Zellbiologische Methoden

3.3.1 Kultivierung von Zellen

Die Zellen wurden in 5 %-iger CO2-Atmosphäre und 85 % Luftfeuchtigkeit kultiviert.

Medien und Lösungen wurden auf 37 °C vorgewärmt, wenn nicht anders angegeben.

Die verwendeten Zellinien HeLa, MCF7, HepG2 wurden in DMEM, 10 % FKS, 1x Penicillin/Streptomycin kultiviert; die Zellinie BHK wurde in DMEM, 5 % FKS, 1x Penicillin/Streptomycin kultiviert.

3.3.2 Trypsinieren von Zellen

Trypsin-EDTA-Lösung: 0,05 % (w/v) Trypsin

0,02 % (w/v) EDTA in modifizierter Puck`s Salzlösung Der Zellrasen wurde mit PBS gespült, um Trypsininhibitoren des FKS zu entfernen. Nach dem Absaugen des PBS wurden die Zellen ca. 5 min mit Trypsin/EDTA bei 37 °C inkubiert. Das Ablösen der Zellen wurde im inversen Mikroskop kontrolliert. Die Trypsin-Reaktion wurde durch Zugabe von serumhaltigem Medium gestoppt, die Zellen durch mehrfaches Aufsaugen mit der Pipette vereinzelt und gegebenenfalls die Zellzahl pro Milliliter mit der Neubauer-Zählkammer bestimmt. Die Zellen wurden in der gewünschten Dichte ausgesät.

3.3.3 Gefrierkonservierung und Revitalisierung von Zellen

Zur Konservierung wurden konfluent wachsende Zellen, z. B. eine 25 cm²-Flasche trypsiniert, in Medium aufgenommen und für 5 min bei 1.000 x g in der Labofuge sedimentiert. Nach Absaugen des Überstandes wurden die Zellen in 3 ml Einfriermedium aufgenommen und auf drei Einfrierröhrchen verteilt. Die Zellen wurden zunächst bei -80°C ü. N. eingefroren und anschließend in flüssigem Stickstoff gelagert.

Zur Revitalisierung wurde das Einfrierröhrchen aus dem Stickstofftank genommen, zunächst für ca. 1 min bei RT angewärmt und anschließend im Ethanolbad bei 37 °C aufgetaut, bis nur noch ein kleiner Eiskern zu sehen war. Die Zellsuspension wurde entnommen, in 3,5 ml kaltes Medium (4 °C) überführt und in der Labofuge 5 min bei 1.000 x g sedimentiert. Der Überstand wurde abgesaugt, das Zellpellet in 5 ml Medium ohne

Selektionsantibiotika resuspendiert und in eine Zellkulturflasche überführt. Am nächsten Tag wurde das Medium gewechselt, um DMSO-Reste, tote Zellen und Zelltrümmer zu entfernen sowie gegebenenfalls Selektionsantibiotika einzuführen.

3.3.4 Transfektion von Zellinien

Lösungen: 2,5 M CaCl2

HBS (2 fach) 50 mM HEPES, pH 7,13

1,5 mM Na2HPO4

0,28 M NaCl

Glyzerin-Schock: 15 % Glyzerin (w/v) in 1 fach HBS Stabile Transfektionen wurden nach der Calcium-Phosphat-Methode (Chen & Okayama, 1987) durchgeführt.

Die Zellen wurden am Vortag in einer Dichte von 2 x 10⁵ Zellen auf einer 60 mm Gewebe-schale ausgesät. Vier Stunden vor Zugabe der DNA wurde das Medium gewechselt. Zur Herstellung des Präzipitats wurden 10 µg des zu transfizierenden Plasmids (Qiagen-Präparation) sowie 25 µl 2,5 M CaCl2 in einem Eppendorfgefäß vorgelegt, mit A. dest. auf 250 µl aufgefüllt und gemischt. Diese DNA-Mischung wurde unter Lufteinstrom in 250 µl HBS eingetropft. Das dabei entstandene Präzipitat blieb 45 min erschütterungsfrei bei RT stehen, um anschließend auf die Zellen gegeben zu werden. Nach 6 bis 16 Stunden wurde das Medium abgesaugt und die Zellen für 2 Minuten einem Glyzerin-Schock unterworfen.

Das Medium wurde von den Zellen abgesaugt, und für 2,5 min wurden 3 ml 15 % Glyzerin in 1x HBS auf die Zellen gegeben. Anschließend wurden die Zellen 2 x mit PBS gewaschen und mit 5 ml Medium kultiviert.

Selektion der stabil transfizierten Zellklone BHK-Zellen:

Zwei Tage nach dem Glyzerinschock wurde dem Medium 100 µg/ml Hygromycin B zugesetzt. An den folgenden Tagen wurde die Hygromycin B-Konzentration um jeweils 100 µg/ml auf eine Endkonzentration von 500 µg/ml erhöht. Nach ca. 14 Tagen wurden Einzelklone auf eine 24-Napf-Gewebekulturplatte überführt. Der Expressionstest durch Western-Blot-Analyse erfolgte 3-4 Wochen nach Transfektionsbeginn.

3.3.5 Radioaktive Markierung von Proteinen mit Jodogen Lösungen:

Jodogen: 1 mM Jodogen

(0,8 mg in 577 µl CH₂Cl₂ lösen und 1:3 in CH₂Cl₂ verdünnen)

Elutionspuffer: 1 mg/ml KJ

0,05 % BSA in 10 mM PBS

Boratpuffer: 20 mM Boratpuffer mit NaOH auf pH 8,0 titriert Jodierungsansatz: 1 µg Pentamannose-6-Phosphat-BSA (PMP-BSA)

100 µCi Na[¹²⁵J]

mit Boratpuffer ad 60 µl

Iodogenbeschichtung:

Glasspitzröhrchen wurden schräg in einen Rotor eingespannt, 80 µl der Jodogenverdünnung zugegeben und im Stickstoffstrom unter Rotation von Dichlormethan befreit. Beschichtete Glasspitzröhrchen sind bei -20 °C circa 8 Wochen haltbar.

Jodierung:

Vor Jodierungsbeginn wurde eine 5 ml NAP-Fertigsäule mit Sephadex G-25 mit 30 ml Elutionspuffer äquilibriert. Der Jodierungsansatz wurde 2 min auf Eis inkubiert und dann in das mit Jodogen beschichtete Röhrchen überführt. Dieses wurde 8 min auf Eis rotiert, und die Reaktion wurde durch Transfer in ein unbeschichtetes Röhrchen überführt. Das Jodogenröhrchen wurde mit 140 µl Boratpuffer nachgespült und das Volumen des Ansatzes durch Zugabe von 300 µl Elutionspuffer auf 500 µl erhöht. Der Reaktionsansatz wurde auf die G25-Säule zur Entfernung des nichtumgesetzten [¹²⁵J]-Na-Jodids aufgetragen und in 0,5 ml Fraktionen eluiert. Von den 10 Fraktionen wurde je 1 µl im Gamma-Counter gezählt. Fraktionen, die jodiertes PMP-BSA enthielten, wurden gepoolt und bei 4 °C gelagert.

Ermittlung der spezifischen Aktivität:

Zur Bestimmung der spezifischen Aktivität wurde die cpm-Zahl der vereinigten Fraktionen berechnet und auf die Gesamtmenge des eingesetzten Proteins bei angenommener verlustfreier Wiederfindung bezogen.

3.3.6 Bestimmung der Endozytoserate durch Aufnahme von [¹²⁵J]-PMP-BSA Bindungsmedium (BM): 0,1 % BSA, 20 mM HEPES, pH 7,5 in DMEM BM + Mannose-6-Phosphat: 6,5 mM Mannose-6-Phosphat in Bindungsmedium Waschpuffer: 2 mM Mannose-6-Phosphat in Hanks-Puffer

Zellen von einer konfluent bewachsenen 35 mm-Kulturschale wurden mit PBS gewaschen und anschließend für 2 Stunden in 700 µl DMEM/0,1 % BSA bei 37 °C und 5 % CO2

inkubiert. Es wurden anschließend 700 µl BM ± Mannose-6-Phosphat mit [¹²⁵J]-markiertem PMP-BSA (1 x 10⁶ cpm/ 35 mm-Kulturschale) zugegeben und die Zellen für 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. Nach Absaugen der Überstände wurden die Zellen 5 x mit 1 ml Hanks-Puffer gewaschen. Anschließend erfolgte eine zweimalige Inkubation der Zellen mit je 600 µl Waschpuffer für 10 min bei 4 °C auf einer Wippe. Die Überstände wurden vereinigt und im Gamma-Counter gemessen. Die Zellen wurden in 1 ml 1 N NaOH abgeschabt und die Endozytose durch Messung des aufgenommenem [¹²⁵J]-markiertem PMP-BSA im Gamma-Counter bestimmt. Die abgeschabten Zellen wurden durch Ultraschall für 3 x 10 sec homogenisiert und je nach Zelltyp 20 bzw. 40 µl für eine Proteinbestimmung nach Lowry (siehe 3.5.2) eingesetzt. Mit Hilfe der erhaltenen Proteinkonzentrationen konnten die Radioaktivitätsmengen auf eine absolute Proteinmenge (mg) bezogen werden. Die Bestimmung der TCA-löslichen Radioaktivität nach der angegebenen Endozytoseperiode bei verschiedenen Zelltypen zeigte keine erhöhten Werte gegenüber den zellfreien Kontrollen, so daß in weiteren Versuchen auf die Bestimmung der Abbaurate verzichtet wurde.