Klonierung der verschiedenen Konstrukte

3.2.16.1 PCR-Mutagenese des MPR300-CT

Zur Untersuchung der Funktion des Tyrosin-haltigen Internalisierungssignals des MPR300-CT für die Bindung an Periplakin wurden die Tyr26- und Val29-Reste gegen Alaninreste ausgetauscht. Ausgehend von dem Konstrukt pGBT9-MPR300-CT als Matrize wurde eine gezielte Mutagenese nach der Quik^-Change-Methode mit den komplementären Oligo-nukleotiden ST18-F und ST18-R durchgeführt.

Durch Insertion eines Stopcodons wurde eine Deletionsmutante des MPR300-CT hergestellt, deren Sequenz beim Val29-Rest endet. Dazu wurde ein PCR-Produkt von 87 Basenpaaren mit den Oligonukleotiden ST20-F und ST21-R amplifiziert, das nach Restriktionsspaltung der durch die Oligonukleotide eingeführten EcoR und Xho

I-Schnittstellen in die korrespondierenden I-Schnittstellen des Vektors pGBT9 subkloniert wurde.

Zur Klonierung der cDNA der zytoplasmatischen Domäne des MPR300 in den in vitro-Translationsvektor pSPUTK wurde der Vektor pAS2-300CT als DNA-Template benutzt.

Die 532 bp-cDNA wurde über eine Nco Schnittstelle der MCS und eine Pst I-Schnittstelle der 3’-nicht-kodierenden Sequenz aus dem Vektor pAS2-300CT ausgeschnitten und in die korrespondierenden Schnittstellen des Vektors pSPUTK kloniert.

3.2.16.2 PCR-Mutagenese des MPR46-CT

Für die Klonierung der mutanten zytoplasmatischen Domänen des MPR46 wurden PCR-Produkte mit den in Tab. 1 angegebenen Oligonukleotid-Primern amplifiziert und die DNA-Fragmente mit der Restriktionsendonuklease BamH I gespalten. In die Oligo-nukleotidsequenzen wurden TGA-Stopcodons für die einzelnen Deletionsmutanten sowie BamH I-Schnittstellen im 5’-nichtkodierenden Bereich eingefügt (Anhang). Der DBD-Vektor pAS2 wurde ebenfalls mit BamH I gespalten, die DBD-Vektorenden mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert und anschließend in den Ligationsansatz mit den gespaltenen PCR-Produkten eingesetzt. Alle Konstrukte wurden anschließend mit dem Oligonukleotid-Primer DBD sequenziert.

Tab. 1: Oligonukleotide für die Mutagenese des MPR46-CT

Konstrukt Oligonukleotid-Primer pAS2-MPR46-CT-Wildtyp ST29-F, ST26-R pAS2-MPR46-CT-Stop A 44 ST29-F, ST23-R pAS2-MPR46-CT-Stop V 48 ST29-F, ST24-R pAS2-MPR46-CT-Stop H 63 ST29-F, ST28-R

pAS2-MPR46-CT-∆1-16 ST25-F, ST26-R

Zur Herstellung der Alaninaustauschmutanten des MPR46-CT wurden die in Tab. 2 angegebenen komplementären Oligonukleotide für eine gezielte in vitro-Mutagenese nach der Quik^-Change-Methode verwendet. Der Erfolg des Alaninaustausches wurde durch Sequenzierung der Konstrukte mit dem Oligonukleotid-Primer DBD überprüft.

Tab. 2: Oligonukleotide für die Herstellung von Alanin-Austauschmutanten des MPR46-CT

Konstrukt Oligonukleotid-Primer

pAS2-MPR46-CT-F18,W19→ A F18-F, F18-R

pAS2-MPR46-CT-Stop H63-Y45,V48→ A Y45-F, Y45-R

pAS2-MPR46-CT-Y45,V48→ A Y45-F, Y45-R

Für die Klonierung der mutanten zytoplasmatischen MPR46-Domänen in die DBD-Vektoren pGBT9 und pAS2-1 wurden PCR-Produkte mit den Forward-Primern ST22-F (MPR-46-CT-WT; StopA44; StopV48; StopH63) bzw. ST25-F (MPR46-CT-∆1-16) und den in Tab. 1 angegebenen Reverse-Primern amplifiziert und die DNA-Fragmente in die EcoRI-/BamHI-Schnittstellen der Vektoren kloniert.

3.2.16.3 PCR-Mutagenese von Periplakin

Ausgehend von dem AD-Vektor pGAD-GH-97 (Klon ST4) als Matrize wurden verschiedene PCR-Produkte mit den in Tab. 3 angegebenen Oligonukleotid-Primern amplifiziert und die DNA-Fragmente mit den durch die Oligonukleotid-Primer eingefügten Schnittstellen mit den Restriktionsendonukleasen gespalten. Die gereinigten PCR-Produkte wurden anschließend über die Schnittstellen in den Vektor pGAD-GH kloniert.

Tab. 3: Oligonukleotide für die Mutagenese von Periplakin

Konstrukt Oligonukleotid-Primer pGAD-GH-Periplakin (aa 1646-1756) PP1-F, PP4-R pGAD-GH-Periplakin (aa 1646-1700) PP1-F ,PP2-R pGAD-GH-Periplakin (aa 1701-1756) PP3-F, PP4-R

3.2.16.4 Klonierung der µ2- und µ3A-Untereinheiten in den AD-Vektor pGAD-424 und den in vitro-Translationsvektor pSPUTK

Zur Klonierung der Maus µ2-cDNA (Ohno et al., 1995) des AP-2-Komplexes in den AD-Vektor pGAD424 wurde als DNA-Template das Plasmid pCR2.1.µ2-2 ^∗ herangezogen, das die gesamte 1,3 kb kodierende µ2-cDNA-Sequenz enthält. Nach Amplifizierung eines 1,3 kb PCR-Produktes mit den Primern µ2-F/µ2-R wurde das DNA-Fragment mit der Restriktionsendonuklease Bgl II gespalten. Der Vektor pGAD-424 wurde zunächst mit BamH I und anschließend mit Bgl II gespalten. Nach Dephosphorylierung der Vektorenden

∗ Die Konstrukte pCR2.1.µ2-2 und pSKII-µ3A wurden freundlicherweise von Herrn Dr. P. V. Schu (Institut für Biochemie II, Universität Göttingen) bzw. von Frau Prof. Dr. M. S. Robinson (Department of Clinical Chemistry, Cambridge) zur Verfügung gestellt.

mit alkalischer Phosphatase, Reinigung des Ansatzes über Qia-Quick-Säulen wurden ca.

100 ng des gespaltenen Vektors mit ca. 500 ng des gespaltenen PCR-Produktes in den Ligationsansatz eingesetzt.

Die kodierende µ3A-cDNA des AP-3-Komplexes der Ratte (Pevsner et al., 1994) wurde unter Verwendung des Plasmids pKSII-µ3A^* mit den Primern µ3-F/µ3-R amplifiziert und nach Restriktionsspaltung in die EcoRI/BamHI-Schnittstellen des Vektors pGAD424 kloniert. Die Konstrukte wurden nach Isolierung der Plasmid-DNA aus positiven Klonen mit den Oligonukleotid-Primern PB6 und PB7 sequenziert.

Zur Klonierung der Maus µ2-cDNA in den Vektor pSPUTK wurde mit den Primern µ2-B-F /µ2-R unter Verwendung des Plasmids pCR2.1.µ2-2 als Matrize ein 1,3 kb PCR-Produkt amplifiziert und nach Restriktionsspaltung in die Bgl II-Schnittstelle des Vektors pSPUTK kloniert. Die Ratten µ3A-cDNA von 1,26 kb wurde mit den Oligonukleotid-Primern µ3-B-F und µ3-R amplifiziert und nach Restriktionsspaltung in die Bgl II-Schnittstelle des Vektors pSPUTK kloniert Zur effizienten Translation wurde in den 5’-Bereich der Oligonukleotide µ2-B-F und µ3-B-F vor das ATG-Startcodon eine Kozak-Konsensus-sequenz eingefügt. Die erhaltenen Konstrukte pSPUTK-µ2 und pSPUTK-µ3A wurden mit dem Oligonukleotid-Primer SP6 sequenziert und zur in vitro-Translation benutzt.

3.2.16.5 Klonierung der Periplakin-cDNA in den eukaryontischen Expressionsvektor pcDNA 3.1(+)

Nach Amplifikation eines 1,5 kb-PCR-Produktes mit dem Oligonukleotid-Primern PP5-F und PP6-R wurde das DNA-Fragment mit der Restriktionsendonuklease BamH I gespalten und anschließend in dieselben Schnittstellen des eukaryontischen Expressionsvektors pcDNA 3.1(+) kloniert. Beide Oligonukleotid-Primer enthielten BamH I-Schnittstellen in ihren 5’-nichtkodierenden Sequenzen, und in den Primer PP5-F wurde ein ATG-Startcodon mit benachbarter Kozak-Konsensus-Sequenz eingefügt. Das Konstrukt wurde mit dem Oligonukleotid-Primer T7 sequenziert.