Zellbiologische Methoden

3.2.1 Kultivierung von E. coli

Die E. coli Bakterien wurden nach einer Transformation mit DNA oder zur Erhaltung von Einzelkolonien auf LB-Platten kultiviert. Zur Selektion transformierter Bakterien enthielten die Pla tten ein geeignetes Antibiotikum (75 µg/ml Ampicillin oder 25 µg/ml Kanamycin). Die Plattenkulturen wurden nach dem Ausstreichen der Bakterien über Kopf für mindestens 12 h bei 37 °C inkubiert. Plattenkulturen konnten bei 4 °C mehrere Wochen gelagert werden. Zur Herstellung von E. coli Flüssigkulturen wurden 3 ml LB-Medium mit einer Einzelkolonie einer Plattenkult ur angeimpft und etwa 12 h bei 150-220 upm und 37 °C geschüttelt. Zum Anlegen größerer Flüssigkulturen wurden 150 ml LB-Medium mit 100 µl einer Flüssigkultur angeimpft und wie beschrieben geschüttelt. Bei Ampicillin-resistenten Stämmen wurde das Medium auf eine Ampicillin-Konzentration von 75 µg/ml eingestellt. Die Ermittlung der Zelldichten beim Bakterienwachstum erfolgte durch Absorptionsmessung bei einer Wellenlänge von 600 nm.

Für die Konservierung der E. coli Stämme wurden in Kryoröhrchen 0,5 ml einer Übernachtkultur mit 0,5 ml 80 % (v/v) Glycerin gemischt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C gelagert.

3.2.2 Transformation von E. coli

3.2.2.1 Herstellung kompetenter E.coli Zellen

Zur Herstellung transformationskompetenter Zellen nach der CaCl2-Methode wurden 50 ml LB-Medium mit 0,5 ml einer Übernachtkultur des gewünschten E. coli-Stamms angeimpft.

Die Zellen wurden bei 37 °C bei 220 upm geschüttelt, bis die Suspension eine OD600 von

0,4 bis 0,6 erreicht hatte (2-3 h). Die Zellen wurden auf Eis abgekühlt und 10 min bei 3000 upm und 4 °C sedimentiert. Danach wurde das Zellsediment in 20 ml eiskaltem 100 mM CaCl2 resuspendiert und 15 min auf Eis inkubiert. Es wurde nochmals 10 min zentrifugiert, und die Zellen wurden anschließend in 3 ml 100 mM CaCl2 aufgenommen. Nach einer weiteren, mindestens einstündigen Inkubation auf Eis waren die Zellen kompetent. Die Zellen konnten 2 bis 3 Tage auf Eis gelagert oder nach Zugabe von Glycerin zu einer Endkonzentration von 20 % (v/v) in flüssigem Stickstoff schoc kgefroren und bei -80 °C konserviert werden.

3.2.2.2 Transformation kompetenter E. coli Zellen

Zur Transformation wurden 100 µl der kompetenten Zellsuspension mit Plasmid -DNA (1 ng) oder Ligationsansätzen (3 µl) für 10 min auf Eis gestellt. Anschließend wurden die Zellen 2 min bei 42 °C inkubiert, nochmals 2 min auf Eis gestellt und nach Zugabe von 100 µl SOC-Medium für 60 min bei 37 °C inkubiert. Von der Zellsuspension wurden je 10 bis 200 µl auf einer LB-Agarplatte mit 75 µg/ml Ampicillin ausplattiert. Die nach der CaCl2-Methode hergestellten kompetenten Zellen ergaben Transformationsausbeuten von etwa 1×10⁷ Kolonien/µg DNA.

3.2.3 Kultivierung von D. discoideum

D. discoideum Zellen wurden entweder in Schüttelkultur (180 upm) oder auf Petrischalen in HL5c-Medium bei einer Temperatur von 21 °C kultiviert. Für die Selektion und das Wachstum von transformierten Zellen wurde dem Medium 10 bis 20 µg/ml G418 bzw.

4 µg/ml Blasticidin S zugefügt. In Schüttelkulturen wurden die Zellen bis zu einer Dichte von 4 bis 6 × 10⁶ Zelle n/ml angezogen. Ab 6 × 10⁶ Zellen/ml beginnt die Wachstumskurve in die stationäre Phase überzugehen. Die Zelldichte in Suspension wurde mit Hilfe eines Hämacytometers bestimmt. Kulturen auf Petrischalen wurden bei Erreichen der Konfluenz mit HL5c -Medium abgespült und gegebenenfalls eine neue Petrischale angeimpft.

Für die Isolierung klonaler Zellinien wurden Zellen auf SM-Agarplatten (Durchmesser 14 cm) kultiviert. Dazu wurden 50 bis 100 µl Zellen mit 500 µl einer Suspension von Klebsiella aerogenes Bakterien in MES-Puffer vermischt und auf einer Agarplatte ausgestrichen. Nach ca. zwei Tagen zeigten sich die D. discoideum Kolonien als Plaques auf dem Bakterienrasen.

Am Rand dieser Plaques befinden sich die vegetativen Zellen, die mit Hilfe eines Zahnstochers in andere Kulturen überführt werden können.

3.2.4 Synchronisieren des Zellzyklus von D. discoideum

Die Synchronisierung des Zellzyklus von D. discoideum wurde mit einer Kälteschock-Methode erzielt (Sutherland et al., 2001). Die Zellen wurden bei 22 °C bis zu einer Dichte von 5 x 10⁶ Zellen/ml gezogen. Dann wurde die Zellsuspension in frischem Medium auf eine Dichte von 1 x 10⁶ Zellen/ml verdünnt und bei 10 °C 20 h inkubiert. Zellen aus dieser Suspension wurden auf Deckgläser übertragen und alle 30 min wurden Proben fixiert. Zellen in der Zellteilung wurden nach 2-3 h auf den Deckgläsern beobachtet.

3.2.5 Konservierung von D. discoideum Zellen

3.2.5.1 Einfrieren von D. discoideum Zellen

Zur Konservierung von D. discoideum Zellen wurden axenisch gewachsene Zellen geerntet, zweimal mit Bonner`s Lösung gewaschen und mit einer Dichte von 1,0 × 10⁸ Zellen/ml in eiskaltem Einfriermedium (HL5c + 10 % (v/v) DMSO) aufgenommen. Die Zellsuspension wurde in 1 ml Aliquots auf Einfrierröhrchen verteilt, die vorher auf Eis gehalten wurden. Die Zellen wurden dann zunächst bei -20 °C für 2 bis 4 h aufbewahrt, bevor sie bei -80 °C gelagert wurden. Um eingefrorene Zellen wieder anzuziehen, wurden sie auf Eis aufgetaut, zweimal mit kaltem HL5c-Medium gewaschen und in eine Petrischale mit HL5c-Medium überführt. Bei Transformanten wurde nach 24 h das Medium gewechselt und das entsprechende Antibiotikum zugegeben.

3.2.5.2 Konservierung von D. discoideum Sporen

Axenisch gewachsene D. discoideum Zellen wurden zweimal mit kaltem MES-Puffer gewaschen und mit einer Dichte von 1 × 10⁸ resuspendiert. Von dieser Zellsuspension wurden 500 µl auf einer MES-Agarplatte (Durchmesser: 10 cm) ausgestrichen und in der Sterilbank für 10 min getrocknet. Die Agarplatten wurden auf den Kopf gestellt und die Zellen entwickelten sich innerhalb von 24 bis 48 h zu Fruchtkörpern. Die Sporen wurden durch Abklopfen im Deckel einer Petrischale gesammelt oder mit Hilfe eines kleinen Spatels geerntet. Die Sporen einer Agarplatte wurden in 500 µl 10 %iger Glycerin-Lösung suspendiert, in 150 µl Aliquots auf Einfrierröhrchen verteilt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Lagerung erfolgte bei -80 °C. Zum Animpfen wurde ein Aliquot bei Raumtemperatur aufgetaut und in eine Petrischale mit HL5c-Medium überführt.

3.2.6 Transformation von D. d iscoideum

Für die Transformation von D. discoideum wurden Zellen entweder aus einer Schüttelkultur oder von Petrischalen geerntet, zweimal in EP -Puffer gewaschen und bei einer Zelldichte von 1-2 × 10⁷ Zellen/ml in demselben Puffer suspendiert. 800 µl dieser Zellsus-pension wurden mit 10-20 µg Plasmid-DNA gemischt und 5 min auf Eis inkubiert. Außer bei der Transformation von AX3-ORF⁺-Zellen wurden der Transformationsmischung auch 10-20 µg des Plasmids pREP zugefügt. Die Cotransformation mit pREP verhindert die Ausschleusung der eingebrachten Plasmide aus transformierten D. discoideum-Zellen. Die Zellsuspension wird zur Transformation in eine gekühlte Elektroporationsküvette (0,4 cm) überführt, die in die Elektrodenkammer der Gene-Pulser-Apparatur geschoben wird. Der Elektroporationsimpuls erfolgte bei 1,2 kV, 25 µF und 600 Ω, was eine Zeitkonstante von etwa 0,8 ms ergab. Nach dem Impuls wurde der Transformationsansatz für 15 min auf Eis gekühlt und anschließend auf zwei Petrischalen mit je 10 ml HL5c-Medium verteilt. 18-24 h nach der Transformation wurde das Medium gegen das Selektionsmedium, das das entsprechende Antibiotikum enthielt, ausgetauscht. Das Selektionsmedium wurde täglich gewechselt, um abgestorbene Zellen zu entfernen. Nach 5 bis 10 Tagen wurden in der Regel die ersten Kolonien sichtbar, die durch Absaugen mittels einer Pipettierhilfe auf Petrischalen

(4 cm Durchmesser) mit Selektionsmedium überführt wurden. Alternativ konnten die Kolonien auch mit einer Bakteriensuspension von K. aerogenes gemischt und auf SM-Agarplatten ausgestrichen werden.