Adoptiver Transfer antigenspezifischer Zellen

Um die Beteiligung basophiler Granulozyten bei der Entwicklung einer humoralen Gedächtnisimmunantwort zu untersuchen, wurde ein adoptiver Transfer antigen-spezifischer Zellen mit und ohne basophilen Granulozyten von immunisierten Spendermäusen auf naive Mäuse durchgeführt. Dabei wurden die Plasmazellen in vitro entfernt, um die basale Produktion von antigenspezifischen Antikörpern durch transferierte Plasmazellen zu vermeiden.

3.5.2.1 Adoptiver Transfer mit Zellen aus APC-immunisierten Spendermäusen

Für den adoptiven Transfer der Zellen immunisierter Spendermäuse auf naive Empfängermäuse wurden C57BL/6 Mäuse zweimal im vierwöchigen Intervall mit APC und B. pertussis immunisiert und fünf Wochen nach der letzten Immunisierung die Zellen aus Milz und Knochenmark isoliert. Ein Teil der Zellen wurde daraufhin in vitro anhand von CD138-Biotin von Plasmazellen depletiert (CD138^-). Bei den restlichen Zellen wurden sowohl Plasmazellen als auch IgE⁺ basophile Granulozyten (CD138^- IgE^-) entfernt (Abbildung 31). Die in vitro Depletion der Zellpopulationen erfolgte mittels MACS-Aufreinigung und wurde durch eine FACS-Analyse vor dem Transfer auf Vollständigkeit kontrolliert. Der Transfer der Zellsuspensionen erfolgte über intravenöse Injektion ins retrobulbäre Venengeflecht der Empfängermaus. Eine dritte Gruppe erhielt als weitere Kontrolle keine Zellen, sondern nur PBS. Alle Tiere wurde 12 h und 36 h nach dem Transfer mit jeweils 10 µg APC i.p. restimuliert bzw.

stimuliert.

Den Empfängermäusen wurde in den folgenden Tagen Blut abgenommen und der Plasmagehalt APC-spezifischer IgG1 und IgG2a Immunglobuline mittels ELISA quantifiziert. Tiere, die keine Zellen sondern PBS erhalten haben, zeigten innerhalb von dreizehn Tagen nur einen sehr geringen Anstieg APC-spezifischer Immunglobuline (Abbildung 31). Die CD138^- Gruppe erhielt sowohl APC-spezifische Gedächtnis-T- und -B-Zellen als auch APC-spezifische basophile Granulozyten aus Milz und Knochenmark. Die CD138^- IgE^- Gruppe erhielt hingegen Gedächtnis-Zellen, aber keine basophilen Granulozyten. Die Gruppe mit transferierten basophilen Granulozyten (CD138^-) reagierte auf die Restimulation mit einer raschen und starken Antikörper-Produktion, die typisch für eine Gedächtnisantwort ist. Abbildung 31 zeigt den Plasmagehalt APC-spezifischer IgG1- und IgG2a-Antikörper. Im Vergleich zu dieser Gruppe war die Produktion APC-spezifischer IgG1- und IgG2a-Antikörper bei der fehlenden Übertragung von basophilen Granulozyten (CD138^- IgE^-) um die Hälfte verringert. Für IgG1 war die eingeschränkte Antikörperproduktion zwischen den Tagen 7 und 13 für beide Nachweismethoden signifikant. IgG2a-Antikörper traten jedoch nur in sehr geringer Konzentration im peripheren Blut auf und waren für den Nachweis mit APC-Biotin unterhalb der Detektionsgrenze.

Abbildung 31: humorale Gedächtnisimmunantwort nach Transfer APC-spezifischer Zellen

C57BL/6 Mäuse wurden zweimal mit 100 µg APC und B. pertussis immunisiert. Fünf Wochen nach der letzten Immunisierung wurden Milz- und Knochenmarkzellen isoliert und über den Oberflächenmarker CD138 mittels MACS von Plasmazellen depletiert (CD138-). Einer Empfängergruppe wurden Zellen ohne basophile Granulozyten (CD138- IgE-) i.v. übertragen, eine weitere Gruppe erhielt PBS als Kontrolle. Die Restimulation erfolgte an den zwei darauf folgenden Tagen mit jeweils 10 µg APC. APC-spezifische IgG1- und IgG2a-Antikörper wurden über mehrere Tage nach der Restimulation mittels ELISA gemessen. Der IgG2a-spezifische ELISA mit APC-Biotin zur Detektion war aufgrund der geringen Plasma-Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze. Dargestellt sind die Mittelwerte und die mittleren Standardfehler von zehn Mäusen pro Gruppe. (* p < 0,05)

Die PBS-Gruppe zeigte als Reaktion auf die APC-Gabe nur eine sehr geringe Antikörper Sezernierung, was auf eine Primärreaktion deutet. Folglich fand bei der PBS-Gruppe keine Gedächtnisimmunantwort statt. Die beiden anderen Gruppen zeigten hingegen eine sekundäre Immunreaktion aufgrund des erfolgreichen Transfers antigenspezifischer Zellen.

3.5.2.2 Adoptiver Transfer bei Balb/c Mäusen

Der adoptive Transfer wurde mit Balb/c Mäusen wiederholt, um eine spezifische Reaktion eines Mausstammes auszuschließen. Dazu wurden Balb/c Spender-Mäuse in einem vierwöchigen Abstand zweimal mit APC und hitze-inaktiviertem B. pertussis immunisiert. Nach abgelaufener Immunreaktion (vier Wochen) wurden die Zellen aus Milz und Knochenmark aufgereinigt und CD138⁺ Plasmazellen bzw. CD138⁺ Plasmazellen und IgE⁺ basophile Granulozyten mittels MACS in vitro depletiert.

Nachdem die Zellzahl beider Aufreinigungen angeglichen wurde, wurden die Zellen in naive Balb/c Mäuse über i.v. Injektion transferiert. Zur Kontrolle der sekundären Immunreaktion erhielt eine weitere Gruppe nur die Vehikelkontrolle (PBS). Nach 12 h und 36 h wurden alle Tiere mit 20 µg APC restimuliert und der Plasmagehalt APC-spezifischer IgG1- und IgG2a-Antikörper (Daten für IgG2a-Antikörper nicht gezeigt) an Tag 3, 5, 7 und 11 nach der Restimulation ermittelt.

Die Kontrollmäuse ohne adoptiven Transfer antigenspezifischer Zellen (PBS) zeigten nur eine minimale Verstärkung der antigenspezifischer Antikörperproduktion für IgG1 und IgG2a (Abbildung 32). Diese Mäuse konnten aufgrund fehlender Zellübertragung nicht mit einer sekundären Immunantwort auf die Antigen-Gabe reagieren. Im Gegensatz dazu war für die Gruppen, die Zellen aus APC-immunisierten Mäusen erhalten haben, ab Tag 7 eine vermehrte Ausschüttung APC-spezifischer IgG1- und IgG2a-Antikörper messbar. Mäuse, denen basophile Granulozyten überragen wurden (CD138-), konnten mit einer schnellen und verstärkten Bildung APC-spezifischer IgG1-Antikörpern reagieren. An Tag 7 und 10 war mittels ELISA eine signifikante Erhöhung der Konzentration antigenspezifischer IgG1-Antikörper nach Übertragung basophiler Granulozyten (CD138-) detektierbar.

Abbildung 32: Transfer von APC-spezifischen Zellen bei Balb/c Mäusen

Aus zweifach APC-immunisierten Balb/c Mäusen (vier Wochen Abstand mit 100 µg und B. pertussis) wurden Zellen aus dem Knochenmark und der Milz isoliert. Die Zellen der Spendermäuse wurden entweder über CD138 von Plasmazellen (CD138-), oder über CD138 und IgE von Plasmazellen und basophilen Granulozyten (CD138- IgE-) depletiert. Nach dem Angleichen der Zellzahl wurden die Zellen i.v. in naive Balb/c Empfängermäuse injiziert. Die Restimulation erfolgte nach 12 h und 36 h mit jeweils 20 µg APC. Eine Gruppe erhielt als Kontrolle nur PBS. Der Plasmagehalt APC-spezifischer IgG1-Antikörper wurde über mehrere Tage mittels ELISA und APC-beschichteten Platten analysiert. Dargestellt sind die Mittelwerte und SEM von zehn Mäusen pro Gruppe. (* p < 0,05; ** p < 0,01)

Alle Tiere besaßen endogene basophile Granulozyten, die nicht auf die APC-Gabe reagierten (PBS). Erst der adoptive Transfer von basophilen Granulozyten aus immunisierten Mäusen ermöglichte eine Reaktion der basophilen Granulozyten auf das Antigen und damit eine Steigerung der humoralen Immunantwort.

Die Abhängigkeit der Reaktion von der Anwesenheit basophiler Granulozyten und deren Fähigkeit, das Antigen APC zu binden und zu reagieren, lassen auf eine Beteiligung basophiler Granulozyten bei der Entwicklung einer humoralen Immunantwort schließen. Der Einfluss basophiler Granulozyten bei einer humoralen Gedächtnisimmunantwort war zudem nicht auf den Mausstamm C57BL/6 begrenzt, sondern konnte auch in Balb/c Mäusen nachgewiesen werden.

3.6 Rekrutierung von basophilen Granulozyten bei einer