Steady State-ATPase

Um die ATPase-Aktivität der Myosin I-Konstrukte zu messen, wurde die Umsetzung von ATP zu ADP und Pi durch nachfolgende enzymatische Reaktionen an die Oxidation von NADH gekoppelt. Die Abnahme der NADH-Absorption konnte photometrisch bei einer Wellenlänge von 340 nm beobachtet werden. In der Abbildung 4.14 ist der Verlauf der Absorption bei 340 nm während der Reaktion von 1 µM D692 mit 1 mM ATP dargestellt. In der Steady State-Phase ist die Geschwindigkeit der Reaktion linear von der Reaktionszeit abhängig, und aus der Steigung dieser Geraden kann die Geschwindigkeit des ATP-Verbrauchs berechnet werden.

Die ATPase-Aktivität, die für ein Myosin gemessen wird, wenn es nicht an Aktin gebunden vorliegt, wird als basale ATPase-Aktivität bezeichnet. Die basale Steady State-ATPase-Aktivität der Wildtyp-Kopffragmente betrug 0,08 s^-1 für MyoB, 0,12 s^-1 für MyoD und 0,04 s^-1 für MyoE. Die Konstrukte, bei denen Mutationen an der TEDS-Stelle vorlagen, zeigten basale ATPase-Aktivitäten die sich nicht signifikant von denen der Wildtyp-Kopffragmente unterschieden.

Abbildung 4.14: Steady State-ATPase des MyoD-Kopffragments. Dargestellt ist die NADH-Absorptionsveränderung während der Reaktion von 1 µM D698 mit 1 mM ATP. Die Absorption wurde bei einer Wellenlänge von 340 nm gemessen. Der lineare Bereich der Kurve wurde mit einer Geraden ausgewertet, und aus der Steigung dieser Geraden wurde die ATP-Umsatzgeschwindigkeit berechnet.

Um den Einfluß einer Phosphorylierung an der TEDS-Stelle auf die Aktin-Aktivierung der ATPase-Aktivität zu untersuchen, wurde neben der basalen ATPase-Aktivität auch die Aktivität bei einer Aktinkonzentration von 20 µM gemessen. Für das Wildtyp-Kopffragment von MyoB wurde ein Wert von 0,39 s^-1 bei 20 µM Aktin bestimmt, was einer etwa dreifachen Aktivierung entsprach. Die basale ATPase-Aktivit ät der Alanin -Mutanten von 0,09 s^-1 wurde bei 20 µM Aktin nur auf einen Wert von 0,11 s^-1 um den Faktor 0,2 aktiviert. Im Gegensatz dazu zeigte die Glutamat-Mutante mit Werten von 0,16 s^-1 für die basale ATPase und 0,68 s^-1 bei 20 µM Aktin eine Aktivierung um den Faktor 3,3. Sie hatte damit eine 17mal höhere Aktivierung als die Alanin -Mutante.

Das Wildtyp-Kopffragment von MyoD zeigte eine Aktivierung um den Faktor 0,3 auf einen Wert von 0,17 s^-1. Auch die Alanin-Mutante wurde durch Aktin nur um den Faktor 0,3 erhöht.

Im Gegensatz dazu wurde die Glutamat-Mutante um den Faktor 12 von einem Wert von 0,10 s^-1 auf 1,34 s^-1 aktiviert und hatte damit eine etwa 40mal höhere Aktivierung als die Alanin -Mutante.

Die ATP -Umsatzgeschwindigkeit des Wildtyp-Kopffragments von MyoE wurde um den Faktor acht auf 0,35 s^-1 aktiviert. Für die Alanin-Mutante des MyoE-Kopffragments liegen keine Daten vor, da sie in D. discoideum nicht überexprimiert wurde, und die Proteinmenge, die für eine kinetische Charakterisierung benötigt wird, nicht isoliert werden konnte. Die Glutamat-Mutante wurde bei 20 µM Aktin 30-fach auf eine ATPase-Aktivität von 2,5 s^-1 aktiviert.

Um die Maximalwerte der ATPase-Aktivität und die Kopplungseffizienz zwischen der Aktinbindung und der Produktfreisetzung zu bestimmen, wurden zusätzlich Messungen bei Aktinkonzentrationen in einem Bereich von 0 bis 60 µM durchgeführt. Die gemessenen

0 100 200 300 400 500 600

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

1 µM D692 1 mM ATP

Absorption

Zeit (s)

ATPase-Geschwindigkeiten wurden in Abhängigkeit von der Aktinkonzentration aufgetragen, und durch Anpassung einer Hyperbel wurden die Konstanten kcat, Kapp und kcat/Kapp erhalten, die von Michaelis-Menten-Parametern abgeleitet sind. Die Konstante kcat gibt den berechneten Maximalwert der Geschwindigkeit an, und Kapp entspricht der apparenten KM für Aktin. Die Bindungskonstante 2. Ordnung für Aktin (kcat/Kapp) wurde durch Berechnung des Quotienten beider Werte erhalten. Sie ist ein Maß für die Kopplungseffizienz des untersuchten Myosins.

Bei viel kleineren Aktinkonzentrationen als Kapp konnten die Daten auch mit einer Geraden besc hrieben werden, und kcat/Kapp wurde aus der Steigung dieser Geraden bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Abbildung 4.15 und der Tabelle 4.3 dargestellt.

Die ATPase-Aktivität des Wildtyp-Kopffragments von MyoB wurde bei steigenden Aktinkonzentrationen hyperbolisch erhöht. Durch Auswertung der Daten mit der Michaelis-Menten-Gleichung wurden ein Maximalwert (kcat) von 2,1 s^-1 und eine Kapp für Aktin von 175 µM ermittelt. Die Kopplungseffizienz (kcat/Kapp) betrug 0,012 µM^-1s^-1. Die ATPase-Geschwindigkeit der Alanin-Mutanten wurde in der Gegenwart von Aktinfilamenten nur so wenig erhöht, daß an die Daten keine Hyperbel angepaßt werden konnte. Eine lineare Regression ergab einen Wert von 0,002 µM^-1s^-1 für kcat/Kapp. Im Gegensatz dazu wurde die ATPase-Aktivität der Glutamat-Mutanten durch Aktinfilamente stärker als der Wildtyp auf einen Maximalwert von 3.1 s^-1 mit einer Kapp von 96 µM aktiviert. Die Kopplungseffizienz (kcat/Kapp) der S-E-Mutanten lag mit 0,032 µM^-1s^-1 dreimal höher als die des Wildtyps und 16mal höher als die der S-A-Mutanten. Aus den ermittelten Werten konnte geschlossen werden, daß das Wildtyp-Kopffragment von MyoB nach der Isolierung aus D. discoideum in einem teilweise phosphorylierten Zustand vorlag.

Die ATPase-Aktivität des Wildtyp-Konstrukts von MyoD zeigte keine Erhöhung der basalen Aktivität durch Aktin, die mit einer Hyperbel ausgewertet werden konnte. Eine lineare Regression ergab einen Wert von 0,004 µM^-1s^-1 für kcat/Kapp. Auch die Alanin-Mutante wurde nur sehr schwach aktiviert, kcat/Kapp betrug 0,001 µM^-1s^-1. Im Gegensatz dazu wurde die ATP-Umsatzgeschwindigkeit der Glutamat-Mutanten stark auf einen Höchstwert von 10,0 s^-1 aktiviert mit einer Kapp von 130 µM. Die Kopplungseffizienz der S-E-Mutanten (kcat/Kapp ) betrug 0,007 µM^-1s^-1 und lag damit 20mal höher als die der Wildtyp-Form und 80mal höher als die der S-A-Mutanten.

Das Wildtyp-Kopffragment von MyoE wurde durch Aktin in seiner ATPase-Aktivität auf einen Maximalwert (kcat) von 2,2 s^-1 erhöht mit einem Wert von 118 µM für Kapp. Die Kopplungseffizienz der Reaktion betrug 0,017 µM^-1s^-1. Die Geschwindigkeit der Glutamat-Mutanten wurde stärker als der Wildtyp bei der ATP -Hydrolyse aktiviert. Es wurde eine Umsatzgeschwindigkeit von 15,4 s^-1 und eine Kapp von 91 µM ermittelt. Damit betrug die Effizienz der Kopplung 0,17 µM^-1s^-1 und war im Vergleich zum Wildtyp zehnfach erhöht.

Abbildung 4.15: Abhängigkeit der Steady State-ATPase-Aktivität der Myosin I-Kopffragmente von der Aktinkonzentration. Die ATPase-Aktivität wurde in Abhängigkeit von der Aktinkonzentration aufgetragen und die Daten wurden durch eine Hyperbel ausgewertet. (A) B698 (? ) S-A -Mutante, (¦ ) Wildtyp (? ) S-E-Mutante;

(B) D692 (? ) S-A -Mutante, (?) Wildtyp, (? ) S-E-Mutante; (C) E698 (? ) Wildtyp, (?) S-E-Mutante. Eine S-A-Mutante von E698 konnte nicht aus D. discoideum isoliert werden.

0 10 20 30 40 50 60

Tabelle 4.3: Steady State-Parameter der aktinaktivierten ATPase -Aktivität.

ATPase-Aktivität ^a Michaelis-Menten-Parameter ^b

Kopplungs- effizienz ^c basal (s^-1) aktiviert (s^-1) Aktivierung k_cat (s^-1) K_app (µM) k_cat/K_app (µM^-1s^-1)

B698 S-A-Mutante 0,09 ± 0,01 0,11 ± 0,02 0,2 n. m. n. m. 0,002 Wildtyp 0,08 ± 0,01 0,30 ± 0,03 2,8 2,1 ± 1,1 175 ± 70 0,012 S-E-Mutante 0,16 ± 0,02 0,68 ± 0,07 3,3 3,1 ± 0,4 96 ± 20 0,032 D692 S-A-Mutante 0,09 ± 0,01 0,10 ± 0,02 0,1 n. m. n. m. 0,001 Wildtyp 0,12 ± 0,02 0,17 ± 0,03 0,3 n. m. n. m. 0,004 S-E-Mutante 0,10 ± 0,02 1,34 ± 0,10 12,4 10,0 ± 3,0 130 ± 50 0,077 E698 Wildtyp 0,04 ± 0,01 0,35 ± 0,02 7,8 2,2 ± 0,2 118 ± 20 0,017 S-E-Mutante 0,08 ± 0,01 2,50 ± 0,20 30,3 15,4 ± 5,0 91 ± 50 0,170 M765 Wildtyp 0,08 ± 0,01 0,68 ± 0,09 7,5 2,6 ± 0,4 73 ± 20 0,036

Reaktionsbedingungen: 25 mM HEPES, pH -Wert 7,4; 25 mM KCl und 25 mM MgCl₂. Die Temperatur betrug 25 °C.

Eine S-A-Mutante von E692 konnte nicht aus D. discoideum isoliert werden.

a Die basale ATPase-Aktivität entspricht der ATP-Umsatzgeschwindigkeit ohne Aktin. Die aktinaktivierte ATPase-Aktivität wurde bei einem Wert von 20 µM F-Aktin bestimmt. Die Aktivierung bei 20 µM Aktin wurde berechnet als (aktivierte ATPase-basale ATPase)/basale ATPase.

b Die Werte für k_cat und K_app wurden durch Auswertung der Daten mit der Michaelis -Menten-Gleichung erhalten.

c Die Kopplungseffizienz (k_cat/K_app) wurde durch Berechnung des Quotienten beider Werte erhalten. Bei viel niedrigeren Aktinkonzentrationen als K_app konnte k_cat/K_app auch bei einer linearen Regression aus der Steigung der Geraden bestimmt werden.