2 Material und Methoden
2.2 Methoden
2.2.1 Zellbiologische Methoden
2.2.1.1 Präparation von Zellsuspensionen
Zur Vorbereitung der Zellpräparation wurde kaltem RPMI 1640 Medium 10% (vol/vol) fötales Kälberserum (FKS) hinzugegeben. Das Medium und andere verwendete Puffer wurden vor und während der Präparation von Zellsuspensionen auf Eis gelagert, um ein vorzeitiges Absterben der Zellen zu vermeiden.
Die Mäuse wurden mit zervikaler Dislokation getötet und mit 70% Ethanol besprüht.
Vor jedem Eingriff wurde das Präparationsbesteck mit 70% Ethanol sterilisiert. Die Entnahme der Organe erfolgte unter sterilen Bedingungen, wobei eine kurzzeitige Lagerung und alle weiteren Präparationsschritte auf Eis stattfanden.
2.2.1.2 Präparation von murinen Splenozyten
Die Bauchhöhle wurde links lateral unterhalb der Rippen geöffnet und die Milz chirurgisch entfernt (Splenektomie). Die Milz wurde von Peritonealepithel und Fettresten befreit und in mehrere kleine Stücke geschnitten, um die Splenozyten vom Bindegewebe der Organhülle loszulösen. Die Milzstücke wurden mit einem sterilen Stempel einer 2 ml Spritze durch ein Sieb mit 70 µm Maschenweite gedrückt. Die Zellen wurden in 5 ml Medium resuspendiert und bei 350 xg (1400 rpm) bei 4 °C für 7 min zentrifugiert. Aufgrund des hohen Fettgehalts in der Milz konnte dabei eine Aggregation der Zellen festgestellt werden. Die sedimentierten Aggregate wurden in 1 ml Medium resuspendiert und auf ein weiteres Zellsieb mit 40 µm Maschenweite gegeben. Das Sieb wurde wiederum mit 3 ml Medium gewaschen, um den Verlust zu minimieren. Nach erneuter Zentrifugation bei 350 xg und 4 °C für 7 min konnten die pelletierten Zellen in Medium oder Puffer aufgenommen werden und waren als Einzelzellsuspensionen sowohl für die FACS-Analyse als auch für weitere Aufreinigungsschritte und Zellkultur geeignet.
2.2.1.3 Präparation von murinen Knochenmarkzellen
Die Hinterbeine wurden am Hüftgelenk chirurgisch abgetrennt. Anschließend wurden die Pfoten und Fibula sowie Haut und Muskelgewebe von Femur und Tibia mit Hilfe eines Skalpells entfernt. Die einzelnen Knochen wurden daraufhin in der Mitte mit einer Schere durchtrennt und das Knochenmark mit kaltem RPMI Medium (mit 10%
FKS Zusatz) und dem Druck einer 10 ml Spritze mit 27G Kanüle ausgespült. Das Knochenmark wurde in einer sterilen Petrischale aufgefangen und in ein Zentrifugenröhrchen überführt. Nach der Zentrifugation bei 350 xg und 4 °C für 7 min wurden die fädigen Knochenmarkstrukturen aus Bindegewebe und Fett durch Resuspendierung in 1 ml Medium aufgelöst. Um restliche Knochenfragmente zu entfernen, wurden die Zellen in ein Zellsieb mit 40 µm Maschenweite gegeben und mit 3 ml Medium vom Sieb gewaschen. Nach einer erneuten Zentrifugation mit gleichen Einstellungen konnten die Zellen in Medium für die Zellkultur oder in Puffer für eine weitere Zellisolation aufgenommen werden und lagen nach kräftigem Vortexen in einer FACS-geeigneten Einzelzellsuspension vor.
2.2.1.4 Durchführung einer Peritoneallavage zur Präparation von murinen Peritonealzellen für die FACS-Analyse
Für die Untersuchung der Verteilung basophiler Granulozyten wurden die Zellen des Peritonealraumes gewonnen. Die getötete Maus wurde auf einem Präparationsbrett fixiert und ohne das Peritoneum zu verletzen die Hautschicht ventral geöffnet. Mit einer 10 ml Spritze und einer 23G Kanüle wurde 10 ml PBS unter Druck in die Bauchhöhle gespritzt, wobei die Organe von der Flüssigkeit umspült wurden. Zellen, die im Peritonealraum zu finden sind, wurden anschließend mit der eingegebenen Flüssigkeit in die Spritze eingesaugt und konnten bei 350 xg und 4 °C für 10 min in einem Zentrifugenröhrchen sedimentiert werden. Die überstehende Flüssigkeit wurde z.T. für den Zytokinnachweis mittels ELISA bei -20 °C gelagert. Die zellulären Bestandteile wurden zur Vorbereitung der FACS-Analyse in Puffer resuspendiert.
2.2.1.5 Gewinnung von Blutzellen und Blutplasma aus Mäusen
Die Konzentration antigenspezifischer Antikörper im Plasma gab Hinweise auf eine ablaufende Immunreaktion im Mausmodell und diente der Untersuchung einer humoralen Gedächtnisimmunantwort.
Mäuse und Ratten haben die Besonderheit eines ausgeprägten retrobulbären Venenplexus. Dieser wurde mit Hilfe einer Kapillare leicht verletzt, wobei beim Entfernen der Kapillare ein sofortiger Stopp der Blutung erfolgte. Der sedierten Maus wurde nach Kontrolle der Narkose-Wirkung und Schmerzfreiheit eine heparinisierte Glaskapillare zwischen vorderen Lidrand und bulbus gedreht. Das Blut wurde in Reaktionsgefäßen mit einer 0,1%igen EDTA-Lösung aufgefangen. Das EDTA verhinderte eine Gerinnung des Blutes durch die Komplexierung von Kalziumionen, die für viele Gerinnungsfaktoren notwenig sind. Anschließend wurde die Maus subcutan (sc.) mit dem Antagonisten, der jeweils die Wirkung der drei Narkose-Komponenten aufhebt, behandelt. Vorteile dieser Art der Blutabnahme ist der geringe Stress durch die kurzzeitige Sedierung mit nachfolgender Antagonisierung, die Möglichkeit einer relativ großen Volumenentnahme und die geringe Infektionsgefahr durch das Fehlen offener Wunden.
Das Blut wurde anschließend bei 450 xg (2400 rpm) für 12 min zentrifugiert und das Plasma vorsichtig abgenommen. Bis zur Bestimmung des Immunglobulingehaltes wurde das Plasma bei -20 °C gelagert.
Für die Weiterverarbeitung der zellulären Bestandteile wurde das entnommene Volumen mit der gleichen Menge von 0,9% NaCl substituiert und eine definierte Menge für die FACS-Färbungen entnommen. Blutproben wurden vor einer Färbung mindestens dreifach mit 0,9% NaCl gewaschen, um ein Abfangen der zugegebenen Färbe-Antikörper durch lösliche Faktoren zu verhindern.
2.2.1.6 Präparation von murinen Lymphknoten-Zellen für die FACS-Analyse Lymphknoten können basophile Granulozyten enthalten. Für die Untersuchung der Zellen in den Lymphknoten wurde der Bauchraum einer Maus ventral geöffnet und der Darm zur Präparation der mesenterialen Lymphknoten freigelegt. Die
mesenterialen Lymphknoten sind perlschnurartig im Mesenterium des Dünndarms angeordnet und gehören zu den „Darm-assoziierten Lymphgeweben“ (gut associated lymphoid tissue, GALT). Bei der Präparation wurde darauf geachtet, dass die Lymphknoten von Fett- und Geweberesten befreit wurden, um eine problemlose Zellisolation und Weiterverarbeitung zu ermöglichen. Außerdem wurden die lymphonodii inguinales superficiales von beiden Seiten freigelegt. Diese liegen in der Leistengegend im Fettgewebe der Unterhaut. Bei der Präparation der lymphonodii axillares wurden sowohl die tiefer liegenden als auch die oberflächennahen Lymphknoten von beiden Seiten verwendet und vereint.
2.2.1.7 Antikörperfärbung: Oberflächenfärbung, intrazelluläre Färbung Die Analyse der Zellen erfolgt mit Hilfe der Bindung markierter Antikörper.
Oberflächenfärbung:
Zellen wurden für die Durchflusszytometrie (FACS) und magnetische Zellseparation (MACS) in Einzelzellsuspension gefärbt. Die Proben konnten sowohl frisch präparierte Primärzellen als auch Zellen aus einem Zellkulturansatz enthalten. Die gewünschten Antikörper wurden in der entsprechenden Konzentration in PBS, Medium oder MACS-Puffer vorbereitet. Die Färbung erfolgte im kleinstmöglichen Volumen größer 70 µl und dauerte bei 4 °C 20 min. Bei der Inkubation mit einem Biotin-konjugierten Antikörper wurde die Probe nach 20 min gewaschen und für weitere 20 min bei 4 °C mit einem Fluorochrom-gekoppelten Streptavidin gefärbt. Die Färbung mit Fluoreszenz-markierten Antikörpern wurde unter Lichtausschluss durchgeführt, um ein Bleichen der Fluoreszenz zu vermeiden. Nach der Färbung wurden die Zellen zur Entfernung ungebundener Antikörper mit 4 ml PBS gewaschen und bei 350 xg und 4 °C für 7 min zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgesaugt. Vor der Messung wurden die Zellen mit FACSLysing Solution fixiert, um störende Erythrozyten mit hoher Eigenfluoreszenz zu lysieren und die Zellen zu fixieren. Nach 10 min Inkubation bei Raumtemperatur unter Lichtausschluss wurden die Proben für 7 min bei 350 xg/4 °C zentrifugiert und in 200 µl PBS aufgenommen.
Intrazelluläre Färbung:
Für die Untersuchung der Strukturen im Inneren einer Zelle war nach einer Oberflächenfärbung der Zellen eine intrazelluläre Färbung mit Antikörpern möglich.
Die Zugabe von 150 µl CytoFix/CytoPerm Lösung für 20 min bei 4 °C unter Lichtausschluss permeabilisierte die Zellmembran. Diese Lösung enthält Paraformaldehyd, das zu einer Denaturierung und Präzipitation von Proteinen und Seitenketten führte. Die Oberflächenantikörper und deren Fluoreszenz wurden dabei stabilisiert. Außerdem enthält die Lösung auch Detergenzien, die eine Porenbildung ermöglichten. Nach der Permeabilisierung wurden die Zellen dreimal mit einer Perm/Wash Lösung gewaschen und jeweils bei 350 xg/4 °C für 7 min zentrifugiert.
Die Perm/Wash Lösung hielt die Porenbildung in der Zellmembran aufrecht.
Anschließend wurde die Probe bei 350 xg/4 °C für 7 min zentrifugiert und der zu färbende Antikörper in Perm/Wash Lösung hinzu gegeben, wobei der Antikörper an intrazellulär vorliegende Moleküle binden konnte. Die Inkubation der Zellen mit dem Antikörper erfolgte für 30 min bei 4 °C unter Lichtausschluss. Nach zwei weiteren Waschschritten mit Perm/Wash Lösung wurden die Zellen in 200 µl PBS resuspendiert und zur FACS-Analyse herangezogen.