 72h p.i.. (Ch. Schmetz, M. Asper, Bernhard-Nocht-Institiut)
2.1.4.2. Übertragung und Epidemiologie
Das Virus persistiert in Nagern der Gattung Mastomys, die südlich der Sahara vorkommen und mehrere Subspezies einer noch ungeklärten Taxonomie von schwer einzuordnenden Mäusearten beinhaltet ( Rosevaer et al., 1969; The Rodents of Afrika). Als Hauptreservoir des Lassavirus gilt die „Vielzitzenratte“ Mastomys natalensis, eine der häufigsten Nagerarten Afrikas, die in vielen Ländern West- und Ostafrikas und des südlichen Afrikas vorkommt. Die Nager leben bevorzugt in engem Kontakt zu menschlichen Behausungen. Zwischen der Durchseuchungsrate der
Mastomysratten, ihrer Zahl und der Antikörperprävalenz bei Menschen wurde ein direkter Zusammenhang festgestellt. In Sierra Leone ergab eine Untersuchung durchschnittlich 2,4 Nagetiere pro Haus, davon waren bis zu 10% mit Lassavirus infiziert. In einzelnen Wohnbereichen wurden 50 bis 70 Nagetiere gefangen, wovon ca. 50% infiziert waren (McCormick and Fisher-Hoch 2002). Untersuchungen belegen, dass Mastomys nur geringe Wanderungswege hinter sich legen und so die Ausbildung verschiedener Lassavirus-Linien begünstigt haben (Bowen, Rollin et al. 2000).
Die Übertragung auf den Menschen erfolgt vorwiegend durch direkten Kontakt mit infizierten Ausscheidungsprodukten der Nager. Aufgrund der hohen ausgeschiedenen Virustiter im Urin ist eine Kontamination mit diesem in ungekochten Nahrungsmitteln (z.B. Mehl) sehr wahrscheinlich (ter Meulen, Lukashevich et al. 1996). Aber auch eine Übertragung durch Aerosole kontaminierter Nahrungsmittel ist nicht auszuschließen. Da in vielen Endemiegebieten Nagetiere als Nahrungsmittel dienen, besteht ebenfalls eine Gefahr sich direkt beim Jagen oder/und Zubereitung der Tiere zu infizieren (ter Meulen, Lukashevich et al. 1996); (Peters, Jahrling et al. 1996); (Salazar-Bravo, Ruedas et al. 2002).
Die Infektion von Mensch zu Mensch kann über infiziertes Gewebe, Blut, Urin und andere Körperflüssigkeiten erfolgen. Es ist bekannt, dass infizierte Menschen das Virus mit dem Urin, Erbrochenem und Blut ausscheiden. Hier bedarf es sicherlich eines direkten Kontaktes durch Eindringen des Virus über Verletzungen der Haut oder Schleimhäute. Übertragungen durch sexuellen Kontakt wurden beschrieben (Monath, Mertens et al. 1973). Des weiteren wurde über Hospitalinfektionen durch unzureichend sterilisiertes medizinisches Material und engen körperlichen Kontakten mit infizierten Patienten berichtet (Frame, Baldwin et al. 1970); (Fisher-Hoch, Tomori et al. 1995); (McCormick and Fisher-Hoch 2002).
Weltweit wurden 21 Fälle aus Endemiegebieten durch den Flugverkehr importiert.
2002 konnte erstmals ein Fall einer Sekundärinfektion durch Kontaktübertragung durch eine importierte Lassavirusinfektion gezeigt werden (Haas, Breuer et al. 2003).
Das Endemiegebiet beschränkt sich auf Länder Westafrikas wie Guinea, Sierra Leone, Liberia und Nigeria. Die Krankheit ist bereits in den 50er Jahren beschrieben worden. Seitdem sind wiederholt Epidemien in Westafrika besonders in Liberia und Sierra Leone aufgetreten. Der letzte von der WHO aus Sierra Leone gemeldete Ausbruch umfaßte 1996/1997 mehr als 800 registrierte
Erkrankte und forderte über 150 Tote (McCormick and Fisher-Hoch 2002). Eine saisonale Häufung der Krankheitsfälle ist während der Trockenzeit in den Monaten zwischen April und Mai zu erkennen. Experimentelle Daten haben gezeigt, dass das Virus insbesondere bei niedriger Luftfeuchtigkeit nach Ausscheidung für mehrere Stunden stabil bleibt (McCormick and Fisher-Hoch 2002). Auch kommt es in diesen Monaten zu einer vermehrten Annährung der Nagetiere an menschliche Behausungen (McCormick and Fisher-Hoch 2002).
Schätzungen gehen von 100.000 bis 300.000 Erkrankungen mit ca. 5000- 10.000 Todesfälle pro Jahr aus (Clegg 2002; McCormick and Fisher-Hoch 2002).
In Mali, Senegal, Demokratische Republik Kongo, Burkina Faso, Ghana, Guinea und der Elfenbeinküste konnten Lassavirus Serumantikörper nachgewiesen werden. Allerdings lag die Antikörperprävalenz zwischen 5 - 40 % und ist geographisch sehr unterschiedlich. In Sierra Leone liegt die Seroprävalenz in küstennahen Gebieten bei rund 5% im Landesinneren dagegen bis zu 40% (McCormick, King et al. 1987).
2.1.4.3. Klinik und Pathogenese
Viele Arenavirus-Infektionen können beim Menschen ein hämorrhagisches Fieber auslösen. Die Viren vermehren sich im retikuloendothelialen System und in Phagozyten. Es kommt zur Permeabilitätsstörung der Kapillaren und hierdurch zu Blutungen und hypovolämischen Schockzuständen. Es wird vermutet, dass 70 – 90 % der Infektionen asymptomatisch verlaufen oder aufgrund ihrer milden Symptomatik als grippaler Infekt missgedeutet werden. Diese hohen Zahlen errechnen sich aus Seroprävalenzstudien (McCormick, King et al. 1987). Die Untersuchungen zum klinischen Bild beruhen zumeist auf hospitalisierten Lassa-Fieber-Patienten. Nach einer Inkubationszeit von 5 bis 21 Tagen (durchschnittlich 7-10 Tagen) kommt es zu einem bis zu drei Tage andauernden Prodomalstadium mit grippeähnlicher Symptomatik: allgemeines Krankheitsgefühl, leichtes Fieber, Gelenk-, Kopf- und Rückenschmerzen. Ab dem dritten Tag bis ca. 6. Tag beginnt das Fieber bis 41° C zu steigen, es kann begleitet sein von Konjunktivitis, trockenem Husten mit retrosternalen Schmerzen, einer exsudativen Pharyngitis und einer gastrointestinalen Symptomatik mit abdominellen Schmerzen, Erbrechen und Diarrhoe (McCormick, King et al. 1987).
Ab dem 7 . bis 12. Krankheitstag kommt es in ca. 85% der Fälle zu einem Rückgang des Fiebers sowie der pharyngealen, thorakalen und abdominellen Schmerzen. Als Spätkomplikationen in dieser Phase kann es bei ca. 17% der Seropositiven und 29% der manifest Erkrankten zu einer
bleibenden ein- oder beidseitigen Innenohrschwerhörigkeit kommen (Cummins 1990; Solbrig and McCormick 1991). Perikard- und Pleuraergüsse sowie zentralnervöse Störungen scheinen gehäuft mit einer Lassa-Virus-Infektion aufzutreten (Johnson, McCormick et al. 1987; McCormick, King et al. 1987). Gelegentlich wird ein makulopapuläres Exanthem gesehen. Schleimhaut-, gastrointestinale- oder vaginale Blutungen, stärkste Pharyngitis mit Ödem (Erstickungsgefahr) und ein extremer Anstieg der Transaminasen gelten als prognostisch besonders ungünstig.
Bei ca. 15% der Erkrankten kommt es zu einer progressiven Verschlechterung mit zunehmender respiratorischen Insuffizienz und in einzelnen Fällen zu neurologischen Manifestationen: aseptische Meningitis, Enzephalitis oder einer globalen Enzephalopathie mit Krämpfen (Knobloch, McCormick et al. 1980; Peters, Jahrling et al. 1996; McCormick and Fisher-Hoch 2002). Der Tod tritt im irreversiblen Schockzustand mit Hypovolämie und Anurie, evtl. unter Krämpfen oder Somnolenz bis zum Koma ein (Knobloch, McCormick et al. 1980). Antikörper sind meist noch nicht nachweisbar (Peters, Jahrling et al. 1996; McCormick and Fisher-Hoch 2002).
Schwere Verläufe finden sich gehäuft bei Schwangeren im letzten Trimenon. Der Anteil der letalen Verläufe liegt über 25 %. Bei über 85% der Fälle kommt es zu Fehl- oder Totgeburten (Price, Fisher-Hoch et al. 1988).
Bei Kindern liegt die Letalität zwischen 12 und 27 %. Bei Kleinkindern kann es durch eine Lassa-Virus-Infektion zu einem generalisierten Ödem mit abdomineller Schwellung und erhöhter Blutungsneigung, dem sogenannten Swollen Baby-Syndrom, kommen (Webb, McCormick et al. 1986; Monson, Cole et al. 1987).
Keines der genannten Symptome oder ihre Kombination unterscheidet Lassa-Fieber jedoch eindeutig von anderen hämorrhagischen Fiebern. Eine Genesung kann ab der 2. Krankheitswoche einsetzen und geht meist mit der Bildung von Antikörpern einher.
Die medizinische Betreuung muss unter entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen erfolgen (striktes „barrier nursing“). Die Gabe von Immunplasma als Therapie von an Lassafieber erkrankten Menschen ist problematisch, da keine standardisierten und sicher virusfreien Präparate zur Verfügung stehen (Gefahr der Übertragung von Hepatitis B , C und HIV). Die Gabe von Ribavirin zeigte, bei frühzeitiger Verabreichung, einen positiven Einfluß auf den Verlauf der Erkrankung mit Senkung der Letalität.
2.1.4.4. Immunreaktion und Labordiagnostik
Die Labordiagnostik erfolgt nur in spezialisierten BSL-4 Laboratorien.
Die Inkubationzeit kann bis zu 24 Tagen betragen (Mertens, Patton et al. 1973; McCormick, Webb et al. 1987). Die klassische Methode Virus zu detektieren war lange Zeit die Inokulation von Verozellen mit Serum, Liquor, Rachenspülflüssigkeit, Pleurapunktaten oder Urin akuter an Lassafieber erkrankter Patienten (Buckley and Casals 1970; Monath, Maher et al. 1974; Jahrling, Frame et al. 1985). Heute ist die Methode der Wahl die RT-PCR aufgrund ihrer Sensitivität und ihres schnelleren Nachweises. Ein weiterer Vorteil liegt auch darin, dass die Präparation nicht in einem BSL-4 Labor erfolgen muss (Lunkenheimer, Hufert et al. 1990; Trappier, Conaty et al. 1993; Demby, Chamberlain et al. 1994; Drosten, Gottig et al. 2002). Die höchste Viruslast liegt zwischen dem 4. und 9. Tag mit einer TCID50/ml von 103 bis 108 (Johnson, McCormick et al.
1987). Je nach Höhe der Virämie gelingt der Virusnachweis bereits am 3. Tag nach Krankheitsbeginn durch Anzucht oder der RT-PCR. Allerdings standen bisher auch keine früheren Patientenproben zur Verfügung (Mertens, Patton et al. 1973; Johnson, McCormick et al. 1987; Trappier, Conaty et al. 1993; Demby, Chamberlain et al. 1994). Eine Virusanzucht in Verozellen sollte stets zu der RT-PCR erfolgen. Das Virus persistiert oft noch lange Zeit nach der Erkrankung und ist im Serum oder Urin gleichzeitig mit Antikörpern nachweisbar (Mertens, Patton et al. 1973; Johnson, McCormick et al. 1987; Trappier, Conaty et al. 1993; Demby, Chamberlain et al. 1994). Die Arbeit von Günther et al., 2001 zeigt den Nachweis von Serumantikörpern bei gleichzeitiger Präsens von Lassavirus im Liquor. Der ELISA zum Nachweis von Lassavirusantigen erwies sich im Vergleich zur Virusanzucht als weniger sensitiv (Bausch, Rollin et al. 2000).
IgG- und IgM- Antikörper können in über der Hälfte akuter Lassafieberfälle ebenfalls in den ersten Tagen, meist 1-2 Tage zeitversetzt zur Virusdetektion, serologisch nachgewiesen werden. In 15% lassen sich vorerst nur IgM-Antikörper nachweisen. Die Serologie ist aber nicht als Methode zur frühen Diagnostik geeignet, da Patienten mit einem letalen Lassafieber gar keine oder nur schwache Antikörper entwickeln (Johnson, McCormick et al. 1987; Schmitz, Kohler et al. 2002). Sie ist aber die Methode der Wahl in der Reconvaleszenz, da ab Tag 18 nach Krankheitsbeginn in 100% der beschriebenen Fälle IgG-Antikörper nachgewiesen werden (Johnson, McCormick et al. 1987).
Noch heute wird die Indirekte Immunfluoreszenz (IIF) mit Lassavirus infizierten Zellen als Nachweismethode als Gold Standard geführt (Johnson, McCormick et al. 1987). Testverfahren wie ELISA und Immunoblots mit recombinanten Proteinen (NP, GPC und Z-Protein) als Antigen sind entwickelt worden und werden zusätzlich für Seroprävalenzstudien oder zur Diagnostik von akuten Infektionen eingesetzt (Barber, Clegg et al. 1987; Lloyd, Barber et al. 1989; Barber, Clegg et al. 1990; Hummel, Martin et al. 1992; Lukashevich, Lukashevich et al. 1993; ter Meulen, Koulemou et al. 1998; Gunther, Kuhle et al. 2001).
Neutralisierende Antikörper treten nur in geringen Titern spät nach der Erkrankung auf. Die Elimination des Virus scheint daher nicht durch Antikörper zu erfolgen, sondern über die zelluläre Immunantwort durch zytotoxische Zellen. Aufgrund von experimentellen Versuchen an Mäusen mit LCMV und aus Impfversuchen mit attenuierten verwandten Arenaviren oder gentechnisch verändertem Vaccinia-Virus durch Expression von Lassavirus Glyko- und Nukleoproteinen am Meerschweinchen und Rhesusaffen, ist zu vermuten, dass T-Zellen (CD4+ und CD8+) eine besondere Bedeutung bei der Viruselimination besitzen (Jahrling, Niklasson et al. 1985; Clegg 1992; ter Meulen 1999; Fisher-Hoch, Hutwagner et al. 2000).
In der frühen Phase einer akuten Infektion findet man auch bei Patienten, die sich mit Lassavirus infiziert haben erhöhte Konzentrationen von Tumornekrosefaktor -alpha und -beta sowie anderen Cytokinen (Schmitz, Kohler et al. 2002). Sie aktivieren die Proliferation von natürlichen Killerzellen, die aber für die Eliminierung des Virus nicht entscheidend sind. Sie scheinen die Expression von MHC-Klasse I-Antigenen auf der Oberfläche infizierter und uninfizierter Zellen zu induzieren und können so durch cytotoxische T-Lymphocyten eliminiert werden. Hierfür scheinen die CD8+ hauptverantwortlich zu sein. CD4+ Zellen scheinen in der späten Infektionsphase durch Sekretion von Cytokinen wie Interleukin-2 und Interferon-gamma zur Aktivierung der CD8+ Zellen beizutragen.
Im Verlauf einer akuten Lassavirus-Infektion werden IgM- und IgG-Antikörper gegen das NP-und die G1- NP-und G2-Proteine gebildet (Lloyd, Barber et al. 1989; Hummel, Martin et al. 1992; ter Meulen, Koulemou et al. 1998). Neuere Erkenntnisse belegen auch eine Antikörperbildung gegen das Z-Protein (Gunther, Kuhle et al. 2001).
2.2. Zielsetzung der Arbeit
Der Nachweis von Lassa-Virus Antikörpern beruht derzeit immer noch auf sogenannten “in-house" Testen. Bei diesen Assays handelt es sich um die indirekte Immunfluoreszenz (IIF) oder um enzymatische Nachweisverfahren. Diese Teste sind kommerziell nicht verfügbar, damit entsprechen sie nicht der IVD- Richtlinie. Die enzymatischen Verfahren beruhen meist auf Kopplung von rekombinanten Antigenen oder Antikörpern an geeignete Trägermaterialien. Diese Teste haben zwar den Vorteil, außerhalb eines BSL-4 Labors hergestellt werden zu können, störend hingegen ist die hohe Hintergrundreaktion von Antikörpern gegen Komponenten von Bakterien- oder Insektenzellen (Niklasson, Jahrling et al. 1984; Bausch, Rollin et al. 2000). Auch bedarf der Nachweis von Antikörpern oft mehrerer Inkubationsschritte. Die Antigene an den Platten sind teils nicht lange lagerungsfähig. Aus Veröffentlichungen geht hervor, dass sich die verschiedenen Enzymteste in Spezifität und Sensitivität sehr unterscheiden (Barber, Clegg et al. 1987; Lloyd, Barber et al. 1989; Barber, Clegg et al. 1990; Hummel, Martin et al. 1992; Lukashevich, Lukashevich et al. 1993; ter Meulen, Koulemou et al. 1998; Gunther, Kuhle et al. 2001).
Die indirekte Immunfluoreszenz (IIF) ist nach wie vor die sensitivste Technik zum Nachweis von Antikörpern. Die Beurteilung beruht allerdings auf einer schlecht objektivierbaren Ablesung, die erfahrene Labormitarbeiter voraussetzt. Das Vorhandensein von antizellulären Antikörpern wird teilweise als falsch positiv interpretiert. Auch ist die IIF zum Screening größerer Serumzahlen recht aufwendig. Die Spezifität der IIF-Antikörperbestimmung kann allerdings mit einer Gegenfärbung der in den Zellen vorhandenen viralen Antigene mit monoklonalen Antikörpern erheblich verbessert werden (Haas, Breuer et al. 2003).
Eine immunenzymatische Methode von hoher Sensitivität und Spezifität, die gleichzeitig auf umweltstabilen und lagerungsfähigen Testmaterialien beruht und unter einfachsten Bedingungen auch in Feldstudien eingesetzt werden kann, wäre von großem Nutzen. Die Etablierung eines immunenzymatischen Verfahrens durch Bindung von Immunkomplexen an Rheumafaktoren (RF-Test) könnte diese Anforderungen erfüllen. Das Verfahren hat sich bereits beim Nachweis von Antikörpern gegen Cytomegalievirus bewährt und ist seit Jahren im Handel (Sachers, Emmerich et al. 1985).
Zielsetzung ist die Entwicklung eines enzymatischen Testes zum Nachweis von IgG-Antikörpern, der auf der Erkennung von Immunkomplexen durch die Bindung von Rheumafaktoren an geeigneten Trägersubstanzen beruht. Bei Rheumafaktoren handelt es sich um Immunglobuline, die meist der Immunglobulinklasse M angehören und die spezifisch mit Antigendeterminaten im Fc-Teil von verschiedenen Immunglobulinen der Klasse IgG reagieren. Der Rheumafaktor reagiert bevorzugt mit IgG, welches durch eine Verbindung mit spezifischem Antigen in seiner Konformation im Fc-Teil verändert wurde.
Der Rheumafaktor wird aus Seren von Patienten mit rheumatischer Arthritis per Ionenaustauschchromatographie isoliert. Mit der gewonnenen Rheumafaktorfraktion werden anschließend bestrahlte Polystyrol-Platten beschichtet.
Die Virusanzüchtung bzw. Isolierung aus humanen Primärisolaten und die Aufarbeitungen müssen im Sicherheitslabor Klasse 4 erfolgen. Inwieweit die Antigengewinnung aus dem Kulturüberstand oder aus den infizierten Zellen direkt erfolgt, sowie die erforderliche Aufarbeitung muss ausgetestet und standardisiert werden.
Die Antigenaufarbeitungen müssen vor dem Ausschleusen inaktiviert werden. Hierzu soll das Detergenz NP 40 verwendet werden. Die erforderliche Konzentration muss durch Austestung über mehrere Zellkulturpassagen experimentell ermittelt werden.
Patientenserum und Antigen sollen gemeinsam inkubiert werden, so dass der Rheumafaktor auf der Platte die Bildung des Immunkomplexes erkennt und bindet. Die Immunkomplexe werden anschließend mit markierten MAK gegen Lassaviren nachgewiesen, da dies zu einer erhöhten Sensitivität im Gegensatz zum direkt markierten Antigen führen könnte und Kreuzreaktionen mit Antikörpern gegen serologisch verwandte Arenaviren ausschließt. Hierzu müssen die bereits 1989 von Hufert et al. hergestellten monoklonalen Antikörper gegen Lassaviren rekloniert, ggf. neu charakterisiert und in großen Volumina hergestellt werden. Die Abtrennung der Immunglobuline aus dem Hybridomaüberstand soll über eine mit anti-Maus Immunglobulin beschichtete Säule erfolgen. Eine Markierung der MAK ist mit Biotin vorgesehen.
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Die Überprüfung der markierten monoklonalen Antikörper und inaktivierten Antigene soll auf einem geeigneten Nachweisverfahren (Sandwich-Assay: MAK- Antigen- markierter MAK) basieren.
Die Austestung der vorliegenden Materialien auf Polystyrol Platten, beschichtet mit Rheumafaktor, muss mit Lassavirus-Antikörper bekannter positiver Humanseren erfolgen. Eine Optimierung einzelner Testsubstanzen, sowie verschiedener Inkubationszeiten, wird als Anforderung zur Testentwicklung als selbstverständlich angesehen.
Die für den Test erforderlichen Materialien müssen umweltstabil und somit lagerungsfähig sein, um unter einfachsten Bedingungen auch in Feldstudien einsatzfähig zu sein. Um diese Anforderungen zu erfüllen, ist die Gefriertrocknung aller verwendeten Materialien anzustreben. Vor allemsoll dieser Test Aufschluss über die Sensitivität und Spezifität der Bestimmung von Lassavirus-Antikörpern geben. Hier liegt in dem bisher verwendeten diagnostischen Verfahren, der indirekten Immunfluoreszenz, eine gewisse Diskrepanz, d.h. nicht alle Antikörper erkennen die 4 Lassavirus Serotypen
(Lassavirus Josiah-Sierra Leone, Eigenisolate Lassavirus AV.-Elfenbeinküste, Lassavirus CSF-Nigeria , Lassavirus NL-Sierra Leone ). Dazu werden Seren klinisch diagnostizierter Lassavirusfieber Fälle, aber auch bisher nicht auf Lassavirus-Antikörper untersuchte Seren aus verschiedenen Endemiegebieten getestet.
Zur Validierung müssen mindestens 200 europäische und 500 afrikanische Serumproben getestet und mit der indirekten Immunfluoreszenz verglichen werden. Dies setzt eine Herstellung ausreichender Immunfluoreszenz-Präparate zur Bestimmung von Antikörpern voraus.
Wir hoffen mit dem neuen Verfahren eine zuverlässige serologische Methode zu etablieren, die auch unter Feldbedingungen eingesetzt werden kann.
3. MATERIAL UND METHODEN
3.1. Präparation des Rheumafaktors (RF)
3.1.1. Auswahl des Serums zur Abtrennung des Rheumafaktors Material:
Patientenseren 0,9%iges NaCl
Latex-RF-Reagenz (Rapi Tex-RF, Fa. Behringwerke, Marburg) Methode:
Patientenseren mit einer chronischen Polyarthritis wurden 1:6 mit 0,9% NaCl verdünnt. Jeweils 25 µl der vorverdünnten Patientenseren, sowie positive und negative Kontrolle im Rapi Tex-RF Testkit mitgelieferte Seren wurden auf einen Objektträger pipettiert und mit einem Tropfen Latex-Reagenz gemischt. Nach 2 Minuten war eine deutliche Agglutination beim Vorhandensein von Rheumafaktoren sichtbar. Die Reaktion beruht auf Latex-Kügelchen gekoppelten anti-RF mit Rheumafaktoren der Patientenseren.
3.1.2. Ermittlung des RF-Titers im Serum Material:
Patientenseren 0,9%iges NaCl
Latex-RF-Reagenz (Rapi Tex-RF, Fa. Behringwerke, Marburg) Lassavirus IIF Präparate (siehe 3.3.1./3.6.)
Methode:
Die RF positiven Seren wurden in 0,9 iger NaCl-Lösung in einer Verdünnungsreihe (1:2) verdünnt und erneut mit Latex Reagenz versetzt. Die höchste Serumverdünnung, in der noch eine Agglutination sichtbar war, wurde als RF-Titer definiert. Zur weiteren Abtrennung des RF wurden nur Seren verwendet, die einen RF-Titer >1:512 aufwiesen.
Diese Patientenseren wurden in der IIF gegen Lassavirus IgM Antikörper getestet, um im weiteren Testverfahren unspezifische bzw. falsch positive Reaktionen durch Bindung von Lassavirusantigenen auszuschließen.
3.1.3. Abtrennung der IgM-Fraktion über Ionenaustauschchromatographie Material:
Mast IgM-Einmalsäulen (Fa. Mast Diagnostica, Hamburg) Rotationsschüttler
Methode:
Die IgM-Fraktion der ermittelten RF-Seren wurde durch Abtrennung über IgM-Einmalsäulen isoliert. Die Einmalsäule enthält einen Ionenaustauscher mit der aktiven Gruppe Diäthylaminoäthyl (DEAE), die eine Ladung trägt. Die Ladung der Proteine im Serum ist abhängig vom ph-Wert des verwendeten Puffers. Ist ein Protein entgegengesetzt zur DEAE-Gruppe (Anionenaustauscher) geladen, wird die Bindung an den Ionenaustauscher ermöglicht. Bei gleicher Ladung werden die Proteine herausgespült.
Die Säulen wurden an einem Stativ befestigt, oben und unten geöffnet, so dass die vorhandene Flüssigkeit in der Säule abtropfen konnte. Anschließend wurde einmal mit 15 ml Puffer I (Mast) gewaschen und das Eluat verworfen. 0,5 ml Serum plus 1,5 ml Puffer I wurden gemischt und über die Säule gegeben. Nachdem die geringe Menge vollständig im Inhalt der Säule eingesogen war, wurde erneut mit 25 ml Puffer I gewaschen und das Eluat verworfen. Danach wurden 2,5 ml Puffer II (Mast) aufgetragen und das Eluat aufgefangen. Die herausgelöste IgM-Fraktion wurde mit 0,1 ml des Inaktivators (Kaninchen anti-human IgG, Mast) versetzt und 10 Minuten auf einem Rotationsschüttler bewegt.
3.1.4. Bestimmung des Proteingehaltes der Fraktion Material:
Shimadzu Double-Beam Spektralphotometer (UV-150-02) Glycerin (Fa. Merck, Darmstadt)
Methode:
Die Proteinbestimmung erfolgte nach Warburg und Christian. Die Methode basiert auf Absorption von Tyrosin- und Tryptophan bei einer Wellenlänge von 280 nm.
Die Proben wurden bei 280 nm gegen eine Vergleichslösung im Spektralphotometer gemessen. Der erhaltene Wert entsprach der Proteinkonzentration in mg/ml (Umrechnungsfaktor 1,0). Da es
sich um eine reine Proteinfraktion handelte, konnte auf eine zusätzliche Messung bei 260 nm zur Ermittlung einer eventuellen Kontamination mit Nukleinsäuren verzichtet werden.
Die IgM-Fraktion wurde anschließend mit 10% Glycerin bei –20°C aliquotiert eingefroren.
3.2. Beschichtung der Polystyrolplatten Material:
Gamma-bestrahlte (20 kGy) Polystyrol Mikrotiterplatten (Fa. Greiner, Frickenhausen) Phosphatpuffer (PBS, Phosphate Buffered Saline)
NaN3
Methode:
Die eingefrorene IgM-Fraktion ( RF-Fraktion ) wurde zur Beschichtung von gamma-bestrahlten Mikrotiterplatten aufgetaut, in PBS mit 1% NaN3 auf 5 µg/ml Proteingehalt eingestellt und 100
µl pro Well auf die Platten pipettiert. Die Platten sind nach der Beschichtung bei 4° C Lagerung nach 48 Stunden gebrauchsfertig.
3.2.1. Lagerung im flüssigen Zustand bei 4°C
Zur Aufbewahrung bei 4° C werden die Platten mit Plastikfolie abgeklebt um eine Ein- bzw. Austrocknung zu verhindern. Die Platten sind in diesem Zustand 1-2 Monate verwendbar.
3.2.2. Lyophilisation - Lagerung bei Raumtemperatur Material:
Vorgefertigte Alufolie zum Einschweißen der Mikrotiterplatten (Fa. Medac, Hamburg) Lyophilisator
Methode:
Die Platten werden wie unter 3.2. beschrieben, beschichtet und mindestens 48 Stunden bei 4°C aufbewahrt. Anschließend werden sie bei –20°C mindestens 6 Stunden tiefgefroren. In diesem Zustand werden sie im Lyophilisator gefriergetrocknet und in Alufolie unter Vakuumbedingungen eingeschweißt. Die Platten können bei RT aufbewahrt werden und sind über Jahre verwendbar.
3.3. Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Lassa-Virus im Maussystem 3.3.1. Viruskultivierung
Material:
Zellinie: Vero, ATCC (American Type Culture Collection, Atlanta, U.S.A.) Vero clone CRL 1586
Virusstamm: Lassavirus Stamm Josiah ATCC 1969, Sierra Leone
Kulturmedium: MEM-Eagle minimial essential medium (Fa. Flow, Meckenheim) 2% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (Fa. Flow, Meckenheim) 100 Units/ml Penicillin (Fa. Flow, Meckenheim) 100 µg/ml Streptomycin (Fa. Flow, Meckenheim) 5 µg/ml Amphotericin B (Fa. Flow, Meckenheim) Trypsinlösung 0,54 M EDTA in Pucklösung 0,5% w/v
(Fa.Flow, Meckenheim)
Trypsin (Fa. Serva, Heidelberg)
Zellschaber (Cellscraper, Fa. Nunc, Wiesbaden)
Multislides Objektträger, fettfrei (Fa. Flow, Meckenheim) -20°C kaltes Aceton
250 ml Kulturflaschen (Fa. Nunc, Wiesbaden)) Inkubator 37°C
Methode:
Die Anzüchtung des Lassavirusstammes Josiah erfolgte aus bereits vorhandenem infektiösem Kulturüberstand in Verozellen im Sicherheitslabor der Klasse 4.
Der infektiöse Virus-Kulturüberstand wurde in einer Konzentration von 10-3 verwendet. Die
infizierten Zellen wurden 5 Tage bei 37 °C kultiviert.
Zur Weiterbehandlung der infizierten Zellen für die Herstellung von IIF-Präparaten wurden die Zellen abtrypsiniert oder abgeschabt und zweimal mit Kulturmedium ohne FKS gewaschen. Anschließend wurde das Zellpellet in wenig Medium aufgenommen und auf fettfreie Multislides Objektträger pipettiert. Die Zelldichte wurde mikroskopisch kontrolliert. Die Objektträger verblieben ca. 6 Stunden unter der Gewebekulturbank (Sterilbank) zum Antrocknen der Zellen. Anschließend erfolgte die Fixierung für 20 Minuten mit –20°C kaltem Aceton. Sobald sich die
Objektträger in der Küvette mit Aceton befanden, konnten sie aus dem Sicherheitslabor herausgeschleust werden.
Der infektiöse Kulturüberstand wurde aliquotiert zur weiteren Verwendung als Virusstock bei –70°C eingefroren.
3.3.2. Virusaufreinigung aus dem Gewebekulturüberstand Material:
Tris-Natriumchlorid-EDTA-Puffer (TNE) Sucrose (Fa. Merck)
Ultrazentrifuge; Rotoren J-21 8000 Upm (Fa. Beckman) SW-40 35000 Upm (Fa. Beckman) Eppendorf Zentrifuge
Lichtquelle Methoden:
Die Antigenaufarbeitung erfolgte aus dem Kulturüberstand infizierter Verozellen. Der infektiöse Kulturüberstand wurde bei 3000 Upm 10 min. zentrifugiert, anschließend auf ein 20% Sucrose-Polster gegeben und über Nacht bei 8000 Upm in einem J-21 Rotor zentrifugiert. Das Sediment wurde mit 400 µl TNE-Puffer aufgenommen, auf einen 20% - 10% igen Zuckergradienten gegeben und 18 Stunden bei 30000 Upm in einem SW-40 Rotor zentrifugiert.
Das Virusmaterial ist an einer opalfarbigen Schicht zu erkennen. Als optische Hilfe diente eine Lichtquelle, mit der das Zentrifugenröhrchen von unten bestrahlt wurde. Das Abpunktieren des Virusmaterials erfolgt bei Einmalzentrifugenröhrchen mit einer Kanüle oder mittels einer 2 ml Plastikpipette bei wieder verwendbaren Röhrchen.
Die gewonnene Virusfraktion wurde anschließend bei 35000 Upm, 1 Stunde in einem SW 40 Rotor zentrifugiert. Das Pellet wurde mit ca. 200 µl TNE-Puffer aufgenommen und bis zur weiteren Verwendung bei –70° C eingefroren.
3.3.3. Herstellung von infektiösem Babymausgehirn Material:
3-4 Tage alte Balb/c-Mäuse (Institut für Versuchstierzucht / Hannover Bornum) 10 ml Plotter
Methode:
3-4 Tage alte Balb/c-Mäuse wurden mit 100 µl infektiösem Gewebekulturüberstand (Virusstock) intracerebral im L4-labor injiziert. Das Mausgehirn der erkrankten Tiere wurde nach ca. 5 Tagen (kurz vor dem Tod) mit einer 20 ml Spritze steril entnommen und mit 30% Sucroselösung 1:2 versetzt. Anschließend mit einem Plotter homogenisiert und aliquotiert bei –70°C eingefroren.
3.3.4. Immunisierung Material:
6 bis 12 Wochen alte weibliche, spezifisch pathogenfreie Balb/c Mäuse (Institut für Versuchstierzucht / Hannover Bornum)
0,15 M NaCl, 1% ige Jodlösung zum Desinfizieren
komplettes und inkomplettes Freund´sches Adjuvans (Fa. Behringwerke, Frankfurt a. Main) Tuberkulinspritzen
Methode:
Mäuse wurden mit einem Gemisch aus 0,1 ml infektiösem Babymausgehirn (siehe 3.3.3.), versetzt mit 0,1 ml kompletten Freund´schen Adjuvans, intraperitoneal immunisiert und 3 Mäuse mit 0,1 ml aufgereinigtem infektiösen Kulturüberstand (siehe 3.3.2.) ebenfalls mit 0,1 ml kompletten Freund´schen Adjuvans gespritzt. Im Abstand von jeweils einer Woche wurden drei weitere Immunisierungen mit inkompletten Freud´schen Adjuvans durchgeführt. 1 Woche vor der Fusion erfolgte eine Boosterung mit 1:10 verdünnten Virusmaterial ohne Zusatz von Freund´schen Adjuvans.
3.3.5. Kultivierung der Myelomzellen Material:
Zellinie: P3-Ns-1-Ag4-11 (NS-1) (V. Mönning, Institut für Virologie, Medizinische Hochschule, Hannover)
Standardkulturmedium für lymphozytäre Suspensionskulturen: RPMI 1640 (Fa. Flow, Meckenheim)
100 µg/ml Streptomycin (Fa. Flow, Meckenheim) 5 µg/ml Amphotericin B (Fa. Flow, Meckenheim) 2 mM L-Glutamin (Fa. Flow, Meckenheim) 1 mM Natriumpyruvat (Fa. Flow, Meckenheim)
20% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (Fa. Gibco, Karlsruhe) ausgetestet für die Stimulation von Klonwachstum
250 ml Kulturflaschen (Fa. Nunc, Wiesbaden) Inkubator 37°C mit 5% C02
Methode:
Die NS-1 Zellen wurden alle zwei Tage geteilt und bei 37°C mit 5% C02 inkubiert. Da die
Teilungsdauer ca. 16 – 18 Stunden beträgt, wurden die zur Zellfusion benutzten Zellen 16 – 18 Stunden vor der Fusion das letzte Mal passagiert.
3.3.6. Bestimmung der Zellzahl Material:
Phosphatpuffer (PBS, Phosphate Buffered Saline) Neubauer-Kammer
geschliffene Deckgläschen
Methode:
Mit einer sterilen Pipette werden ca. 100 µl der vorher gut aufgeschüttelten Zellsuspensionen entnommen und mit PBS verdünnt. Nach Auflegen des Deckgläschens auf die Neubauerkammer wurde die zu zählende Zellsuspension in die Kammer pipettiert. Die in den vier (wiederum aus 16 Unterquadraten bestehend) Eckquadraten liegenden Zellen werden gezählt. Die durchschnittliche Zellzahl pro Eckquadrat wird berechnet. Diese Zahl multipliziert mit dem Verdünnungsfaktor entspricht der Zellzahl pro 0,1 µl (Paul 1980).
3.3.7. Gewinnung von Mausserum Material:
Äther (Apotheke) / Decapitierungsschere Wasserbad
Methode:
Die Mäuse wurden mit Äther getötet und sofort decapitiert und entblutet. Das Serum wurde durch Zentrifugation, 10 Minuten 3000 Upm, gewonnen und anschließend bei 56° C, 60 Minuten im Wasserbad inaktiviert, aus dem L4-Labor ausgeschleust, aliquotiert und bei – 20° C eingefroren.
3.3.8. Zellhybridisierung durch Polyethylenglykol (PEG-Fusion) Material:
Versuchstiere
je Fusion: 1 immunisierte Balb/c Maus
1 Balb/c Maus zur Gewinnung von intraperitonealen Makrophagen und Milzzellen ( alternativ: 2,5 % Ewing Sarcoma Growthfaktor- ESG Fa. Tecnomara, Fernwald) Chemikalien: Polyethylenglykol 1500 –PEG ( Fa. Roth, Karlsruhe) Dimethylsulfoxid –DMSO (Fa. Merck, Darmstadt) Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin-Lösung
100x Konzentrat –HAT Lösung (Fa.Boehringer-Ingelheim) Hypoxanthin-Thymidin-Lösung 100x Konzentrat –HT Lösung
( Fa. Boehringer-Ingelheim)
Fusionsmedium: PBS mit 15% DMSO und 42% Polyethylenglykol Zellkulturmedien: RPMI mit Zusätzen (siehe 3.3.5.) plus HAT-Lösung
Endkonzentration 4 x 10-7 M Aminopterin,10-4 M Hypoxanthin, 1,6 x 10-5 M Thymidin
RPMI mit Zusätzen (siehe 3.3.5.) plus HT-Lösung
Endkonzentration 10-4 M Hypoxanthin und 1,6 x 10-5 M Thymidin
Phosphatpuffer (PBS, Phosphate Buffered Saline), steril Äther
Methode:
Die Methode von Köhler und Milstein (Kohler, Howe et al. 1976) wurde mit einigen Modifikationen ausgeführt.
Die immunisierten Balb/c wurden wie unter 3.3.7. getötet, sofort decapitiert, entblutet und anschließend splenektomiert. Die entnommenen Milzen wurden in 10 ml sterilem PBS in einer sterilen Petrischale, mit einer Pinzette zerkleinert und anschließend in ein Zentrifugenglas überführt.
Das Sediment aus verbleibenden Gewebspartikeln wurde verworfen und der Überstand mit 400 x g für 10 Minuten bei 20°C zentrifugiert. Die Tumorzellen wurden ebenfalls in sterilen PBS gewaschen und bei 20°C zentrifugiert. Dann erfolgte das Zusammenmischen von 108 Milzzellen
und 107 NS-1 Zellen mit anschließender Zentrifugation bei 400 x g, 20° C.
Das Pellet wurde tropfenweise – vorsichtig - mit 1 ml 37° C warmen Fusionsreagenz überschichtet, mit einer sterilen Pipette (Öffnung mit großen Durchmesser, ggf. abgeschnittene Pipettenspitze, steril) vorsichtig homogenisiert und für 1 Minute bei 37° C im Wasserbad inkubiert. Im Anschluß wurde das Fusionsmedium durch tropfenweise Zugabe von 20 ml RPMI 1640 (ohne FKS ) ausverdünnt, die frisch fusionierte Zellsuspension niedertourig bei 400 x g abzentrifugiert und in 120 ml HAT-Medium vorsichtig mit einer sterilen Pipette resuspendiert. Als Feederlayer wurde dem HAT-Medium normale Milzzellen einer gesunden Balb/c Maus in einer Konzentration von 1 - 4 x 106 Zellen/ml und 2,5 x 103 /ml Mausmakrophagen zu gesetzt
(alternativ: 2,5 % Ewing Sarcoma Growthfaktor- ESG Fa. Tecnomara, Fernwald). Die Zellsuspension wurde dann auf sechs Flachbodenmikrotiterplatten zu je 180 µl pro Mikrocup verteilt und im Brutschrank bei 37° C, 5% CO2 inkubiert. Nach zwei Wochen wurde das
HAT-Medium successive (25 – 100 µl /Mikrocup) gegen HT-HAT-Medium, nach weiteren 2 Wochen successive (25 – 100 µl /Mikrocup) gegen das Standardkulturmedium RPMI 1640 ausgetauscht. Hybridomakolonien erscheinen erstmalig 14 bis 21 Tage nach der Fusion.
3.3.9. Hybridomakultivierung Material:
24 er Well-Polystyrolplatten (Fa. Greiner, Frickenhausen) Standardkulturmedium für lymphozytäre Suspensionskulturen: RPMI 1640 (3.3.5.) ggf. HT-Medium (3.3.8.)
Methode:
Es wurden nur Zellklone weiterkultiviert, die in der IIF (siehe 3.3.9.2. Nachweis von monoklonalen Antikörpern im Zellkulturüberstand) einen Antikörpertiter gegen Lassaviren aufwiesen.
Waren ca. 70% eines Mikrocups mit dem Zellklon bewachsen, wurde die Hybridomakolonie zur weiteren Vermehrung auf 24er Well-Makroplatten umgesetzt. Hierzu wurden 0,5 ml Standardmedium mit Milzfeederzellen (1Milz/100ml) pro Well vorgelegt und 100 µl resupendierte Zellsuspension aus dem Mikrocup zugegeben. Da das Zellwachstum von Klon zu Klon variierte, wurden die Zeitabstände des Fütterns sowie das Umsetzen der Zellen auf Makroplatten nach mikroskopischen Gesichtspunkten beurteilt. Sobald 24 Makrocups mit einem Hybridomaklon bewachsen waren, wurden die Zellen in eine Kulturflasche mit Zusatz von 5 ml Standardmedium überführt und bis zu einer Zelldichte von 5 x 105 /ml weiterkultiviert. Die
Umsetzung erfolgte dann in 75 cm3 Gewebekulturflaschen mit Zusatz von 20 ml
Standardmedium bis eine Zellzahl von 1 x 107 – 1 x 108/ml erreicht wurde.
3.3.9.1. Einfrieren von Hybridomazellen Material:
Standardkulturmedium für lymphozytäre Suspensionskulturen: RPMI 1640 (3.3.5.) + 10% FKS
+ 10% DMSO Methode:
Die Hybridomazellen wurden mit einer Zellzahl von 1 x 107 /ml eingefroren. Der Zusatz von 10
% DMSO (sterilfiltriert) zum Medium erfolgte direkt vor der Zugabe auf die Zellen. Die Zellen wurden bei 1000 Upm 10 Minuten abzentrifugiert, der Überstand bei 4°C aufbewahrt und das Zellpellet sowie die anderen Reagenzien auf gestoßenem Eis gehalten. Die Zellen wurden für 1-2 Tage bei –20° C, anschließend mindestens 2 Tage bei –70° C und zuletzt in flüssigen Stickstoff überführt.
3.3.9.2. Nachweis von monoklonalen Antikörpern im Zellkulturüberstand – Indirekte Immunfluoreszenz
Material:
Multislides Objektträger infiziert mit Lassavirus (Viruskultivierung 3.3.1.) Fluorescein Isothiocyanat (FITC)- konjugierte Kaninchen anti-Maus Antikörper
(Fa. Dakopatts a/s, Kopenhagen, Dänemark)
Fluorescein Isothiocyanat (FITC)- konjugierte Maus anti-human Antikörper (Fa. Siffin/Berlin)
Phosphatpuffer (PBS, Phosphate Buffered Saline) Methode:
Die Herstellung von Multislides Objektträgern erfolgte wie unter 3.3.1 beschrieben. Die mit infizierten Zellen betropften Objektträger wurden nach Acetonfixierung getrocknet und bei –20°C tiefgefroren oder getrocknet, unter Vakkum in Aluminiumfolie eingeschweißt und bei Raumtemperatur aufbewahrt.
Nach dem Auftauen oder Entnehmen aus den Aluminiumtaschen können die Objektträger direkt betropft werden. Die Hybridomaüberstände wurden zum Screenen konzentriert eingesetzt. Als positive Kontrolle diente das gewonnene Serum der Fusionsmaus und /oder eine humane Serumkontrolle mit Antikörper gegen Lassavirus. Als negative Kontrolle diente dementsprechend das Serum einer nicht mit Lassavirus immunisierten Balb/c Maus sowie ein humanes Serum ohne Antikörper gegen Lassavirus. Die Felder des Objektträgers wurden mit ca. 20 µl betropft. Nach einer Inkubationszeit von mindestens 120 Minuten bei 37°C oder über Nacht bei 4°C in einer feuchten Kammer wurden die Präparate in PBS gewaschen und mit 1:100 verdünnten konjugiertem Kaninchen-anti-Maus IgG/IgM Antikörpern versehen bzw. anti-Human FITC-konjugierten Antikörpern bei Verwendung von Humanseren. Die Inkubation erfolgt 30 Minuten bei 37°C, anschließend werden die Objektträger in PBS gewaschen, mit einem Deckgläschen versehen und mikroskopisch (C. Zeiss, Fluoreszenzauflichtkondensator IV/FL, Kombination Blauanregung) beurteilt. Positive Proben zeigen eine typische cytoplasmatische Fluoreszenz (siehe Abbildung 9).
3.3.9.3. Subklassenbestimmung Material:
Chemikalien: Tween 20
Ortho-1,2, Phenyldiamin (Fa. Merck, Darmstadt)
Immunglobuline: unkonjugierte Ziege-anti-Maus (Fa. Miles Laboratories Ltd. Elkhart, Indiana, USA)
Kaninchen-anti-Maus IgG1, IgG 2a, IgG 2b, IgG 3, IgM, IgG A
( Fa. Dakopatts A/s, Koppenhagen, Dänemark) ELISA-Waschpuffer (siehe Puffer und Lösungen 3.9.)
ELISA-Substratpuffer (siehe Puffer und Lösungen 3.9.) Rinderalbumin (BSA) (Fa. Merck, Darmstadt)
Dynatech-Microelisa-Spektrophotometer Methode:
Die Subklassenbestimmung wurde als ELISA (Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay) auf bestrahlten Rundbodenmikrotiterplatten durchgeführt. Diese wurden mit Ziege-anti-.Maus (GAM) Immunglobulin 1:500 beschichtet. Nach Absättigung unspezifischer Bindungsstellen des Kunststoffbodens, durch eine 1% ige Rinderserumalbuminlösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur, wurden je Vertiefung 50 µl Hybridomaüberstand pipettiert. Nach 24 Stunden Inkubation der Mausantikörper bei 4° C wurden die Cups dreimal mit Waschpuffer gewaschen und anschließend mit je 50 µl pro Cup subklassenspezifischen Kaninchen-anti-Maus Immunglobulinen (RAM) beschichtet; Inkubation bei 37° C für eine Stunde. Nach dreimaligem Waschen erfolgte im nächsten Schritt die Zugabe von Peroxidase markiertem Ziege-anti-Kaninchen Immunglobulin 1:2500, 50 µl pro Cup, 45 Minuten bei Raumtemperatur.
Die Cups wurden wieder dreimal mit Waschpuffer abgespült und mit 50 µl Substratpuffer (ortho-Phenylendiamin, OPD + 0,1% H2O2) pro Cup versehen. Nach 10 Minuten wurde die
Reaktion durch Zugabe von 100 µl 2N H2 SO4 pro Cup gestoppt. Die photometrische Messung
der Farbreaktion erfolgte bei 492 nm.
3.4. Reclonierung, Aufreinigung, Markierung und Konservierung von monoklonalen Antikörpern
3.4.1. Auftauen und Reclonierung von Hybridomazellen Material:
Standardkulturmedium für lymphozytäre Suspensionskulturen: RPMI 1640 (3.3.5.)
Methocel 4000 purum (Fa. Fluka, Neu-Ulm) Methode:
Die aufgetauten Hybridomazellen werden vorerst mit 10 ml Standardmedium gewaschen (1000 Upm 10 Minuten) und anschließend mit 10 ml Medium in einer 25 cm3 Gewebekulturflasche bei
37°C, 5% CO2 kultiviert.
Die Reklonierungen der Hybridomazellen erfolgt nach ca. 2 Tagen nach der Methode des „limited-dilution“ Verfahrens (Galfre and Milstein 1981) in 1. Standardkulturmedium und/oder in 2. Methocel-Softagar.
1. Die Hybridomazellen wurden auf eine Zelldichte von 10 Zellen/ml, 5 Zellen/ml und 1 Zelle/ml in RPMI Standardmedium verdünnt und mit einem Volumen von 100 µl /Well in Mikrotiterplatten ausgesät. Die Mikrotiterplatten waren 3-5 Tage zuvor mit 100 µl /Well Milzfeederzellen (1 Milz/100 ml) beschichtet und bei 37° C, 5% CO2 vorinkubiert worden.
Einzeln wachsende Kolonien wurden in der IIF (siehe 3.3.9.2.) auf ihren Antikörpergehalt gegen Lassavirus ausgetestet. Hierzu wurden die Hybridomakulturüberstände 1:4 bis 1: 512 verdünnt. Jeweils die vier Subklone mit dem höchsten Titer wurden wie unter 3.3.9. beschrieben ohne Zusatz von weiteren Milzfeederzellen weiterkultiviert.
2. Hierzu wurden kleine Petrischalen (60 x 15 mm) mit Standardmedium und Milzfeederzellen beschickt und für 3-5 Tage vorkultiviert. Anschließend erfolgte die Einsaat von 1 x 104/ml, 3 x
104/ml und 5 x 104/ml Zellen pro reclonierender Hybridomalinie in 2,5% Methocel/ RPMI
Standardmedium-Agar. Nach einer Kultivierungsperiode von vier bis sechs Tagen waren die einzelnen Zellen zu morulaartigen Kolonien ausgewachsen, sie wurden unter mikroskopischer Kontrolle einzeln abpipettiert und auf Mikrotiterplatten neu angezüchtet und vor der Weiterkultivierung in Kulturflaschen in den Verdünnungen 1:4 bis 1:512 auf ihren Antikörpertiter gegen Lassavirus in der IIF getestet.
3.4.2. Aufreinigung und Ankonzentrierung durch Abtrennung des IgG über Affinitäts-Chromatographie
Material:
Säule XK 16/40 Fa. Amersham Biosciences /Freiburg Ziege Anti-Maus IgG (H+L) Fa. Zymed Laboratories U.S.A.
-Sepharose 4B Konjugat
PD-10-Columus Sephadex G 25M Fa. Amersham Biosciences, Freiburg Bindungspuffer: 0,1M Carbonatpuffer in 0,5M nach pH 8,7
NaHCO3 8,4g/1000 ml
NaCl 29,00g/1000 ml NaCO3 10,6g/1000 ml
NaCl 29,22g/ 1000 ml NaHCO3 vorlegen und mit Na2CO3auf pH 8,7 einstellen.
Elutionspuffer: 0,1M Glycinpuffer in 0,5M nach pH 2,3 C2H5NO2 7,5g/ 1000 ml
NaCl 29,22g/ 1000 ml pH-Wert mit 1M HCL einstellen
Aufbewahrungspuffer: 0,02M Phosphatpuffer pH 7,0 Na2HPO4x2H2O 3,56g/ 1000 ml
KH2PO4 2,72g/ 1000 ml
NA2HPO4x2H2O vorlegen und mit KH2PO4 auf pH 7,0 einstellen
Säulenpuffer: 0,1M Carbonatpuffer pH 8,5 NaHCO3 8,4g/ 1000 ml
Na2CO3 10,6g/ 1000 ml
NaHCO3 vorlegen und mit NaHCO3 auf pH 8,5 einstellen.
PD 10-Säule Fa.Pharmacia , Freiburg 0,1 M Carbonatpuffer pH 8,5
Centriprep YM Fa. Amicon-Millipore, Witten Kit für Proteinbestimmung, Fa. Bio Rad, München
0,01% Thimerosal Fa. Sigma , Schnellendorf
Methode:
Die Glassäule XK 16/40 wird mit Ziege-anti-Maus IgG Sepharose gefüllt und 20 min. mit dem entgasten und filtrierten Bindungspuffer gespült. Der Kulturüberstand wird filtriert und 1:2 mit Bindungspuffer verdünnt (pro Säulenlauf 25 ml Kulturüberstand + 25 ml Bindungspuffer). Das Material wird auf die Säule gegeben und mit dem Elutionspuffer (ph 2,3) werden die gebundenen Monoklonalen Antikörper wieder eluiert. Durch die ständige Messung im Durchflussphotometer
wird ein Peak bei erhöhter Proteinkonzentration am Schreiber des Photometers angezeigt. Dieses Eluat wird aufgefangen. Aus 50 ml Kulturüberstand erhält man ungefähr 5 ml IgG. Da das Eluat stark sauer ist, wird es sofort über eine PD 10 Säule gegen 0,1M Carbonatpuffer (pH 8,5) umgepuffert und anschließend eingeengt über Centriprep YM10 Säulen auf ca. 1ml.
Die Proteinbestimmung erfolgt mit dem Protein-Assay (Fa. Bio-Rad) in Mikrotiterplatten und wird photometrisch bei 595 nm gemessen. Es werden stets Doppelwerte ermittelt. Die MAK werden mit 0,01% Thimerosal versetzt und bei 4° C oder lyophilisiert bei RT gelagert.
3.4.3. Biotin-Markierung monoklonaler Antikörper Material:
Biotin: (long arm) NHS, wasserlöslich, Fa. Vector PD 10-Säule (Fa.Pharmacia,/Freiburg)
PBS Methode:
Zur Biotin-Markierung sollte der Proteingehalt der Monoklonalen Antikörper zwischen 1,5 – 2 mg/ml betragen.
20 mg Biotin werden in 500 ml Milli-Q-Wasser, ggf. etwas erwärmen, gelöst und es wird 1/10 des Protein (MAK)-IgG-Gehaltes zu dem aufgereinigten MAK pipettiert.
Während der Inkubation von 2 Stunden bei Raumtemperatur mehrmals sanft schütteln (IgG kann ausfallen). Das Stoppen der Reaktion erfolgt mit 10mg Glycin. Um das erneute Ausfallen von IgG nach dem Lösen mit Glycin zu verhindern, erfolgt anschließend eine sofortige Pufferung über eine PD 10 Säule gegen PBS. Das gewonnene Eluat kann über Centriprep Säulen erneut eingeengt werden.
3.4.4. Konservierung der biotin-markierten monoklonalen Antikörper Material:
0,01% Thimerosal Fa. Sigma, Schnellendorf 1% Mausserum Fa. Charles River, Berlin
1% Humanserum BNI, Hamburg
Methode:
Die biotin-markierten Antikörper werden mit der IIF überprüft. Hierzu werden sie in Verdünnungsschritten ab 1:100 auf mit Lassavirus infizierten Verozellen titriert und die Biotinylierung mit anti-Maus FITC Streptavidin nachgewiesen. Anschließend werden die MAK zur Konservierung mit 0,01% Thimorosal, 1% negativen Mausserum und 1% Humanserum versetzt. Sie werden lyophilisiert und bei RT aufbewahrt.
3.5. Herstellung, Inaktivierung und Konservierung
Übersicht der im Rahmen der Untersuchung verwendeten Lassavirus-Stämme: Virusstamm Ursprung /Accession No. Herkunft
Lassa AV Mensch, Serum
AF 246121
Isolat BNI Lassa Josiah Mensch, Serum
J04324
Mc Cormick CDC/Atlanta
Lassa CSF Mensch, Liquor
AF333969
Isolat BNI
Lassa NL Mensch,Serum Isolat BNI
LCMV Armstrong Laborstamm (Mensch) M20869 Heinrich-Pette-Institut/ Hamburg Junin MC2 Impfstamm XJCL3 D10072 Universität Leuven/ Belgien
Mopeia 800150 Laborstamm (Mensch) M33879
Heinrich-Pette-Institut/ Hamburg
Amapari Laborstamm (Maus) Heinrich-Pette-Institut/ Hamburg
3.5.1. Anzüchtung verschiedener Arenaviren Material:
Zellinie Vero (ATCC; Vero clone CRL 1586 Kulturmedium: Leibowitz mit Glutamin +5% FKS
Vorgehen:
Die Lassavirus Stämme AV, NL und CSF sind direkt aus Patientenserum bzw. Liquor isoliert worden. Hierzu wurden jeweils 50 ul Patientenmaterial auf eine 25 cm2-Zellkulturflasche mit 3 x
105 Verozellen pipettiert. Die Zellen wurden alle 5-6 Tage geteilt. Die Infektion ist mit der IIF
kontrolliert worden. Der infektiöse Kulturüberstand wurde aliquotiert (104 TCID
50/ml) und als
Virusstock bei –70° C eingefroren (Günther, Emmerich et al. 2000; Gunther, Weisner et al. 2001).
3.5.2. Inaktivierung Material:
NP 40 Fa. Shell AG, Hamburg
Vorgehen:
Verozellen wurden mit den unter 3.5.1 hergestellten Virusstocks in den Verdünnungen 1:300 und 1:3000 infiziert. Die Kulturüberstände und infizierten Zellen wurden an verschiedenen Tagen geerntet. Die adhaerenten Zellen wurden in den 75 cm2 verwendeten Kulturflaschen durch
Zugabe von 10ml PBS mit unterschiedlichen Konzentrationen NP 40 (2 bis 0,01%) abgelöst (siehe Ergebnisse 4.1.1.2.). Die Zellsuspension und die Kulturüberstände wurden anschließend 60 Sekunden auf der Beschallungsstufe 3 im Intervallprogramm beschallt und danach bei 3000 Upm 10 min. zentrifugiert, um mögliche Zellreste zu entfernen. Nach ca. 1h erfolgte eine Ultrazentrifugation von 18h bei 25000 Upm. Der Überstand wurde verworfen und das Sediment mit 1/100 des eingesetzten Volumens in Leibowitz Medium plus 5% FKS resuspendiert. Um zu überprüfen, ob die eingesetzte NP 40 Konzentration zur Inaktivierung der Lassaviren ausreichte, wurde das gewonnene Sediment in 24er Wellplatten, die mit Verozellen bewachsen waren, verdünnt. In den Kontrollen ohne NP 40 ergab sich ein Titer von 108 TCID
50. Da in dem
Sediment nach Resuspension nur geringe NP 40 Reste vorhanden waren, zeigte eine 1:100 Verdünnung keine Zelltoxizität mehr. Die nach 6 Tagen gewonnenen Überstände wurden jeweils dreimal pro Well weiterpassagiert. Die Infektiösität bzw. Inaktivierung wurde mit der IIF überprüft. Hierzu wurden die Polystyrolplatten mit Ethanol/Methanol (1:2) für 20 min. fixiert und danach aus dem BSL-4 Labor ausgeschleust.
3.5.3. Konservierung
Die mit Detergenz behandelten Antigene wurden aus dem BSL-4 Labor ausgeschleust und im Antigentest, der im Ergebnisteil unter 4.1.1.1. beschrieben ist, ausgetestet. Die Antigene wurden bei –70° C über Nacht tiefgefroren und konnten dann lyophilisiert werden. Die ermittelten Antigentiter wurden auf den Etiketten der Antigenpräparationen vermerkt (siehe Ergebnisse 4.1.1.3.).
3.6. Lassavirus-Antikörper Nachweis mit der indirekten Immunfluoreszenz: Doppelfluoreszenztest
Material:
Ziege anti-human-IgG FITC (Fa. Siffin/Berlin) Ziege anti-human-IgM FITC (Fa.Siffin/Berlin) Ziege anti-Maus-IgG TRITC (Fa. Dianova/Hamburg) IgM-Absorbens (Fa. Bios GmbH/München) Vorgehen:
Für die IIF wird das Untersuchungsmaterial (Serum und/oder Liquor) mit den fixierten infizierten Zellen zusammen mit Maus Monoklonalen Antikörpern inkubiert. Die Bindung der Mausantikörper wird in einem zweiten Schritt nachgewiesen. Der Nachweis der menschlichen Antikörper erfolgt mit einem fluorochrom-markierten Anti-Humanimmunglobulin, die der Mausantikörper durch ein Rhodamin anti-Maus Konjugat (Haas, Breuer et al. 2003).
Serum: IgM Nachweis in der IIF:
1. Beim Nachweis von spezifischen IgM-Antikörpern kann die gleichzeitige Anwesenheit von IgG stören. Ein Überschuß von IgG Antikörpern kann durch kompetitive Hemmung die IgM Bindung an das Antigen verhindern und der Nachweis von IgM Antikörpern dadurch behindert werden.
2. IgM Rheumafaktoren können dagegen zu falsch positiven Ergebnissen beim IgM Nachweis führen. Der IgM Rheumafaktor ist ein IgM Autoantikörper, der gegen (körpereigene) IgG
Antikörper gerichtet ist. Hat im Testansatz spezifisches IgG an das Antigen gebunden und sind IgM Rheumafaktoren anwesend, können diese ihrerseits an das gebundene IgG binden und damit erfaßt werden.
Aufgrund dieser Fehlermöglichkeiten werden alle IgG positiven Seren vor dem Nachweis von IgM Antikörpern mit IgG-Absorbens vorbehandelt
Zu beachten ist, dass vor der Absorption alle Reagenzien und Serumproben auf Raumtemperatur erwärmt werden müssen (ca. 5 min.)
Das Serum wird mit IgG Absorbens 1:5 verdünnt (20 ul Serum und 80ul Absorbens), gemischt und 10 –15 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Testablauf:
Objektträger mit Lassavirus infizierten Verozellen (-20°C oder eingeschweißt) werden in eine feuchte Kammer gelegt. 5 ul Monoklonaler Antikörper (Kulturüberstand) werden auf alle Felder des Objektträgers pipettiert, Inkubation 10-15 min bei 37°C im Brutschrank.
Die Patientenseren werden in den Verdünnungen 1:5 bis 1:160; Liquores 1:2,5 bis 1:80 (zu beachten ist, dass durch Vorlage des monoklonalen Antikörpers die Seren/Liquores 1:2 nachverdünnt werden) auf den vorgelegten MAK pipettiert (kein Waschschritt!) und 60 min. bei 37°C oder über Nacht bei 4°C inkubiert. Für den Nachweis von IgM-Antikörpern werden die Objektträger 120 min. bei 37°C bzw. über Nacht bei 4°C inkubiert.
Die Objektträger werden für 15 min. in PBS gewaschen. Anschließend wird mit Fliespapier die Flüssigkeit abgesogen. Anschließend werden 10-20 µl anti-human-IgG FITC plus 5% negativem Mausserum oder anti-human-IgM FITC plus 5% negativem Mausserum in der vorgeschriebenen Verdünnung von 1:200 aufpipettiert und 20 min. bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wird mit PBS abgespült und anschließend für 15 min. in PBS auf dem Schüttler gewaschen. Dann erfolgt die Anfärbung der Monoklonalen Antikörper mit 10-20 µl anti-Maus-IgG TRITC 1:200, 20 min. bei 37°C im Brutschrank. Die Objektträger werden wieder gewaschen und unter dem Fluoreszenzmikroskop beurteilt.
Während des Mikroskopierens wird das Filtersystem von der FITC-Fluoreszenz („grün“) zur Rhodamin Fluoreszenz („rot“) verschoben. Bei positiven Antigen-Antikörper Reaktionen sind
deutliche Kolokalisationen der spezifisch gebundenen Monoklonalen Antikörper (rote Fluoreszenz) und der humanen Antikörper (grüne Fluoreszenz) zu erkennen.
Unspezifisch gebundene humane Antikörper binden an anderen Zellstrukturen als der MAK (keine Überlappung!).
Bei einem positiven Antikörpernachweis werden die Seren weiter verdünnt und mit der IIF erneut bis zur Bestimmung des Endtiters getestet (siehe Ergebnisse Abbildung 9).
3.7. Lassa-Virus IgM ELISA Material:
PBS (siehe 3.9.)
Waschpuffer (siehe 3.9.)
monoklonaler Antikörper gegen Lassavirus 2F1 BNI
negatives Humanserum BNI
negatives Mausserum Fa. Charles River/Berlin
1 M Schwefelsäure Fa. C. Roth /Darmstadt
TMB-Substrat Fa. Medac/Hamburg
Ziege anti-human IgM Fa. Siffin/ Berlin Streptavidin-Peroxidase Fa. Siffin/ Berlin Ziege anti-human IgM FITC markiert Fa. Siffin/ Berlin Tetramethylbenzidin (TMB) Fa. Medac/ Hamburg Wasserstoffperoxid (H2O2) Fa. Medac/ Hamburg
Methode:
Der Lassa-Virus-IgM Test ist ein µ-Capture ELISA für den qualitativen Nachweis von IgM-Antikörpern gegen Lassaviren. Der Test wurde während der Fertigstellung dieser Arbeit zusätzlich zum RF-Test entwickelt (Publikation in Vorbereitung).
Der Nachweis erfolgt durch Bindung von IgM-Antikörpern aus dem Patientenserum und Liquor an eine mit anti-human IgM beschichteten Polystyrol-Mikrotiterplatte. Die 50 µl / Vertiefung der Serum- oder Liquorproben werden ab einer Verdünnung von 1:10 für 2 Stunden bei RT auf den Platten inkubiert. Anschließend wird mit Waschpuffer dreimal gewaschen; dann erfolgt die Zugabe von 50 µl /Vertiefung des inaktivierten Subtypenantigens LAS-Jos über Nacht bei 4C° (siehe 3.5./4.1.). Die Platten werden danach wieder dreimal mit Waschpuffer gewaschen. Der
Nachweis der Bindung von Lassaantigen an spezifische Antikörper erfolgt durch den biotinylierten monoklonalen Antikörper (MAK 2F1, 50 µl /Vertiefung, Verdünnung 1:1000 für 2 Stunden bei RT). Nach dreimaligem Waschen wird der gebundene MAK durch 50 µl /Vertiefung Streptavidin-Meerrettichperoxidase nachgewiesen.
Nach einem weiteren Waschschritt erfolgt die Farbreaktion durch die Zugabe von 50 µl/Vertiefung eines farblosen Substratsystems (TMB/H2O2). Die Reaktion wird durch 100µl
/Vertiefung 1N Schwefelsäure gestoppt. Die photometrische Messung erfolgt bei 450 nm (Referenzbereich 630 nm)
Auswertung: es wird der Mittelwert (X) der negativen Kontrolle ermittelt. Ein negatives Ergebnis liegt vor, wenn die Extinktion ≤ 2,5X beträgt. Grenzwertig sind Extinktionen zwischen 2,5X und 4 X. Ein positives Ergebnis liegt vor, wenn die Extinktion >4X ist.
3.8. Patientenmaterial
Seren von: Bezugsquelle:
Akuten Lassafieber-Fällen Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedizin, Hamburg Abt. Virologie
Blutspendern Institut für Transfusionsmedizin der Universitätsklinik Eppendorf, Hamburg
Autoimmunerkrankten Institut für Immunologie
derUniversitätsklinik Eppendorf, Hamburg
Touristen mit fieberhaften Infekt Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedizin, Hamburg Abt. Virologie
Gesunden West-Afrikanern Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedizin, Hamburg Abt.fürVirologie, Helmintologie, Molekularer Grundlagenforschung
