Pulmonalarterieller Druck in Normoxie

Zuerst werden die normoxischen Basiswerte für die Wildtypen und transgenen Mäuse dargestellt. Pro Abbildung werden jeweils die Tiere ohne und mit Superoxiddismutase im Perfusat zusammengefasst. Neben der Quantifizierung der Superoxid-Freisetzung durch SOD wurden die NADP(H)-Oxidasen der Mauslungen am Ende des Versuches mit PMA stimuliert. Gemeinhin ist anzumerken, dass die in den Versuchen gemessenen pulmonalarteriellen Drücke verglichen mit Ergebnissen aktueller Literatur höher sind. Wie eigene Vorversuche zeigten, ist der Unterschied auf das verwendete Perfusat zurückzuführen, das speziell für die ESR-Messungen angesetzt wurde und höher viskös ist als das Perfusat, welches in anderen Experimenten verwendet wurde. Dennoch sind die hier gezeigten Ergebnisse mit den bereits publizierten Daten vergleichbar und stehen mit diesen in Einklang.

3.4.1.1 Wildtypen

Die Lungen von Wildtypmäusen hatten einen gemittelten PAP von 11,6 ± 0,6 mm Hg für die Gruppe ohne SOD im Perfusat (n = 7; Abbildung 3-2). Wurde dem Perfusat SOD zugesetzt, betrug der PAP 12,9 ± 0,8 mm Hg (n = 7). Die Stimulation von NADP(H)-Oxidasen mit PMA führte zu einem raschen Druckanstieg, der ca. 30 Sekunden nach der Bolusgabe von PMA einsetzte und letztlich zur Bildung eines Ödems in den Lungen führte. Aus diesem Grund wurden die Lungen nicht von Anfang an mit PMA perfundiert.

Der PMA-induzierte Druckanstieg hatte in beiden Gruppen, d. h. in Versuchen mit und ohne SOD, den gleichen zeitlichen Verlauf. Obwohl die maximalen PAP-Werte für die mit SOD perfundierten Lungen (PAPmax = 28,4 ± 1,5 mm Hg) im Vergleich zu den Lungen ohne SOD (PAPmax = 24,2 ± 1,9 mm Hg) zu Versuchsende tendenziell höher lagen, ergaben sich daraus keine Unterschiede. Dasselbe gilt für den berechneten Druckanstieg

pro Minute (ΔPAP/min). Dieser Wert lag für die Lungen mit SOD bei 0,8 ± 0,1 mm Hg und für die Lungen ohne SOD bei 0,7 ± 0,1 mm Hg.

Abbildung 3-2: Pulmonalarterieller Druck in Mauslungen des Wildtyps (C57Bl/6J)

Die Graphik zeigt den PAP [mm Hg] in den Lungen des Wildtyps bei normoxischer Beatmung. SOD [150 U/ml] wurde zweimal gegeben (rote Pfeile). Die PMA-Gabe [10 µM Endkonzentration im Perfusat] erfolgte für beide Gruppen nach fünfminütigem Aussetzen der Probenentnahme zur Analyse mit ESR. WT = Wildtyp, SOD = Superoxiddismutase, PMA = Phorbol-Myristat-Acetat.

3.4.1.2 gp91^phox-defiziente Mäuse

Für die Lungen der Mäuse mit einem Knock-Out der gp91^phox-Untereinheit von NADP(H)-Oxidasen ergab sich in den Versuchen ohne SOD ein gemittelter PAP von 12,7 ± 0,7 mm Hg (Abbildung 3-3; n = 8). Die Perfusion mit SOD führte zu keiner Veränderung des pulmonalarteriellen Drucks (12,7 ± 0,9 mm Hg; n = 8). Nach Stimulation von NADP(H)-Oxidasen durch PMA wurde ein maximaler Druck von 25,8 ± 1,5 mm Hg in den Lungen, die ohne SOD perfundiert wurden, und in den Mauslungen mit SOD im Perfusat ein maximaler PAP von 27,3 ± 1,9 mm Hg registriert. Die Berechnung des Druckanstieges pro Minute nach PMA-Stimulation ergab im Vergleich der Gruppe ohne SOD (ΔPAP = 0,5 ± 0,1 mm Hg/min) gegen die Gruppe mit SOD (ΔPAP = 0,7 ± 0,1 mm Hg/min) ebenfalls kein signifikantes Ergebnis.

Abbildung 3-3: Pulmonalarterieller Druck in gp91^phox-defizienten Mauslungen

Die Graphik zeigt den PAP [mm Hg] in gp91^phox-defizienten Mäusen bei normoxischer Beatmung.

SOD [150 U/ml] wurde zweimal gegeben (rote Pfeile). Die PMA-Gabe [10 µM Endkonzentration im Perfusat] erfolgte für beide Gruppen nach fünfminütigem Aussetzen der Probenentnahme zur Analyse mit ESR. gp91^-/- = gp91^phox-Knock-Out, SOD = Superoxiddismutase, PMA = Phorbol-Myristat-Acetat.

3.4.1.3 p47^phox-defiziente Mäuse

Der pulmonalarterielle Druck in Mauslungen, die eine Gendefizienz für die p47^phox -Untereinheit von NADP(H)-Oxidasen aufweisen, war in den untersuchten Gruppen ohne und mit Superoxiddismutase fast identisch. In den Lungen, die ohne SOD perfundiert wurden, lag der gemittelte Basisdruck in der Pulmonalarterie bei 12,1 ± 0,6 mm Hg (n = 7). Bei Perfusion mit SOD wurde der mittlere pulmonalarterielle Druck mit 12,6 ± 1,1 mm Hg gemessen (Abbildung 3-4; n = 7). Die Stimulation von NADP(H)-Oxidasen in den Lungen dieser Mäuse durch einen PMA-Bolus hatte einen Druckanstieg von 0,5 ± 0,1 mm Hg pro Minute zur Folge wenn kein SOD im Perfusat vorhanden war.

Nach 20 Minuten ergab sich ein maximaler Druck von 21,0 ± 2,7 mm Hg in diesen Lungen. Demgegenüber stand ein maximaler PAP von 24,5 ± 2,2 mm Hg bei der Perfusion mit SOD und nach PMA-Stimulation. Der ΔPAP/min ergab sich zu 0,7 ± 0,1 mm Hg.

Abbildung 3-4: Pulmonalarterieller Druck in p47^phox-defizienten Mauslungen

Darstellung des PAPs [mm Hg] von p47^phox-defizienten Mauslungen bei normoxischer Beatmung.

SOD [150 U/ml] wurde zweimal gegeben (rote Pfeile). Die PMA-Gabe [10 µM Endkonzentration im Perfusat] erfolgte für beide Gruppen nach fünfminütigem Aussetzen der Probenentnahme zur Analyse mit ESR. p47^-/- = p47^phox-Knock-Out, SOD = Superoxiddismutase, PMA = Phorbol-Myristat-Acetat.

3.4.1.4 p22^phox-überexprimierende Mäuse

Der dritte genveränderte Mausstamm, der in den Versuchen eingesetzt wurde, überexprimiert die Untereinheit p22^phox von NADP(H)-Oxidasen. Die Mauslungen diesen Stammes zeigten unter normoxischer Beatmung eine signifikante (p < 0,005) Erhöhung des pulmonalarteriellen Druckes bei der Perfusion mit SOD (Abbildung 3-5). In diesen Versuchen wurde ein mittlerer PAP von 15,8 ± 1,4 mm Hg gemessen (n = 3), im Gegensatz dazu wurde bei Perfusion ohne SOD (n = 3) ein PAP von 10,6 ± 0,3 mm Hg registriert. Ausgehend von einem höheren Basisdruck lagen auch die maximalen Werte des PAP nach Stimulation mit PMA in den mit SOD perfundierten Lungen höher als in den Lungen ohne SOD im Perfusat, allerdings war dieser Unterschied nicht signifikant, was wahrscheinlich auf die geringe Anzahl der Versuchstiere zurückzuführen ist. Unter Perfusion mit SOD stieg der pulmonalarterielle Druck auf einen maximalen Wert von 31,1 ± 2,6 mm Hg, wohingegen bei Perfusion ohne SOD ein maximaler PAP von 23,4 ± 3,4 mm Hg erreicht wurde. Trotz dieser Differenz unterscheidet sich der pro Minute gemessene Druckanstieg in beiden Versuchsgruppen nicht. In den Versuchen mit SOD-Perfusion wurde ein ΔPAP von 0,7 ± 0,1 mm Hg/min gemessen und die Lungen ohne SOD hatten einen ΔPAP von 0,6 ± 0,2 mm Hg/min nach Stimulation mit PMA.

Abbildung 3-5: Pulmonalarterieller Druck in p22^phox-überexprimierenden Mauslungen

Die Graphik zeigt den PAP [mm Hg] bei normoxischer Beatmung. SOD [150 U/ml] wurde zweimal gegeben (rote Pfeile). Die PMA-Gabe [10 µM Endkonzentration im Perfusat] erfolgte für beide Gruppen nach fünfminütigem Aussetzen der Probenentnahme zur Analyse mit ESR. p22^+/T = p22^phox-überexprimierend, SOD = Superoxiddismutase, PMA = Phorbol-Myristat-Acetat.

3.4.1.5 Chimäre Mäuse

Auch bei den chimären Mäusen wurde der basale pulmonalarterielle Druck unter normoxischen Bedingungen gemessen. Insgesamt wurden vier verschiedene Typen von Chimären hergestellt, von denen in diesem Kapitel allerdings nur zwei Gruppen behandelt werden: Zum einen die Wildtypen des Stammes C57Bl/6J, die Knochenmark aus gp91^phox -defizienten Mäusen erhalten haben (WT/gp91^-/-) und zum anderen Mäuse mit einer Deletion der gp91^phox-Untereinheit, welchen Knochenmark aus Wildtypmäusen (gp91^-/-/WT) transplantiert wurden. Die jeweiligen Kontrollen, also die Mäuse, die Knochenmark aus Spendertieren des gleichen Stammes erhielten, werden hier nicht dargestellt, da sich der PAP in diesen Tieren nicht von dem der betreffenden Tiere ohne Knochenmarkstransplantation unterschied.

a) WT/gp91

-/-Der gemittelte pulmonalarterielle Druck in den Wildtypen mit transplantiertem Knochenmark aus gp91^phox-defizienten Mäusen betrug 14,7 ± 1,4 mm Hg wenn die Perfusion ohne SOD-Zugabe (n = 4) stattfand. Wurde dem Perfusat SOD zugegeben, konnte keine Änderung des PAP registriert werden (14,7 ± 1,0 mm Hg; n = 5). Nach Stimulation von NADP(H)-Oxidasen durch PMA stieg der PAP bei Perfusion ohne SOD auf einen maximalen Wert von 20,6 ± 1,1 mm Hg. Dieser Wert unterschied sich nicht von dem maximalen PAP bei der Perfusion mit SOD, der unter diesen Bedingungen 21,9 ± 0,8 mm Hg betrug (Abbildung 3-6). Bei Betrachtung des Druckanstiegs pro Minute konnte ebenfalls kein Unterschied ermittelt werden. Bei Perfusion ohne SOD stieg der

Druck um 0,4 ± 0,04 mm Hg/min, wurde dem Perfusat SOD beigemischt, betrug der ΔPAP 0,3 ± 0,04 mm Hg/min.

Abbildung 3-6: Pulmonalarterieller Druck in Wildtyplungen mit gp91 -/-Granulozyten

Die Graphik zeigt den PAP [mm Hg] in Mäusen des Wildtyps, denen Knochenmark aus gp91^phox -defizienten Tieren transplantiert wurde, bei normoxischer Beatmung. SOD [150 U/ml] wurde zweimal gegeben (rote Pfeile). Die PMA-Gabe, in einer Endkonzentration im Perfusat von 10 µM resultierend, erfolgte für beide Gruppen nach fünfminütigem Aussetzen der Probenentnahme zur Analyse mit ESR. WT/gp91^-/- = Wildtyp Empfänger und gp91^-/- Spender, SOD = Superoxiddismutase, PMA = Phorbol-Myristat-Acetat.

b) gp91^-/-/WT

Der pulmonalarterielle Druck in den gp91^phox-Knock-Out Empfängertieren, die Knochenmark aus Wildtyp-Spendern bekamen, wurde während der Perfusion ohne SOD mit 13,6 ± 0,8 mm Hg registriert (n = 4). Nach Zugabe von Superoxiddismutase wurde ein leichter Anstieg des gemittelten PAP auf 15,3 ± 1,2 mm Hg gemessen (n = 4), allerdings war die Druckdifferenz zwischen den beiden Gruppen nicht signifikant (Abbildung 3-7). In den Lungen mit SOD im Perfusat wurde ein niedrigerer maximaler Druck nach Stimulation mit PMA (23,8 ± 1,5 mm Hg) ermittelt als in den Lungen ohne SOD (25,2 ± 1,0 mm Hg).

Der Druckanstieg pro Minute in den mit SOD perfundierten Lungen betrug 0,4 ± 0,1 mm Hg und in den Mauslungen ohne Superoxiddismutase im Perfusat 0,6 ± 0,1 mm Hg.

Abbildung 3-7: Pulmonalarterieller Druck in gp91^-/- Mauslungen mit Wildtyp-Granulozyten

Die Graphik zeigt den PAP [mm Hg] in gp91^phox-defizienten Mäusen nach Transplantation von Knochenmark aus Wildtypen bei normoxischer Beatmung. SOD [150 U/ml] wurde zweimal gegeben (rote Pfeile). Die PMA-Gabe [10 µM Endkonzentration im Perfusat] erfolgte für beide Gruppen nach fünfminütigem Aussetzen der Probenentnahme zur Analyse mit ESR. gp91^-/-/WT = gp91^-/- -Empfänger und Wildtyp-Spender, SOD = Superoxiddismutase, PMA = Phorbol-Myristat-Acetat.

3.4.1.6 Zusammenfassung

Um die Verhältnisse der gemessenen pulmonalarteriellen Drücke zu veranschaulichen, werden die Werte in Tabelle 3-5 nochmals zusammengefasst.

Tabelle 3-5: Übersicht der gemessenen Werte für den pulmonalarteriellen Druck

Die Tabelle zeigt die mittleren Werte für den PAP [mm Hg] ± SEM in den Lungen der untersuchten Mäusen mit und ohne SOD im Perfusat sowie vor und nach Stimulation von NADP(H)-Oxidasen mit PMA. gp91^-/- = Tiere mit gp91^phox-Defizienz; p47^-/- = Tiere mit p47^phox-Defizienz; p22^+/T = Mäuse, welche die p22^phox-Untereinheit von NADP(H)-Oxidasen überexprimieren; WT/gp91^-/- = Tiere des Wildtyps C57Bl/6J mit Knochenmark aus gp91^phox-defizienten Tieren; gp91^-/-/WT = Mäuse mit gp91^phox-Defizienz nach Transplantation von Knochenmark des Wildtyps. (^*0,01 ≤ p <

0,05 gegenüber PAP vor PMA-Gabe; ^#p < 0,005 vs. Perfusion ohne SOD)

C57Bl/6J gp91^-/- p47^-/- p22^+/T WT/gp91^-/- gp91^-/-/WT ohne SOD 11,6 ±0,6 12,7 ± 0,7 12,1 ± 0,6 10,6 ± 0,3 14,7 ± 1,4^* 13,6 ± 0,8^* ohne SOD,

nach PMA

24,2±1,9^* 22,8± ,8^* 21,0± ,7^* 23,4±3,4^* 20,6± 1,1^* 25,2±1,0^* mit SOD 12,9± 0,8 12,7 ± 0,9 12,6 ± 1,1 15,8±1,4^# 14,7 ± 1,0 15,3±1,2 mit SOD,

nach PMA 28,4±1,5^* 27,3±1,9^* 24,5±2,2^* 31,3±2,6^* 21,9±0,8^* 23,8±1,5^*

Nach Stimulation von NADP(H)-Oxidasen durch PMA stieg der pulmonalarterielle Druck in allen untersuchten Lungen signifikant an. Die nach der Stimulation maximal erreichten Druckwerte unterschieden sich nicht signifikant voneinander. Für die Gruppen, die mit SOD perfundiert wurden, zeigten die pulmonalarteriellen Drücke keine signifikanten Abweichungen unter Basisbedingungen.