Die Zelllinien RAW 264.7, SP2/0 und CHO wurden in RPMI Medium 1640 mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) bei 37°C, 5% Kohlendioxidgehalt und 95% relativer Luftfeuchtigkeit in einem Inkubator kultiviert. HEK 293, HEK 293T und RAW 264.7 (für den Transwellassay) wurden in DMEM-Medium mit 10% FCS bei 37°C und 10% Kohlendioxidgehalt kultiviert.
Die Kultivierung von COS-7 Zellen erfolgte in DMEM-Medium, in Gegenwart von 1,0 g/l D-Glukose, 3,7 g/l NaHCO3, 1,0289 g/l N-Acetyl-L-Alanyl-L-Glutamin und 5% FCS bei 37°C und 10% Kohlendioxidgehalt. Schneider S2 (S2) Zellen wurden in Insect Xpress Medium mit 10% FCS bei 21°C ohne CO2 kultiviert. Zur Selektionierung stabiler S2 Transfektanden wurde dem Medium 300 µg/ml Hygromycin zugesetzt.
Zur Expression von Fusionsproteinen mit anschließender Reinigung über Affinitätschromatographie oder Größenausschlusschromatographie wurde den Medien kein FCS zugesetzt.
3.3.2 Zellzahl- und Vitalitätsbestimmung
Die Zellzahl und die Vitalität der Zellen wurden mikroskopisch mit Hilfe des Trypanblau-Ausschlusstests bestimmt. Dazu wurde aus der Zellsuspension ein Aliquot entnommen und mit gleichem Volumen Trypanblaulösung verdünnt. Anschließend wurden in einer
Neubauer-Zählkammer die lebenden (nicht gefärbten) und toten (blau gefärbten) Zellen innerhalb eines Großquadrates (= 16 Kleinquadrate) unter dem Phasenkontrast-Mikroskop ausgezählt.
Berechnung der Zellzahl: z [Zellen/ml] = Z x V x 104
Z = Zahl der ungefärbten Zellen in einem Großquadrat (1 mm2);
V = Verdünnungsfaktor
3.3.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen
Zellen wurden vor Erreichen der Konfluenz geerntet und in 1 ml eiskaltem Einfriermedium suspendiert. Die Zellen wurden in Kryoröhrchen überführt und in Styroporbehältern für 24 h bei -70°C gelagert. Die dauerhafte Lagerung der Zellen
erfolgte in Flüssigstickstoff. Zum Auftauen wurden die Zellen direkt aus dem Stickstoff in ein 37°C warmes Wasserbad überführt und sofort nach dem Auftauen in warmes, serumhaltiges Medium aufgenommen. Nach Absinken der Zellen wurde das Medium gewechselt.
Einfriermedium für alle Säugerzelllinien: 50% RPMI 1640, 40% FCS, 10% DMSO (Dimethylsulfoxid)
Einfriermedium für S2 Zellen: 70% Insect Express, 20% FCS, 10% DMSO
3.3.4 Stimulationsexperimente mit TLR Liganden in RAW 264.7
RAW 264.7 wurden mit einer Dichte von 106 Zellen/ml in 96-Loch Platten ausgesät und mit den angegebenen Fusionsproteinen kultiviert. Nach 30 min wurden die Zellen mit verschiedenen TLR Aktivatoren (Pam3Cys, LTA oder LPS aus Salmonella abortus equi S-Form in verschiedenen Konzentrationen) 12 h in einem Volumen von 100 µl stimuliert.
Anschließend wurde das proinflammatorische Zytokin IL-6 im Überstand per ELISA gemessen.
3.3.4.1 Transwellassay
Um die Aktivität der LPS-Trap zu überprüfen, wurden LPS-Trap transfizierte HEK 293T Zellen in eine 24-Loch Platte mit einer Dichte von 5x105 Zellen/ml ausgesät. Nach
12 h wurde ein mit RAW 264.7 beladenes Transwell (8x104 Zellen/ml) eingesetzt und 8 h mit den transfizierten HEK 293 kokultiviert. Die Zellen wurden dann mit den angegebenen LPS-Konzentrationen über Nacht stimuliert (Gesamtvolumen 800 µl). Anschließend wurde TNF im Überstand per ELISA gemessen.
3.3.5 Transfektionen
3.3.5.1 Calciumphosphattransfektion
Um HEK 293, CHO, oder COS-7 Zellen transient mit Plasmid-DNA zu transfizieren, wurde die Methode der Calciumphosphatpräzipitation verwendet. Das Prinzip basiert darauf, dass eine Mischung aus DNA, Calcium und Phosphatpuffer einen feinkörnigen Niederschlag aus Calciumphosphat und DNA bildet. Dieses Präzipitat wird auf die Zellen pipettiert, welche diese Kristalle dann per Endozytose aufnehmen.
3x106 Zellen wurden in einer 100-mm2 -Schale in 5 ml Medium ausgesät und 24 h kultiviert.
Zu Beginn der Transfektion wurde das Medium gewechselt und mit der Herstellung des Präzipitates begonnen. Zu diesem Zweck wurden 500 µl CaCl2-DNA-Lösung (10 µg DNA in 500 µl 0,5 M CaCl2) mit 500 µl 2 x HBS gemischt und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert, bis sich ein feines Präzipitat bildete. Das Calciumphosphat-DNA-Gemisch wurde dann tropfenweise gut verteilt auf die Schalen mit den Zellen pipettiert und für 6 h in einen Brutschrank gestellt. Anschließend wurde zweimal mit PBS gewaschen und frisches Medium zugegeben.
Falls die Expressionsversuche zur Gewinnung von rekombinanten Proteinen mit anschließender Affinitätschromatographie oder zur Konzentrierung von Überständen per Größenausschlusschromatographie dienten, wurden die Zellen nach dem Mediumwechsel ohne FCS kultiviert. Nach 48 h wurden die Überstände analysiert, um eine transiente Proteinexpression nachzuweisen.
3.3.5.2 Transfektionen mit kationischen Liposomen
Das Prinzip der sog. Lipofektion beruht auf einer Ultraschallbehandlung eines Lipides oder Lipidgemisches in wässriger Lösung, bei der sich Liposomen bilden. Dieses Reagenz (Fugene 6) wird mit Zellkulturmedium und mit der DNA vermischt. Üblicherweise wurde ein Ansatz von 3:1 (Fugene Reagenz: DNA) in 500 µl gewählt, gut gemischt und für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Fugene-DNA Komplexe zu 3x106 S2 Zellen/ml in einer 25 cm2 Zellkulturflasche gegeben. Die Zellen wurden am nächsten Tag mit 500 µM CuSO4 stimuliert und 3 Tage kultiviert bevor die Proteinexpression analysiert wurde.
In dieser Zeit fusionieren die Liposomen-DNA-Komplexe mit der Zellmembran und die DNA gelangt in den Zellkern (Mechanismus unbekannt).
3.3.5.2.1 Stabile Transfektion in S2 Zellen
Zur Herstellung stabiler S2 Transfektanden wurden S2 Zellen mit dem Expressionsplasmid und einem Vektor, der eine Hygromycin Resistenz enthielt, (pCoHygro) im Verhältnis 20:1 kotransfiziert. Für die Transfektion unter 4.1.3.5.3 wurde mit einem Verhältnis von 50:1 (LPS-Trap in pMT: pCoHygro) kotransfiziert. Das weitere Verfahren ist gleich der oben beschriebenen Methode zur transienten Transfektion von S2 Zellen. Die Zellen wurden anschließend über 4 Wochen in Medium mit 300 µg/ml Hygromycin kultiviert. Nach der Selektionsphase wurden die Zellen bis zu einer Mindestdichte von 6x106 Zellen pro ml expandiert, mit CuSO4 stimuliert (500 µm) und die Proteinexpression nach 5 Tagen analysiert.
3.3.5.2.2 Transfektion mit jetPEI
Die Methode der Lipofektion mit jetPEI wurde für die Zelllinien SF-21 und HEK 293T (die im Transwell-Experiment eingesetzt wurden) benutzt.
Das Vorgehen ist ähnlich dem der Transfektion mit Fugene 6. Die Zellen wurden zu 3x106 pro 100-mm2 Zellkulturschale ausgesät und mit 10 µg DNA nach den Anweisungen des Herstellers transfiziert.