Die alkalische Verseifung, das Lösen und das Aufreinigung der Fleischproben erfolgte mit einem Verfahren entsprechend der Amtlichen Sammlung für Untersuchungsmethoden nach §64 LFGB, 07.00/40. Zur Absicherung dieser Methode wurden geräucherte Fleisch-proben mehrfach aufgearbeitet (Bestimmung der Variation) und ebenso wie Lösungsmittel2- und Prozesskontrollen3 (Blanks) mittels GC-MS analysiert. Die Fleischproben wurden zwei parallel durchgeführten Aufarbeitungen unterzogen, da zu den Proben für die GC-MS-Analytik ein interner Standard mit deuterierten oder fluorierten PAKs zugefügt wurde. Dabei zeigte sich die Bedeutung eines hochreinen Lösungsmittel, des mehrfachen Spülens der Glasgefäße mit Lösungsmittel vor dem Einsatz und einer Belüftung des Rotationsverdampfers mittels gefilterter Raumluft. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse dieser Kontrolluntersuchungen nach Ergreifen der Korrekturmaßnahmen, die zu gut auswertbaren Chromatogrammen führten (siehe Abb. 1). Die Identifikation der PAKs erfolgte über die Molmasse und die Retentionszeit; eine nachträgliche Korrektur oder Hochrechung der Peakhöhe erfolgte nicht.
Tab. 1: Kontrolluntersuchungen mittels GC-MS zur Verifizierung der Analytik (Überprüfung der Probenauf- arbeitung und -aufreinigung) nach Ergreifen von Korrekturmaßnahmen*
PAK LOD
Phenanthren 0,029 0,086 11,93 139,17 23,83% 59,33% 116,00%
Anthracen 0,009 0,027 0,36 1,85 6,39% 2,84% 32,38%
Fluoranthen 0,013 0,038 1,22 16,92 30,91% 69,45% 99,85%
Pyren 0,049 0,147 0,55 5,87 19,79% 41,38% 75,09%
* PAKs aus der EFSA – Monitoringliste sind mit Sternchen markiert
2 in üblicherweise eingesetzten Mengen: Cyclohexan Eindampfung Ausschüttelung mit Dimethylformamid Lösen in Cyclohexan Aufreinigung mit Kieselgelsäule
3 vollständige alkalische Verseifung, Lösung und Aufreinigung ohne Einsatz einer Fleischprobe
PAK LOD
Abb. 1: beispielhaftes Chromatogramm einer Fleischprobe (Aufarbeitung Nr. 303, Fleischprobe 7D)
in dieser Abbildung verwendete Abkürzungen:
N: Naphthalin ACY: Acenaphthylen ACN: Acenapthen
F: Fluoren PHE: Phenanthren
A: Anthracen FLU: Fluoranthen PYR: Pyren
BghiF: Benzo[ghi]fluoranthen BcPHE: Benzo[c]phenanthren CYC: Cyclopenta[cd]pyren
TRI: Triphenylen CHR: Chrysen BbF: Benzo[b]Fluoranthen
BkF: Benzo[k]Fluoranthen BjF: Benzo[j]Fluoranthen
BeP: Benzo[e]pyren BaP: Benzo[a]pyren
PER: Perylen INF: Indeno[1,2,3-cd]fluoranthen
INP: Indeno[1,2,3-cd]pyren DBA: Dibenzo[a,h]anthracen BghiP: Benzo[ghi]perylen ANT: Anthranthen
Die statistische Sicherheit der Bioassay-Analysen ergab sich durch folgende Maßnahmen:
die Berechnungen wurden durchgeführt auf Basis einer Negativkontrolle in acht Vertiefungen der Zellkulturplatte, zur Hälfte in einer Position, die zu Beginn und zur Hälfte in einer Position, die am Ende des Messablaufes gemessen wurden
auf jeder Platte wurde eine Fleischprobe mit bekanntem Kontaminationsgrad aufgetragen und gemessen; die Ergebnisse der gesamten Platte wurden verworfen, wenn sich Abweichungen über der zweifachen Standardabweichung von dem durchschnittlich bekannten Ergebnis ergaben
die 3 pM und 10 pM Stufen der Standardreihe wurden über die Kurvenanpassung berechnet und die Ergebnisse der Platte verworfen, wenn sich Abweichungen über der dreifachen Standardabweichung von dem erwarteten Wert ergaben
in die Kalkulation wurden nur Kurven mit Anpassungen, die ein Bestimmtheitsmaß R² von 0,985 nicht unterschritten, miteinbezogen
Weiterhin wurden die Wiederfindungsraten im Bioassay mit B[k]F dotierten Proben ermittelt. Die Wiederfindungsrate der dotierten Proben, nach der Aufarbeitung, Aufreini-gung und Messung mittels CALUX-assay, betrug durchschnittlich 90,5% (siehe auch Veröffentlichung 1). Die Messung mittels GC/MS ergab eine Wiederfindungsrate von 80,4%. Zum Vergleich: Die Wiederfindungsrate des deuteriertem B[b]F (recovery) des eingesetzten internen Standards bei der Messung mittels GC/MS betrug durchschnittlich 83%. Tabelle 2 zeigt die Wiederfindungsraten der PAKs des internen Standards.
Tab. 2: durchschnittliche Wiederfindungsrate (recovery) der PAKs im internen Standard bei der GC-MS Analytik
d8-Naphthalin (leicht) 36,6 % d10-Pyren (leicht) 59,8 %
d8- Acenaphthylen (leicht) 42,9 % d12-B[a]A 74,8 % d10- Acenaphthene (leicht) 36,5 % d12-B[b]F 82,6 % 2- Fluorofluoren (leicht) 45,6 % d12-B[a]P 95,4 % d10-Phenanthren (leicht) 50,4 % d12- Benzo[ghi]perylen 96,1 %
d10-Fluoranthen (leicht) 61,2 %
Optimierung des CALUX-Assays
In Vorversuchen wurde der chemical-activated luciferase gene expression assay (CALUX-assay), der routinemäßig in Belgien und den Niederlanden für die Untersuchung auf Dioxine eingesetzt wird, für die Untersuchung auf PAK optimiert (siehe Veröffentlichung 1).
Die Berechnung der Ergebnisse erfolgte in Relation zu einer Standardsubstanz. Hier wurden testweise zwei Substanzen eingesetzt: Benzo[k]fluoranthen (B[k]F) und 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). Beide Substanzen erwiesen sich in der Analytik von PAKs in unbekannten Fleischproben als nutzbar. Die Induktionsäquivalente unbekannter Proben, gemessen mit B[k]F bzw. mit TCDD als Standardsubstanz, korrelierten miteinander mit einem Bestimmtheitsmaß von R² = 0,957.
Als optimale Inkubationsdauer der Proben auf den Zellen erwies sich ein Zeitraum von 6 Stunden. Außer PAKs binden auch Dioxine und Biphenyle am Aryl-Hydrocarbon-Rezeptor (AhR). Diese könnten zu einem falsch-positiven Ergebnis führen. VONDRACEK et al.
(2001) beschreiben, dass die PAK-induzierte Luciferasebildung nach sechs Stunden Inkubationszeit beginne abzunehmen und nach 24 Stunden nicht mehr nachweisbar sei.
Im Gegensatz dazu sei die Dioxin-induzierte Luciferasebildung auch noch nach 24 Stunden nachweisbar. Dies könnte man dazu nutzen, in Zweifelsfällen eine (falsch positive) Induktion der Zellen durch Dioxine auszuschließen. Um dies nachzuweisen, wurden 39 PAK-haltige Fleischproben zweimal getestet, nach sechs Stunden und nach 24 Stunden. Abbildung 2 zeigt, dass nach 24 Stunden fast keine Induktion der Zellen mehr möglich war. Lediglich die heiß geräucherten und eingekauften Proben wiesen eine leichte Induktion auf. Ein falsch positives Resultat der sechs Stunden Messung konnte bei diesen Proben daher ausgeschlossen werden.
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
roh 3 h kalt 6 h kalt 1 h heiß 3 h heiß Einkauf
TCDD-IEQ
6h 24h
Abb. 2: Induktionsäquivalente von 39 Proben aus 6 Gruppen unterschiedlicher Räuchertechniken, gemessen mit 6 h und 24 h Inkubationsdauer auf den Zellen
Zur Validierung des Bioassays wurden die Ergebnisse des CALUX-Assays und der GC-MS-Analytik für 42 Fleischproben miteinander verglichen. Die Ergebnisse des Bioassays wurden dann auf eine Korrelation mit einzelnen Gehalten an verschiedenen PAKs untersucht. Aufgrund einer geänderten Nachweistechnik (geändertes Pipetierverhalten) und der sich dadurch ergebende Unterschiede wurde dieser Vergleich in zwei Abschnitten durchgeführt (einmal im Winter 06/07 für 20 Proben und einmal im Winter 07/08 für 21 Proben) und die sich ergebenden Bestimmtheitsmaße gemittelt. Tabelle 3 zeigt die Korrelation der Gesamtwirkung der Fleischprobe am Rezeptor (Bioassay) zu dem Gehalt einzelner PAKs. Die PAKs, die die EFSA als besonders wichtig in der Analytik von Lebensmitteln bezeichnet, sind hervorgehoben (EUROPÄISCHE KOMMISSION 2007).
Tab. 3: Bestimmtheitsmaße R² von den Induktionsäquivalenten von 42 Fleischproben (CALUX-Assay, in zwei zeitlichen Abschnitten) und den Gehalten der Proben an 27 einzelnen PAKs (GC-MS) *
PAK R² (erster Abschnitt) R² (zweiter Abschnitt) R² (gemittelt)
* B[a]A 0,874 0,875 0,874
Benzo[e]pyren 0,897 0,802 0,850
* B[b]F 0,879 0,816 0,848
* Summe B[b+k+j]F 0,861 0,792 0,827
Benzo[c]phenanthren 0,785 0,841 0,813
* B[a]P 0,845 0,776 0,811
* Benzo[c]fluoren 0,846 0,772 0,809
* Chrysen 0,732 0,866 0,799
Anthracen 0,712 0,886 0,799
Benzo[ghi]fluoranthen 0,776 0,801 0,789
Perylen 0,830 0,716 0,773
* B[j]F 0,735 0,809 0,772
Pyren 0,704 0,796 0,750
Fluoren 0,666 0,799 0,732
* Benzo[ghi]perylen 0,789 0,666 0,727
* Indeno[1,2,3-cd]pyren 0,802 0,623 0,713
* DBA 0,838 0,520 0,679
* PAKs aus der EFSA – Monitoringliste sind mit Sternchen markiert
PAK R² (erster Abschnitt) R² (zweiter Abschnitt) R² (gemittelt)
* Cyclopenta[cd]pyren 0,676 0,577 0,626
Coronen 0,696 0,541 0,618
* 5-Methylchrysen 0,601 0,601 0,601
Anthanthren 0,661 0,515 0,588
Fluoranthen 0,450 0,695 0,573
Acenaphthylen 0,319 0,807 0,563
* B[k]F 0,459 0,614 0,537
Phenanthren 0,320 0,665 0,492
Triphenylen 0,583 0,358 0,471
Acenaphthen 0,184 0,571 0,377
Naphthalin 0,011 0,303 0,157
Die Abbildungen 3a und 3b zeigen beispielhaft die Korrelation von B[a]P mit der Gesamtantwort des CALUX-Assays.
R2 = 0.85
0 100 200 300 400 500 600 700
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
B[a]P (µg/kg)
TCDD IEQ (ng/kg)
800
Abb. 3a: Korrelation der Induktionsäquivalente (IEQ) von 20 Fleischproben (CALUX-Assay) und deren Gehalt an B[a]P (Winter 2006/07)
R2 = 0,78
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
B[a]P (µg/kg)
TCDD IEQ (ng/kg)
Abb. 3b: Korrelation der Induktionsäquivalente (IEQ) von 21 Fleischproben (CALUX-Assay) und deren Gehalt an B[a]P (Winter 2007/08)
Zur weiteren Validierung des Bioassays wurde mit Hilfe von Induktionsfaktoren einzelner PAKs die „theoretische“ Induktion der Zellen berechnet und diese mit der tatsächlich ge-messenen Induktion verglichen. Die verwendeten Induktionsfaktoren wurden von MACHALA (2001) publiziert und mit demselben Bioassay und derselben Standardsubstanz (2, 3, 7, 8 - TCDD) erstellt. Zum einen publizierte MACHALA (2001) Induktionsfaktoren unter Verwendung des EC25, zum anderen unter Verwendung des EC50. Daher erfolgte ein Vergleich der Induktionsäquivalente der Fleischproben mit beiden Arten von Faktoren. Abbildung 4a und 4b zeigen den Vergleich der Induktionsäquivalente, die aus den GC-MS-Ergebnissen und den Induktionsfaktoren errechnet bzw. mittels Bioassay gemessen wurden. Aufgrund der oben beschriebenen Unterschiede der Ergebnisse in den beiden Analysezeiträumen wurde eine nach Analysezeiträumen getrennte Darstellung vorgenommen. Bei diesen Vergleichen betrug das Bestimmtheitsmaß 0,86 bzw. 0,79 (Verwendung der auf EC25 basierenden Induktionsfaktoren) und 0,84 bzw. 0,74 (Verwendung der auf EC50 basierenden Faktoren).
0
200
400
600
8001000
1200
1400 6A6D6E4D4E4F5D5E8A8B7A7B7G9101112A12B13A113B roh3 h kalt geräuchert6 h kalt geräuchert20 min heiß geräuchert1 h heiß geräucherteingekaufte Probenmehrmals geräuchert Probennummer
IEQ in ng/k g
errechnete IEQs (EC25 basiert) errechnete IEQs (EC50 basiert) gemessene IEQs Abb. 4a: Vergleich der gemessenen Induktionsäquivalente von 20 Fleischproben mit den „theoretischen“ Induktionsäquivalenten, die auf Grundlageder GC-MS-Ergebnisse und von Machala 2001 publizierten Induktionsfaktoren berechnet wurden (Analysezeitraum Winter 06/07)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400 16A16B14A14B14E 14F15A15B15C7D17A17B17C18A118A218B19202122 roh3 h kalt geräuchert6 h kalt geräuchert1 h heiß geräuchert3 h heiß geräucherteingekaufte Proben Probennummer
IEQ in ng/kg
errechnete IEQs (EC25 basiert) errechnete IEQs (EC50 basiert) gemessene IEQs Abb. 4b: Vergleich der gemessenen Induktionsäquivalente von 20 Fleischproben mit den „theoretischen“ Induktionsäquivalenten, die auf Grundlageder GC-MS-Ergebnisse und von Machala 2001 publizierten Induktionsfaktoren berechnet wurden (Analysezeitraum Winter 07/08)
Praktische Anwendung des CALUX-Assays
Um eine praktische Anwendung wirkungsorientierter Analytik mittels CALUX-Assay zu ermöglichen, wurden 30 unterschiedlich geräucherte Bauchspeckproben hergestellt und untersucht (siehe Veröffentlichung 2). Neben der wirkungsorientierten Analytik wurde einmalig der Gehalt 31 PAKs in den Fleischproben mittels GC-MS bestimmt, darunter die 16 PAKs, die von der EFSA als besonders wichtig für die Untersuchung von Lebensmitteln benannt wurden. Tabelle 4 zeigt einen Überblick der Untersuchungsergebnisse.
Tab. 4: Bestimmung der TCDD - Induktionsäquivalente (IEQ) im CALUX-Assay und der Gehalte der 16
„EFSA - priority“ PAKs (GC-MS) in 30 Bauchspeckproben, eingeteilt nach ihrer Räuchertemperatur roh, ungeräuchert
(n = 5)
kalt geräuchert (3 - 6h); (n = 13)
heiß geräuchert (1 - 3h); (n = 12) TCDD-IEQ (ng/kg) 28,3 ± 14,3 246,5 ± 108,3 625,3 ± 346,2 Benzo[c]fluoren (µg/kg) 0,04 0,18 0,77
B[a]A (µg/kg) 0,19 0,53 1,31
Cyclopenta[cd]pyren (µg/kg) < LOQ 0,14 0,95 Chrysen (µg/kg) 0,49 0,47 1,18 5-Methylchrysen (µg/kg) < LOQ 0,02 0,07
B[b]F (µg/kg) 0,07 0,18 0,39
B[k]F (µg/kg) 0,03 0,13 0,20
B[j]F (µg/kg) 0,06 0,11 0,25
B[a]P (µg/kg) 0,03 0,19 0,43
Indeno[1,2,3-cd]pyren (µg/kg) 0,02 0,11 0,17 DBA (µg/kg) < LOQ 0,02 0,05 Benzo[ghi]perylen (µg/kg) 0,02 0,08 0,19 Dibenzo[a,e]pyren (µg/kg) < LOQ < LOQ 0,01 Dibenzo[a,h]pyren (µg/kg) < LOQ < LOQ 0,01 Dibenzo[a,i]pyren (µg/kg) < LOQ < LOQ 0,01 Dibenzo[a,l]pyren (µg/kg) < LOQ < LOQ 0,02 Summe der 16 EFSA-PAKs (µg/kg) 0,8 2,2 5,8 Summe aller 31 PAKs (µg/kg) 162,3 473,2 759,6
Die Induktionsäquivalente unterschieden sich signifikant (p < 0,01) zwischen den drei Gruppen (roh, kalt geräuchert, heiß geräuchert). Die Gehalte der 16 PAKs von der EFSA-Liste unterschieden sich ebenfalls signifikant (p < 0,05) zwischen diesen Gruppen, mit den Ausnahmen Chrysen und 5-Methylchrysen. Hier bestanden lediglich zwischen ungeräucherten und heiß geräucherten Proben signifikante Unterschiede (p < 0,05), nicht zwischen den kalt und den heiß geräucherten Proben.
Neben den 16 EFSA – PAKs wurde auch das Verhalten von 15 weiteren PAKs im Hinblick auf eine Kumulation durch den Räucherprozess untersucht. Dieses sind PAKs, die von der US Environmental Protection Agency (EPA) als bedeutsam in der Umweltanalytik angesehen werden oder von der WHO als zusätzlich bedeutsam eingestuft werden (WHO 1998, 2005). Hierunter fallen auch so genannte leichte PAKs, deren chemische Struktur maximal vier Ringe beinhaltet. Von diesen 15 weiteren PAKs zeigten Naphthalin, Acenaphthen, Phenanthren, Fluoranthen, Pyren, Benzo[ghi]fluoranthen, Benzo[c]phenanthren, Triphenylen und Coronen eine hohe Variabilität in den Untersuchungen (siehe auch Tab.1). Das Vorkommen von Acenaphtylen, Fluoren, Anthracen, Benzo[e]pyren, Perylen und Anthranthen lässt Zusammenhänge zur Räucherintensität erkennen und signifikante Unterschiede (p < 0,05) sind messbar.
Entsprechen dazu waren die Wiederfindungsraten der leichten PAKs im internen Standard (recovery) in der GC-MS-Analytik dementsprechend niedriger (siehe auch Tab. 2).
Die geräucherten Fleischproben können weiter aufgegliedert werden in Bezug auf die Länge des Räuchervorganges. Tabelle 5 zeigt die Mittelwerte der Induktionsäquivalente, des Gehaltes an B[a]P und der Summe aller 16 EFSA - PAKs von fünf Kategorien unterschiedlich geräucherter Bauchspeckproben.
Tab. 5: Mittelwerte der TCDD - Induktionsäquivalente (IEQ) von 26 unterschiedlich geräucherten Fleisch proben (Bauchspeck), des Gehaltes an Benzo[a]pyren (B[a]P) und die Summe der 16 EFSA - PAKs
TCDD-IEQ (ng / kg) B[a]P (µg / kg) 16 EFSA - PAKs (µg / kg)
roh, ungeräuchert; (n = 5) 28,3a ± 14,3 0,03a ± 0,01 0,75a ± 0,65 kalt geräuchert, 3 h; (n = 6) 220,5b ± 109,5 0,17b ± 0,07 2,30b ± 1,04 kalt geräuchert, 6 h; (n = 5) 281,9b ± 128,9 0,20b ± 0,08 2,24b ± 0,89 heiß geräuchert, 1 h; (n = 7) 475,6c ± 138,9 0,39c ± 0,19 4,64c ± 1,86 heiß geräuchert, 3 h; (n = 3) 1092,9 ± 400,3 0,53 ± 0,23 9,86 ± 4,35 Signifikante Unterschiede (p < 0,05) sind durch unterschiedliche Kleinbuchstaben gekennzeichnet
Signifikante Unterschiede (p < 0,05) bestanden, außer zwischen den rohen Proben und allen geräucherten Proben, zwischen den Proben, die eine Stunde lang heiß geräuchert worden waren und beiden Gruppen kalt geräucherter Proben. Zwischen den beiden Gruppen kalt geräucherter Produkte war kein signifikanter Unterschied (p > 0,05) feststellbar. Es ist unüblich, Bauchspeck drei Stunden lang heiß zu räuchern. Diese Technik wurde daher nur einmalig mit drei Proben zur Erzeugung einer hohen Kontamination eingesetzt. Aus diesem Grund waren hier – obwohl zu vermuten - keine signifikanten Unterschiede nachweisbar.
Die Bauchspeckproben wurden an zwei unterschiedlichen Stellen gezogen. Zum einen die Randregion des Bauches, an dem das Untersuchungsgut von allen Seiten von Rauch erreicht wurde. Auf der anderen Seite wurden Proben aus der Mitte des Bauchspeckes gezogen, mit einem Mindestabstand von fünf Zentimetern zum Rand. Hier konnte der Rauch nur von oben und von unten einwirken, nicht von der Seite. Die Induktionsäquivalente der ungeräucherten Proben zeigten keinen signifikanten Unterschied (p = 0,6) zwischen den Probenlokalisationen. Mit zunehmendem Räuchergrad zeigten sich zunehmende Unterschiede. Die Proben, die eine Stunde heiß geräuchert waren, zeigten signifikante Unterschiede (p < 0,01). Bei den Proben, die drei Stunden lang
heiß geräuchert waren, sind deutlich unterschiedliche Induktionen messbar; Signifikanzen lassen sich aber aufgrund der oben erläuterten geringe Probenanzahl nicht errechnen. Die Summe der 16 EFSA – PAKs zeigt ebenfalls Unterschiede, allerdings fallen diese geringer aus als bei den Induktionsäquivalenten und erreichen nicht Signifikanzniveau.
0
Abb. 5: Induktionsäquivalente und Summe der 16 EFSA – PAKs von 26 Bauchspeckproben, im Vergleich der Probenlokalisationen: die linken Balken zeigen die Proben, die aus der Mitte entnommen wurden, die rechten Balken zeigen die Proben aus dem Randgebiet des Bauchspeckes
Um die selbst hergestellten Bauchspeckproben mit handelsüblichen Produkten vergleichen zu können, wurden im Großhandel und auf dem Wochenmarkt entsprechende Bauchspeckproben eingekauft. Abbildung 6 vergleicht die gemessenen Induktions-äquivalente dieser Proben mit der Summe der nachgewiesenen Einzelgehalte der 16 EFSA – PAKs. Das Bestimmtheitsmaß R² zwischen diesen Ergebnissen beträgt 0,79.
0 1 2 3 4 5 6 7 8
A B C D E F G H
aus Großhandel vom Wochenmarkt
Summe EFSA-PAK (µg/kg)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
TCDD-IEQ (ng/kg)
Abb. 6: Induktionsäquivalente und Summe der 16 EFSA – PAKs von acht im Großhandel bzw. auf dem Wochenmarkt bezogene Bauchspeckproben
Im Mittel enthielten die eingekauften Proben 0,22 µg B[a]P / kg, mit einer Spannweite von 0,02 bis 0,45 µg / kg. Auffällig war Probe D. Diese hatte keinen schwächeren Räucher-geschmack, löste aber eine signifikant geringe (p < 0,01) Induktion der Zellen aus und enthielt 0,05 µg B[a]P / kg (0,02 µg / kg in der Mitte; 0,08 µg / kg am Rand).