Zusammenfassung

PAP wird durch das Fehlen der normoxischen phagozytären ROS-Produktion nicht beeinflusst, ebenso wie der durch PMA induzierte Anstieg des pulmonalarteriellen Druckes. Diese Beobachtung erklärt sich wahrscheinlich durch das Vorhandensein einer intrazellulären, nicht-phagozytären superoxidbildenden NADP(H)-Oxidase. Da in dem verwendeten Untersuchungssystem die intrazelluläre ROS-Produktion nicht nachvollzogen werden konnte, ist dieser Mechanismus durchaus denkbar.

In Phasen akut hypoxischer Ventilation setzten Lungen aus Wildtypen und p22^phox -überexprimierenden Mäusen Superoxid nach intravasal frei. Auch in den Mauslungen mit einer Defizienz für die p47^phox-Untereinheit von NADP(H)-Oxidasen wurde während den hypoxisch ventilierten Phasen eine signifikant erhöhte ^•O2--Produktion detektiert, wohingegen Mäuse mit einem Knock-Out der gp91^phox-Untereinheit keine ROS-Produktion zeigten. Der beobachtete Trend zur ROS-Freisetzung während der normoxisch ventilierten Phasen nach akuter Hypoxie in chimären Mäusen mit rekonstituierten Knochenmarkszellen aus gp91^phox-defizienten Tieren zeigt, dass bei alveolärer Hypoxie sehr wahrscheinlich nicht-phagozytäre NADP(H)-Oxidasen Superoxid freisetzen. Diese Freisetzung wird in den Lungen der Wildtypen und p22^phox-überexprimierenden Tiere durch die ROS-Produktion aus phagozytären NADP(H)-Oxidasen maskiert. Diese Annahme wird zudem durch den Verlauf des pulmonalarteriellen Druckes gestützt, der bei allen untersuchten Tieren eine signifikante HPV als Antwort auf alveoläre Hypoxie zeigte.

Nach chronisch hypoxischer Exposition der Versuchstiere setzten die Lungen kein Superoxid frei. Lediglich p22^phox-überexprimierende Mäuse zeigten unter Basalbedingungen eine Tendenz und nach PMA-Stimulation eine signifikant erhöhte ROS-Produktion. Um die ^•O2--Freisetzung nach chronischer Hypoxie zu charakterisieren sind weitere Experimente notwendig, gleiches gilt für die Untersuchung des vaskulären Remodelings, v. a. in Bezug auf die in den Versuchen eingesetzten Knock-Out Mäuse. Um die Superoxidfreisetzung während und nach chronisch hypoxischer Exposition nachzuweisen, wäre ein in vivo Ansatz denkbar, bei dem Spin-Probes systemisch oder intratracheal appliziert werden und dann über die gesamte Expositionsdauer im Tier verbleiben. Dieser Ansatz war für die vorliegende Arbeit allerdings nur schwer durchführbar, da die zu dieser Zeit erhältlichen Spin-Traps aufgrund der hohen Toxizität und Unverträglichkeit nicht in einem lebenden Tier einzusetzen waren.

6 Abstract

Hypoxia induces (patho)physiological changes in the lung. Physiological matching of perfusion to ventilation occurs in acute hypoxia by constriction of precapillary vessels.

Pathophysiological changes result in media hypertrophy (remodeling) by proliferation and migration of smooth muscle cells and fibroblasts driven by chronic hypoxia. For both processes, reactive oxygen species (ROS) are thought to play a pivotal role as signalling molecules. The aim of this study was to elucidate the role of ROS under acute and chronic hypoxia and non-phagocytic NADPH-oxidases (NOX) as possible source of lung superoxide (^•O2-) release.

We investigated ^•O2- release in isolated perfused and ventilated mouse lungs using electron spin resonance spectroscopy with the spin probe hydroxy-carboxy-tetramethylpyrrolidine.

Specificity for ^•O2- was assured in parallel experiments in the presence of superoxide dismutase. NOX were activated by phorbol-myristate-acetate. The impact of chronic hypoxia on ROS production in mouse lungs was investigated in mice kept for 21 days under hypoxia (FiO2 = 0.10). We also investigated ^•O2-- release in mice lacking the p47 or gp91 or overexpressing the p22 subunit of NOX. The source of ^•O2- was identified in chimeric mice.

Normoxically ventilated mouse lungs released ^•O2- under baseline conditions into the intravascular compartment. Mice show no ^•O2--release under baseline conditions after chronic hypoxia. Depletion of the p47 or gp91 subunit of NOX decreases ^•O2--release, but overexpression of the p22 subunit increases ^•O2- production in mouse lungs.

Mouse lungs release ^•O2- under normoxic conditions. This release is only partially dependent on the p47, but highly dependent on gp91 and p22 subunit of NADP(H)-oxidases. Trials with chimeras specify leukocytes being the primary source of normoxic

•O2--production.

7 Anhang

7.1 Eidesstattliche Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass diese Doktorarbeit selbständig verfasst wurde und von mir keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet wurden.

Ort, Datum Rolf Schäfer

7.2 Danksagung

Mein Dank gilt:

Prof. Dr. med. Werner Seeger: Für die freundliche Aufnahme in das Lungenzentrum der Universität Gießen (University of Giessen Lung Center, UGLC), die Bereitstellung der Labors und der technischen Ausstattung.

Prof. Dr. rer. nat. Wolfgang Clauss: Für die freundliche und unkomplizierte Betreuung der Arbeit im Fachbereich 08 - Biologie und Chemie - der Justus-Liebig-Universität Gießen.

Prof. Dr. rer. nat. Norbert Weißmann: Für die Überlassung des bearbeiteten Themas, die exzellente, kompetente Betreuung, das allzeit „offene Ohr“, Kritik, Anregung und Unterstützung. Vielen Dank für das offene und freundschaftliche Arbeitsverhältnis!

Prof. Dr. med. Hossein Ardeschir Ghofrani und Prof. Dr. rer. nat. Ralph Schermuly: Für Betreuung, Kritik, Anregung und das kollegiale Arbeitsverhältnis.

Dr. rer. nat. Markus Roth: Für Gespräche, Anregung und Ideen, das offene und freundschaftliche Verhältnis und die gute Arbeitsatmosphäre.

Dr. med. Oliver Eickelberg: Für Kritik, Anregung und aufgeregte/aufregende Diskussionen sowie die Lehre(n) im Rahmen des MBML.

Rory Edward Morty, PhD: Für die zeitintensiven Klausurvorbereitungen und Diskussionen, Gespräche und das offene, freundschaftliche Verhältnis.

Dr. Steven M. Holland and Dr. Li Ding, Laboratory of Clinical Infectious Diseases, NIH, Bethesda, MD: Für die Bereiststellung der p47^phox-Knock-Out Mäuse

Dr. David G. Harrison, Emory University, School of Medicine, Atlanta, GA: Für die Bereitstellung der p22^phox-überexprimierenden Mäuse

„Meinen Labormädels“:

Karin Quanz: Für die exzellente Einarbeitung, Hilfe, Betreuung, Kritik und Anregung sowie das überaus freundschaftliche Verhältnis, die sehr gute Zusammenarbeit und sehr angenehme Arbeitsatmosphäre.

Anke Voigt: Für Hilfe, das sehr freundschaftliche Verhältnis und die sehr gute Zusammenarbeit und angenehme Arbeitsatmosphäre.

Ingrid Breitenborn-Müller: Für Fragen, Antworten und Zuhören sowie das freundschaftliche Verhältnis, die sehr gute Zusammenarbeit und sehr angenehme Arbeitsatmosphäre.

Monika Kreutzer: Für Abwechslung, Pausen, Kaffee und „Dampf ablassen“, das freundschaftliche und freundliche Verhältnis und die angenehme Atmosphäre.

Allen Doktoranden, Diplomanden und technischen Mitarbeitern der Labors Seeger/Grimminger: Für Hilfe und die angenehme Arbeitsatmosphäre

Dem MBML-Jahrgang 2005

Nicht zuletzt bedanke ich mich bei meiner Familie, die mir immer mit Rat und Tat zur Seite stand und mir Kraft und Zuversicht gab. Besonderer Dank gilt meiner Mutter für das Vertrauen in mich und die finanzielle Unterstützung während meines Studiums.

Weiterhin möchte ich mich bei Tatjana Duch für die umfassende Hilfe und die starken Nerven bedanken. Ferner bedanke ich mich bei Martin Köstler, Patrick Schäfer und Oliver Schmidt für die Ratschläge, Hilfestellungen und Ablenkung zwischendurch.