und gesunden Kontrollen
Mit den folgenden Experimenten sollten physiologische und pathologische Veränderungen der TLR Dichte auf Zellen des peripheren Blutes bei Patienten mit Sepsis und gesunden Probanden beschrieben werden.
Außerdem sollten Veränderungen der TLR Dichte auf Monozyten in Gesamtblutkulturen nach in vitro Exposition mit LPS untersucht werden. Diese Experimente sollen der Etablierung eines humanen Modellsystems zur in vitro Simulation der bei Patienten mit Sepsis in vivo beobachteten Veränderungen dienen. Weiter sollte überprüft werden, ob ein Zusammenhang zwischen den Veränderungen der TLR Dichte und dem Schweregrad bzw.
der Mortalität der Sepsis existiert. Vorarbeiten aus der Arbeitsgruppe Infektiologie konnten eine erhöhte TLR2- und TLR4- mRNA Konzentration in mononukleären Zellen des peripheren Blutes unter den Bedingungen der Sepsis zeigen. Nun sollte untersucht werden, ob tatsächlich eine erhöhte Antigen-Dichte von TLR2 und TLR4 auf der Zelloberfläche von Monozyten und Granulozyten bei Patienten mit Sepsis vorliegt.
4.3.1 Etablierung eine Protokolls für die Durchflusszytometrie
Zunächst sollte ein Protokoll für die Durchflusszytometrie etabliert werden, um die Dichte von TLR2 und TLR4 auf der Oberfläche von Monozyten und Granulozyten im Vollblut zu quantifizieren und um Variationen der TLR-Dichte unter dem in vitro Einfluss von LPS zu bestimmen. Gesamtblut von Patienten mit Sepsis oder von Normalpersonen wurden mit 40 ng/ml LPS (aus Salmonella minnesota) bzw. 0,9% NaCl inkubiert und anschließend in PBS gewaschen. Monozyten und Granulozyten wurden mit APC-gekoppelten anti–CD14-Antikörpern markiert und im Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht identifiziert. Die Oberflächenverteilung von TLR2 wurde mit einem monoklonalen anti-humanen TLR2 Antikörper (Klon TL2.1) ermittelt, der mit einem sekundären PE-gekoppelten Antikörper gefärbt wurde. Die Oberflächenverteilung von TLR4 wurde mit einem PE-gekoppelten anti-humanen TLR4 Antikörper (Klon HTA 125) untersucht. Mittels Durchflusszytometrie konnte die Dichte von TLR2, TLR4 und CD14 auf der Monozyten- und Granulozytenoberfläche quantifiziert werden.
Bevor ein definiertes Patientenkollektiv untersucht wurde, sollten Titrationsversuche durchgeführt werden, um die optimale Konzentration der Antikörper für den Nachweis der TLRs auf der Monozyten-Oberfläche zu bestimmen (Abb. 4.40). Die so ermittelten Antikörper
Konzentrationen (TL2.1: 5 µg/ml und HTA 125: 20 µg/ml) wurden in den folgenden
TLR2 Kontrolle + 40 ng/ml LPS TLR2 Sepsis
TLR2 Sepsis + 40 ng/ml LPS
Abb. 4.40: Titrationsversuche mit anti-humanen TLR2 und TLR4 Antikörper. Blut von Normalpersonen (Kontrolle) bzw. von Patienten mit Sepsis (Sepsis) wurde mit 40 ng/ml LPS (aus Salmonella minnesota) bzw. mit 0,9% NaCl inkubiert. Die Oberflächedichte von TLR2, TLR4 und CD14 wurde mittels Durchflusszytometrie quantifiziert. Die Fluoreszenzen FL2 (rot) der PE-gekoppelten TLR-Antikörper und FL4 (orange) des APC-PE-gekoppelten anti–CD14-Antikörper wurden simultan im Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht analysiert. Die Bestimmungen wurden mit verschiedenen Antikörperkonzentrationen von Klon TL2.1 gegen humanes TLR2 und Klon HTA 125 gegen humanes TLR4 durchgeführt, um die optimalen Konzentrationen kurz vor Erreichen der Sättigungsgrenze zu bestimmen.
4.3.2 Patientenkollektiv
23 Patienten von verschiedenen Intensivstationen des Klinikums der Universität Regensburg (Innere Medizin, Chirurgie, Anästhesie), bei denen entsprechend der ACCP/SSCM Konsensus-Definition eine Sepsis diagnostiziert wurde, wurden innerhalb von 48 h nachdem die Sepsiskriterien erfüllt waren, untersucht. 12 gesunde freiwillige Probanden wurden als Kontrollen rekrutiert. Die Patienten wurden entsprechend des Keimnachweises aus den entnommenen Proben in folgende Gruppen unterteilt: Gram-positive (n=4), Gram-negative (n=7), polymikrobielle (n=8) oder Kultur-negative Infektion (n=3). Das mediane Alter der Patienten war 65,5 Jahre (27-85); der mediane simplified acute physiology score (SAPS) II betrug 22 (12-44).
4.3.3 Untersuchungen der Dichte von TLR2 auf Monozyten und Granulozyten
Zunächst wurde die basale Expression von TLR2 auf Monozyten und Granulozyten von Patienten mit Sepsis und gesunden Kontrollprobanden untersucht. Weder für die eine noch
Konzentration HTA125 (µg/ml)
TLR4 Kontrolle + 40 ng/ml LPS TLR4 Sepsis
TLR4 Sepsis + 40 ng/ml LPS
für die andere Zellpopulation zeigte sich ein signifikanter Unterschied. Auch nach in vitro Stimulation mit 40 ng/ml LPS änderte sich die Dichte von TLR2 auf der Oberfläche von Monozyten und Granulozyten nicht. Demnach ergab sich auch kein Unterschied zwischen dem Stimulationsindex (dem Quotienten aus TLR Oberflächendichte nach LPS Stimulation und TLR Oberflächendichte ohne Stimulation) bei Patienten mit Sepsis und gesunden Kontrollen.
Die TLR2 Expression auf Monozyten und Granulozyten septischer Patienten zeigte also keinen signifikanten Unterschied im Vergleich mit der Kontrollgruppe (Daten nicht gezeigt).
4.3.4 Untersuchungen der Dichte von TLR4 auf Monozyten und Granulozyten
Auf den Monozyten septischer Patienten zeigte sich bereits vor Stimulation mit LPS eine signifikant erhöhte TLR4 Expression im Vergleich mit der Kontrollgruppe (p=0,001) (Abb.
4.41A). Dieser Unterschied mit der Kontrollgruppe war signifikant für alle Subgruppen der septischen Patienten, allerdings ließ sich in der Subgruppenanalyse innerhalb der Sepsisgruppe kein signifikanter Unterschied für die Basisstimulation feststellen (p=0,1) (Abb.
4.41B). Der Stimulationsindex für TLR4 auf Monozyten war signifikant höher in der Kontrollgruppe verglichen mit allen Subgruppen in der Patientengruppe (p<0.001 für alle Patienten, p<0.05 für Patienten mit Gram-positiver Sepsis und p<0.01 für alle anderen Subgruppen) (Abb. 4.41C). Vorausgesetzt, dass das Kollektiv der septischen Patienten im Rahmen der Bakteriämie einem in vivo LPS Stimulus ausgesetzt war, zeigen die Daten eine direkte Korrelation der TLR4 Expression auf Monozyten und LPS Stimulation in vivo und in vitro.
Auf den Granulozyten hingegen war die TLR4 Expression signifikant höher in der Kontrollgruppe als bei den Septikern (p=0.02), allerdings zeigte sich hier in der Subgruppenanalyse nur ein Unterschied zwischen Kontrollen und Patienten mit Gram-positiver Sepsis (p=0.006) (Abb. 4.41D). Außerdem zeigten Granulozyten beider Gruppen keine Zunahme von TLR4 nach Stimulation mit LPS.
Abb. 4.41: Untersuchung der TLR4 Expression auf Monozyten und Granulozyten von Patienten mit Sepsis und von gesunden Probanden mittels Durchflusszytometrie. Monozyten und Granulozyten wurden mit APC-konjugiertem anti–CD14-Antikörper und im Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht identifiziert, die TLR4 Expression wurde mit einem PE- konjugiertem anti-humanem TLR4 Antikörper bestimmt.
(A): TLR4 Expression auf Monozyten von Patienten mit Sepsis (S) und von gesunden Probanden (K).
(B): TLR4 Expression auf Monozyten von gesunden Probanden (K) und von Patienten mit einer Gram-negativen (G-), Gram-positiven (G+), polymikrobiellen (P) oder Kultur-negativen (KN) Sepsis.
(C): Nach ex vivo Stimulation mit 40 ng/ml LPS bzw. 0,9% NaCl wurde der TLR4 Stimulationsindex bei gesunden Probanden (K), Patienten mit einer Gram-negativen (G-), Gram-positiven (G+), polymikrobiellen (P) oder Kultur-negativen (KN) Sepsis bestimmt. TLR4 Stimulationsindex: Quotient aus TLR4 Oberflächendichte nach LPS Stimulation und TLR4 Oberflächendichte nach Stimulation mit 0,9% NaCl (ohne Stimulation).
(D): TLR4 Expression auf Granulozyten von gesunden Probanden (K) und Patienten mit einer Gram-negativen (G-), Gram-positiven (G+), polymikrobiellen (P) oder Kultur-Gram-negativen (KN) Sepsis.
Granulozyten wurden im Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht analysiert.
Es fand sich keine Korrelation der TLR4 Expression mit der Schwere der Sepsis oder der Letalität.